发明内容
本发明目的是提供一种药物组合物在制备预防和治疗脑卒中,特别是缺血性脑卒中的应用,通过试验证实,本发明药物组合物能显著降低局灶性脑缺血大鼠的梗塞范围,具有拮抗脑缺血损伤的作用。
本发明中药组合物是构树叶有效成分组合物,具体为木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷和芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷。
优选的,木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷和芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷重量比例为1:5-5:1。
更优选的,木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷和芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷重量比为5:1。
该组合物的比例还可以是:木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷和芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷重量比为1:1。
该组合物的比例还可以是:木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷和芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷重量比为1:5。
或者为:木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷和芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷重量比为5:1。
本发明药物组合物可以预防和治疗脑卒中,更优选的,该脑卒中为缺血性脑卒中。
本发明药物组合物中,木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷和芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷是中药构树叶的成分,可以从市场上买到,也可以根据现有技术制备,本发明使用的木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷和芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷是符合药用标准的产品,优选纯度>60%,更优选纯度>90%,最优选纯度>98%。
本发明还公开了含有上述药物组合物作为活性组分的药物制剂为胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、软胶囊剂或膏剂。
本发明中药组合物可以按常规的制剂工艺,例如,范碧亭《中药药剂学》(上海科学出版社1997年12月第1版)记载的制备工艺,制成药剂学可接受的任意常规剂型,例如胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、注射剂、冻干粉针或膏剂等。
本发明的应用中,所述中药组合物为胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、注射剂、冻干粉针或膏剂制剂中的一种,为使上述剂型能够实现,需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料,例如:填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括:淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等;崩解剂包括:淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等;润滑剂包括:硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等;助悬剂包括:聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等;粘合剂包括,淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等;甜味剂包括:糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等;矫味剂包括:甜味剂及各种香精;防腐剂包括:尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等;基质包括:PEG6000,PEG4000,虫蜡等。为使上述剂型能够实现中药药剂学,需在制备这些剂型时加入药学可接受的其它辅料(范碧亭《中药药剂学》,上海科学出版社1997年12月第1版中各剂型记载的辅料)。
