CN101524387A - 苦碟子注射液制备工艺及在心脑血管疾病治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

苦碟子注射液制备工艺及在心脑血管疾病治疗中的应用，是将抱茎苦荬菜碱水提取，提取液浓缩至生药量0.5－2.0g的浸膏，冷藏，滤取上清液，低温碱性醇沉二次，第一次碱性醇浓度为65－75％，pH值为7－8，温度为－10－10℃，第二次碱性醇浓度为75－80％，温度为－10－10℃，回收乙醇后过滤，滤液用碱调pH值至7－8后加入大孔树脂，用量为药液的1－10％，过滤，滤液经低温梯度冻融，制得苦碟子总酚酸提取物，再经低温速离心和双层卷式复合膜过滤后调pH值至中性，即得苦碟子注射液。本发明制得的苦碟子注射液纯度高、质量稳定，对冠心病、心绞痛和脑梗塞，疗效确切，安全可控。

Description

苦碟子注射液制备工艺及在心脑血管疾病治疗中的应用

技术领域

本发明涉及一种新的中药的提取工艺及其在药学上的应用，具体是提供一种苦碟子注射的生产方法和应用，属于中药技术领域。

背景技术

抱茎苦荬菜，俗称苦碟子、满天星等，为菊科苦荬菜属抱茎苦荬菜[Ixerissonchifolia(Bge)Hance]的两年生干燥地上部分，主产于我国东北、华北等地。《卫生部药品标准内蒙古分册》记载，抱茎苦荬菜味苦、辛，锐、凉，具开胃，解毒，接骨，去痞作用，用于不思饮食，解毒，骨折，牙痛。民间主要用于治疗阑尾炎、扁桃体炎、无名肿痛等症。

对苦碟子药材及制剂的研究近几年有了很大的发展，据文献报道抱茎苦荬菜含有黄酮、腺苷、内酯等化学成分。药理研究表明黄酮类成分是其中的主要活性成分类别之一，化学研究表明抱茎苦荬菜黄酮类成分以木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、木犀草素7-O-β-D葡萄糖苷、芹菜素7-O-β-D葡萄糖醛酸苷、芹菜素7-O-β-D葡萄糖苷以及其他数种黄酮类成分含量较高。

目前研究苦碟子有效成分的方法可归纳为以下几种：

1、先用水或醇提取，将回收溶剂后的提取物混悬于水中，分别用氯仿、醋酸乙酯、正丁醇提取，划分成几个提取部分。再用硅胶柱或高效液相半制备柱层析、分离成单组分物质。上述方法是试验室研究单一黄酮成分的常用分析方法，不适合医药工业化生产抱茎苦荬菜总黄酮提取物。

2、申请号200510082836.1的发明专利“木犀草素-7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷及其提取方法和用途”，公开了从抱茎苦荬菜药材中提取分离木犀草素-7-O-β-D吡喃葡萄糖醛酸苷的一种方法，先后采用钙-硫法得到粗黄酮提取物，再经过硅胶柱层析法和HPLC分离制备，得黄色无定型粉末。该制备方法仅仅适合实验室分析型工艺，获得的产品数量为毫微克级，且操作复杂，产品收率低，成本大，不适合工业化生产。

3、申请号200610072744.X的发明专利申请“苦碟子总黄酮及其制备方法和含它的冻干粉针与质量控制方法”。公开了苦碟子提取物的制备方法，采用反复醇液调酸调碱处理法，由于黄酮类化合物在碱性溶液中不稳定，易发生氧化和开环反应，且苦碟子中的大量弱酸性黄酮类化合物在酸性溶液中不易析出，致使收率低，大量活性成分流失。同时，该专利虽然提供了提取物木犀草素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷含量仅为8％左右，这一含量既未达到静脉注射用二类原料药的标准，即80％以上。

4、申请号200410078168.0的发明专利“一种含有抱茎苦荬菜提取物的制剂及其制备方法”，公开了一种含总黄酮成分不少于80，其中黄酮木犀草素7-O-葡萄糖醛酸不少于24，腺苷不少于0.18的抱茎苦荬菜提取物及制剂，采用的是提取液加絮凝剂或直接进行柱层析，一方面絮凝工艺操作复杂，产品收率低，且易带入非药物性杂质，另一方面，简单的水或醇处理的提取液进行柱层析，杂质含量多，影响分离效果，致使生产负荷大，而且成品含量低。

