CN109749996A - 获得和维持纯化或富集的哺乳动物神经干细胞群和/或神经祖细胞群的培养方法 - Google Patents

获得和维持纯化或富集的哺乳动物神经干细胞群和/或神经祖细胞群的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了分离的可扩增的人神经干细胞或祖细胞，其中所述细胞为祖细胞或干细胞，保持了其分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，保持了其在整个后续传代中有效分化为少突胶质细胞谱系细胞的能力，并且所述细胞至少表达细胞表面抗原CD133和CD140α。本发明还提供了一种在体外培养分离自哺乳动物中枢神经系统的可扩增的神经祖细胞或干细胞的方法，以及培养物本身，其中所述细胞保持其分化为神经元、星形胶质细胞、和少突胶质细胞的能力以及其有效分化为少突胶质细胞谱系细胞的能力。此外，本发明还提供了治疗髓磷脂缺失或少突胶质细胞缺失所造成病况的方法，也提供了组合物，所述组合物包含分离的可扩增的神经干细胞或通过本发明方法培养的分离的可扩增的神经干细胞。

Description

获得和维持纯化或富集的哺乳动物神经干细胞群和/或神经 祖细胞群的培养方法
技术领域
本发明一般涉及神经干细胞和神经祖细胞的细胞生物学领域。具体而言，本发明提供了纯化的或富集的哺乳动物神经干细胞群和/或神经祖细胞群，该细胞群易于在体外分化成少突胶质细胞谱系细胞(oligodendrocyte-lineage cells)，并且该细胞群适用于生物学研究、药物筛选和人类治疗。
与相关申请的交叉引用
本申请与2011年1月12日提交的美国临时专利申请61/431,944和2011年11月11日提交的美国临时专利申请61/558,527相关。
关于联邦资助的研发的说明
不适用。
背景技术
中枢神经系统的发展过程中，原始、多能神经干细胞(NSC)增殖，产生瞬时分裂的祖细胞，祖细胞最终分化成组成成人大脑的各种细胞类型。成人中枢神经系统主要由神经元和包括星形胶质细胞和少突胶质细胞的神经胶质细胞构成。正在发育的脑中，(最终分化为)神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的祖细胞顺序地从神经干细胞中产生(见图1)。神经元祖细胞首先形成并分化成多种类型的神经元。然后星形胶质细胞发展并发挥支持神经元存活的功能。最后，少突胶质细胞的祖细胞开始出现并在整个中枢神经系统中迁移。然后，他们分化为成熟的少突胶质细胞，这些成熟的少突胶质细胞产生正常的神经功能所必需的髓磷脂。
由于少突胶质细胞在支持中枢神经系统中发挥着重要作用，纯化或富集的少突胶质细胞群或其前体细胞(即少突胶质细胞前祖细胞和/或少突胶质细胞祖细胞)群可用作细胞治疗和再生药物，例如治疗神经疾病，包括先天性脱髓鞘疾病(例如，克拉贝氏(Krabbe)病或佩-梅(Pelizaeus-Merzbacher)病)、脊髓损伤和其它源于隔离神经细胞的髓鞘的缺陷导致的疾病。这些细胞也可以用于研究和确定用于治疗许多神经疾病如多发性硬化和精神分裂症的新药物。
成熟的少突胶质细胞不增殖，培养中也不易存活，从组织样本中直接获得数量上足够用于研究或人类治疗的少突胶质细胞是非常困难的。因此，用于这些目的的少突胶质细胞的使用受限于这些细胞的缺少。
针对这个问题的一种解决方案是将神经干细胞和/或神经祖细胞培养增殖以获得足够大量的后续可分化成少突胶质细胞的细胞。分化可在体外或体内发生，例如在移植的情况下。这种方法能够产生大量的少突胶质细胞或其祖细胞或前细胞用于研究和人类治疗。
然而，研究人员一直在努力确定允许少突胶质细胞祖细胞或前祖细胞——尤其是来自人类或非人灵长类动物的此类细胞——长期培养和大量扩增的培养条件，其中产生的扩增的细胞群主要由保留了分化成少突胶质细胞能力的细胞组成。
有些科学家报道了从大鼠上获得少突胶质细胞祖细胞(Raff等在1983年J.Neurosci杂志3:1289；Raff等在1983年Nature杂志303:390；Espinosa de los Monteros等1993年在Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90:50)。这些增殖性的少突胶质细胞祖细胞由于具有在体外分化成少突胶质细胞或2型星形胶质细胞的能力而称为O-2A祖细胞。其他科学家也在原代培养物中发现了大鼠或小鼠的少突胶质细胞前祖细胞(Gallo,Armstrong RC在1995年J.Neurosci杂志15:394，Grinspan,Franceschini B在1995年J.Neurosci.Res杂志41:540，Decker等在2000年Mol.Cell.Neurosci杂志16:422)。这些细胞被认为是少突胶质细胞祖细胞的前体，由于其与少突胶质细胞祖细胞相比具有更高的迁移能力，因此预期这些细胞在细胞治疗中更加有益。不幸的是，科学家们一直无法在体外长期有效增殖这些细胞。相反的，科学家们报道了使用B104条件培养基或生长因子组合培养源于大鼠视神经或脊髓的O2A祖细胞，所述生长因子组合例如(i)血小板衍生生长因子AA(PDGF-AA)与碱性成纤维细胞生长因子(bFGF或碱性FGF)和神经营养因子-3(NT-3)，或(ii)PDGF-AA与睫状神经营养因子(CNTF)和NT-3。但是，尚未有人成功地使用这些生长因子从灵长类动物组织大量扩增这些细胞类型。
因此，从哺乳动物而非大鼠或小鼠获得和扩增纯化的或富集的少突胶质细胞群和/或其前体细胞群仍然是很困难的。从人类和非人灵长类动物获得和扩增这些细胞尤其困难。因此，非常需要用于产生纯化或富集的哺乳动物神经干细胞群或祖细胞群的方法，所述细胞群易于在体外分化成少突胶质细胞谱系细胞。
发明概述
本发明涉及分离的可扩增的人神经细胞，其中所述细胞是祖细胞或干细胞，其中所述细胞保持其分化为神经元、星形胶质细胞、和少突胶质细胞的能力，其中所述细胞保持其在整个后续(多次)传代中有效分化为少突胶质细胞谱系细胞的能力，并且所述细胞至少表达细胞表面抗原CD133和CD140α。
本发明还涉及体外培养可扩增的神经细胞的方法，其中所述细胞是从哺乳动物中枢神经系统分离的祖细胞或干细胞，其中所述细胞保持了其分化为神经元、星形胶质细胞、和少突胶质细胞的能力以及其有效地分化成少突胶质细胞谱系细胞的能力，其中所述方法包括从人胎儿神经组织分离和离解(dissociating)至少一个细胞；在温度为37℃，含有1-20％的O2和5％CO2的气体环境下，和化学定义的(chemically defined)无血清培养基中培养细胞，其中所述培养基包含至少5ng/ml的PDGF-AA，至少0.5ng/ml的bFGF，和至少10μM的1-硫代甘油；以及传代所述细胞以获得可扩增的人神经细胞。
本发明还涉及神经干细胞药物组合物，其包含分离的可扩增的人神经细胞。
另外，本发明还涉及神经干细胞药物组合物在用于治疗病况的药物中的应用。
本发明还涉及体外培养和扩增从哺乳动物中枢神经系统分离的神经干细胞和/或神经祖细胞的方法，其中所述培养和扩增的细胞保持其分化成少突胶质细胞谱系细胞的能力。本发明中的细胞培养物是贴附培养物。
本发明还涉及分离的纯化或富集的可扩增哺乳动物神经干细胞群和/或神经祖细胞群，所述细胞群易于在体外分化成少突胶质细胞谱系细胞(即，如图7和图15所示的蜘蛛网形态的O4-阳性细胞)。
本发明还涉及哺乳动物少突胶质细胞谱系细胞，所述细胞通过从哺乳动物中枢神经系统获得的神经干细胞和/或神经祖细胞的体外扩增和分化而获得。
本发明还涉及一种培养基，所述培养基包括：
-至少5ng/ml PDGF-AA
-至少0.5ng/ml bFGF，和
-至少10μM的1-硫代甘油，优选地，所述培养基为化学定义的无血清培养基。
在本发明的一个具体实施方式中，所述培养基还包括至少1.0ng/ml的IGF-1。
在本发明的一个具体实施方式中，所述培养基包含：
-40-200ng/ml PDGF-AA,
-5-100ng/ml bFGF,
-10-100μM 1-硫代甘油，和
-5-100ng/ml IGF-1。
在本发明的一个具体实施方式中，所述培养基包含：
-约100ng/ml PDGF-AA,
-约20ng/ml bFGF,
-约50μM 1-硫代甘油，和
-约20ng/ml IGF-1。
在本发明的一个具体实施方式中，所述培养基包含：
-5-100ng/ml PDGF-AA,
-1-50ng/ml bFGF,
-10-100μM 1-硫代甘油，和
-5-100ng/ml IGF-1。
在本发明的一个具体实施方式中，所述培养基包含：
-约20ng/ml PDGF-AA,
-约20ng/ml bFGF,
-约50μM 1-硫代甘油，和
-约20ng/ml IGF-1。
在本发明的一个具体实施方式中，所述培养基包括DMEM/F12，所述DMEM/F12添加有非必需氨基酸、谷氨酰胺、丙酮酸、B27、N-乙酰半胱氨酸和β-巯基乙醇。
在本发明的一个具体实施方式中，所述培养基用于富集可扩增的神经细胞，所述细胞为祖细胞或干细胞。
在本发明的一个具体实施方式中，所述细胞为可扩增的人神经细胞，其中所述可扩增的人神经细胞是在不违反社会公德的情况下获取的。
在本发明的一个具体实施方式中，所述细胞保持其分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，其中所述细胞保持其在整个后续传代中有效分化为少突胶质细胞谱系细胞的能力。
在本发明的一个具体实施方式中，所述细胞表达细胞表面抗原CD133，CD140α，A2B5和PSA-NCAM。
在本发明的一个具体实施方式中，所述细胞已在ATCC保藏，保藏号为PTA-12291。
附图概述
图1显示了神经干细胞和神经祖细胞发育为脑中三种主要的细胞类型-神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞；
图2显示了各种CNS细胞标志物的表达比较；
图3在微缩图(slides)A-F显示了HFSC(克隆#2b)的相差图象；
图4显示了HFSC细胞(克隆#2b)在不同生长因子组合中的扩增率；
