CN113599495A - 组合物及其在制备治疗视网膜色素变性的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及组合物及其在制备治疗视网膜色素变性的药物中的应用。本发明提供了枸杞糖肽和木犀草素联用在制备防治感光细胞病变相关疾病的药物中的应用。研究表明，相对于单独用药，LbGP与Luteolin联合给药能够更显著性的提升RP模型小鼠视网膜感光细胞的存活率，更显著改善小鼠的视觉行为，保护RP模型小鼠视网膜的结构。

Description

组合物及其在制备治疗视网膜色素变性的药物中的应用
本申请要求于2021年06月04日提交中国专利局、申请号为202110625734.9、发明名称为“组合物及其在制备治疗视网膜色素变性的药物中的应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及组合物及其在制备治疗视网膜色素变性的药物中的应用。
背景技术
视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)是一种感光细胞退变导致视觉丧失的严重疾病，是全球主要致盲性眼科疾病。RP主要是有遗传突变导致的，表现为视杆细胞先死亡，随后视锥细胞也接着死亡，患者失明。
视网膜神经元主要分为三层，包括位于外核层的视锥和视杆细胞，内核层的双极细胞、水平细胞和无长突细胞，以及节细胞层的节细胞。光从瞳孔进入视网膜后，先穿过整个视网膜到达感光细胞层(包括视锥和视杆两类)，光转化为电信号，电信号再从感光细胞传递到双极细胞，再传递到节细胞，节细胞的轴突形成视神经，将电信号向大脑传输，产生视觉。
已有研究人员使用视网膜退化小鼠模型(rd1，rd10小鼠)试验，rd1，rd10小鼠中PDE6β酶缺失或者功能障碍，导致视杆细胞凋亡，进而视锥细胞退变。其中rd1小鼠PDE6β酶完全缺失，感光细胞退变过程非常迅速，大概在出生后第8天感光细胞开始退变，到出生后21d感光细胞几乎完全凋亡；而rd10小鼠PDE6β酶并未完全缺失，只是功能出现障碍，因此感光细胞凋亡慢，变性大概在出生后17d开始，到出生后45d左右视杆完全凋亡，而视锥细胞直到180才几乎全部凋亡。而两种小鼠的视网膜内层(包括双极细胞、节细胞等)几乎完整保存下来。
目前，对于视网膜色素变性在临床上没有很好的治疗办法，因此，进一步开发具有治疗视网膜色素变性的药物具有非常重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供组合物及其在制备治疗视网膜色素变性的药物中的应用。
本发明提供了枸杞糖肽和木犀草素联用在制备防治感光细胞病变相关疾病的药物中的应用。本发明中，所述感光细胞病变相关疾病包括视网膜色素变性。
本发明以剂量为10mg/kg的木犀草素(luteolin)和100mg/kg的枸杞糖肽(LbGP)为例对两药联用的效果进行验证。
与对照组未经治疗的RP模型小鼠相比，联合灌胃LbGP与Luteolin治疗后RP模型小鼠视网膜外核层(ONL)中感光细胞存活率显著提高，在黑箱中的停留时间显著延长，视敏度明显提升；联合灌胃LbGP与Luteolin对于RP模型小鼠暗适应条件下视网膜电位的a波的幅度和b波的幅度均有所提升，并且显著改善RP模型小鼠视网膜感光细胞的结构退变及减弱视网膜Müller胶质细胞增生。
相对于单独用药，枸杞糖肽和木犀草素联用在保护感光细胞、防治视网膜色素变性方面具有更显著的优势。具体的，本发明研究中，对木犀草素给药剂量为10、50、100、110、120mg/kg条件下，对RP模型小鼠的治疗作用进行验证，以及对枸杞糖肽给药剂量为5、10、20、100、110mg/kg条件下，对RP模型小鼠的治疗作用进行验证。结果表明，相对于给药剂量为10～120mg/kg的木犀草素或给药剂量为5～110mg的枸杞糖肽，两药联用(10mg/kg的木犀草素+100mg/kg的枸杞糖肽)对视网膜色素变性的治疗效果都存在显著性的优势。另外，在其他剂量下进行两药联用效果的验证，也能获得显著性优于单独用药的效果。
本发明中，所述防治包括预防和治疗。所述两药联用包括两药分别给药，或两药同时给药。所述两药分别给药包括先枸杞糖肽再给予木犀草素，或先给予木犀草素再给予枸杞糖肽。本发明中，所述给药的方式包括灌胃或注射。具体实施例中，采用灌胃方式进行功效验证实验。
本发明中，所述防治包括：增加感光细胞层厚度、改善明暗分辨能力、提高视觉敏锐度、提高视网膜对光反应的能力、改善视网膜感光细胞的变性和/或减弱视网膜Müller胶质细胞增生。
本发明实施例中，以MNU诱导型的RP模型小鼠作为实验对象，考察两药联用的效果。