发明内容

本发明的目的是提供一种苦碟子注射液的制备方法。

本发明的另一个目的是提供该注射液，用于治疗冠心病、心绞痛和脑梗塞的用途。

虽然许多文献报道抱茎苦荬菜用于治疗心脑血管疾病的主要化学成分为腺苷和总黄酮类化合物，但是发明人经过提取分离和注射液制剂学实验证明，抱茎苦荬菜主要用于治疗心脑血管疾病的有效部位群为抱茎苦荬菜中总酚酸类化合物，简称苦碟子总酚酸，其注射液的稳定性和成品率明显优于石-硫法工艺产品。药理试验和临床观察研究结果表明，用苦碟子总酚酸提取物制成的苦碟子注射液(简称苦碟子A)与石-硫法工艺制成的苦碟子注射液(简称苦碟子B)比较，差异非常显著，P＜0.001。

采用的技术方案是：

一、本发明的苦蝶子注射液的制备方法，包括下述工艺步骤：

1、切碾制：将干燥坚实的抱茎苦荬菜药材切碾成薄片状段；

2、碱性水提取二次：用碱性纯化水提取二次，过滤，合并滤液，将滤液减压浓缩至0.5～2.0ml/g药材；

3、冷藏静置：在0-10℃温度下冷藏，静置4～12小时，分取上清液；

4、低温碱性梯度醇沉：低温碱性梯度醇沉二次，收集上清液，减压回收乙醇；

5、碱性吸附除杂质：吸附，过滤，除杂质。

6、低温梯度冻融两次，-20～10℃，低温滤过；

7、酸性条件下煮碳和高温加热絮凝：110～121℃，加热20～60min，即得苦碟子总酚酸提取物。

8、将上述制得的苦碟子总酚酸提取物低温高速离心，得苦碟子离心液，将制得的苦碟子离心液用双层卷式复合膜过滤系统过滤，滤液用注射用水稀释至规定量，灌装，在110℃～121℃温度下灭菌10～60min，即得苦碟子注射液。

上述的碱水提取二次所用的碱为NaHCO₃，Na₂CO₃，NaOH，NH₃OH中的至少一种。

上述的低温碱性梯度醇沉二次是指：第一次碱性醇浓度为65％～75％，PH值为7～8；第二次碱性醇浓度75％～80％，低温是指-10～10℃，碱性醇是指乙醇中含NaHCO₃，Na₂CO₃，NaOH，NH₃OH中的一种或几种组合物。

上述碱性吸附除杂质中的碱性是指含NaOH的pH值为7.0～8.0的水溶液，吸附是用颗粒状大孔树脂和聚酰胺吸附材料吸附。

上述的低温冻融主要是指-20～-5℃冷冻，静置12小时以上，0～10℃融化和过滤。

上述的步骤(7)所述的酸性是指含HCl的水溶液。

上述的双层卷式复合膜是指：双层是分子量或型号相同的2层膜材料叠加而成，复合是2组叠加的膜材料构成的过滤膜组件，膜是指纤维素聚砜膜，分子量为1万和8万的膜材料。

本发明可获得高纯度苦碟子总酚酸提取物，属于抱茎苦荬菜中新的有效部位群，其中酚酸性黄酮类化合物占总固体量的20％，主要以黄酮的葡萄糖醛酸苷为主，其他酚酸性化合物占总固体量的60％以上，两者总含量超过总固体量的80％以上，质量稳定，疗效确切，安全可控，符合制备中药注射剂的要求。药效学和临床试验结果表明，苦碟子总酚酸类成分制成的苦碟子注射液有明显的治疗冠心病、心绞痛和脑梗塞的药理作用。