图5显示了高剂量的PDGF-AA(100ng/ml)和1-硫代甘油对HFSC细胞(克隆#2b)增殖的影响；
图6显示了HFSC细胞(克隆#2b)的生长曲线；
图7在微缩图A-F显示了HFSC细胞在无血清培养基中的自发分化；
图8是倒置显微镜拍摄的相差图像，显示HFSC细胞(克隆#3)在不同代的形态；
图9显示了HFSC细胞(克隆#3)的生长曲线；
图10微缩图A-F为倒置显微镜拍摄的相差图像，显示了HFSC细胞(克隆4A和4B)在不同代的形态；
图11显示了HFSC细胞(克隆#4A和4B)的生长曲线；
图12微缩图A-S显示了未分化的HFSC细胞的免疫表型；
图13微缩图A-H显示了流式细胞仪检测数据，说明未分化的HFSC细胞(克隆#2b，13代)的比例；
图14显示了分化的HFSC细胞(克隆#3，15代)的免疫表型；
图15微缩图A-E显示了HFSC细胞(克隆#2b，15代)的分化潜能。
附图详述
图1描述了神经干细胞和神经祖细胞发育为脑中三种主要的细胞类型-神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。带箭头的实线表示一种细胞类型到另一种的进展。从HFSC细胞到神经元限制性前体细胞(NRP)的虚线表示HFSC细胞具有较低的最终变成神经元细胞的倾向。从HFSC细胞到O2A细胞的粗线表示HFSC细胞具有较大的产生少突胶质细胞谱系细胞的倾向。如实施例7中所示(参见图14)多能HFSC细胞分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。实施例2中(参见图7)和实施例8(参见图15)显示了HFSC细胞分化成少突胶质细胞谱系细胞的倾向。
图2显示了各种CNS细胞标志物的表达比较。本发明在实施例7(参考附图12和13)公开了HFSC细胞的表型，并在该图中进行了概括。如下将要讨论的，HFSC细胞，与其他细胞类型都不相同，具有神经干细胞和少突胶质细胞2型星形胶质细胞祖细胞(O2A)两种特点。
图3在微缩图A-F显示了HFSC(克隆#2b)相差图像。图3中，微缩图A表示倒置显微镜拍摄的相差图像，显示HFSC细胞(克隆#2b)，所述细胞在DMEM/F12和20ng/ml PDGF-AA和10ng/ml bFGF中培养，培养箱保持37℃，5％O2，5％CO2，DMEM/F12含有谷氨酰胺和HEPES并添加有B27添加剂(InvitrogenTM)，非必需氨基酸(NEAA)(InvitrogenTM)，1.5mM的丙酮酸(InvitrogenTM)，55μM的β-巯基乙醇(InvitrogenTM)，和1mM N-乙酰-L-半胱氨酸(Sigma)(下文将该组合称为“HFSCM1培养基”)。所显示的细胞来自0代，第7天。细胞形成球体，这些球体直接接种到聚鸟氨酸涂层培养板上，在1代没有分离球体。
在图3中，微缩图B、C为倒置显微镜拍摄的相差图像，显示了如上文图3微缩图A所述培养的HFSC细胞(克隆#2b)。所示分别细胞来自于1代，第1天和2代，第14天。直接接种到聚鸟氨酸涂层培养板的细胞贴附并从球体扩增开来(图3，微缩图B)。传代的细胞能够在此培养条件下在后续传代中成功地扩增(图3，微缩图C)。
图3中，微缩图D-F为倒置显微镜拍摄的相差图像，显示了在具有100ng/ml PDGF-AA、10ng/ml bFGF、10ng/ml IGF-1和50μM 1-硫代甘油的HFSCM1培养基在37℃、5％O2和5％CO2培养箱中培养和多次传代后的HFSC细胞(克隆#2b)。大多数HFSC细胞是与周围的细胞成群的暗相细胞。从集群分离的分散细胞倾向于自发分化成带突起的(process-bearing)多极细胞(所谓的“蜘蛛网状”形态)，这是前-成少突胶质细胞和未成熟的少突胶质细胞(如图3微缩图D和E的白色箭头所示)的特点，但它们的出现频率通常低于1％。图3微缩图D、E、和F所示的细胞分别来自8代，第8天；11代，第11天和19代，第11天。
图4显示了HFSC细胞(克隆#2b)在不同的生长因子组合存在下的扩增率：(1):20ng/ml PDGF-AA+10ng/ml bFGF；(2):20ng/ml PDGF-AA+10ng/ml bFGF+5ng/ml NT-3；(3):20ng/ml PDGF-AA+10ng/ml bFGF+10ng/ml IGF-1；(4):20ng/ml PDGF-AA+10ng/mlbFGF+5ng/ml NT-3+10ng/ml IGF-1.。在3代的第11天(P3D11)收集细胞，并对每种条件下的活细胞进行计数。然后，在相同细胞密度，在与3代中使用的相同条件下进行传代。在4代第8天(P4D8)收集细胞并对每个条件中的活细胞数进行计数(在细胞因为开始形成球体而亚融合前收获这些细胞)。在3代，条件(4)是最有效的，但在4代并非如此。在两个代中，条件(3)都是有效的。
图5显示了高剂量的PDGF-AA(100ng/ml)和1-硫代甘油对HFSC细胞(克隆#2b)增殖的影响，在存在以下生长因子组合的HFSCM1培养基中培养：(1):20ng/ml PDGF-AA+10ng/mlbFGF+10ng/ml IGF-1；(2):20ng/ml PDGF-AA+10ng/ml bFGF+10ng/ml IGF-1+50μM 1-硫代甘油；(3):100ng/ml PDGF-AA+10ng/ml bFGF+10ng/ml IGF-1；(4):100ng/ml PDGF-AA+10ng/ml bFGF+10ng/ml IGF-1+50μM 1-硫代甘油；(5):100ng/ml PDGF-AA+10ng/ml bFGF+50μM 1-硫代甘油。在5代的第7天收集细胞(如4代，在细胞因为开始形成球体而分汇合前收获这些细胞)，并对每种条件下的活细胞数进行计数。还测试了20ng/ml PDGF-AA+10ng/mlbFGF的组合，但回收的细胞数太低无法评估(小于1×104个细胞，低于计数范围)，从该图中去除了这一数据。条件(1)可以在3代扩增细胞，但不能在5代扩增细胞。加入50μM的1-硫代甘油[条件(2)]或提高PDGF-AA浓度到100ng/ml[条件(3)]对扩增速率的积极影响非常小。当加入50μM的1-硫代甘油和提高PDGF-AA浓度到100ng/ml组合时[条件(4)]，细胞扩增速率显著提高，细胞可被成功扩增。当从该条件中消除IGF-1时[条件(5)]，扩增率降低至小于1，表明IGF-1也促进了HFSC细胞的增殖和/或存活。
图6显示了人HFSC细胞(克隆#2b)的生长曲线(黑线空心圆圈)。HFSC细胞(克隆#2b)在10ng/ml PDGF-AA和10ng/ml bFGF存在下开始培养。从第3代加入10ng/ml IGF-1。从第6代PDGF-AA的浓度从20ng/ml提高到100ng/ml。然而，它们对细胞的扩增率影响很小或无影响。从第7代加入50μM的1-硫代甘油。在存在100ng/ml PDGF-AA,10ng/ml bFGF,10ng/mlIGF-1和50μM 1-硫代甘油下HFSC细胞(克隆#2b)开始迅速生长。第17代加入10ng/ml NT-3。NT-3略微增强了细胞生长但一代后作用消失。此图还显示在10代第6天(虚线空心圆圈)和11代第11天(点线空心圆圈)冷冻的人HFSC细胞(克隆#2b)的生长曲线。冷冻细胞解冻后能够以类似速率扩增。
图7在微缩图A-F中显示了在无血清培养基中HFSC细胞自发分化。微缩图A和B是倒置显微镜拍摄的相差图像，显示在12代、第9天(图7，微缩图A和B)，经过补充有20ng/mlPDGF-AA,10ng/ml bFGF,10ng/ml IGF-1和50μM 1-硫代甘油(图7，微缩图A)或不具有1-硫代甘油(图7，微缩图B)的HFSCM1培养基培养的HFSC细胞(克隆#2b)的形态变化。在更换培养基时不补充bFGF，HFSC细胞自发分化。即使在相同的条件下，如果每天补充bFGF，HFSC细胞不分化并且看起来增长缓慢。此外，使用40ng/ml或更高浓度的PDGF-AA时，HFSC分化被阻断并形成集群。通过将PDGF-AA浓度从100ng/ml降低到20ng/ml并且不补充bFGF，细胞可自发地分化成具有蛛网状形态的带突起的多极细胞，其表达O4抗原(图7，微缩图C和D)和/或GalC抗原(图7中，微缩图E和F)，这是少突胶质细胞谱系细胞[即，前-成少突胶质细胞(O4阳性和GalC阴性)，未成熟少突胶质细胞(O4阳性和GalC阳性)]的决定性特征。
图8是倒置显微镜拍摄的相差图像，显示不同代的HFSC细胞(克隆#3)的形态。常规的神经干细胞最初在bFGF和EGF存在下扩增15天(参见图8，微缩图A，0代，第15天)。在这之后，细胞在具有20ng/ml PDGF-AA和10ng/ml bFGF的HFSCM1培养基，37℃、5％O2、5％CO2培养箱中培养。从第4代，PDGF-AA浓度增加至100ng/ml并加入10ng/ml的IGF-1(参见图9)。从第8代加入50μM的1-硫代甘油(参见图9)。在经过若干代后形态变得与克隆#2b几乎相同。
图9显示了人类HFSC细胞(克隆#3)(黑线的空心圆圈)的生长曲线。HFSC细胞(克隆#3)最初在10ng/ml的EGF和10ng/ml的bFGF存在下培养以扩增常规的神经干细胞。然后，从第1代，生长因子组合变为20ng/ml的PDGF-AA和10ng/ml的bFGF。从第2代加入10ng/ml的IGF-1和10ng/ml的NT-3。在图4所示数据的基础上，从第4代除去NT-3，PDGF-AA浓度从20ng/ml增加到100ng/ml。然而，如克隆#2b所示，它们对细胞扩增速率影响甚微或无影响。从第5代加入50μM的1-硫代甘油，和克隆#2b一样，HFSC细胞(克隆#3)开始在100ng/ml PDGF-AA,10ng/ml bFGF,10ng/ml IGF-1和50μM 1-硫代甘油存在下迅速生长。此图还包括在第10代第7天(第10代，第7天：虚线空心圆)冷冻的人类HFSC细胞(克隆#3)的生长曲线。冷冻细胞解冻后，能够以类似的速度扩增。