一些实施例中，所述增加光细胞层厚度主要通过保护感光细胞实现，一些具体实施例中，所述增加光细胞层厚度为增加视网膜外核层厚度。具体的，本发明研究表明，木犀草素和枸杞糖肽联用能够增加RP条件下光细胞层的厚度。
所述改善明暗分辨能力体现为，恢复实验动物在黑场停留的时间，即恢复RP模型小鼠在黑场停留的时间，使之与模型小鼠产生显著性的差异。
所述提高视觉敏锐度包括改善对精细光栅的分辨能力。具体的，木犀草素和枸杞糖肽联用能够显著改善对精细光栅的分辨能力，提高RP条件下的视觉敏锐度。
所述提高视网膜对光反应的能力包括改善视网膜电位图，具体包括提高a波和b波的振幅。具体实施例中，表现为提高RP模型动物视网膜电位中的a波振幅和b波振幅。
改善视网膜感光细胞的变性，本发明所述视网膜感光细胞包括视锥细胞和视杆细胞。所述改善视网膜感光细胞的变性包括恢复视锥细胞和视杆细胞中光敏感蛋白表达水平。具体包括恢复视网膜外段层视蛋白长度，增加视紫红质厚度。具体的，包括改善RP状态下，视网膜外段层视蛋白长度和/或视紫红质厚度。
所述减弱视网膜Müller胶质细胞增生，具体包括减弱RP状态下视网膜Müller胶质细胞增生。
本发明还提供了一种组合物，其由枸杞糖肽和木犀草素组成。
本发明中，所述枸杞糖肽和木犀草素的质量比为(10～120)：(5～20)。
本发明中，所述枸杞糖肽和木犀草素的质量比100：10。
本发明所述的组合物中，枸杞糖肽和木犀草素可以分别独立存在，也可以混合状态存在，本发明对此不做限定，其都在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种防治感光细胞病变相关疾病的药物，其包括本发明所述的组合物。
本发明所述的药物中，还包括其他治疗感光细胞病变的药物。
所述治疗感光细胞病变的药物具体为治疗视网膜病变的药物。
本发明所述的药物的剂型为口服液、注射液或滴眼液。
一些实施例中，本发明所述药物的剂型为口服液。
其中辅料包括PBS溶液。还包括pH调节剂。所述pH调节剂包括NaOH溶液或HCl溶液。
本发明还提供了一种防治感光细胞病变相关疾病的方法，其包括给予本发明所述的药物。
本发明提供了枸杞糖肽和木犀草素联用在制备防治感光细胞病变相关疾病的药物中的应用。研究表明，相对于单独用药，LbGP与Luteolin联合给药能够更显著性的提升RP模型小鼠视网膜感光细胞的存活率，更显著改善小鼠的视觉行为，保护RP模型小鼠视网膜的结构。
附图说明
图1示LbGP与luteolin联合灌胃提高RP模型小鼠感光细胞的存活率：其中，A图：四组分别为未经治疗的RP模型小鼠、单独灌胃口服LbGP的RP模型小鼠、单独灌胃口服luteolin的RP模型小鼠及LbGP与luteolin联合灌胃的RP模型小鼠视网膜冰冻切片，显示距离视乳头800um处各个核层的DAPI染色。B图：四组小鼠视网膜感光细胞核层ONL厚度统计结果；***:P＜0.001，各组样本量：MNU，N＝5；MNU+LbGP,N＝10；MNU+Luteolin,N＝6；MNU+LbGP+Luteolin,N＝19，ONL:外核层；INL：内核层；GCL：节细胞层；
图2示LbGP与luteolin联合用药明显改善RP模型小鼠辨别明暗的能力：黑白箱穿梭系统示意图(A)、小鼠在黑箱和白箱之间的穿梭轨迹图(B)及RP模型小鼠的实验结果(C)，其中C图示未经治疗的RP模型小鼠、单独灌胃口服LbGP的RP模型小鼠、单独灌胃口服luteolin的RP模型小鼠及LbGP与luteolin联合灌胃的RP模型小鼠在黑箱的停留时间，**：P＜0.01；*：P＜0.05；各组小鼠之间的数据分析采用T-test方法检验，各组样本量：MNU,N＝11；MNU+LbGP,N＝10；MNU+Luteolin,N＝6；MNU+LbGP+Luteolin,N＝13；
图3示LbGP与luteolin联合用药提高RP模型小鼠对精细光栅的空间分辨能力：视动检测系统示意图(A)及RP模型小鼠的实验结果(B)，其中，B图示未经治疗的RP模型小鼠、单独灌胃口服LbGP的RP模型小鼠、单独灌胃口服luteolin的RP模型小鼠及LbGP与luteolin联合灌胃的RP模型小鼠的视敏度(cpd)，*：P＜0.05；数据分析采用T-test方法检验，各组样本数：MNU，N＝6；MNU+LbGP，N＝6；MNU+Luteolin，N＝6；；MNU+LbGP+Luteolin，N＝6；