脑卒中具有“发病率高、复发率高、致残率高、死亡率高以及经济负担高”的特征。约2/3的脑卒中存活者遗留有不同程度的残疾,其中70%~80%的脑卒中患者因为残疾不能独立生活。
我国已经入老龄化社会,可能有大量的中年人因卒中早死或致残,如不加以控制,我国第一个出现“井喷”甚至“海啸”的慢病就可能是脑卒中。因此,脑卒中的防治已刻不容缓。
本发明提供的药物组合物是中药构树叶的有效成分组合物,具体是木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷和芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷的组合物,经试验证实,该药物组合物可以显著地降低局灶性脑缺血大鼠的梗塞范围,具有拮抗脑缺血损伤作用。
为证实本发明药物治疗脑卒中的活性,以不同规格的组合物及单体进行了下列药理和临床试验。
动物实验
实验一:构树叶有效成分提取物“木犀草素-7-o-ß-D葡萄糖醛酸苷”(GSY-A) 对FeCl3所致的大鼠局灶性脑缺血模型作用。
实验目的
构树叶有效成分提取物“木犀草素-7-o-ß-D葡萄糖醛酸苷”对FeCl3所致的大鼠局灶性脑缺血模型有较好的改善作用,并对其起效剂量进行探索。
1 实验材料
1.1 供试品
1.1.1 名称:构树叶有效成分提取物“木犀草素-7-o-ß-D葡萄糖醛酸苷”(GSY-A),供试品号:TN-1210。 1.1.2 理化性质:黄色粉末。 1.1.3 含量及规格:本品为构树叶提取的单体化合物,纯度为98.07%。 1.1.4 来源和批号:石家庄以岭药业股份有限公司,批号:20121022。 1.1.5 供试品保管:低温冷藏。
1.2 阳性药及工具药
盐酸,石家庄市华迪化工工贸有限公司,批号:20100123。
三氯化铁,天津市永大化学试剂有限公司,批号:20100131。
水合氯醛,天津市大茂化学试剂厂,批号:20090228。
PBS粉,北京索莱宝科技有限公司,批号:P1010。
红四氮唑(TTC),国药集团化学试剂有限公司,批号:20120210。
磷酸氢二钾(K2HPO4),天津市永大化学试剂有限公司,YD20101209。
甲醛,天津市大茂化学试剂厂,批号:20101109。
生理盐水,石家庄四药有限公司,批号:120421405。
1.3 实验系统
1.3.1 动物种系:SD大鼠。
1.3.2 动物级别:SPF级。
1.3.3 动物性别和数量:84只,雄性。
1.3.4 动物年龄:约4~6周龄。
1.3.5 动物体重:180-200g。
1.3.6 动物来源:购于中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所。
1.3.7 动物合格证号及发证单位、接收日期:合格证编号0295035,许可证号SCXK(京)2009-0017,发证单位是中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所,接收日期2012年12月7日。
1.3.8 饲养条件:大鼠笼养,饲养在河北省中西医结合医药研究院新药评价中心,光照12小时/天,温度20~25℃,相对湿度40~70%。
1.3.9 检疫过程:新到的动物检疫期4天,在检疫期间观察动物饮水、摄食和健康状况,以及是否存在疾病和死亡征兆。
1.3.10 饲料:实验动物全价颗粒饲料,由军事医学科学院实验动物中心提供,生产许可证:SCXK(军)2007-005。
1.3.11 饮水:瓶装普通饮用水,动物自由饮用。每日冲洗水瓶并换水一次。
1.3.12 垫料:购自河北省实验动物中心,隔日更换。
1.3.13 标识:动物识别采用5%苦味酸标记。
2 实验方法
2.1 实验设计依据
2.1.1 采用标准:国家食品药品监督管理局颁布的《药品注册管理办法》,附件1-中药、天然药物注册分类及申报资料要求。
2.1.2 实验系统选择说明:实验性脑缺血的动物模型有多种,主要分两大类,即局灶性脑缺血和全脑缺血。但临床上局灶性脑缺血的发生率远高于全脑缺血,单支动脉阻断,尤其是大脑中动脉阻断造成的脑梗塞与人类缺血性卒中最为类似。因此引起局灶性脑梗塞的方法,以大脑中动脉阻断尤为常见。FeCl3局部浸润动脉可使血管内膜剥脱,内膜下组织暴露,通过Fe3+促发羟自由基的产生,引发脂质过氧化,损伤血管内皮,促使血小板粘附聚集并发生释放反应,激发凝血过程,导致血管内血栓形成,阻塞血管,引起脑组织缺血、缺氧,形成局灶性缺血性梗塞灶。本模型成功率高,栓塞位置固定,梗死范围稳定,重复性好,适合药物的药效学评价。