图10是倒置显微镜拍摄的相差图像，在微缩图A-F显示了不同代数下的HFSC细胞(克隆4A和4B)的形态。在37℃，5％O2，5％CO2培养箱中，在具有20ng/ml的PDGF-AA，20ng/mlbFGF和20ng/ml的IGF-1(克隆#4A)或100ng/ml PDGF-AA，20ng/ml bFGF和20ng/ml的IGF-1(克隆#4B)的HFSCM1培养基和50μM 1-硫代甘油中培养细胞。克隆#4A开始比克隆#4B扩增速度低，但从第2代几乎以相同速度增长。经过3代后它们变为几乎是均质的(homogeneous)，它们的形态变为与克隆#2b或#3几乎相同。
图11显示了人类HFSC细胞(克隆#4A：虚线空心正方形和#4B：黑线空心圆圈)的生长曲线。HFSC细胞(克隆#4A)在20ng/ml的PDGF-AA,20ng/ml bFGF,20ng/ml,IGF-1和50μM1-硫代甘油存在下进行培养。HFSC细胞(克隆#4B)在100ng/ml的PDGF-AA,20ng/ml bFGF和20ng/ml IGF-1以及50μM 1-硫代甘油存在下进行培养。首先两个克隆的细胞数量急剧下降，这种下降在克隆#4A更为突出。细胞数量最初下降后，它们开始迅速扩增。此图还包括在第5代第6天(第5代第6天：虚线空心圆)冷冻的人类HFSC细胞(克隆#4B)的生长曲线。
图12在微缩图A-S显示了未分化的HFSC细胞的免疫表型；(克隆#2b，12-16代)在100ng/ml PDGF-AA,10ng/ml bFGF,10ng/ml IGF-1,和50μM 1-硫代甘油存在下培养，对CD133、Sox2、巢蛋白(Nestin)、Olig2、PDGF-Rα、NG2、A2B5、PSA-NCAM、GFAP或波形蛋白(Vimentin)染色呈阳性。使用DAPI复染细胞的细胞核。这些图显示，至少90％的细胞为CD133,Sox2,巢蛋白,Olig2,PDGF-Rα,NG2,A2B5和波形蛋白阳性，但没有GFAP阳性的细胞。PSA-NCAM染色稍微弱，但仍有超过90％的细胞显示PSA-NCAM阳性。
图13，微缩图A-H，显示了流式细胞仪检测数据，该数据显示未分化的HFSC细胞(克隆#2b，13代)的比例。黑线柱(histograms)代表同种型对照，灰色填充柱代表每个测试抗原。此数据表明，大部分HFSC细胞为CD133阳性(图13，微缩图A)，CD9阳性(图13，微缩图B)，CD140a阳性(图13，微缩图)，NG2阳性(图13，微缩图D)，A2B5阳性(图13，微缩图E)，O4阳性(图13，微缩图F)，PSA-NCAM阳性(图13，微缩图G)。进行的免疫细胞化学(数据未示出)测试，显示CD44阴性(图13，微缩图H)。
图14显示培养在含有血清的培养基中31天的分化的HFSC细胞(克隆#3，15代)的免疫表型，并用识别神经元(βIII微管蛋白，神经丝蛋白-L和MAP2)、少突胶质细胞(O4，MBP)和星形胶质细胞(GFAP)的抗体染色，然后是荧光二抗。使用DAPI复染细胞核。HFSC细胞能够分化成对每种标志物阳性的细胞。为了评估共定位的神经元轴突和髓磷脂，细胞与抗-βIII微管蛋白抗体和抗-MBP抗体(图14，微缩图A-C)，抗-神经丝蛋白-L抗体和抗-MBP抗体(图14，微缩图D-F)，抗-MAP2抗体和抗-MBP抗体(图14，微缩图G-I)共染色。只有少数神经元轴突和髓磷脂共定位。为了评估O4抗原和MBP的共定位，细胞与O4抗体和抗-MBP抗体共染色(图14，微缩图J-L)。大多数MBP信号与O4抗原信号共定位。HFSC细胞也可以分化成GFAP抗原阳性的星形胶质细胞(图14，微缩图M-O)。此外，许多细胞对在上皮细胞包括星形胶质细胞和间充质细胞表达的波形蛋白呈阳性。此外，未分化的细胞也对波形蛋白呈阳性(数据未示出)。
图15在微缩图A-E显示了HFSC细胞(克隆#2b，15代)的分化潜能。细胞在DMEM/F12中分化，DMEM/F12含有谷氨酰胺和HEPES，并补充有B27添加剂，N2添加剂和50μM的1-硫代甘油与10ng/ml的PDGF-AA，100ng/ml的IGF-1，10ng/ml的BDNF和100μM的pCPT-cAMP。分化4天后，细胞用抗-GD3抗体和O4抗体染色，然后用荧光二抗染色。未分化的细胞表达GD3要强于少突胶质细胞祖细胞，O4反之(图15的箭头，微缩图A，B和C显示未分化的细胞)。大多数分化细胞呈现多极化形态，具有微弱的GD3信号和较强的O4信号，表明其为少突胶质细胞祖细胞或前-成少突胶质细胞。其他细胞类型(如星形胶质细胞和神经元)定义为GD3阴性和O4阴性细胞。图15，微缩图D从分化细胞的10个不同图像显示每个细胞群体的比率。细胞总数的70％以上分化成少突胶质细胞祖细胞(75.8％±2.09％)。超过总数20％的细胞仍然是未分化的细胞(23.5％±2.03％)。其他细胞类型均少于细胞总数的1％(0.7％±0.41％)。计算少突胶质细胞祖细胞和其他细胞类型占分化的细胞(少突胶质细胞祖细胞加其它细胞类型)的比例，并示于图15，微缩图E。少突胶质细胞祖细胞占分化细胞的99.1％±0.56％，而其他细胞类型占分化细胞的0.9％±0.56％。
本发明优选实施方式详述
本发明提供了一种方法，该方法用于培养和扩增从哺乳动物中枢神经系统中获得的的神经干细胞或神经祖细胞以产生纯化或富集的神经干细胞群或神经祖细胞群，所述细胞群具有体外分化为少突胶质细胞或少突胶质细胞谱系细胞的能力。神经干细胞和神经祖细胞产生的后代都或为神经元细胞(如神经元祖细胞或成熟神经元)或为包括星形胶质细胞和少突胶质细胞的神经胶质细胞。虽然神经干细胞是可自我再生的(即能无限增殖)，神经祖细胞可能、但不必定，能够自我再生。本发明的培养方法能够产生扩增的细胞群，该细胞群可分化成占分化细胞至少70％，80％，90％或95％的少突胶质细胞系细胞，即少突胶质细胞祖细胞和少突胶质细胞。
如下缩写和定义贯穿在本申请全文：
术语“HFSC细胞”是指本发明中描述的纯化或富集的细胞群，所述细胞是扩增的哺乳动物神经干细胞和/或神经祖细胞。
术语“HFSCM1培养基”是指DMEM/F12，在组合中包含谷氨酰胺和HEPES并补充有B27添加剂(InvitrogenTM)，非必需氨基酸(NEAA)(InvitrogenTM)，1.5mM的丙酮酸(InvitrogenTM)，55μM的β-巯基乙醇(InvitrogenTM)，和1mM N-乙酰基-L-半胱氨酸(Sigma)。
术语“神经胶质细胞”是指中枢神经系统的非神经元细胞，包括成熟的少突胶质细胞、星形胶质细胞、和这些细胞类型的一种或两种的定向祖细胞。
术语“专能(multipotent)祖细胞”指的神经祖细胞，其具有产生多个、但数量有限的谱系的细胞的潜能。
“多能性(pluripotency)”(源自拉丁文“plurimus”或“非常多”和“潜在的”或“动力”)是指有潜力分化成三个胚层的任意层的干细胞，所述三个胚层为：内胚层(胃内粘膜(interior stomach lining)，胃肠道，肺)，中胚层(肌肉，骨骼，血液，泌尿生殖)，或外胚层(表皮组织和神经系统)。神经干细胞是专能而不是多能。胚胎干细胞是多能而不是专能。
定向祖细胞是定向或确定会成为特定类型成熟细胞的祖细胞。与之相反，专能或多能祖细胞具有变为两种或更多种类型的成熟细胞中的一种的潜能(如基于时间和环境因素，O-2A祖细胞可以成为少突胶质细胞或2型星形胶质细胞)。
“少突胶质细胞”是一种神经胶质细胞，其主要功能是在一些脊椎动物中枢神经系统中隔离神经细胞轴突。
术语“少突胶质细胞谱系细胞”是指少突胶质细胞，前-成少突胶质细胞和少突胶质细胞祖细胞(例如O2A祖细胞)。此术语不包括神经胶质细胞限制性前体或神经干细胞。
术语“少突胶质细胞祖细胞(oligodendrocyte progenitor cells)”和“少突胶质细胞祖细胞(oligodendrocyte progenitors)”在整个申请中互换使用，该术语指的是相对于(形成)神经元或非神经组织，这种细胞优先定向形成的祖细胞和/或后代更多的是少突胶质细胞。除非另有规定，它们可以、但不必定，有生成其他类型的神经胶质细胞(如2型星形胶质细胞)的能力。这里所用的此术语不包括少突胶质细胞的前祖细胞或神经胶质细胞限制性前体(参见图1)。
“少突胶质细胞前祖细胞”是少突胶质细胞祖细胞的前体细胞。
“前-成少突胶质细胞”是有丝分裂后少突胶质细胞的前体细胞。
通过培养“扩增”细胞指的是在培养基存在下增加细胞数量，所述培养基含有刺激细胞增殖的添加物。
“细胞扩增率”是指特定日期的细胞数除以初始培养时的细胞数。
“扩增的”神经前体细胞或神经干细胞此处指的是从分离的神经前体细胞或神经干细胞衍生的神经前体细胞或神经干细胞，所述分离的神经前体细胞或神经干细胞是体外增殖的，所述“扩增的”神经前体细胞或神经干细胞产生扩增的细胞群。
“传代”细胞(也称为“继代培养”或“分裂”细胞)指的是一种技术，该技术通过将细胞彼此分离(用酶，如胰蛋白酶或胶原酶)然后将一小部分数目的细胞转移到新的培养容器中，而使细胞在较长的时间段内在实验室培养条件下保持存活并生长。如果以规律的时间间隔传代，由于避免了长时间高细胞密度相关联的早衰，细胞可以培养更长的时间。
生长环境是指细胞在体外增殖、分化和/或成熟的环境。环境的特点包括培养细胞的培养基，可能存在的生长因子或分化诱导因子，可存在的支撑结构(如在固体表面上的基板)。
通用技术
生物学、蛋白质化学、抗体技术的一般方法可以在《蛋白质化学的实验操作手册》(Current Protocols in Protein Science)(Wiley&Sons出版，J.E.Colligan等主编)，《细胞生物学的实验操作手册》(Current Protocols in Cell Biology)(Wiley&Sons出版，J.S.Bonifacino等主编)，《免疫学的实验操作手册》(Current Protocols in Immunology)(Wiley&Sons出版，J.E.Colligan等主编)中得知。细胞培养方法在当前版本的《动物细胞培养：基本技术手册》(Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique)(Wily&Sons出版，R.I.Freshney等主编)，《细胞培养的普通技术》(General Techniques of CellCulture)(Cambridge Univ.Press出版，M.A.Harrison&I.F.Rae主编)等中记载。组织培养耗材和试剂可以从R&DInvitrogenTM,Nalgene-NuncTMInternational,Sigma-AldrichTM,和ScienCell等商业厂商获得。