图4示LbGP与Luteolin联合用药显著提高RP模型小鼠视网膜对光反应：A、B图为未经治疗的RP模型小鼠、单独灌胃口服LbGP的RP模型小鼠、单独灌胃口服luteolin的RP模型小鼠及LbGP与luteolin联合灌胃的RP模型小鼠在暗适应条件下(scotopic)三种光强刺激(0.01,0.1,3cd.s/m2)下的a波b波振幅；CD图为四组实验小鼠在明适应条件下(photopic)3cds/m2和10cds/m2光强刺激下的a波b波振幅；数据分析采用T-test方法检验，***:P＜0.001；**:P＜0.01；*:P＜0.05；各组样本数：MNU，N＝9；MNU+LbGP，N＝10；MNU+Luteolin，N＝6；；MNU+LbGP+Luteolin，N＝14；
图5示LbGP与luteolin与联合用药明显改善了RP模型小鼠视网膜感光细胞的变性，保护了感光细胞的结构；其中A图为opsin染色在共聚焦显微镜下的成像，被标记的视蛋白呈绿色条状,存在于视网膜视锥细胞外段层，B图为rhodopsin染色在共聚焦显微镜下的成像，被标记的视紫红质呈红色，位于视杆细胞外段层。从左往右依次代表了未经治疗的RP模型小鼠、单独灌胃口服LbGP的RP模型小鼠、单独灌胃口服luteolin的RP模型小鼠及LbGP与luteolin联合灌胃的RP模型小鼠，C图为四组小鼠视锥细胞视蛋白平均长度以及视杆细胞视紫红质平均厚度的统计结果；数据采用T-test方法检验，***:P＜0.001；**:P＜0.01；各组样本量：MNU，N＝5；MNU+LbGP，N＝3；MNU+Luteolin，N＝3；MNU+LbGP+Luteolin，N＝5；
图6示LbGP与Luteolin联合用药显著减弱RP模型小鼠视网膜Müller胶质细胞增生：A图为GFAP染色在共聚焦显微镜下的成像，被标记的Müller胶质细胞呈绿色条状，图片从左往右依次代表了未经治疗的RP模型小鼠、单独灌胃口服LbGP的RP模型小鼠、单独灌胃口服luteolin的RP模型小鼠及LbGP与luteolin联合灌胃的RP模型小鼠视网膜冰冻切片的GFAP染色结果，B图为四组组小鼠视网膜上GFAP的平均荧光强度统计结果，采用T-Test方法检验。***:p＜0.001；*：P＜0.05；各组样本数：MNU，N＝5；MNU+LbGP，N＝3；MNU+Luteolin，N＝3；MNU+LbGP+Luteolin，N＝5；
图7示混合用药较单独用药可以显著提高MNU损伤后感光细胞存活率，该图图注标记与图1相同，其数据与图1所示并非同一批次实验获取，因此数据绝对值存在差异，在LbGP与luteolin给药剂量皆为110mg/kg的情况下，LbGP与luteolin组合物给药剂量为110mg/kg的受试组对感光细胞的保护作用，显著性由于单独给药的受试组，p<0.01；
图8示混合用药较单独用药可以显著改善视锥细胞外段层长度；该图图注标记与图5相同，其数据与图5所示并非同一批次实验获取，因此数据绝对值存在差异，在LbGP与luteolin给药剂量皆为110mg/kg的情况下，LbGP与luteolin组合物给药剂量为110mg/kg的受试组对视锥细胞的保护作用，显著性由于单独给药的受试组，p<0.01；
图9示混合用药较单独用药可以显著改善视杆细胞外段层厚度；该图图注标记与图4相同，其数据与图4所示并非同一批次实验获取，因此数据绝对值存在差异，在LbGP与luteolin给药剂量皆为110mg/kg的情况下，LbGP与luteolin组合物给药剂量为110mg/kg的受试组对视锥细胞的保护作用，显著性由于单独给药的受试组，p<0.01；
图10示混合用药较单独用药可以显著抑制Muller胶质细胞的增生，该图图注标记与图6相同，其数据与图6所示并非同一批次实验获取，因此数据绝对值存在差异，在LbGP与luteolin给药剂量皆为110mg/kg的情况下，LbGP与luteolin组合物给药剂量为110mg/kg的受试组对Muller胶质细胞的增生的抑制作用，显著性由于单独给药的受试组，p<0.01。
具体实施方式
本发明提供了组合物及其在制备治疗视网膜色素变性的药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
1、其中各供试品分别来自：
枸杞糖肽粉末(宁夏天仁枸杞生物科技股份有限公司)、木犀草素(成都曼斯特生物科技有限公公司)、DMSO(广州佰惠生物科技有限公司)、生理盐水(江西科伦药业有限公司)、复方托吡卡胺滴眼液(暨南大学附属第一医院眼科提供)、唯地息眼凝胶(暨南大学附属第一医院眼科提供)、三溴乙醇(美国sigma公司)、叔戊醇(美国sigma公司)、Triton X-100(美国sigma公司)、30％过氧化氢(广州化学试剂厂)、无水乙醇(广州化学试剂厂)、多聚甲醛(PFA)(广州化学试剂厂)、蔗糖(广州化学试剂厂)、O.C.T包埋剂(美国樱花公司)、驴血清(广州佰惠生物科技有限公司)、DAPI(Electron Microscopy Sciences)、荧光二抗488(美国life公司)、荧光二抗594(美国abcam公司)、Opsin抗体(美国Millipore公司)、PBS缓冲液粉末(广州佰惠生物科技有限公司)。