2.1.3委托单位提供资料:GSY-A,黄色粉末,为构树叶提取的单体化合物,纯度为98.07%,低温冷藏,由石家庄以岭药业股份有限公司提供,批号:20151022。
2.2 剂量与分组
GSY-A共设置5个剂量组,由低到高分别是:0.128、0.32、0.8、2、5mg/kg,另设模型对照组,根据以上剂量设置情况,将84只大鼠按体重随机分为下列6组,每组14只。
2.3 给药方法
经尾静脉注射给药。
2.4 供试品配制和保存
根据尾静脉注射体积为1ml/100g,GSY-A纯度为98.07%,计算各剂量组的配制浓度,由高到低分别是0.51、0.204、0.082、0.033、0.013mg/ml,临用前生理盐水稀释至所需浓度,0.22μm滤膜过滤除菌,每日现用现配。
2.5 供试品的给予
用一次性注射器抽取药液进行尾静脉注射,体积为1ml/100g体重,模型组尾静脉给予同体积的生理盐水,均于大脑中动脉栓塞后10min开始给药,连续给药3天。
2.6 模型制备
实验动物检疫期结束后开始模型制备,以10%水合氯醛腹腔麻醉,侧卧固定,在眼眦和外耳道中线处剪一小口,暴露颞肌,用止血钳将颞肌夹开,向两侧分开,注意不要损伤面神经。暴露鳞状骨大部分,然后在颧弓和鳞状骨前联合的前下方约2mm钻孔,在手术显微下,用小号直纹钳开约2mm直径小颅窗,显露大脑中动脉。将吸有50%三氯化铁溶液(1M盐酸溶液配制)10μl滴在小片滤纸上,敷在该段大脑中动脉处,放置30分钟后中动脉变黑去掉滤纸,用生理盐水冲洗局部组织,逐层缝合后回笼饲养,室温控制在25℃左右。
2.7 观测的指标、时间和内容
末次给药后3h,麻醉动物,断头取脑,去掉嗅球、小脑和低位脑干后,在冰箱中速冻15min,取出后行冠状切4刀分为5片。第一刀在脑前极与视交叉连线中点处,第二刀在视交叉部位,第三刀在漏斗柄部位,第四刀在漏斗柄与叶尾极之间。迅速将脑片置于1.2%TTC染液中(0.02M K2HPO4 配制),37℃避光温孵20min,取出后置于4%甲醛液中避光保存24h。正常组织经染色后呈玫瑰红色,梗塞组织呈白色。将每个脑平面投射到密度均一的铝铂上,小心挖下白色组织并称重,以梗塞组织重量占全脑重量及手术侧半脑重量的百分比作为梗塞范围(%),并以手术侧半脑梗塞范围计算各药物治疗组的抑制率(%),计算公式如下:
抑制率(%)= ×100%
2.8 相关工作人员通知
购买动物时通知动物室,在动物出现异常情况时通知病理室进行处理。
2.9 仪器系统
307-6型台式牙科钻,上海医疗器械股份有限公司齿科医疗厂。
SZ-PT体视显微镜,奥林巴斯,日本。
DT2000电子天平,常熟双杰测试仪器厂。
YP-3000电子天平,上海越平科学仪器有限公司。
AL204电子天平,METTLER POLEDO。
HZQ-F160振荡培养箱,哈尔滨市东联电子技术开发有限公司。
2.10 统计方法
数据用均数±标准差( ±s)表示,采用SPSS统计软件包,首先进行正态性检验,符合正态分布的数据,均数比较用单因素方差分析,若方差齐,两两比较采用最小显著差法,若方差不齐则采用Dunnett’sT3检验行两两比较;如不符合正态分布,则用非参数检验进行统计分析。
3 结果
梗塞范围结果:模型组手术侧及全脑梗塞范围分别为5.23%、2.67%。
与模型组比较:GSY-A的三个剂量组,即5、2、0.8mg/kg组的术侧及全脑梗塞范围均显著减少(P<0.01,P<0.05),抑制率分别为39.96、28.49、22.56%。0.32、0.128mg/kg两个剂量组的术侧及全脑梗塞范围均未见显著变化(P>0.05),抑制率分别为14.91、10.13%。
以手术侧半脑梗塞范围计算各药物治疗组的抑制率(%),并以此绘制量效曲线,,随着剂量的递增,其脑缺血的保护逐渐增强。
4 结论
本实验以三氯化铁损伤大鼠大脑中动脉制备局灶性脑缺血模型,以TTC为染色剂,观察KDZ-A静脉给药后脑梗塞范围的改变,进一步确认其脑缺血的保护作用,并探讨其量效关系。实验结果表明:GSY-A在0.8、2、5mg/kg剂量组均能显著降低局灶性脑缺血大鼠的梗塞范围,具有良好的拮抗脑缺血损伤作用,在0.32、0.128mg/kg剂量时,无显著作用,具有较好的量效关系。
5 讨论
本次实验共设置5个剂量组,由低到高分别是:0.128、0.32、0.8、2、5mg/kg,采用尾静脉注射给药,观察对脑缺血的保护作用。结果显示GSY-A在0.8mg/kg剂量及以上具有较好的脑缺血保护作用,在0.32mg/kg剂量及以下未见显著作用,且表现出良好的剂量效应关系。
此外,本次实验第一天给药时,3组40号大鼠尾静脉注射失败,将其移入模型组。