与本发明公开相关的专业参考书包括《神经科学原理》(Principles ofNeuroscience)，第四版，Kandel等主编，McGraw-Hill2000年出版；《中枢神经系统再生：基础科学和临床进展》(CNS Regeneration:Basic Science and Clinical Advances)，M.H.Tuszynski&和J.H Kordower编，Academic Press1999年出版；《神经元：细胞和分子生物学》(The Neuron:Cell and Molecular Biology)，第三版，I.B.Levitan和L.K.Kaczmarek编，Oxford U.Press2001年出版；《神经胶质细胞：它们在行为中的作用》(Glial Cells:Their Role in Behavior)，PR Laming等合编，Cambridge U.Press 1998年出版；《神经胶质细胞在健康与疾病中的功能角色》(The Functional Roles of GlialCells in Health and Disease)，Matsas与Tsacopoulos合编，Plenum Pub.Corp,1999年出版：《神经胶质细胞发育》(Glial Cell Development)，Jessen与Richardson编,OxfordU.Press2001出版；《钢铁之人》(Man of Steel)，Adrian Hill,1996年。
在细胞个体发生的背景下，形容词“分化的”是一个相对术语。分化的细胞是比正在和它比较的细胞在发育途径上已经发展得更远的细胞。因此，神经干细胞可以分化为细胞谱系限制性祖细胞。这些继而可以分化成沿着分化途径更远的细胞或分化成末期分化的细胞，如成熟的神经元或少突胶质细胞。
本发明的分化的细胞可根据它们是否表达少突胶质细胞特征性表型标志物来表征。取决于细胞群的成熟程度，这些细胞可能存在的典型的免疫组化标志物有以下几种：
Sox2：多能干细胞和神经干细胞的标志物；
巢蛋白，神经干细胞标志物；
CD133：神经干细胞的细胞表面标志物；
PDGF-受体α(PDGF-Rα)：血小板衍生生长因子受体的α链。少突胶质细胞和其祖细胞的标志物；
CD140a：与PDGF-Rα相同。CD140a抗体识别PDGF-Rα的胞外区。少突胶质细胞和其祖细胞的表面标志物；
CD9：细胞表面糖蛋白，已知和整联蛋白以及其他跨膜的4个超家族蛋白复合。生殖干细胞、神经干细胞、少突胶质细胞、间充质干细胞的细胞表面标志物；
PSA-NCAM：唾液酸神经细胞黏附分子。神经元限制性前体(NRP)、神经元祖细胞、成神经细胞和少突胶质细胞前祖细胞的表面标志物。此标志物在神经胶质细胞限制性前体(GRP)中为阴性。
A2B5:神经胶质细胞限制性前体(GRP)、神经胶质细胞祖细胞和少突胶质细胞祖细胞(OPC)以及2型星形胶质细胞的细胞表面标志物。该细胞表面标志物在神经元限制性前体(NRP)中为阴性。
NG2：硫酸软骨素蛋白多糖。巨噬细胞和少突胶质细胞祖细胞的细胞表面标志物。
GD3：神经节苷脂GD3。少突胶质细胞前祖细胞和少突胶质细胞祖细胞的标志物。
O4：少突胶质细胞及其祖细胞的标志物。
半乳糖脑苷C(GalC)：未成熟少突胶质细胞的标志物。
髓鞘碱性蛋白(MBP)：成熟的少突胶质细胞的标志物。
CD44：细胞表面糖蛋白，参与细胞-细胞相互作用以及细胞粘附和迁移，透明质酸的受体。一些上皮细胞和星形胶质细胞系细胞的细胞表面标志物。
胶质纤维酸性蛋白(GFAP)：星形胶质细胞的标志物。
βIII微管蛋白：神经祖细胞和神经元的标志物。
神经丝蛋白-L：成熟神经元标志物。
微管相关蛋白2(MAP2)：成熟神经元的标志物。
组织特异性标志物可以使用任何适当的免疫学技术进行检测，如细胞表面标志物的流式免疫组化，或细胞内或细胞表面标志物免疫组化(例如，固定的细胞或组织切片)。流式细胞仪详细分析方法在Gallacher等，BLOOD杂志，2000年96:1740有记载。如果在标准的免疫组化或流式细胞仪测定中，任选将细胞固定以后，并任选使用标记的二抗或其他耦合物来放大标记，可检测到大量的抗体结合于抗原，则将细胞表面抗原的表达定义为阳性。为了便于在研究或治疗中使用，最大限度地提高具有少突胶质细胞或其祖细胞的特征的细胞在细胞群中的比例常常是有利的。有可能获得至少50％，60％，70％，90％或95％为特定谱系细胞的细胞群，所述特定谱系的细胞鉴定为对这些细胞的特征性表型标志物是阳性的。
对于与神经功能重建相关的治疗性应用，往往希望将细胞群形成其他细胞类型尤其是未分化的干细胞和非外胚层谱系细胞的能力最小化。根据(具体)应用，将神经元谱系细胞和其定向祖细胞、或星形胶质细胞谱系的细胞和其定向祖细胞的比例最小化可能是有利的。根据本发明，细胞群的污染具有少于30％，20％，10％或5％这些其他类型细胞的污染。
本发明的方法不能导致整个人机体的发育。
本发明的方法涉及在定义的(defined)培养基中培养来自哺乳动物中枢神经系统的分离的神经干细胞和/或神经祖细胞，所述培养基允许所述细胞通过多次传代而扩增。本发明培养方法培养的细胞在整个扩增中保持其分化成少突胶质细胞谱系细胞的能力。本发明培养方法培养的细胞可以传代多于6次，扩增超过1000倍，而保持其分化为少突胶质谱系细胞的能力。在一些实施方式中，本发明培养方法得到的扩增的细胞群含有或可在无血清培养条件下分化成至少30％，50％，70％或80％的分化细胞为少突胶质细胞谱系细胞的细胞群。在一优选实施方式中，采用本发明培养方法得到的扩增细胞培养物群体在分化的细胞中包括至少90％的少突胶质细胞谱系细胞。在优选实施方式中，扩增的细胞是专能的。在一些实施方式中，大部分的扩增细胞在降低PDGF-AA的培养基(即20ng/ml的PDGF-AA，优选用10ng/ml bFGF，有或没有50μM的1-硫代甘油，和任选至少10ng/ml的IGF-1)中培养、在更换培养基的中间不补充bFGF的情况下，能够分化成少突胶质细胞谱系细胞。在一些实施方式中，大部分的扩增的细胞在包含谷氨酰胺和HEPES并补充有B27添加剂、N2添加剂和50μM1-硫代甘油的DMEM/F12中培养后能够分化成少突胶质细胞谱系细胞，所述DMEM/F12含有10ng/ml的PDGF-AA,100ng/ml IGF-1,100μM pCPT-cAMP和10ng/ml BDNF。
合适的培养容器包括但不限于，培养容器的表面具有一种多氨基酸或多氨基酸组合(例如，聚赖氨酸和/或聚鸟氨酸)，用层粘连蛋白、玻连蛋白或纤维连接蛋白处理的组织培养塑料和表面。细胞接种的密度范围为104至105个细胞/平方厘米，优选密度为约3×104-5×104个细胞/平方厘米。根据已有的研究(Raff等,J.Neurosci杂志,3:1289,1983；Raff等,Nature杂志,303:390,1983；神经细胞培养手册,第三版,Humana Press,Inc出版)，聚鸟氨酸或聚赖氨酸可用于涂覆培养容器。可涂覆1-40μg/ml，优选2-20μg/ml，更优选为5至15μg/ml聚鸟氨酸到培养容器。细胞粘附强度可能不同，这取决于培养容器的提供商、表面改良、样式(format)和具体批号。对于每个来源的培养容器，可使用本领域中已知的方法确定涂层材料的最佳浓度。在一些实施方式中，与10μg/ml的聚鸟氨酸或聚赖氨酸孵育两小时来涂覆容器，容器例如来自BD Falcon公司(美国，马里兰州，Sparks市)。在一些实施方式中，可与聚鸟氨酸或聚赖氨酸孵育30分钟来涂覆容器，容器例如来自Nalgen NuncInternational公司(美国，纽约州，罗切斯特市)。
从哺乳动物中枢神经系统分离的神经干细胞和/或神经祖细胞在化学上确定的无血清培养基中培养，所述培养基允许细胞扩增，不促进细胞分化(例如，分化为神经元，星形胶质细胞或少突胶质细胞)。所述培养基包括基础培养基，例如，但不限于，Dulbecco改进的Eagle培养基：营养混合物F-12，1:1(DMEM/F12)(Invitrogen公司)(例如，Iscove改进的Dulbecco培养基，RPMI-1640和Neurobasal)。基础培养基可补充各种成分以支持细胞健康和生存。这样的成分可包括，但不限于，至少0.25％非必需氨基酸[NEAA-1％溶液，含有100μM L-丙氨酸，L-天冬酰胺H2O，L-天门冬氨酸，L-谷氨酸，甘氨酸，L-脯氨酸，L-丝氨酸]，至少1.0mM的谷氨酰胺，至少0.5mM的丙酮酸，至少1％的B27补充物(Invitrogen公司)，至少0.1mM的N-乙酰半胱氨酸和/或至少10μM的β-巯基乙醇。在一些实施方式中，基础培养基可以包括NS21(Y.Chen等在J.Neurosci.Methods.,171:239,2008公开的方法)代替B27添加剂。B27添加剂含有牛血清白蛋白，转铁蛋白，胰岛素，孕酮，皮质酮，三碘-L-甲状腺原氨酸，视黄醇醋酸酯，DL-生育酚，DL-生育酚醋酸酯，生物素，亚油酸，亚麻酸，乙醇胺，亚硒酸钠，左旋肉碱，还原型谷胱甘肽，过氧化氢酶，超氧化物歧化酶，D-半乳糖和腐胺。Invitrogen公司已披露其成分，但并未透露它们的浓度。但是，原来的配方，B18添加剂，各成分的浓度已经公开。NS21是基于此信息开发的，并且公开了各梯度的浓度。在神经元培养中，它与B27添加剂一样好。此外，NS21可用于培养来自于人类胚胎干细胞的神经干细胞和少突胶质细胞祖细胞。因此，该添加剂被视为替代B27添加剂的良好候选物。在一优选实施方式中，培养基包括DMEM/F12，添加有1-4mM，更优选为2.5mM的谷氨酰胺；10-25mM，更优选为15mM的HEPES；0.5-2.0mM，更优选为1mM丙酮酸；1-4％，更优选为2％的B27添加剂；0.25-3％，更优选为1％NEAA；1-200μM，更优选为50μM 1–硫代甘油；0.1-3mM，更优选为1mM的N-乙酰半胱氨酸和/或10-100μM，更优选为55μM的β-巯基乙醇。