2、实验所用的仪器系统
体视显微镜(德国蔡司(ZEISS)公司)、维纳斯剪(德国蔡司(ZEISS)公司)、系线镊(苏州朗格利(集团)有限公司)、电子天平(上海天美平有限公司)、注射器(湖南医械科技有限公司)、冰冻切片机(德国莱卡(Leica)仪器有限公司)、烘片机(金华市科迪仪器设备有限公司)、-80℃低温冰箱(美国Thermo公司)、-20℃低温冰箱(青岛海尔股份有限集团)、纯水-超纯水系统(美国Millipore公司)、荧光显微镜(德国莱卡(Leica)仪器有限公司)、黑白箱系统(香港万浩科技有限公司)、ERG记录系统(德国罗兰(Roland)公司)、恒温烘箱(深圳耐美特仪器有限公司)、磁力搅拌器(上海普洋仪器有限公司)、制冰机(北京长流科学仪器公司)、PH计(意大利米克仪器有限公司)、手术灯(深圳瑞沃德生命技术有限公司)。
3、实验动物信息包括：
动物种系：化学诱导型RP模型小鼠
动物级别：SPF级
动物性别和数量：雄
动物体重：7周时体重约20g
动物年龄：7周
动物来源：化学诱导型RP模型小鼠需要后期造模，选用7周大小的C57/BL小鼠，购买于广州言诚生物科技有限公司。
饲养条件：饲养于暨南大学动物房，所有动物保证处于标准的12/12h光照周期的实验环境，并保证充足食物和水的供应。
检疫过程：所购买的小鼠均为有实验动物质量合格证的SPF级小鼠。实验小鼠购入后，按照实验动物入室标准操作规程进入隔离实验室，动物管理人员每日检查一次，检疫期为10天。
饲料：SPF级鼠粮。
饮水：纯净水。
垫料：SPF级垫料。
标识：填写笼盒标签，包括：笼号、课题组名称、负责人、试验名称、基因型、动物性别等信息。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例：
一、试验方法
1、试验分组与造模方法
1.1小鼠模型、试验准备
本次实验选用视网膜退变模型小鼠为化学诱导型RP模型小鼠，是使用MNU腹腔注射特异性诱导感光细胞凋亡，MNU诱导型的RP模型小鼠近年来已被广大中外学者所认可。
试验前的主要准备就是记录C57小鼠的身体状况和眼部状况，排除身体及眼部有异常的小鼠，而后每日以灌胃的方式给药。
1.2试验方法
选取7周大小的雄性C57小鼠,按照0.1ml/10g体重的标准灌胃，每天晚上在同一时间段给小鼠进行联合灌胃LbGP与Luteolin(100mg/kg的LbGP与10mg/kg的luteolin)，灌胃7天后，进行1％MNU(40mg/kg体重)的腹腔注射诱导视网膜损伤，损伤后继续联合灌胃LbGP与Luteolin一周，观察联合灌胃LbGP与Luteolin对RP模型小鼠的治疗效果，在灌胃14天后，进行下述各种检测：在第15天上午及下午进行黑白箱穿梭系统检测和视动系统检测。在第16天上午进行视网膜电位记录观察小鼠视网膜的对光反应能力，在第16天下午，将所有检测完成的小鼠进行视网膜取材。取小鼠视网膜冰冻切片进行DAPI染色、Opsin染色、rhodopsin染色、GFAP染色,分别观察感光细胞层厚度(主要观察及测量ONL层)、视锥细胞表达视蛋白情况、视杆细胞表达视紫红质情况、Müller胶质细胞活跃状态。
1.3剂量和分组
LbGP的剂量100mg/kg，Luteolin的剂量为10mg/kg，实验分为四组，未经治疗的RP模型小鼠(MNU)，单独灌胃口服100mg/kg LbGP的RP模型小鼠(MNU+LbGP)，单独灌胃口服10mg/kg Luteolin的RP模型小鼠(MNU+Luteolin)，联合灌胃100mg/kg LbGP与10mg/kgLuteolin的RP模型小鼠(MNU+LbGP+Luteolin)。
另进行对照实验：
LbGP的剂量110mg/kg，Luteolin的剂量为110mg/kg，实验分为三组，单独灌胃口服110mg/kg LbGP的RP模型小鼠(MNU+LbGP)，单独灌胃口服110mg/kg Luteolin的RP模型小鼠(MNU+Luteolin)，联合灌胃LbGP与Luteolin的RP模型小鼠(MNU+100mg/kg LbGP+10mg/kgLuteolin)。
2给药方法：
灌胃给药。
3供试品配制和保存
LbGP粉末由宁夏天仁公司提供，常温避光储存于干燥瓶中。配制给药剂量为100mg/kg的LbGP溶液或110mg/kg的LbGP溶液。