具体实施方式

苦蝶子注射液的制备方法，包括下述步骤：

1、药材切碾制：将抱茎苦荬菜切碾制成1.0～10.0cm的片状段；

2、碱性水提取：用的碱调节PH值为7.0～9.0，所加碱性纯化水的量为药材量的10～30倍，提取2次，提取温度70～100℃，每次为20～40分钟。提取液浓缩至每1ml相当于含生药0.5～2.0g的浸膏；

3、冷藏静置：上述浸膏，于0～10℃静置4～12小时，滤取上清液；

4、低温碱性梯度醇沉二次：醇浓度分别为65％和75％，pH值为7～8，温度-10～10℃，静置8～12小时，滤过，滤液减压回收乙醇，趁冷过滤；

5、碱性吸附除杂质：将醇沉后的滤液，用碱调节pH值至7～8，加入碱性乙醇处理过的大孔树脂或者聚酰胺，用量为药液的1％～10％，搅拌20-30min，静置，过滤；

6、低温梯度冻融二次：取吸附除杂质后滤液，-20℃静置12小时以上，融化后澄清板滤过，滤液于-10℃静置48小时以上，0～10℃融化后滤过；

7、酸性条件下煮碳和高温加热絮凝：二次冻融后药液用盐酸调节pH值至4.0～6.0，煮碳，脱碳，于110℃～121℃，加热20～60min，即得苦碟子总酚酸提取物；

8、将制备的苦碟子总酚酸提取物进行低温高速离心：取苦碟子总酚酸提取物，于-10～10℃，5000～15000r/min，离心10～30min，分取离心液；

将离心液用双层卷式复合膜过滤系统过滤，滤液调节pH值至中性，灌封。

灌封后，优选110℃(60min)，115℃(30min)，116℃(25min)，120℃(10min))中的一种进行高温灭菌，确保F₀≥8.0，即得苦碟子注射液。

本发明的百分比浓度为质量百分比浓度。

本发明的苦碟子注射液的制备方法及其应用其优点在于：

(1)传统抱茎苦荬菜提取及苦碟子注射液生产为石-硫法：取抱茎苦荬菜，加水煎煮，浓缩，加氧化钙乳调节pH值至10，离心，沉淀物悬浮于乙醇中，加硫酸溶液调节pH值至3～4，离心，离心液加40％氢氧化钠溶液中和pH值至7.0，滤过，滤液回收乙醇，置-5℃以下放置，滤过，滤液置-5℃以下放置，滤过，稀释，用微孔滤膜滤过，灌封，在105℃灭菌45分钟，即得。

(2)新的抱茎苦荬菜提取及苦碟子注射液生产工艺包括：药材切碾制，碱性水提取二次，浓缩，冷藏，低温碱性梯度醇沉，碱性吸附除杂质，低温梯度冻融，酸性条件下煮碳和高温加热絮凝，低温高速离心，双层卷式复合膜过滤系统过滤，稀释，灌封，高温灭菌。

改进后的方法与传统方法相比较：

1、中间体中苦碟子酚酸性成分研究

取同一批抱茎苦荬菜药材，切碾成段，混匀，测定药材的阿魏酸、蒲公英素-B和总酚酸的含量，再分成12等份，每份500g，分别按石-硫法(简称苦碟子B法)和苦碟子总酚酸制备方法(简称苦碟子A法)方法工艺操作，制成中间体，滤过，滤液进行含量测定，结果见表1-1。

表1-1不同工艺提取物的含测结果

2、中间体质量检查

分别取两种工艺制备的苦碟子注射液中间体，加注射用水稀释至相同浓度，相当于1ml/g药材，分别按照中国药典2005年版一部附录中药注射剂要求检测，结果见表2.