此外，氧气可促进神经祖细胞的分化。因此，为了减少细胞分化，细胞可培养在1-20％O2的生长环境。在一优选实施方式中，将细胞培养在培养瓶中，置于提供37℃、1-10％更优选5％的O2、5％CO2的生长环境的培养箱中。建立HFSC细胞后，评估氧气浓度的影响，但与扩增HFSC细胞的培养环境中5％O2的条件相比，20％O2条件下分化的细胞并没有增加。HFSC细胞在5％O2条件下的增长稍微快于20％O2条件。氧气可引起氧化应激并已知在啮齿类细胞中诱导p53突变。为了减少突变的风险，我们保持在5％O2条件下培养HFSC细胞。
神经干细胞和/或神经祖细胞在还含有促进增殖的生长因子的培养基中中培养，以分离细胞。培养基中可包含至少5，10，20或40ng/ml血小板衍生生长因子-AA(PDGF-AA)，至少2.5，5或10ng/ml的碱性FGF(bFGF)，和/或至少为10，25或50μM的1-硫代甘油以分离细胞。在一些实施方式中，培养基中还包括至少1，5或10ng/ml的胰岛素样生长因子-1(IGF-1)。在一些实施方式中，PDGF-AA可替换为PDGF-BB，PDGF-AB，PDGF-CC，或PDGF-DD。在一些实施方式中，bFGF可替换为成纤维细胞生长因子的其它成员(如FGF-4或FGF-9)。在一些实施方式中，IGF-1可替换为IGF-2。在一优选实施方式中，培养基中包括40-60μM 1-硫代甘油，40-200ng/ml的PDGF-AA，5-100ng/ml的bFGF，和5-100ng/ml的IGF-1以分离细胞。
分离的神经干细胞和/或神经祖细胞在还含有生长因子的培养基中培养，以在分离细胞后刺激增殖。培养基中可含有至少为1，2，或5ng/ml的血小板衍生生长因子-AA(PDGF-AA)，至少为0.5，1或5ng/ml的碱性FGF(bFGF)和/或至少10，25或50μM的1-硫代甘油以扩增细胞。在一些实施例中，培养基中还包括至少为1，2或5ng/ml的胰岛素样生长因子-1(IGF-1)。在一优选实施方式中，培养基中包括40-60μM的1–硫代甘油，5-100ng/ml的PDGF-AA，1-50ng/ml的bFGF，和5-100ng/ml的IGF-1以在HFSC细胞分离后扩增细胞。
在本发明的培养条件下生长的分离的神经干细胞和/或神经祖细胞显示出倍增时间为50-120小时。在优选实施方式中，倍增时间为约60-100小时。细胞可以在至少8，11，14或17代中保持此增殖率。这些细胞每月可扩增至少100，250，或优选为至少500倍。在优选实施方式中，使用本发明的方法培养的细胞在多于18代中显示扩增率>1。
实施例
实施例1-HFSC细胞培养和扩增；基础培养基和生长因子的确定
使用来自人类12周胎儿脊髓的HFSC细胞，该脊髓在得到捐赠者知情同意后从Advanced Bioscience Resources,Inc.(美国，加利福尼亚州，阿拉美达)获得，在初步实验中测试几种培养基和添加剂。将细胞培养于DMEM：F-12(1:1)(DMEM/F12)中(InvitrogenTM，美国，加州，卡尔斯巴德)，最初添加有2mM谷氨酰胺(InvitrogenTM)，1mM的丙酮酸(InvitrogenTM)和2％B27添加剂(InvitrogenTM)。检测各种生长因子是否能刺激HFSC细胞增长。最有效的生长因子是PDGF-AA和bFGF的组合。在PDGF-AA和bFGF存在下，细胞可以生长但显示空泡而且看起来不健康。测试若干添加剂并观察到添加1％NEAA以及2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸盐和2％B27添加剂的DMEM/F12可降低空泡和稍微增加细胞数目(数据未示出)。其他添加剂包括1mM N-乙酰半胱氨酸(Sigma-AldrichTM，美国，密苏里州，圣路易斯)和55μMβ-巯基乙醇(InvitrogenTM)似乎改善细胞的状态，但改善并不像添加NEAA那样突出(数据未显示)。因此，补充有2mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸、2％B27添加剂、1％NEAA、1mM的N-乙酰基半胱氨酸和55μMβ-巯基乙醇的DMEM/F12确定为最佳基础培养基，并用于其后的HFSC细胞培养。
人脊髓从脊柱分割15周人胎儿脊髓，除去脑膜和外周神经。然后用Accutase离解组织并洗涤，从人胎儿脊髓获得的细胞在含有以下生长培养基的培养容器中培养：DMEM/F12，含有2.5mM谷氨酰胺和15mM的HEPES，2％B27添加剂(InvitrogenTM)，1％NEAA，1.5mM的丙酮酸(InvitrogenTM)，55μMβ-巯基乙醇(InvitrogenTM)，1mM N-乙酰-L-半胱氨酸(Sigma-AldrichTM)，20ng/ml PDGF-AA(R&D Systems公司,美国明尼苏达州明尼阿波利斯)和10ng/ml bFGF(R&D Systems公司)。然后将细胞放入培养箱中，保持在37℃，5％O2和5％CO2。每天向培养基中加入bFGF(10ng/ml)。在传代中每2-3天更换培养基。根据这些初步实验，在PDGF-AA和bFGF存在下，生长的细胞并不多，许多细胞停止增殖或几周内死亡。这个结果似乎是合理的，因为表达PDGF-Rα的细胞通常少于细胞的5％。为了去除不响应PDGF-AA和bFGF的细胞，将细胞培养在超低粘附培养板(Corning Inc.，美国纽约州康宁)。响应PDGF-AA和bFGF的细胞成为球形(参考图3，微缩图A)，不响应的细胞不形成球体。对于更换培养基和传代，将球体在较低速度离心收集(300rpm收集球体，1,000rpm收集单个细胞)。9天后，收获细胞并传代到聚鸟氨酸涂层的培养容器。该阶段之后，每7-14天传代细胞。在这些早期阶段细胞显示异质形态(见图3，微缩图B和C)，许多细胞一个月内停止增殖。增殖率随着时间的推移越来越慢，细胞最终没有扩增。此外，细胞开始不健康，在其细胞质中形成空泡。
实施例2-HSCF细胞扩增的最佳生长条件的确定
如实施例1中提到，在培养基中加入PDGF-AA和bFGF能支持HFSC细胞最初足够的生长，但2次传代后的扩散速率减慢。对NT-3(R&D Systems公司)和IGF-1(Sigma-AldrichTM)进行了测试以确定它们是否可以提高HFSC细胞增殖。20ng/ml的PDGF-AA和10ng/ml的bFGF不足以刺激细胞增殖率(扩增率为<1)(参见图4)。随后加入5ng/ml的NT-3和/或10ng/ml的IGF-1增强了增殖率(扩增率变为>1)。NT-3和IGF-1的组合在第3代最有效。每个条件中获得的细胞进一步传代以确认其效果。提前收获细胞，因为细胞开始形成球体。在第4代，NT-3和IGF-1的组合恢复的增殖率下降，单独添加IGF-1在第4代最有效。NT-3和IGF-1的组合可能会导致细胞分化或形成更多的球体而在更换培养基时丢失。因此，添加IGF-1被确定为最有效的存活因子并用于随后的HFSC细胞培养。然而，HFSC细胞的增殖率在第4代的末期再次开始减缓，与接种细胞数相比细胞数减少。因此，测试另一种添加剂，1-硫代甘油是否能够提高HFSC细胞在第5代的增殖。
图5显示了1-硫代甘油在HFSC细胞增殖上的效果。初始生长因子组合(20ng/mlPDGF-AA+10ng/ml bFGF)完全不能扩增细胞(图中未示出这一数据，因为其低于可计数范围)。从第3代开始使用的生长因子组合(20ng/ml PDGF-AA+10ng/ml bFGF+10ng/ml IGF-1)比这一组合(20ng/ml PDGF-AA+10ng/ml bFGF)更有效，但无法刺激第4代后的HFSC细胞增殖(图4)。许多与脂肪酸和相关的长链烃类的生物合成和降解相关的辅因子具有硫醇。接下来在HFSC细胞上测试1-硫代甘油，因为它是一种硫醇系抗氧化剂，已有报道显示其刺激某些细胞增殖(如小鼠胚胎皮层和海马神经元，小鼠骨髓肥大细胞，人B细胞系)。此外，也测试了更高剂量的PDGF-AA(100ng/ml)是否能够弥补对生长因子反应性的下降。
在20ng/ml PDGF-AA,10ng/ml bFGF和10ng/ml IGF-1存在下加入50μM 1-硫代甘油轻微刺激了细胞增殖，但细胞数目仍然下降(扩增率<1)。此结果与1-硫代甘油不存在时，在存在10ng/ml bFGF+10ng/ml IGF-1的情况下PDGF-AA浓度增大到100ng/ml结果类似。然而，当50μM 1-硫代甘油和提高的PDGF-AA(100ng/ml)都包含在培养基中(依然有10ng/ml的bFGF和10ng/ml的IGF-1)，这两种成分似乎协同作用，显著增加了细胞数(扩增率>1)。当IGF-1从此添加物组合中消除(即总添加物为100ng/ml的PDGF-AA+10ng/ml的bFGF+50μM1-硫代甘油)，扩增率减少到<1，表明IGF-1也促进HFSC细胞增殖和/或存活。但是，如果HFSC细胞在此条件下进行培养更长时间，HFSC细胞即使在这种状态下也可能扩增。此数据表明，加入50μM的1-硫代甘油和PDGF-AA浓度增加到100ng/ml加入到10ng/ml的bFGF+10ng/ml的IGF-1中对细胞扩增是重要的。此外，IGF-1的添加可能不是必须的，但即使在50μM的1-硫代甘油和100ng/ml的PDGF-AA存在下仍然能有效增加扩增率。50μM 1-硫代甘油和100ng/mlPDGF-AA的组合以及10ng/ml bFGF+10ng/ml IGF-1用于随后的HFSC细胞培养。
在100ng/ml的PDGF-AA,10ng/ml bFGF,10ng/ml IGF-1和50μM的1-硫代甘油存在下，HFSC细胞在第6代以后进一步扩增。传代后在这些条件下细胞开始更迅速地增殖，在一个星期之内扩增了3-4倍。在这种情况下倍增时间约60-100小时。即使在8代(图3，微缩图D)、11代(图3，微缩图E)和19代(图3，微缩图F)之后，HFSC细胞仍然能够保持这种增殖状态。因此，含有100ng/ml PDGF-AA,10ng/ml bFGF,10ng/ml IGF-1和50μM的1-硫代甘油的确定的培养基被鉴定为神经干细胞和/或神经祖细胞长期扩增的最佳培养条件。