单独用药组LbGP的100mg/kg体重的配方如下：使用电子天平称取LbGP粉末100mg并放置于灭菌后的EP管中，加入10ml的PBS溶液，将其震荡至完全溶解，使用锡箔纸避光保存在4℃的冰箱中。药物使用前需要摇匀。
单独用药组LbGP的110mg/kg体重的配方如下：使用电子天平称取LbGP粉末110mg并放置于灭菌后的EP管中，加入10ml的PBS溶液，将其震荡至完全溶解，使用锡箔纸避光保存在4℃的冰箱中。药物使用前需要摇匀。
混合用药组中LbGP配方如下：使用电子天平称取LbGP粉末100mg并放置于灭菌后的EP管中，加入5ml的PBS溶液，将其震荡至完全溶解，使用锡箔纸避光保存在4℃的冰箱中。药物使用前需要摇匀，灌胃时将药物在针管里混合摇匀灌胃。
木犀草素(luteolin)购于成都曼斯特公司，药品粉末避光保存在4℃的冰箱中，配制给药剂量为10mg/kg的luteolin或110mg/kg的luteolin。
单独用药组luteolin的10mg/kg体重的配方如下，使用电子天平称取luteolin粉末10mg放置于灭菌后的EP管中，加入1mmol/L的NaOH 500ul,将luteolin粉末充分溶解，再加入少量PBS溶液，进行酸碱度的测定，使用1mmol/L的HCL进行酸碱度的中和，使用PH测定仪将PH调至7.2-7.4，最后加入PBS定容至10ml,使用锡箔纸避光保存在4℃的冰箱中。药物使用前需要摇匀。
单独用药组luteolin的110mg/kg体重的配方如下，使用电子天平称取luteolin粉末110mg放置于灭菌后的EP管中，加入1mmol/L的NaOH 500ul,将luteolin粉末充分溶解，再加入少量PBS溶液，进行酸碱度的测定，使用1mmol/L的HCL进行酸碱度的中和，使用PH测定仪将PH调至7.2-7.4，最后加入PBS定容至10ml,使用锡箔纸避光保存在4℃的冰箱中。药物使用前需要摇匀。
混合用药组中luteolin配方如下，使用电子天平称取luteolin粉末10mg放置于灭菌后的EP管中，加入1mmol/L的NaOH500ul,将luteolin粉末充分溶解，再加入少量PBS溶液，进行酸碱度的测定，使用1mmol/L的HCL进行酸碱度的中和，使用PH测定仪将PH调至7.2-7.4，最后加入PBS定容至5ml,使用锡箔纸避光保存在4℃的冰箱中。药物使用前需要摇匀，灌胃时将药物在针管里混合摇匀灌胃。
4供试品的给予
实验开始时，每天在同一时间段给小鼠灌胃。灌胃前先检查小鼠眼部情况，称量小鼠体重，记录体重，按照给药容量：0.1ml/10g体重的标准灌胃，灌胃7天后，在第七天行MNU腹腔注射，而后继续灌胃7天。
5观测的指标、时间和内容
5.1视觉行为-黑白箱检测
在灌胃14天后，第15天上午进行黑白箱检测。
本实验的原理是小鼠趋暗避明的特性，正常的C57小鼠趋向于待在黑箱中，而视网膜退变的小鼠丧失了明暗辨别能力，在两箱中停留的时间几乎相同。整个黑白箱装置包括封闭的黑箱与白箱、摄像头和操控软件(Noldus Etho Vision XT 8.0)。黑白箱的长宽高分别为16cm、16cm、25cm。两个箱子之间有一个门，小鼠能够通过门在两个箱子中自由穿梭，其中一个箱子无照明，为黑暗环境，故称黑箱；另外一个箱子给以照明，为明亮环境，故称白箱。黑箱与白箱之中各有一个红外摄像头，通过摄像头，我们可以记录小鼠在黑白箱中活动的状况。实验室将黑白箱摄像头与Noldus EthoVision XT 8.0软件相连，记录小鼠在黑箱和白箱活动的轨迹及在两箱中各自活动的时间，本实验每只老鼠记录5分钟。我们分析小鼠在黑箱中停留的时间占总记录时间的百分比。具体实验操作如下：
①适应和准备。把鼠放在房间适应半小时(无需暗适应)，实验开始之前使用75％酒精喷洒黑白箱系统，并以纸巾擦拭干净，避免之前实验动物残留的气味、鼠屎毛发等杂质对测试小鼠带来干扰。
②记录。打开软件，把小鼠放入白箱中，在记录前小鼠有10秒的适应时间，随后正式记录5分钟。全部测试完成后，保存和导出测试数据和图片。
③最后我们统计小鼠5分钟内在黑箱所占时间的比例。
5.2视觉行为-视动检测
在灌胃14天后，第15天下午进行视动检测。
视动检测借助于啮齿动物头部追随旋转光栅旋转的视动反射，判断动物对不同空间频率光栅的分辨能力，从而量化地评价动物高级视觉能力。小鼠提前暗适应至少3小时，实验开始之前需检查小鼠眼睛无血丝、白内障等异常情况再开展实验，实验开始时房间关灯，仅留红灯。具体操作如下：