表2-1不同工艺中间体的检测结果

3、苦碟子注射液成品质量检测

取同一批抱茎苦荬菜药材，分别按照石-硫法和总酚酸法工艺操作，经提取，精制，稀释，灌封和灭菌，制成苦碟子注射液成品，按照中国药典2005年版一部附录中药注射剂要求检测，结果见表3-1。

表3-1不同工艺成品的检测结果(3批统计结果)

4、药理及临床对比试验

本制剂与类似药物在功效上有以下不同点：

(1)犬心肌缺血试验研究

主要药效学试验是比较总酚酸法苦碟子注射液与石-硫法苦碟子注射液产品在治疗冠心病、心绞痛和脑梗塞的作用，为深入研究抱茎苦荬菜的活性部位群总酚酸和药理作用，临床用药提供实验依据，为苦碟子注射液工艺创新，为持续提高苦碟子注射液的有效性和安全性提供实验依据。见表4-1-1～4-1-2。

(2)犬心脏血流动力试验研究

观察苦碟子总酚酸静脉滴注给药后对麻醉犬心脏血流动力学的作用。见表4-2-1～4-2-4)。

(3)对麻醉犬脑血流量的影响  见表4-3-1。

(4)临床试验

采用随机双盲法分组、分阶段对照，进行临床观察，结果见表4-4-1～4-4-3。

[实验例1]犬心肌缺血试验

实验目的：

通过主要药效学试验，比较总酚酸法和石-硫法生产的苦碟子注射液的药理作用，苦碟子注射液工艺研究提供实验依据。

1、实验材料

1.1药品与试剂

总酚酸法苦碟子注射液(简称苦碟子A)为浅黄棕色液体，规格为10ml/支，静脉滴注，生药含量为1g/ml，成人日用量为20ml/60kg，批号：080712。临用前用0.9％的氯化钠注射液配成所需浓度。

石-硫法苦碟子注射液(简称苦碟子B)为黄棕色液体，规格为10ml/支，静脉滴注，生药含量为1g/ml，成人日用量为20～40ml/60kg，批号：080518。临用前用0.9％的氯化钠注射液配成所需浓度。

1.2动物

试验用犬25只，由沈阳药科大学试验动物中心提供，体重7.5-10.0kg，雌雄兼用。

1.3仪器

SLY-808智能化八道生理记录仪  上海科科医学模型有限公司

752型紫外可见分光光度计，上海分析仪器厂

2、实验方法与结果

对麻醉犬冠脉结扎所致心肌梗塞的影响

取试验用犬25只，♀

兼用，体重7.5-10kg。随机均分为五组。(1)伪手术组：生理盐水1.0ml/kg；(2)模型组：生理盐水1.0ml/kg；(3)石硫法组：苦碟子注射液1.0ml/kg；(4)总酚酸法组小剂量组：0.5ml/kg；(5)苦碟子总酚酸大剂量组：1.0ml/kg。由前肢隐小静脉用3％戊巴比妥钠1ml/kg麻醉后，固定于手术台上。于左侧第四、五肋间开胸，暴露心脏，并接人工呼吸机。分离右侧股动脉、股静脉，股动脉插管测量动脉压(BP)和心率(HR)，股静脉插管以备静脉滴注药物.打开心包膜，缝于胸壁，做成荷包摇篮。用0号丝线结扎左冠状动脉前降支上中1/3处，伪手术组只穿线不结扎。选择梗塞区附近位置10个标测点缝置心外膜电图电极，并在远离梗塞区选一对照点，用八道生理记录仪胸导联标测心外膜电图(EECG)。结扎15min后给药。记录缺血前、缺血15min和给药后15、30、60、120、180min的EECG、血压(SAP、DAP、MAP)、心率(HR)。统计各标测点EECG的ST段偏移∑-ST，以及ST段抬高≥2mv以上的N-ST。各组给药180min后，股静脉取血，测定血清CPK、LDH、MDA、SOD值。取血后立即取出心脏，用生理盐水洗去血液后，称取心室重量，并把心室横切成5片，置于37℃0.25％NBT溶液中染色15min，剪去各心肌片被染色的非梗塞区，把未染色的梗塞区心肌称重，除以全心重或心室重分别得到梗塞范围占全心重或占心室重的％。

结果见表4-1-1一表4-1-2。

表4-1-1对麻醉犬冠脉结扎所致心肌梗塞CPK、LDH、MDA、SOD的影响(x±s)

注：n＝5，Student-t检验；各组与模型组相比：^*p＜0.05，^**p＜0.01；

各组与伪手术组相比：#p＜0.05，##p＜0.01。

表4-1-2苦碟子总酚酸对麻醉犬冠脉结扎所致心肌梗塞范围的形响(X±S)