实验二:构树叶有效成分提取物“芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷”(GSY-B)对FeCl3所致的大鼠局灶性脑缺血模型作用。
实验目的
采用三氯化铁制备局灶性脑缺血大鼠模型,尾静脉注射不同剂量的KDZ-B,测算大鼠脑梗塞范围,对其起效剂量进行探索。
1 实验材料
1.1 供试品
1.1.1 名称:构树叶有效成分提取物“芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷”(GSY-B),供试品号:TN-1210。
1.1.2 理化性质:黄色粉末。
1.1.3 含量及规格:本品为构树叶提取的单体化合物,纯度大于95%。
1.1.4 来源和批号:石家庄以岭药业股份有限公司,批号:20121025。
1.1.5 供试品保管:冷冻保存。
1.2 阳性药及工具药
盐酸,石家庄市华迪化工工贸有限公司,批号:20100123。
三氯化铁,天津市永大化学试剂有限公司,批号:20100131。
水合氯醛,天津市大茂化学试剂厂,批号:20090228。
PBS粉,北京索莱宝科技有限公司,批号:P1010。
红四氮唑(TTC),国药集团化学试剂有限公司,批号:20120210。
磷酸氢二钾(K2HPO4),天津市永大化学试剂有限公司,YD20101209。
甲醛,天津市大茂化学试剂厂,批号:20101109。
生理盐水,石家庄四药有限公司,批号:120421405。
1.3 实验系统
1.3.1 动物种系:SD大鼠。
1.3.2 动物级别:SPF级。
1.3.3 动物性别和数量:84只,雄性。
1.3.4 动物年龄:约4~6周龄。
1.3.5 动物体重:180-200g。
1.3.6 动物来源:购于中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所,许可证号SCXK(京)2009-0017。
1.3.7 饲养条件:大鼠笼养,饲养在河北省中西医结合医药研究院新药评价中心,光照12小时/天,温度20~25℃,相对湿度40~70%。
1.3.8 检疫过程:新到的动物检疫期4天,在检疫期间观察动物饮水、摄食和健康状况,以及是否存在疾病和死亡征兆。
1.3.9 饲料:实验动物全价颗粒饲料,由军事医学科学院实验动物中心提供,生产许可证:SCXK(军)2007-005。
1.3.10 饮水:瓶装普通饮用水,动物自由饮用。每日冲洗水瓶并换水一次。
1.3.11 垫料:购自河北省实验动物中心,隔日更换。
1.3.12 标识:动物识别采用5%苦味酸标记。
2 实验方法
2.1 实验设计依据
2.1.1 采用标准:国家食品药品监督管理局颁布的《药品注册管理办法》,附件1-中药、天然药物注册分类及申报资料要求。
2.1.2 实验系统选择说明:FeCl3局部浸润动脉可使血管内膜剥脱,内膜下组织暴露,通过Fe3+促发羟自由基的产生,引发脂质过氧化,损伤血管内皮,促使血小板粘附聚集并发生释放反应,激发凝血过程,导致血管内血栓形成,阻塞血管,引起脑组织缺血、缺氧,形成局灶性缺血性梗塞灶。本模型成功率高,栓塞位置固定,梗死范围稳定,重复性好,适合药物的药效学评价。
2.1.3委托单位提供资料:GSY-B,黄色色粉末,为构树叶提取的单体化合物,纯度大于95%,供试品号:TN-1210。由石家庄以岭药业股份有限公司提供,批号:20151025。
2.2 剂量与分组
GSY-B设置5个剂量组,由低到高分别是:0.128、0.32、0.8、2、5mg/kg,另设模型对照组,根据以上剂量设置情况,将84只大鼠按体重随机分为下列6组,每组14只。
2.3 给药方法
经尾静脉注射给药。
2.4 供试品配制和保存
根据尾静脉注射体积为1ml/100g,GSY-B为95%,计算各剂量组的配制浓度,由高到低分别是0.5、0.2、0.08、0.032、0.013mg/ml,临用前生理盐水稀释至所需浓度,0.22μm滤膜过滤除菌,每日现用现配。
2.5 供试品的给予
用一次性注射器抽取药液进行尾静脉注射,体积为1ml/100g体重,模型组尾静脉给予同体积的生理盐水,均于大脑中动脉栓塞后10min开始给药,连续给药3天。
2.6 模型制备
实验动物检疫期结束后开始模型制备,以10%水合氯醛腹腔麻醉,侧卧固定,在眼眦和外耳道中线处剪一小口,暴露颞肌,用止血钳将颞肌夹开,向两侧分开,注意不要损伤面神经。暴露鳞状骨大部分,然后在颧弓和鳞状骨前联合的前下方约2mm钻孔,在手术显微下,用小号直纹钳开约2mm直径小颅窗,显露大脑中动脉。将吸有50%三氯化铁溶液(1M盐酸溶液配制)10μl滴在小片滤纸上,敷在该段大脑中动脉处,放置30分钟后中动脉变黑去掉滤纸,用生理盐水冲洗局部组织,逐层缝合后回笼饲养,室温控制在25℃左右。
2.7 观测的指标、时间和内容[2]