①先打开电脑，在系统上方先打开电脑，在系统上方30cm设置一个摄像装置(手机)。实验开始之前使用75％酒精喷洒视动系统，并以纸巾擦拭干净，避免之前实验动物残留的气味、鼠屎毛发等杂质对测试小鼠带来干扰；电脑上打开MatLab软件，然后运行不同空间频率的正弦光栅(100％contrast)，空间频率包括0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35，0.4，0.45，0.5cpd；各个频率的光栅先顺时针方向旋转30s，再逆时针方向旋转30s，每个频率之间隔10s，光栅运行速度12degree/s。
②在程序起始的暗适应时期，将小鼠放置到视动台子中心区域，放置下去立即开始按摄像头记录，同时要保持安静的环境。完成后清理视动系统台子并通气等待1min，避免酒精散发的气味影响后续实验。
③记录完成后，留存小鼠头部运动影像用于后续的整理分析。当光栅旋转时小鼠的头部随着光栅旋转超过30度，即判定为小鼠能看到当前光栅。小鼠能产生视动反射的最细的光栅，对应的空间频率即为该小鼠的视敏度。
6.3视觉功能-视网膜电位记录
在灌胃14天后，第16天上午进行视网膜电位记录。
在ERG(视网膜电位记录)记录之前，将小鼠放入黑暗环境适应至少6小时(通常前一天晚上放进去暗适应过夜)，实验时需要将室内的灯关闭，仅留一盏小红灯。具体实验步骤如下：
①麻醉和扩瞳。使用1.25％的三溴乙醇将小鼠进行麻醉，每只小鼠腹腔注射0.2ml/10g。然后在两侧眼睛上各滴一滴复方托吡卡胺滴眼液(扩瞳药)，作用5分钟使小鼠眼球瞳孔扩开。(在记录过程中，小鼠置于37摄氏度恒温加热水浴平台上以避免小鼠体温过低死亡。)
②填写小鼠信息。打开软件，填写小鼠的信息，包括基因型，给药情况，雌雄，出生日期等。
③插电极。将两个参考电极插入小鼠眼眶附近，另一根参考电极插入小鼠尾部附近。两个记录电极轻扣在小鼠眼睛角膜上。检查一遍电极是否插好。
④记录和保存。电极插好后边可以开始记录。在罗兰系统中，我们开始记录暗适应情况下(Scotopic 0.01,0.1和3.0cds/m2)视网膜各层神经元的反应情况。随后，在背景为20cd/m2的绿光下明适应5分钟，然后，刺激光强为photopic 3.0和photopic 10.0cds/m2，观察视网膜各层神经元的反应情况。(记录过程中，如果发现小鼠眼球过于干燥可以滴加1％水合甲基纤维素滋润小鼠眼睛)最后记录到的结果需要保存下来。
⑤分析结果。记录所得到的曲线，首先有一个向下的波谷，称为a波，在暗适应的弱光刺激下，主要为视杆细胞对光的群体反应，光刺激强度增后，为视杆和视锥细胞的混合反应；在明适应条件下，由于视杆细胞已经被漂白，主要为视锥对光的群体反应。a波之后，有一个向上的波，称为b波，为给光双极细胞对光的群体反应。我们统计的是a波(基线到波谷)和b波(波谷到波峰)的幅度，以此判定感光细胞和给光双极细胞对光反应能力的强弱。
5.3视网膜免疫组化
5.3.1取材和包埋
断颈处死小鼠后，取出小鼠眼球，随后，将眼球沿着角膜缘剪开，只剩下视杯，放入4％PFA中固定30分钟。然后用1X PBS洗3次，每次5分钟。然后，将视杯置于24孔板中的30％蔗糖溶液中脱水过夜。待视杯沉到24孔板的孔管底，说明视杯已经脱水完全。然后取出视杯，用镊子取出晶状体，用O.C.T将视杯进行包埋，迅速置于-80℃冰箱冷冻保存。
5.3.2冰冻切片
待OCT完全地凝固后，取出包埋好的组织块置于切片机温箱中复温30min。取出包埋块，固定在Leica冰冻切片机头上(其中冻头温度-21℃，机箱温度-20℃，)，调整切片角度与参数，视网膜切片厚为15μm。每只眼球切6套，每套都带有视神经的切片以确保所切区域在视网膜中处于相似的中心-外周位置以便比较。切好的片子放在烘片机上，设置37℃烘片2小时。烘完后，收在玻片盒里，保存于-80℃冰箱。
5.3.3DAPI染色与免疫荧光染色
(1)DAPI染色：将待染色的片子从-80℃冰箱中取出，37℃烘片15min。将切片置于避光湿盒内，用1X PBST洗三次，每5分钟，然后加入DAPI溶液(1：1000)，室温孵育5分钟，最后加入抗荧光淬灭封片剂，随后封片。
(2)免疫荧光染色：将视网膜切片从-20℃冰箱取出，放于避光湿盒里，常温下晾干，用免疫组化笔划出带有视网膜组织的范围。先用含有0.1％的Triton X-100PBST洗三遍，每遍5min。依次接着吸取300ml配制好的免疫荧光封闭液置于玻片上，在常温下封闭1小时。倒掉封闭液，直接加入配制好的免疫荧光一抗(anti-Opsin；anti-rhodopsin；anti-GFAP)，然后轻放于4℃冷库孵育16小时。用1XPBST缓冲液洗三遍，每遍5min。尽量吸干玻片上的液体，再加入已经配置好的免疫荧光二抗，避光放置于室温下孵育2小时。孵育完成后，用1X PBST缓冲液洗三遍，每遍5min，抗荧光淬灭封片剂封片，最后避光放置于4℃冰箱等待荧光拍照。