注：n＝5，Student-t检验，各组与模型组相比：^*p＜0.05，^**p＜0.01；各组与伪手术组相比：^#p＜0.05，^##p＜0.01。

3、实验结果表明：苦碟子A二个剂量组及苦碟子B组静脉给药均明显减轻心肌缺血程度；能减少血清中CPK、LDH、MDA释放，增强SOD活性，与模型组比较差异显著(P＜0.05、0.01)；并能缩小心肌梗塞范围(P＜0.05、0.01)，减慢因缺血而致的心率加快(P＜0.05、0.01)。提示苦碟子A对冠脉结扎所致狗心肌缺血有明显的改善作用，且作用优于苦碟子B。

[试验例2]犬心脏血流动力学研究

实验目的：观察苦碟子总酚酸静脉滴注给药后对麻醉犬心脏血流动力学的作用。

1实验材料

1.1苦碟子A：含生药材1g/ml，pH＝6.55；苦碟子B：含生药材1g/ml，pH＝7.10；

1.2杂种家犬：健康，共20只，

♀兼有，体重6～10kg，由沈阳药科大学实验动物中心提供。

1.30.9％氯化钠注射液：250ml/瓶，批号080416。沈阳志鹰制药厂生产；

SLY-808智能化八道生理记录仪  上海科科医学模型有限公司

1.6MFV一3200型电磁血流量计，日本光电公司生产。

2实验方法

取健康杂种家犬20只，随机分为4组，每组5只，

♀兼有，分别为生理盐水(NS)对照组、苦碟子B对照组及苦碟子总酚酸大、小剂量组。犬称重后，腹腔注射戊巴比妥钠30mg/kg进行麻醉，并仰位固定于犬手术台上。剪去颈、胸部及右后肢内侧的毛，并用碘酒和75％酒精消毒剪毛区。切开颈部皮肤，分离气管，进行气管插管，并接动物人工呼吸机。分离颈总动脉，并插入动脉插管，用充满含肝素钠25u/ml生理盐水(NS)的导管液导接通TP一400T型压力换能器，由AP一641G型血压放大器记录血压(收缩压SAP、舒张压DAP、平均动脉压MAP)，定标灵敏度为13.33kPa(100mmHg汞柱)/cm。分离右侧股静脉，以备输液和给药。在左侧第四肋间横向切开皮肤，分离肋间肌。用开胸器撑开胸腔切口，暴露心脏，切开心包膜，做心包摇篮。开动人工呼吸机(20--25次/min)，分离于升主动脉根部，放置适宜直径的电磁血流量计的探头，由电磁血流量计记录心输出量(C0)。左心室心尖部插入导管至左心室腔内测量心室内压(换能器为TP一400型，放犬器为AP一601型)，定标灵敏度为13.33kPa/cm。并将信号输入AD一601G型放大器放大后记录左心室舒张末期压(LVEDP)，输入即一601G型微分器记录左心室内压最大上升速率。于冠脉第一、第二分支间分离冠状动脉，放置适宜探头测量冠脉流量(CAF)，并于犬四肢皮下插入针状电极，记录II导联心电图，测量心率(HR)。上述测量信号均输入RM--6000型八道生理记录仪记录、描记，同时将心输出量、心电、血压及心室内压的电信号同步输入微机的生物医学生理信号处理系统进行记录、处理，并由微机处理后读出心室内压峰值(LVSP)、舒张末期压(LVEDP)、心室内压最大上升速率及一个周期心室内压曲线下积分的面积。最后，按文献^[1]的公式和方法计算心脏指数(CI)、每搏输出量(SV)、心搏指数(SI)、左室作功指数(LVWI)、血管总外周阻力(TPVR)及反应心脏耗氧情况的TTI等参数。