末次给药后3h,麻醉动物,断头取脑,去掉嗅球、小脑和低位脑干后,在冰箱中速冻15min,取出后行冠状切4刀分为5片。第一刀在脑前极与视交叉连线中点处,第二刀在视交叉部位,第三刀在漏斗柄部位,第四刀在漏斗柄与叶尾极之间。迅速将脑片置于1.2%TTC染液中(0.02M K2HPO4 配制),37℃避光温孵20min,取出后置于4%甲醛液中避光保存24h。正常组织经染色后呈玫瑰红色,梗塞组织呈白色。将每个脑平面投射到密度均一的铝铂上,小心挖下白色组织并称重,以梗塞组织重量占全脑重量及手术侧半脑重量的百分比作为梗塞范围(%),并以手术侧半脑梗塞范围计算各药物治疗组的抑制率(%),计算公式如下:
抑制率(%)= ×100%
2.8 相关工作人员通知
购买动物时通知动物室,在动物出现异常情况时通知病理室进行处理。
2.9 仪器系统
307-6型台式牙科钻,上海医疗器械股份有限公司齿科医疗厂。
SZ-PT体视显微镜,奥林巴斯,日本。
DT2000电子天平,常熟双杰测试仪器厂。
YP-3000电子天平,上海越平科学仪器有限公司。
AL204电子天平,METTLER POLEDO。
HZQ-F160振荡培养箱,哈尔滨市东联电子技术开发有限公司。
2.10 统计方法
数据用均数±标准差( ±s)表示,采用SPSS统计软件包,首先进行正态性检验,符合正态分布的数据,均数比较用单因素方差分析,若方差齐,两两比较采用最小显著差法,若方差不齐则采用Dunnett’sT3检验行两两比较;如不符合正态分布,则用非参数检验进行统计分析。
3 结果
梗塞范围结果见附表1:模型组术侧及全脑梗塞范围依次为5.75%、2.89%。与模型组比较:GSY-B的两个剂量组,即5、2mg/kg组的术侧及全脑梗塞范围均显著减少(P<0.01,P<0.05),抑制率分别为31.48、24.87%,余下三个剂量0.8、0.32、0.128mg/kg组的术侧及全脑梗塞范围均未见显著变化(P>0.05),抑制率分别为14.78、12.70、9.04%。
4 结论
本实验以三氯化铁损伤大鼠大脑中动脉制备局灶性脑缺血模型,以TTC为染色剂,观察GSY-B静脉给药后脑梗塞范围的改变,评价脑缺血保护作用,并探讨其量效关系。实验结果表明:GSY-B在2、5mg/kg剂量下均能显著降低局灶性脑缺血大鼠的梗塞范围,具有良好的拮抗脑缺血损伤作用,在0.8、0.32、0.128mg/kg剂量时,无显著作用。
5 讨论
本次实验共设置5个剂量组,由低到高分别是:0.128、0.32、0.8、2、5mg/kg,采用尾静脉注射给药,观察对脑缺血的保护作用。结果显示GSY-B在2mg/kg剂量及以上具有较好的脑缺血保护作用,在0.8mg/kg剂量及以下未见显著作用。
实验三:构树叶有效成分组合物对FeCl3所致的大鼠局灶性脑缺血模型作用。
实验目的
采用三氯化铁制备局灶性脑缺血大鼠模型,尾静脉注射构树叶有效成分组合物、构树叶有效成分提取物“木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷”、构树叶有效成分提取物“芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷”,测算大鼠脑梗塞范围,比较药效强弱。
1 实验材料
1.1 供试品
1.1.1 名称:构树叶有效成分组合物1(组合物1),供试品号:TN-1215-1;
构树叶有效成分组合物2(组合物2),供试品号:TN-1215-2;
构树叶有效成分组合物3(组合物3),供试品号:TN-1215-3;
构树叶有效成分提取物“木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷”(GSY-A),供试品号:TN-1211;
构树叶有效成分提取物“芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷”(GSY-B),供试品号:TN-1210。 1.1.2 理化性质:黄色粉末。
1.1.3 含量及规格:
构树叶有效成分组合物1(组合物1), 本品为构树叶提取的组合物,其中木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷和芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷重量比为5:1,木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷含量为0.70g/g,芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷含量为0.14g/g;