5.3.4拍片与图片分析
染色完成后，选取含有视神经乳头片子置于蔡司荧光显微镜下观察，并拍照。在物镜20倍镜下拍照。对于DAPI染色、opsin染色、rhodopsin染色的切片所拍照的图片，在ImagePro Plus软件下测量视网膜中外核层(ONL)的厚度与长度，对于GFAP染色的片子所拍照的图片，在ZEN软件下测量平均荧光强度。
6相关工作人员通知
购买动物时通知动物室，在动物出现异常情况时通知病理室进行处理。
7统计方法
所有样本计量均采用均数±标准误(X±SEMs)表示，采用Graphpad软件进行统计分析。数据间比较采用T-test的方法统计，p<0.05时，认为有显著性差异。
二、结果
1.LbGP与luteolin联合用药显著增加RP模型小鼠感光细胞层厚度
本实验统计距离视神经穿出位置400μm、800μm、1200μm、1600μm处的视网膜外核层厚度(图1、图7)。正常C57小鼠的视网膜ONL厚度为61.59±0.93μm，未经治疗的RP模型小鼠的ONL厚度为14.78±1.74μm(与正常C57小鼠相比，P＜0.0001),经过灌胃口服LbGP治疗后的RP模型小鼠的视网膜厚度呈增加趋势，如在400μm处，ONL厚度增加为36.17±3.68μm(与未经治疗的RP模型小鼠相比，P＜0.05),灌胃口服luteolin的RP模型小鼠的视网膜外核层厚度也有所增加，达到26.61±3.17μm(与未经治疗的RP小鼠相比，P＞0.05)，而灌胃口服LbGP与luteolin的RP模型小鼠的视网膜外核层厚度显著增加，达到49.23±3.09μm(与未经治疗的RP模型小鼠相比，P＜0.0001)。类似的，在800μm、1200μm、1600μm处，经过LbGP与luteolin联合治疗的RP模型小鼠的视网膜外核层厚度都有所增加。因此，LbGP与luteolin联合治疗显著增加了RP模型小鼠视网膜感光细胞层厚度，即提高了感光细胞的存活率。
2.LbGP与luteolin联合用药明显改善RP模型小鼠的明暗分辨能力(黑白箱)
我们使用黑白穿梭箱检测小鼠对明暗的辨别能力。基于小鼠喜欢呆在黑暗环境中的本能行为，当小鼠置于白箱中时，它们倾向于进入黑箱并滞留在里面。如果小鼠丧失了视觉能力，分辨不清楚明暗，则在黑箱和白中的停留时间相近(图2)。本实验发现正常C57小鼠在黑箱停留时间为217.96±4.85s(N＝12)，而未经治疗的RP模型小鼠在黑箱停留时间为157.94±6.49s(N＝11，与C57正常小鼠相比，P<0.0001)，经过LbGP治疗后的RP模型小鼠在黑箱停留时间为179.95±4.76s(N＝10，与未经治疗的RP模型小鼠相比，P＜0.05),经过luteolin灌胃口服治疗后，RP模型小鼠在黑箱中停留时间显著增加，达到181.98±7.37s(与未经治疗的RP小鼠相比，P＜0.05),经过LbGP与luteolin治疗后的RP模型小鼠在黑箱停留时间为189.09±2.56s(与未经治疗的RP模型小鼠相比，P＜0.01),表明经LbGP与luteolin治疗后的RP模型小鼠的明暗辨别能力明显有改善。
3.LbGP与luteolin联合用药明显提高RP模型小鼠的视觉敏锐度
本实验通过视动系统检测，评估小鼠的最佳视敏度(图3)。正常C57小鼠的视敏度为0.38±0.02(N＝6)，显著高于未经治疗的RP模型小鼠的视敏度(0.11±0.03，N＝6，P＜0.001)。经过LbGP治疗的RP模型小鼠的视敏度为0.22±0.02(N＝6,与未经治疗的RP模型小鼠相比，P＜0.05)，经过luteolin治疗的小鼠，视敏度稍有提高，达到0.21±0.03cpd(与未经治疗的RP小鼠相比，P＞0.05)，经过LbGP与luteolin联合用药治疗的小鼠的视敏度为0.29±0.02cpd(与未经治疗的RP模型小鼠相比，P＜0.01)。此实验表明，经过LbGP治疗的RP模型小鼠对精细光栅的分辨能力有提升，视敏度得到了提高。
4.LbGP与luteolin联合用药显著提高RP模型小鼠视网膜对光反应的能力