手术完成后稳定20min左右，待所记录的各指标稳定后，记录上述指标作为给药前的正常值，然后于股静脉滴注给药，大剂量组的剂量为3g生药/Kg，中剂量组为2g生药/Kg，小剂量组为1g生药/Kg，均将药物混入100ml的NS输液中，约在15min内滴完。空白对照组仅滴入100ml的NS输液：阳性药组给予葛根素注射液50mg/Kg，给药方法同苦碟子给药组。记录并计算给药后5、10、20、30、60、120、180min的上述各血流动力学指标，结果进行给药前、后的配对t一检验统计学处理。

3.实验结果(详见表4-2-1～4-2-4)

表4-2-1空白对照组犬的心脏血流动力学指标变化情况(X±S n＝5)

注：与给药前比较.★：P＜0.05。

表4-2-2苦碟子B组犬的心脏血流动力学指标变化情况(X±S n＝5)

注：与给药前比较。^*：P＜0.05

表4-2-3苦碟子A组(0.5ml/kg)犬的脏血流动力学指标变化情况(X±S n＝5)

注：与给药前比较，^*：P＜0.05，^**：P＜0.01。^***：P＜0.001。

表4-2-4苦碟子A组(1.0ml/kg)犬的心脏血流动力学指标变化情况(X±S n＝5)

注：与给药前比较，^*：P＜0.05，^**：P＜0.01，^***：P＜0.001.

由表4-2-1可知，对照组麻醉犬手术后10min即引起持续性心率增加(与滴注NS前比较，P＜0.05～0.001)；心脏每搏输出量、心搏指数和心室内压最大上升速率随时间呈下降趋势，在2～3h时则有明显下降(P＜0.05)其余的血流动力学指标则无显著性改变。

由表4-2-2～表4-2-4可知，苦碟子A静脉滴注给药后，麻醉犬的心率无显著性增加(与给药前比较，P＞0.05)，表明苦碟子A可抑制因手术引起的犬心率增加，且给药后5min，即引起麻醉犬的CAF明显增加，并呈一定的剂量依赖性，大剂量组在给药后120min内均有明显增加(P＜0.05～0.001)，3h时亦有增高，但无统计学差异。中剂量组在30min内CAF显著升高(P＜0.05～0.001)，而苦碟子B组的作用仅维持了约20min。大、中剂量组给药后有短时间的心输出量明显增加(P＜0.05～0.01)，作用仅维持了10～60min。另外，大剂量组的LVSP、CI和LTWI在给药后10min内明显升高(P＜0.05～0.01)；中剂量组的CI、SV在给药后的20～30min内明显增高，TPVR则有明显的下降(P＜0.05～0.001)。苦碟子B静脉滴注给药后，1h内麻醉犬的CAF显著上升(P＜0.05～0.001)，CO、LVSP、±dp/dt max、LVWI在给药后10～20min内也有明显上升(P＜0.05)，但犬的心率有增加，在给药后1～2h时有显著增加(P＜0.05)。

综上所述证明，苦碟子A给药后能抑制麻醉犬手术后心率增快，显著增加冠脉流量和心输出量，心脏指数、每搏心输出量和左室作功指数也有明显增加，而血管外周阻力则明显下降，表明能扩张外周血管，增强心功能。这样，能调整缺血心肌的供一需平衡，使心脏血流供应得到改善，有利于保护缺血心肌，减轻心脏缺血症状，且其作用优于苦碟子B。

[试验例3]对麻醉犬脑血流量的影响

1、材料

1.1药品：苦碟子注射液A，10ml/支，自制；0.9％氯化钠注射液(250ml/瓶)，由沈阳志鹰制药厂生产，批号：0805230301；苦碟子注射液B，10ml/支，自制，批号：20080603。