实施例3-HSCF细胞的自发分化技术
测试各种培养条件时，观察到当HFSC细胞培养时从培养基移除bFGF，许多细胞似乎分化为两极或多极细胞(指示少突胶质细胞)并很快死亡。为了避免这些细胞死亡，开发了自发分化技术。
培养基通常是每2天更换以扩增HFSC细胞，认为这对保持HFSC细胞在增殖状态是非常重要的。为加强细胞分化，本实验每3天或4天更换培养基。碱性FGF和高浓度的PDGF-AA被认为阻止HFSC细胞分化，但其对HFSC细胞生存也很重要。因此，在存在10ng/ml bFGF,10ng/ml IGF-1和具有50μM 1-硫代甘油或不具有1-硫代甘油的情况下，PDGF-AA浓度从100减少到20ng/ml。如果移除bFGF，HFSC细胞无法很好地生存。通常情况下，每天补充bFGF以保持HFSC细胞增殖状态。当停止补充bFGF，许多HFSC细胞从其集群分离，并形成了复杂的网络状突起(指示前-成少突胶质细胞和/或未成熟的少突胶质细胞)并良好存活，如图7，微缩图A和B所示。
如图7的微缩图C-F所示，这些具有蛛网状形态的process-bearing细胞对O4抗原和/或GalC抗原呈阳性，因此，认为这些细胞是前-成少突胶质细胞(O4阳性和GalC阴性)或未成熟的少突胶质细胞(O4阳性和GalC阳性)。即使在1-硫代甘油的存在下，HFSC细胞也可以分化，但当培养基中存在1-硫代甘油时过程的复杂程度看起来更简单，如图7中微缩图A和B所示。此外，其它细胞类型(如星形胶质细胞和神经元)很少观察到，HFSC细胞被认为容易仅分化成少突胶质细胞谱系细胞。这种技术使得能够观察到处于健康状态的分化的少突胶质细胞谱系细胞。
这些数据进一步表明，由于大部分的分化细胞表现少突胶质细胞的特征和类似于少突胶质细胞或前-成少突胶质细胞，本发明的培养条件尤其可用于扩增容易分化成少突胶质细胞的分离的神经干细胞和/或神经祖细胞。
实施例4-从常规神经干细胞诱导HFSC细胞
如图1所示，传统的神经干细胞被认为是HFSC细胞的前身。为确认此关系，检测了是否如先前报道的能从常规神经干细胞诱导HFSC细胞。源于人胎儿脊髓(11孕周)第二个组织样本的细胞最初在10ng/ml的EGF和10ng/ml的bFGF的存在下培养于DMEM/F12中15天以扩增传统的神经干细胞，DMEM/F12中含有2.5mM谷氨酰胺，15mM的HEPES，2％的B27添加剂，1％NEAA，1.5mM的丙酮酸，55μMβ-巯基乙醇，1mM的N-乙酰-L-半胱氨酸。最初存在许多不同类型的细胞，但在原代培养末期时，得到一些可扩增的细胞群。这些结果示于图8，微缩图A，0代第15天。第1次传代之后，在与克隆#2b相同的条件下(即，含有10ng/ml bFGF,10ng/ml IGF-1,100ng/ml PDGF-AA和50μM 1-硫代甘油的HFSCM1培养基)培养细胞至15代。
原代培养末期时获得的可扩增细胞群中的细胞形态在约第5代变得同质，细胞倾向于形成集群和球体，与克隆#2形成的类似(参见图8，微缩图B-F)。此外，该克隆可自发分化成少突胶质细胞谱系细胞(数据未显示)，显示与克隆#2b相同的免疫表型(数据未示出)以及如实施例7所述通过流式细胞术检测到显示相同的标志物表达模式。冷冻来自于该克隆的细胞用于进一步的测试(如图12)。该数据表明，HFSC细胞可以从传统的神经干细胞诱导，传统的神经干细胞被认为是HFSC细胞的前身。
认为PDGF-AA通过PDGF受体α起作用。已知这种受体被所有PDGF家族成员(PDGF-AA，PDGF-BB，PDGF-AB，PDGF-CC和PDGF-DD)激活。利用细胞克隆#2b和克隆#3，使用PDGF-BB来研究PDGF-BB是否可以替换PDGF-AA。PDGF-BB在除PDGF-AA外的相同条件下可扩增两个克隆，证明PDGF-AA可成功地被其它PDGF家族成员替换。
实施例5-最佳细胞培养成分的确定
当本申请发明人测试HFSC细胞(克隆#2b)建立后的不同的培养条件时，发明人注意到对各生长因子的剂量响应已经变化。为了分离HFSC细胞(克隆#2b)，除了50μM的1-硫代甘油外，较高浓度的PDGF-AA(100ng/ml)是必要的。该克隆变为持续增殖后，不再需要高浓度的PDGF-AA(100ng/ml)来扩增克隆。扩增率在约10-20ng/ml PDGF-AA时饱和，更高浓度的PDGF-AA(100ng/ml)对克隆增长并无额外效果。这可能是因为长期培养或连续使用1-硫代甘油。为了建立HFSC细胞克隆#2b和克隆#3，几代后使用1-硫代甘油。为了研究较高浓度的PDGF-AA的效果，在1–硫代甘油的存在下，从初始培养建立了新的克隆。此外，对bFGF和IGF-1的响应似乎分别在20ng/ml和40ng/ml饱和。当使用较高浓度的IGF-1(50-500ng/ml)时，可以看到更多的分化细胞(看起来1％左右)。因此，认为20ng/ml IGF-1对于扩增HFSC细胞是优选的。使用20ng/ml的bFGF和20ng/ml的IGF-1，与使用10ng/ml的bFGF和10ng/ml的IGF-1相比，扩增率提高了5％至10％。因此，本实验使用了20ng/ml的bFGF和20ng/ml的IGF-1。
来自第三个样品(12孕周)的HFSC细胞进行培养，以研究在鉴定出的最佳培养基成分中是否需要较高浓度的PDGF-AA，以及它们是否能在另一批次的细胞中提供类似的生长特性。细胞在与克隆#2b和#3相同的培养基(即HFSCM1培养基和50μM的1-硫代甘油)中培养，培养基中含有20ng/ml(克隆#4A)或100ng/ml(克隆#4B)PDGF-AA以及20ng/ml的bFGF和20ng/ml的IGF-1。在第1代末期，克隆#4A细胞数少于克隆#4B的三分之一(图11，微缩图A和B)。然而，在第1代后，克隆#4A开始以与克隆#4B类似的速度增殖，即使其PDGF-AA浓度低于克隆#4B。在第3代细胞形态变为均质，细胞倾向于形成集群和球体，与克隆#2b或克隆#3形成的类似(参见图10，微缩图C-F)。此外，与克隆#2B和#3一样，这些细胞可以自发地分化成少突胶质细胞谱系细胞。这一结果表明，对于分离HFSC细胞，较高浓度的PDGF-AA不是必须的(mandatory)，但是优选的，而且一旦HFSC细胞建立，较高浓度的PDGF-AA不是必要的(necessary)。此外，这种培养方法可以在另一批次细胞中提供相似的生长特性，确认了此过程是可重复的。冷冻来自该克隆的细胞用于进一步的测试。
实施例6-冻融循环后扩增的HFSC细胞恢复和生长的能力
克隆#2b的细胞在10、11、12代在8％DMSO存在下冷冻保存。11代冷冻的HFSC细胞(克隆#2B)已保藏在ATCC(保藏号PTA-12291，于2011年11月30日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，美国弗吉尼亚州20110-2209，马纳萨斯，Blvd大学，10801)。克隆#3的细胞在9代和10代也在8％DMSO的存在下冷冻保存。克隆#4A和#4B的细胞增长快于克隆#2b或#3，因此它们在相同状态下在4代和5代(克隆#4A)或3代、4代和5代(克隆#4B)在8％DMSO存在下冷冻保存。用于培养HFSC细胞的培养基(HFSCM1培养基和50μM的1-硫代甘油)同样用于冷冻HFSC细胞。其后解冻细胞并在具有10ng/ml的bFGF，10ng/ml的IGF-1，100ng/ml的PDGF-AA或20ng/ml的bFGF，20ng/ml的IGF-1，20ng/ml PDGF-AA的上述无血清HFSCM1培养基和50uM的1–硫代甘油中培养细胞。观察这些细胞发现以与冷冻前相似的速度增殖(图6，图9和图11)。冷冻的细胞用于图12-15中所示的接下来的实验。
实施例7-扩增的和未分化的HFSC细胞的表征
当实施例2的HFSC细胞在100ng/ml PDGF-AA,10ng/ml bFGF,10ng/ml IGF-1和50μM 1-硫代甘油存在下培养，它们生长为集群和/或球体，如图3，微缩图D-F所示。从集群中分离出来的分散的细胞，具有分化成少突胶质细胞的趋势，如在图3，微缩图D和E所示。即使在单个细胞状态下进行细胞传代，它们最终开始聚集并再次形成集群。他们在增殖状态的形状与少突胶质细胞前祖细胞类似(Ben-Hur等,J.Neurosci杂志,18:5777,1998；Gago等,Mol.Cell.Neurosci杂志,22:162,2003)，但并不像生长成双极形态不形成任何集群的O-2A祖细胞。虽然大鼠少突胶质前祖细胞很久以前就被报道过，但在人类中对应的细胞尚未见报道。然而，确定扩增的细胞培养物中少突胶质细胞前体细胞的精确阶段是不必要的，因为不管如何它们保持了其分化成少突胶质细胞的能力(如下所示)。