构树叶有效成分组合物2(组合物2), 本品为构树叶提取的组合物,其中木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷和芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷重量比为1:1,木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷含量为0.44g/g,芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷含量为0.44g/g;
构树叶有效成分组合物3(组合物3), 本品为构树叶提取的组合物,其中木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷和芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷重量比为1:5,木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷含量为0.14g/g,芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷含量为0.70g/g;
构树叶有效成分提取物“木犀草素-7-o-ß-D葡萄糖醛酸苷”,本品为构树叶提取的单体化合物,纯度为95.01%;
构树叶有效成分提取物“芹菜素-7-o-ß-D葡萄糖醛酸苷”,本品为构树叶提取的单体化合物,纯度为95%。
1.1.4 来源:石家庄以岭药业股份有限公司,
1.1.5 供试品保管:冷冻保存。 1.2 阳性药及工具药
盐酸,石家庄市华迪化工工贸有限公司,批号:20100123。
三氯化铁,天津市永大化学试剂有限公司,批号:20100131。
水合氯醛,天津市大茂化学试剂厂,批号:20090228。
PBS粉,北京索莱宝科技有限公司,批号:P1010。
红四氮唑(TTC),国药集团化学试剂有限公司,批号:20120210。
磷酸氢二钾(K2HPO4),天津市永大化学试剂有限公司,YD20101209。
甲醛,天津市大茂化学试剂厂,批号:20101109。
生理盐水,石家庄四药有限公司,批号:120421405。
1.3 实验系统
1.3.1 动物种系:SD大鼠。
1.3.2 动物级别:SPF级。
1.3.3 动物性别和数量:84只,雄性。
1.3.4 动物年龄:约4~6周龄。
1.3.5 动物体重:180-200g。
1.3.6 动物来源:购于中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所,许可证号SCXK(京)2009-0017。
1.3.7 饲养条件:大鼠笼养,饲养在河北省中西医结合医药研究院新药评价中心,光照12小时/天,温度20~25℃,相对湿度40~70%。
1.3.8 检疫过程:新到的动物检疫期4天,在检疫期间观察动物饮水、摄食和健康状况,以及是否存在疾病和死亡征兆。
1.3.9 饲料:实验动物全价颗粒饲料,由军事医学科学院实验动物中心提供,生产许可证:SCXK(军)2007-005。
1.3.10 饮水:瓶装普通饮用水,动物自由饮用。每日冲洗水瓶并换水一次。
1.3.11 垫料:购自河北省实验动物中心,隔日更换。
1.3.12 标识:动物识别采用5%苦味酸标记。
2 实验方法
2.1 实验设计依据
2.1.1 采用标准:国家食品药品监督管理局颁布的《药品注册管理办法》,附件1-中药、天然药物注册分类及申报资料要求。
2.1.2 实验系统选择说明:FeCl3局部浸润动脉可使血管内膜剥脱,内膜下组织暴露,通过Fe3+促发羟自由基的产生,引发脂质过氧化,损伤血管内皮,促使血小板粘附聚集并发生释放反应,激发凝血过程,导致血管内血栓形成,阻塞血管,引起脑组织缺血、缺氧,形成局灶性缺血性梗塞灶。本模型成功率高,栓塞位置固定,梗死范围稳定,重复性好,适合药物的药效学评价。
2.1.3委托单位提供资料:
组合物1, 黄色粉末,本品为构树叶提取的组合物,其中木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷和芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷重量比为5:1,木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷含量为0.70g/g,芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷含量为0.14g/g,供试品号:TN-1215-1,批号20151021;