1.2实验动物试验用犬，体重6-11kg，雌雄兼用。动物由沈阳药科大学大学实验动物中心提供。

1.3实验仪器：SLY-808智能化八道生理记录仪上海科科医学模型有限公司。

MFV一1200型电磁流量计。

2、试验方法：取杂种犬18只，体重7-11kg，雌雄各半，随机分成3组，每组6只。分组为：(1)溶媒对照组(1.0ml/kg)；(2)苦碟子注射液A组(1.0ml/kg)；(3)苦碟子注射液B组(1.0ml/kg)。实验时用3％戊巴比妥钠30mg/kg，后腿外隐静脉注射麻醉犬，分离左颈总动脉，沿颈总动脉再向胸锁乳突方向分离出左椎动脉，另行分离出左侧颈内动脉，分别在颈内动脉和椎动脉套上直径适宜的卡式探头并连接于MFV一1200型电磁流量计测量颈内动脉和椎动脉血流量。各指标均同步记录于SLY-808智能化八道生理记录仪并输入到PowerLab 8Sp数据采集与处理系统处理。手术完成后静脉注射肝素10mg/kg使动物全身肝素化。平衡约30min，待所观察各项指标稳定后，各组动物静脉滴注给药(40滴/min)，容量5.4ml/kg。分别记录给药前及给药后15、30、60、90、120和180min各指标值。

实验结束后，取出犬脑称重，以颈内动脉血流量与椎动脉血流量之和再除以1/2脑重作为脑血流量，计算每100g脑重的脑血流量和脑血管阻力(平均动脉血压/脑血流量)，并求出各指标变化百分率Δ％[(给药后值一给药前值)/给药前值]×100％。

统计学处理所有数据以均数±标准差(X±S)表示，采用t检验处理数据。

表4-3-1对麻醉犬脑血流量的影响(X±S n＝6)

注：与溶媒对照组比较，^*：P＜0.05，^**：P＜0.01，^***：P＜0.001；与苦碟子注射液B组比较，#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001.

表4-3-1结果显示，在给药后30-180min时，苦碟子注射液A(1.0ml/kg)和苦碟子注射液B组犬脑血流量与溶媒对照组相比，有显著性差异；脑血流量在给药后30-180min与溶媒对照组相比有显著性差异，P＜0.01或P＜0.001。苦碟子A组与苦碟子B组比较，差异非常显著，P＜0.001，即苦碟子A组能明显增加麻醉犬脑血流量，且明显优于苦碟子B。

[试验例4]双盲双模拟临床疗效试验

我们在2008年9～12月期间，采用随机双盲法分组、分阶段对照，进行临床观察，现总结如下。

1、病例选择与分组

1.1病例选择：男性40岁以上，女性45岁以上，65岁以下，符合以下条件之一而疼痛发作每周至少3次以上者。

1.2分组：将选择的112例，随机分为甲、乙两组，进行双盲法治疗。揭盲后，对苦碟子A和苦碟子B心绞痛病情程度进行了比较。两组心绞痛类型与轻重分级见表4-4-1。表明其心绞痛程度大致相同，有可比性。

2、纳入病历标准

2.1心绞痛典型，平时或疼痛发作时心电图呈心肌缺血改变或运动试验阳性者。

2.2心绞痛症状虽不典型，但心电图诊断明确者。

3、治疗与观察方法：

3.1两组患者均经门诊或住院观察，并详细填写观察病历。

表4-4-1心绞痛类型与轻重分级(例)

经统计学分析表明，两组病例在心绞痛类型与轻重分级方面没有差异，P＞0.05。

3.2将苦碟子注射液A(主要含有苦碟子总酚酸类成分)和苦碟子注射液B(传统的石-硫法制备，主要含有黄酮类似物)。两者外包装与剂量完全相同，用法均为每次20ml，一日1次，14天为一疗程。用药期间停用其他抗心绞痛药物，只允许心绞痛发作时含硝酸甘油片。用药前，两组均作心电图(如休息心电图正常，必要时作运动试验)、肝功能、血、尿常规检查。疗程结束时，分别复查上述项目，疗程全部结束后，先评定疗效、最后揭盲，进行汇总，对号分析和总结。

3.3疗效评定与心绞痛分级按冠心病普查预防座谈会修订的“心绞痛症状疗效评定标准”进行。

4、临床疗效

4.1心绞痛疗效

心绞痛分级与心绞痛疗效，结果见表4-4-2。

表4-4-2心绞痛轻重与疗效(例)