为了表征未分化HFSC细胞的免疫表型，用Accutase(创新细胞技术公司(Innovative Cell Technologies)，美国加州圣迭戈)把11-15代的细胞离解成单细胞状态并在聚鸟氨酸包被的24孔培养板生长，在存在100ng/ml PDGF-AA,10ng/ml bFGF,10ng/mlIGF-1和50μM 1-硫代甘油情况下培养3-7天。随后将细胞用4％多聚甲醛固定，然后用PBS洗涤。为了染色表面抗原如CD133，PDGF-Rα，NG2，A2B5，O4，O1，GalC和PSA-NCAM，细胞用含3％正常山羊(gout)血清(NGS)的PBS封闭并用抗体染色。对于染色细胞内抗原如Sox2,巢蛋白,Olig2,髓鞘碱性蛋白(MBP),波形蛋白,GFAP,βIII微管蛋白,神经丝蛋白-L和MAP2，在封闭前将细胞用0.1％的Triton X-100在冰冷的PBS中通透。在含有3％NGS的PBS中，以1：300(CD133/1)，1:300(PDGF-Rα)，1:600(NG2)，1:1000(PSA-NCAM)，1:1000(A2B5)，1:1000(O4)，1:1000(O1)，1:1000(Sox2)，1:200(巢蛋白)，1:200(Olig2)，1:100(GalC)，1:50(MBP)，1:500(波形蛋白)，1:1000(GFAP)，1:100(βIII微管蛋白)，1:200(神经丝蛋白-L)，1:1000(MAP2，多克隆)或1:200(MAP2，单克隆)，使用CD133/1小鼠IgG1单克隆抗体(克隆AC133，Miltenyi生物技术公司)，抗PDGF-Rα的兔多克隆抗体(Upstate公司)，抗NG2的兔多克隆抗体(Millipore公司)，抗PSA-NCAM小鼠IgM单克隆抗体(Millipore公司)，A2B5小鼠IgM的单克隆抗体(Millipore公司)，O4小鼠IgM单克隆抗体(R&D系统公司)，O1小鼠IgM单克隆抗体(Millipore公司)，抗-Sox2的兔多克隆抗体(Millipore公司)，抗-巢蛋白的小鼠IgG1单克隆抗体(Millipore公司)，抗-Olig2小鼠单克隆IgG2a抗体，抗GalC的单克隆IgG3抗体(Millipore公司)，抗-MBP大鼠单克隆IgG2a抗体(Millipore公司)，抗波形蛋白的小鼠IgG1单克隆抗体(Santa Cruz公司)，抗GFAP兔多克隆抗体(Millipore公司)，抗βIII微管蛋白的单克隆小鼠IgG1抗体(Millipore公司)，抗神经丝蛋白-L的小鼠单克隆IgG1抗体(CellSignaling公司)，抗MAP2的兔多克隆抗体(Millipore公司)和抗MAP2小鼠IgG1单克隆抗体(Millipore公司)。在4℃过夜培养后，更换含3％NGS的PBS 3次以清洗孔。在一些情况下，使用对于某些细胞表面抗原(NG2，A2B5，O4，O1和GD3)染色的活细胞以减少非特异性信号。在这种情况下，不封闭，在固定前将细胞用各一抗染色。在含有0.5％BSA的PBS中，以1:150(NG2)，1:100(A2B5)，1:200(O4)，1:100(O1)和1:200(GD3)，使用抗NG2的兔多克隆抗体，A2B5小鼠IgM单克隆抗体，O4小鼠IgM单克隆抗体，O1小鼠IgM单克隆抗体，和抗-双唾液酸神经节苷脂GD3小鼠单克隆IgG3抗体(Millipore公司)。在室温下孵育30分钟后，更换含有0.5％BSA的PBS3次以清洗孔。二抗，DyLight 488-耦合的AffiniPure山羊抗兔IgG(Fcγ片段特异性)，DyLight 488-耦合的AffiniPure山羊抗小鼠IgG(Fcγ片段特异性)，DyLight488-耦合的AffiniPure山羊抗兔IgG(H+L)，DyLight 488-耦合的AffiniPure山羊抗大鼠IgG(H+L)，DyLight 594-耦合的AffiniPure山羊抗小鼠IgG(H+L)，和/或DyLight 594-耦合的AffiniPure山羊抗小鼠IgM(μ链特异性)(所有二抗均购自杰克逊免疫研究实验室公司)以1:500稀释在室温下使用1小时。然后用PBS清洗细胞2次。使用DAPI复染细胞核。然后用带有落射荧光设备的Olympus IX81观察细胞。
大多数HFSC细胞为CD133阳性(图12，微缩图A和B)，Sox2阳性(图12，微缩图C和D)和巢蛋白阳性(图12，微缩图E和F)，指示它们是神经干细胞。大多数HFSC细胞为Olig2阳性(通常指示运动神经元祖细胞和少突胶质细胞祖细胞)(图12，微缩图G和H)，PDGF-Rα阳性(通常指示少突胶质细胞谱系细胞)(图12，微缩图I和J)，A2B5阳性(A2B5通常不存在于神经干细胞，通常见于神经胶质细胞祖细胞、少突胶质细胞祖细胞和2型星形胶质细胞上)(图12，微缩图M和N)，指示少突胶质细胞祖细胞。大多数的HFSC细胞PSA-NCAM阳性(图12，微缩图O和P)，但其表达水平有变化(PSA-NCAM通常不存在于神经干细胞，通常见于神经元祖细胞和少突胶质细胞的前祖细胞上)。未见到GFAP阳性细胞，但大部分是波形蛋白阳性(参见图12，微缩图Q和S)。至少90％的HFSC细胞对上述除GFAP外的标志物是阳性的，但精确计数是非常困难的，因为HFSC细胞往往形成集群，在固定和染色中也可以很容易地脱离培养容器。为了量化其纯度，进行流式细胞仪分析，结果如图13中所示。
此外，通过免疫组化，未分化的HFSC细胞与O4抗体染色较弱，该抗体是前-成少突胶质细胞(O4阳性，GalC阴性)和未成熟的少突胶质细胞(O4阳性，GalC阳性)的标志物，但很难区分弱染色和非特异性染色。在该细胞培养物中可以观察到一些对O4抗体呈强阳性的形态多极化的前-成少突胶质细胞，但其出现频率少于细胞总数的1％。
另外，未分化的HFSC细胞对抗-MAP2抗体弱染色，但它们的形态不像神经元。当抗体用于在血清存在下分化的细胞时，以强烈的信号和神经元形态鉴定到神经元(参见图14中的微缩图H)。没有在未分化的HFSC细胞中发现这种与MAP2的强烈信号以及神经元形态。细胞分化后微弱信号消失，所以这种染色似乎是特异的，未分化的HFSC细胞可能不是非特异性染色。
总体上说，HFSC细胞表达神经干细胞特异性标志物(CD133，Sox2和巢蛋白)和少突胶质细胞谱系细胞的特异性标志物(Olig2，NG2，A2B5，和O4)。这些数据表明HFSC细胞可能是神经干细胞和少突胶质细胞祖细胞之间的中间细胞。另外，除上述抗原外，HFSC细胞表达PSA-NCAM，指示是大鼠少突胶质细胞前祖细胞的人类对应物。
PSA-NCAM中的聚唾液酸(PSA)是长的、带负电荷、细胞表面的聚糖，具有大量水合容量来调节细胞间的距离。PSA参与成人中枢神经系统中一些与可塑性相关的反应，包括昼夜和激素模式的变化，痛苦和压力适应，以及学习和记忆方面(RutishauserNat等，Rev.Neurosci杂志,9:26,2008)。PSA在新生儿的神经系统的功能之一是少突胶质细胞祖细胞的迁移。在创伤模型中，当PSA从迁移中的O2A祖细胞移除时，O2A祖细胞的迁移被抑制(Barral-Moran等,J.Neurosci.Res杂志，72:679,2003)。PSA另一个作用是控制细胞的分化时间。PSA在发育中的轴突和少突胶质细胞前体中都有表达，在这些细胞上的表达下调与髓鞘化的启动相关。PSA也与成人中枢神经系统中与可塑性相关的反应有关。由于PSA能够调节发育和成人可塑性，因此考虑到表达PSA的细胞可在由于受伤或疾病而使组织受到了损害的情况中具有治疗价值。在创伤模型中通过疤痕观察到PSA表达区的轴突再生(在疤痕中或在嫁接的Schwann细胞上工程化的PSA表达)。HFSC细胞是内源性表达PSA的细胞，将对治疗创伤如脑损伤或脊髓损伤治疗具有同样的效果。
为了进一步表征HFSC细胞(克隆#2B)，解冻在11代冷冻的细胞，在上述生长条件下培养，每7-9天传代。然后将在13代培养9天的细胞使用以下抗体进行流式细胞术：PE耦合的抗-CD133/1小鼠IgG1单克隆抗体(克隆AC133，Miltenyi生物技术公司)，PE耦合的CD140a小鼠IgG2a单克隆抗体(克隆αR1，BD Pharmingen公司)，PE耦合的CD9小鼠IgG1单克隆抗体(克隆M-L13，BD Pharmingen公司)，PE耦合的CD44小鼠IgG2b单克隆抗体(克隆G44-26，BDPharmingen公司)，PE耦合的抗-PSA-NCAM小鼠IgM单克隆抗体(2-2B，Miltenyi生物技术公司)，PE耦合的A2B5小鼠IgM单克隆抗体(克隆105HB29，Miltenyi生物技术公司)，PE耦合的O4小鼠IgM单克隆抗体(克隆O4，Miltenyi生物技术公司)，和PE耦合的抗-NG2小鼠IgG1单克隆抗体(R&D系统公司)。简单地说，用Accutase离解之后，将细胞洗涤，重悬在冰冷的具有2mM EDTA和0.5％BSA的PBS中并保存在冰上。计数细胞数量后，使用冰冷的具有2mM EDTA和0.5％BSA的PBS调整细胞数为1x 107个细胞/ml。25μl细胞悬浮液(250,000个细胞)转移到每个1.5毫升管。然后一抗按照制造商的建议分别加入到各管中，用每个抗体的PE耦合的同种型对照来设置适当的门。在冰上孵育20分钟后，用冰冷的具有2mM EDTA和0.5％BSA的PBS洗涤细胞，并重新悬浮在固定缓冲液(BD Bioscience公司)。在冰上固定20分钟后，将细胞洗涤，再悬浮在冰冷的具有2mM EDTA和0.5％BSA的PBS中。使用FACS Canto II(BDBioscience公司)测量细胞的荧光，使用Gatelogic软件(Inivai Technologies Pty Ltd.)分析每个数据。
如图13所示，所有或大多数的HFSC细胞(克隆#2b)为CD133阳性(100％的细胞)，CD9阳性(100％的细胞)，CD140a阳性(98.8％的细胞)，NG2阳性(89.8％的细胞)，A2B5阳性(99.9％的细胞)，O4阳性(94.6％的细胞)，PSA-NCAM阳性(68.9％的细胞)，CD44阴性(0.4％的细胞呈阳性)。通过免疫组化，O4信号几乎不能和非特异性染色区别开，并且远弱于前-成少突胶质细胞和少突胶质细胞的O4信号。从流式细胞仪结果可以看到，HFSC细胞(克隆#2b)的O4信号能够与同种型对照组分开，HFSC细胞(克隆#2b)对O4抗原呈现弱阳性。HFSC细胞(克隆#3)通过流式细胞仪显示出几乎相同的表型。这些细胞为CD133阳性(98.4％的细胞)，CD9阳性(99.4％的细胞)，CD140α阳性(91.5％的细胞)，NG2阳性(63.4％的细胞)，A2B5阳性(99.8％的细胞)，O4阳性(71.6％的细胞)，PSA-NCAM阳性(74.7％的细胞)，CD44阴性(0.3％的细胞为阳性)。
实施例8–扩增的HFSC细胞在含血清培养基中的分化潜力
为了测试扩增的细胞的分化潜能，将HFSC细胞(克隆#3)传代到分离/单细胞阶段，并在含血清的培养基[少突胶质细胞的前体细胞分化培养基(OPCDM)](ScienCellTM研究实验室)中培养以刺激分化。然后细胞用抗体染色，这些抗体识别神经元(抗-βIII微管蛋白抗体，抗-神经丝蛋白-L抗体和抗-MAP2抗体)，少突胶质细胞祖细胞和少突胶质细胞[O4抗体，O1抗体，抗-GalC抗体和抗-髓鞘碱性蛋白(MBP)抗体]，和星形胶质细胞(抗-GFAP抗体)，然后使用荧光染料耦合的二抗(DyLight488，或DyLight594，Jackson ImmunoResearch公司)。使用DAPI复染细胞核。