组合物2, 黄色粉末,本品为构树叶提取的组合物,其中木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷和芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷重量比为1:1,木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷含量为0.44g/g,芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷含量为0.44g/g,供试品号:TN-1215-2,批号20151023;
组合物3, 黄色粉末,本品为构树叶提取的组合物,其中木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷和芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷重量比为1:5,木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷含量为0.14g/g,芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷含量为0.70g/g,供试品号:TN-1215-3,批号20150923;
GSY-A,黄色粉末,为构树叶提取的单体化合物,纯度大于95%,供试品号:TN-1211,批号:20150708;
GSY-B,黄色粉末,为构树叶提取的单体化合物,纯度大于95%,供试品号:TN-1210,批号:20150814,以上样品均由由石家庄以岭药业股份有限公司提供。
2.2 剂量与分组
在剂量为0.32mg/kg下设置5组,分别为构树叶有效成分组合物设置3组,每组组合物中木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷和芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷含量比分别为5:1、1:1、1:5,构树叶有效成分提取物“木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷”设置1组,构树叶有效成分提取物“芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷”设置1组,另设模型对照组,根据以上剂量设置情况,将84只大鼠按体重随机分为下列6组,每组14只,具体分组和剂量见附表1。
2.3 给药方法
经尾静脉注射给药。
2.4 供试品配制和保存
根据尾静脉注射体积为1ml/100g,计算配制浓度是0.032mg/ml,临用前生理盐水稀释至所需浓度,0.22μm滤膜过滤除菌,每日现用现配。
2.5 供试品的给予
用一次性注射器抽取药液进行尾静脉注射,体积为1ml/100g体重,模型组尾静脉给予同体积的生理盐水,均于大脑中动脉栓塞后10min开始给药,连续给药3天。
2.6 模型制备
实验动物检疫期结束后开始模型制备,以10%水合氯醛腹腔麻醉,侧卧固定,在眼眦和外耳道中线处剪一小口,暴露颞肌,用止血钳将颞肌夹开,向两侧分开,注意不要损伤面神经。暴露鳞状骨大部分,然后在颧弓和鳞状骨前联合的前下方约2mm钻孔,在手术显微下,用小号直纹钳开约2mm直径小颅窗,显露大脑中动脉。将吸有50%三氯化铁溶液(1M盐酸溶液配制)10μl滴在小片滤纸上,敷在该段大脑中动脉处,放置30分钟后中动脉变黑去掉滤纸,用生理盐水冲洗局部组织,逐层缝合后回笼饲养,室温控制在25℃左右。
2.7 观测的指标、时间和内容
末次给药后3h,麻醉动物,断头取脑,去掉嗅球、小脑和低位脑干后,在冰箱中速冻15min,取出后行冠状切4刀分为5片。第一刀在脑前极与视交叉连线中点处,第二刀在视交叉部位,第三刀在漏斗柄部位,第四刀在漏斗柄与叶尾极之间。迅速将脑片置于1.2%TTC染液中(0.02M K2HPO4 配制),37℃避光温孵20min,取出后置于4%甲醛液中避光保存24h。正常组织经染色后呈玫瑰红色,梗塞组织呈白色。将每个脑平面投射到密度均一的铝铂上,小心挖下白色组织并称重,以梗塞组织重量占全脑重量及手术侧半脑重量的百分比作为梗塞范围(%),并以手术侧半脑梗塞范围计算各药物治疗组的抑制率(%),计算公式如下:
抑制率(%)= ×100%
2.8 相关工作人员通知
购买动物时通知动物室,在动物出现异常情况时通知病理室进行处理。
2.9 仪器系统
307-6型台式牙科钻,上海医疗器械股份有限公司齿科医疗厂。
SZ-PT体视显微镜,奥林巴斯,日本。
DT2000电子天平,常熟双杰测试仪器厂。
YP-3000电子天平,上海越平科学仪器有限公司。
AL204电子天平,METTLER POLEDO。
HZQ-F160振荡培养箱,哈尔滨市东联电子技术开发有限公司。
2.10 统计方法
数据用均数±标准差( ±s)表示,采用SPSS统计软件包,首先进行正态性检验,符合正态分布的数据,均数比较用单因素方差分析,若方差齐,两两比较采用最小显著差法,若方差不齐则采用Dunnett’sT3检验行两两比较;如不符合正态分布,则用非参数检验进行统计分析。