4.2心电图变化

心电图治疗前后变化，结果见表4-4-3。

表4-4-3不同疗程心电图变化

心电图不正常的93例，用苦碟子A与苦碟子B治疗后心电图总有效率分别为64.5％与34.4％，两者相比，差异非常显著(P＜0.001)。

5、结论

5.1以上临床试验证明，苦碟子A的临床疗效明显由于苦碟子B，且苦碟子A对冠心病患者的心电图疗效显著，尤其对中重度患者疗效更优。

5.2苦碟子A在临床观察过程中未见任何不良反应，临床前后肝、肾、心电图、血压、血、尿常规检查未见异常，且在临床观察期间未见过敏反应。

Claims (6)

1、苦蝶子注射液的制备方法，包括苦碟子总酚酸的制备和苦碟子注射液的配制，即将干燥坚实的抱茎苦荬菜药材切碾成1-10cm的薄片状段、碱性水提取、冷藏、滤过、碱性低温醇沉、碱性吸附除杂质、低温梯度冻融两次、酸性条件下煮碳、高温加热絮凝、低温高速离心和双层卷式复合膜过滤工艺步骤，其特征在于：

所述的碱性水提取工艺步骤是将切碾成1-10cm的药材放入容器内；将水用碱调节pH值为7.0-9.0后加入到容器内，加入量为药材量的10-30倍，提取两次，提取温度为70-100℃，每次为2040分钟，提取液浓缩至每1ml相当于含生药0.5-2.0g的浸膏；

所述冷藏工艺步骤，是将制得的浸膏在0-10℃下静置4-12小时，滤取上清液；

所述的碱性低温醇沉工艺步骤，是将制得的浸膏经冷藏工艺步骤制得的上清液进行低温碱性梯度醇沉二次，第一次碱性醇浓度为65-75％，pH值为7-8，温度为-10-10℃，静置8-12小时过滤；第二次碱性醇浓度为75-80％，温度为-10-10℃，静置8-12小时，过滤，合并滤液，滤液减压回收乙醇，趁冷过滤；

所述碱性吸附除杂质工艺步骤，是将醇沉后的滤液，回收乙醇后，用碱调节pH值至7-8，加入碱性乙醇处理过的大孔树脂或聚酰胺，用量为药液的1-10％，搅拌20-30min，静置，过滤；

所述低温梯度冷融工艺步骤，是将上述经大孔树脂或聚酰胺吸附除去杂质后的滤液，在-20--5℃温度下冷冻，静置12小时以上，再在0-10℃温度下融化后过滤，得苦碟子滤液；

所述酸性条件下煮碳和高温加热絮凝工艺步骤，是将两次冷融后药液用盐酸调节pH值至4-6，煮碳，脱碳，于110-121℃加热20-60min，即得苦碟子总酚酸提取物；

所述低温高速离心和双层卷式复合膜过滤工艺步骤，是将制得的苦碟子总酚酸提取物在-10～10℃温度下，以5000-15000r/min高速离心10-30min，得苦碟子离心液，苦碟子离心液用注射用水稀释至规定量后，用双层卷式复合膜过滤，滤液调节pH值至中性，灌装，在110-121℃下灭菌，即得苦碟子注射液。

2、根据权利要求1所述的苦蝶子注射液的制备方法，其特征在于所述碱性水提取中所用的碱为NaHCO₃，Na₂CO₃，NaOH，NH₃OH中至少一种。

3、根据权利要求1所述的苦蝶子注射液的制备方法，其特征在于所述的碱性醇，是指乙醇中含NaHCO₃，Na₂CO₃，NaOH，NH₃OH中至少一种。

4、根据权利要求1所述的苦蝶子注射液的制备方法，其特征在于所述低温碱性梯度冷融，是在-20℃温度下，静置12小时以上，融化后澄清板过滤，滤液于-10℃温度下静置48小时以上，0-10℃融化后过滤。

5、采用权利要求1所述的苦蝶子注射液的制备方法，其特征在于所述的双层卷式复合滤膜的滤膜是用分子量1万-8万的超滤膜；所述灭菌温度为115℃，灭菌时间为30min；灭菌温度为120℃，灭菌时间为10min。

6、根据权利要求1所述的苦碟子注射液，其特征是经药理和临床研究证明，可用于冠心病、心绞痛和脑梗塞的治疗。