在经过处理以刺激HFSC细胞分化之后，观察到了所有三种主要的中枢神经系统(CNS)表型。当HFSC细胞培养在含血清的培养基时，检测到βIII微管蛋白阳性细胞、神经丝蛋白-L阳性细胞、和MAP-2阳性细胞(指示神经元)。大量βIII微管蛋白阳性细胞(图14中，微缩图B)，少量细胞是神经丝蛋白-L(图14中，微缩图E)或MAP2(图14中，微缩图H)阳性。这一结果表明，其中许多是未成熟的神经元。HFSC细胞也可以分化成MBP-阳性细胞。MBP是髓磷脂的主要组分，只在成熟的少突胶质细胞表达。此数据表明，HFSC细胞有能力分化为成熟的少突胶质细胞。评价了MBP和上述神经元标志物的共定位，但仅可看到少数共定位(图14中的微缩图C，F，I)。这可能是由于神经元不成熟，因为髓鞘不会被包裹在未成熟的神经元轴突上。还评价了MBP和O4抗原的共定位(图14，微缩图J-L)。大多数MBP信号与O4抗原信号共定位，但只有一半的O4抗原信号与MBP信号共定位。这个结果是合理的，因为O4抗原在少突胶质细胞祖细胞、不成熟的少突胶质细胞和成熟少突胶质细胞表达，而MBP只在成熟的少突胶质细胞表达。这些细胞对GalC抗原也为阳性(数据未示出)，GalC抗原是不成熟的少突胶质细胞的标志物。如图14，微缩图M-O所示，还检测了GFAP阳性细胞(星形胶质细胞)和波形蛋白阳性细胞。这些数据显示，扩增的HFSC细胞是专能的，并且，因此它们可能是神经干细胞，因为取决于环境，它们能够产生三种主要的中枢神经系统细胞表型。HFSC细胞(克隆#2b)在相同条件下进行了测试，显示了与HFSC细胞(克隆#3)同样的专能性。
实施例9–扩增的HFSC细胞在无血清培养基中的分化潜力
如图5所示，在不补充bFGF的情况下通过降低PDGF-AA浓度，HFSC细胞表现出良好的分化成少突胶质细胞的潜能。然而，分化的细胞少于细胞总数的一半。如果在没有bFGF，有10ng/ml PDGF-AA和100ng/ml IGF-1的情况下，以很低的密度接种HFSC细胞(<0.5×104个细胞/平方厘米)，大多数细胞看起来都分化，但在一天之内消失。为了检验它们再分化成少突胶质细胞的潜能，认为诱导分化和长期细胞存活是非常重要的。已知环状AMP(cAMP)诱导多种细胞类型的分化。PCPT-cAMP是一种可渗透细胞的cAMP类似物，测试了其是否能够在HFSC细胞诱导分化。100μM的pCPT-cAMP能够诱导高密度HFSC细胞(3×104个细胞/平方厘米)分化，但细胞无法良好生存，即使存在100ng/ml的IGF-1。有报道显示BDNF能够增强少突胶质细胞祖细胞分化和支持分化的细胞的细胞生存。当HFSC细胞在存在10ng/ml的PDGF-AA，100ng/ml的IGF-1，100μM的pCPT-cAMP和10ng/ml的BDNF的DMEM/F12中分化时，至少多于一半的HFSC细胞分化成process-bearing细胞，所述DMEM/F12含有谷氨酰胺和HEPES，并补充有B27添加剂，N2添加剂和50μM的1-硫代甘油。由于HFSC细胞表达几种少突胶质细胞标志物，如O4或NG2，因此需要一种区分HFSC细胞和少突胶质细胞谱系细胞的新方法。根据几次试验，发明人注意到，未分化的细胞表达GD3要强于少突胶质细胞祖细胞，O4反之(图11，微缩图B和微缩图C的箭头)。当用GD3和O4染色细胞时，少突胶质细胞可以通过染色模式和它们的形态而区分出来。此外，其他类型的细胞，如神经元或星形胶质细胞也可以被识别，因为它们不表达GD3或O4抗原。图15，微缩图D显示了不同细胞类型的比例。未分化细胞占总细胞的23.5％±2.0％。少突胶质细胞祖细胞占总细胞的75.8％±2.1％。其他类型的细胞仅为0.9％±0.6％。如上所述，少突胶质细胞祖细胞相对于分化的细胞(少突胶质细胞祖细胞加上其它细胞类型)的比率为分化的细胞的99.1％±0.56％，而其他类型的细胞为分化细胞的0.9％±0.56％。此数据表明，HFSC细胞具有分化成少突胶质细胞谱系细胞的高潜能。
实施例10-通过荧光激活细胞分选(FACS)法或磁性分选法富集或选择HFSC细胞
本发明公开了HFSC细胞的表型为CD133阳性，CD140a阳性，CD9阳性，CD44阴性，PSA-NCAM阳性，A2B5阳性，O4阳性和NG2阳性。此信息可用来选择或富集HFSC细胞而不用培养。CD133是神经干细胞标志物，在祖细胞或前体细胞中不表达。CD9也用作神经干细胞的标志物，但已知有些少突胶质细胞表达CD9。PSA-NCAM和A2B5用于检测神经元限制性前体细胞或神经胶质细胞前体细胞。认为大多数神经前体细胞和祖细胞表达PSA-NCAM和A2B5或者PSA-NCAM或A2B5，应用它们富集HFSC细胞效果不怎么好，尤其是在第一和第二个三个月(trimester)。CD140a，NG2，A2B5和O4用作少突胶质前体细胞、前-少突胶质细胞(pro-oligodendroglia)和少突胶质细胞的标志物。在HFSC细胞中CD140a和NG2的表达水平比在少突胶质前体细胞、前-成少突胶质细胞、或少突胶质细胞更高，而A2B5和O4在HFSC细胞中的表达水平比在少突胶质细胞前体细胞、前-成少突胶质细胞、或少突胶质细胞少。认为应用CD140a和NG2更适合富集HFSC细胞。基于本发明上述所述信息和数据，每个标志物用来富集HFSC细胞的有效性为CD140a>NG2>CD9>CD133>A2B5>O4，PSA-NCAM，但这个顺序将因孕周而改变。
然而，单一的标志物并不足以选择HFSC细胞，两个标志物的组合可以更特异地选择HFSC细胞。神经干细胞标志物(CD133或CD9)之一和少突胶质细胞谱系标志物(CD140a，NG2)之一的结合对选择HFSC细胞是非常有效的。基于上述信息，在这些组合中对选择HFSC细胞最高效的标志物组合是CD133和CD140a，但其它组合也应该比用单一标志物选择更有效。
CD133或CD140a的出现频率通常较低(小于5％)，CD140a的出现比CD133更晚(从大约第8孕周开始表达，到大约18孕周最大)。因此，取决于孕周，既表达CD133又表达CD140a的细胞非常少(小于总细胞的1％)。如果细胞来源于15孕周或更早期的人胎儿组织，大多数CD133阳性细胞可能不表达CD140a。由于CD133阳性和CD140a阴性的细胞将在更晚表达CD140a，因此在CD133阳性细胞最初富集后，当细胞在培养HFSC细胞的相同条件下培养时，可获得HFSC细胞。

Claims (10)

1.一种分离的可扩增的人神经细胞，其中所述细胞为祖细胞或干细胞，
其中，所述细胞已在有效富集可扩增的神经细胞的条件下培养，所述条件包括，含有有效量的生长添加剂的培养基、两种生长因子和一种存活因子，其中所述两种生长因子是血小板衍生生长因子(PDGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，所述的存活因子为胰岛素样生长因子(IGF)，
所述细胞保持其分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，
其中所述细胞保持其在整个后续传代中有效分化为少突胶质细胞谱系细胞的能力，
其中所述细胞表达细胞表面抗原CD133，CD140α，A2B5和PSA-NCAM，
其中所述可扩增的人神经细胞是在不违反社会公德的情况下获取的。
2.根据权利要求1的分离的可扩增的人神经细胞，其特征在于所述细胞已在ATCC保藏，保藏号为PTA-12291。
3.根据权利要求1的可扩增的人神经细胞，其特征在于所述两种生长因子存在的浓度为至少5ng/ml的PDGF和至少2.5ng/ml的bFGF以分离可扩增的人神经细胞。
4.根据权利要求1的可扩增的人神经细胞，其特征在于所述一种存活因子存在浓度至少为1ng/ml的IGF。
5.根据权利要求1的可扩增的人神经细胞，其特征在于所述细胞可以冷冻和解冻而不失去其在整个后续传代中分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，以及其至少表达细胞表面抗原CD133，CD140α，A2B5和PSA-NCAM的能力。
6.一种体外培养可扩增的神经细胞的方法，其中所述细胞是分离自哺乳动物中枢神经系统的祖细胞或干细胞，其中所述细胞保持其分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力以及其有效分化为少突胶质细胞谱系细胞的能力，所述方法包括：
a)从人胎儿神经组织分离和离解至少一个细胞，
b)在温度为37℃，含有1-20％O2和5％CO2的气体环境中，化学定义的无血清培养基中培养细胞，所述培养基包含：
-至少5ng/ml PDGF-AA
-至少0.5ng/ml bFGF，和
-至少10μM的1-硫代甘油，
c)从b)传代细胞以获得所述表达细胞表面抗原CD133，CD140α，A2B5和PSA-NCAM的可扩增的人神经细胞，
其中人胎儿神经组织是在不违反社会公德的情况下获取的。
7.体外培养物，其包含从哺乳动物中枢神经系统获得的至少一个分离的神经细胞，其中所述分离的细胞浸没在化学定义的无血清培养基中，该培养基包含：
-至少5ng/ml的PDGF-AA，
-至少5ng/ml的bFGF，和
-至少10μM 1-硫代甘油，
其中从哺乳动物中枢神经系统获得的至少一个分离的神经细胞是在不违反社会公德的情况下获取的。
8.神经干细胞药物组合物，其包含权利要求1所述的分离的可扩增的人神经细胞。
9.神经干细胞药物组合物，其包含可扩增的神经细胞，所述可扩增的神经细胞经权利要求6的方法在体外培养。
10.一种培养基，其特征在于，所述培养基包括：
-至少5ng/ml PDGF-AA
-至少0.5ng/ml bFGF，和
-至少10μM的1-硫代甘油，优选地，所述培养基为化学定义的无血清培养基。
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