3 结果
梗塞范围结果见附表1:模型组术侧及全脑梗塞范围依次为6.16%、3.15%。与模型组比较:构树叶有效成分组合物3个不同组成的组,即每组中木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷和芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷含量比分别为5:1、1:1、1:5组的术侧及全脑梗塞范围均显著减少(P<0.05,P<0.01,P<0.05),抑制率分别为40.58、47.89、33.93%,构树叶有效成分提取物“木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷”,构树叶有效成分提取物“芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷”组的术侧及全脑梗塞范围均未见显著变化(P>0.05),抑制率分别为11.36、4.22%;与构树叶有效成分提取物“木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷”组,构树叶有效成分提取物“芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷”组比较:组合物②组术侧及全脑梗塞范围均显著减少(P<0.01,P<0.05)
4 结论
本实验以三氯化铁损伤大鼠大脑中动脉制备局灶性脑缺血模型,以TTC为染色剂,观察构树叶有效成分组合物、构树叶有效成分提取物“木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷”,构树叶有效成分提取物“芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷”静脉给药后脑梗塞范围的改变,评价其脑缺血保护作用的强弱。实验结果表明:在0.32mg/kg剂量下,构树叶有效成分组合物(木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷和芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷含量比为5:1、1:1、1:5)均能显著降低局灶性脑缺血大鼠的梗塞范围,具有拮抗脑缺血损伤作用,其作用显著优于构树叶单一有效成分提取物“木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷”组,也显著优于构树叶有效成分提取物“芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷”组。
附表
结论:通过试验可知,GSY-A单独使用时,在0.8mg/kg剂量及以上具有较好的脑缺血保护作用,在0.32mg/kg剂量及以下未见显著作用,且表现出良好的剂量效应关系;GSY-B单独使用时,在2mg/kg剂量及以上具有较好的脑缺血保护作用,在0.8mg/kg剂量及以下未见显著作用。而组合物通过实验结果表明:在0.32mg/kg剂量下,构树叶有效成分组合物(木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷和芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷含量比为5:1、1:1、1:5)均能显著降低局灶性脑缺血大鼠的梗塞范围,具有拮抗脑缺血损伤作用,其作用显著优于构树叶单一有效成分提取物“木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷”组,也显著优于构树叶有效成分提取物“芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷”组。二者在经过组合之后,用量显著降低,效果却显著增加,说明组合物在进入体内后,发生了协同增效的作用,达到了意想不到的效果。
经试验证明,纯度为60%-100%的构树叶中提取的有效成分组合物,具体为木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷和芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷,均可达到试验所预期的效果,可以从市场上买到,也可以根据现有技术制备,本发明使用的木犀草素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷和芹菜素-7-o-ß-D-葡萄糖醛酸苷是符合药用标准的产品,可以用于预防和治疗脑卒中。