本部分实验将未经治疗的RP模型小鼠、单独灌胃口服LbGP的RP模型小鼠、单独灌胃口服luteolin的RP模型小鼠及LbGP与luteolin联合灌胃的RP模型小鼠进行6小时以上的暗适应，记录在暗场下(scotopic 0.01,0.1,3.0cds/m2)的视网膜电位图，小鼠在明适应5分钟后，视网膜的视杆细胞对光反应能力被漂白，故在明适应条件下，我们主要记录视锥细胞的对光反应(图4、图9)。在scotopic 0.01cds/m2下,C57小鼠的a波振幅为11.40±1.25μV，显著高于未经治疗的RP模型小鼠a波振幅(2.54±0.63μV，P＜0.001)，C57小鼠的b波振幅为316±31.58μV，显著高于未经治疗的RP模型小鼠b波振幅(102.54±26.05μV，P＜0.001)。经过LbGP灌胃治疗后的RP模型小鼠a波振幅有所增加，达到7.69±1.51μV(VS未经治疗的RP模型小鼠，P＜0.05),经过LbGP灌胃治疗后的RP模型小鼠b波振幅有所增加，达到217.58±26.45μV，但对比未经治疗的RP模型小鼠，P＞0.05。经过luteolin灌胃治疗后的RP模型小鼠a波振幅有所增加，达到4.58±1.25μV，但对比未经治疗的RP模型小鼠未达到统计学意义(2.55±0.64，P＞0.05),在scotopic 0.01cds/m2下，经过luteolin灌胃治疗后的RP模型小鼠b波振幅有所增加，达到157.12±44.99μV，P＜0.001)，但对比未经治疗的RP模型小鼠(102.54±26.05μV，P＞0.05),经过灌胃口服luteolin的RP模型小鼠对比未经治疗的RP模型小鼠的a、b波振幅有增加趋势，但没达到统计学意义。经过LbGP与luteolin联合灌胃治疗后的RP模型小鼠a波振幅显著增加，达到8.82±1.07μV，对比未经治疗的RP模型小鼠，P＜0.001,在scotopic 0.01cds/m2下C57小鼠的b波振幅为316±31.58μV，显著高于未经治疗的RP模型小鼠b波振幅(102.54±26.05μV，P＜0.001)，经过LbGP与luteolin联合灌胃治疗的RP模型小鼠b波振幅显著增加，达到307.1±14.93μV，对比未经治疗的RP模型小鼠，P＜0.001。经过LbGP与luteolin联合灌胃后的RP模型小鼠对比未经治疗的RP模型小鼠的a、b波振幅增加，a波有增加的趋势但未达到统计学意义，b波的振幅增加，对比未经治疗的RP模型小鼠，P＜0.05。因此，LbGP与luteolin联合给药显著提高了RP模型小鼠的视网膜对光反应。
5.LbGP与luteolin联合用药明显改善RP模型小鼠视网膜感光细胞的变性
视蛋白(opsin)和视紫红质(rhodopsin)分别是感光细胞中视锥细胞和视杆细胞所表达的光敏感蛋白。通过免疫荧光染色标记opsin和rhodopsin,观察在灌胃口服LbGP治疗RP模型小鼠后视网膜表达情况及形态变化(图5、图8)。正常C57小鼠视网膜外段层视蛋白呈长条状，平均长度为10.84±0.41μm，未经治疗的RP模型小鼠视蛋白表达显著减少，长度为2.35±0.14μm(与正常C57相比，P＜0.0001)，经过LbGP治疗后，视网膜外段层长度恢复至4.79±0.40μm(与未经治疗的RP模型小鼠相比，P＜0.05)，经过灌胃口服luteolin治疗后，视网膜外段层仍为短条状，长度恢复至4.84±0.58μm(与未经治疗的RP模型小鼠相比，P＜0.05)，经过LbGP与luteolin联合灌胃治疗后，视网膜外段层形态恢复为细长条状，长度恢复至7.51±0.42μm。rhodopsin染色中，正常C57小鼠外段层视紫红质呈高表达状态，平均厚度为16.53±0.61μm,而未经治疗RP模型小鼠的视紫红质表达极少，平均厚度为2.13±0.15μm(与正常C57小鼠相比，P＜0.0001)。经过LbGP治疗后的RP模型小鼠视网膜视紫红质平均厚度为2.86±0.21μm(与未经治疗的RP模型小鼠相比，P＜0.05)。经过灌胃口服luteolin治疗后的RP模型小鼠视网膜视紫红质平均厚度为2.63±1.51μm(与未经治疗的RP模型小鼠相比，P＜0.05)。经过LbGP与luteolin联合灌胃治疗后的RP模型小鼠视网膜视紫红质平均厚度为5.07±1.25μm(与未经治疗的RP模型小鼠相比，P＜0.01)。因此，LbGP与luteolin联合给药显著改善了感光细胞(包括视锥和视杆)的结构，减缓了变性。
6.LbGP与luteolin联合用药明显减弱RP模型小鼠视网膜Müller胶质细胞增生
本实验通过观察各组小鼠视网膜内Müller胶质细胞标志物GFAP表达的情况，来评估RP模型小鼠视杆细胞和视锥细胞死亡期间的炎症反应。我们统计了被GFAP标记的Müller胶质细胞的平均荧光强度(图6、图10)。对于正常的C57小鼠，由于Müller胶质细胞未被激活，因此标记的GFAP处于低表达的状态，平均荧光强度为568.82±36.01，而未经治疗的RP模型小鼠视网膜Müller胶质细胞增生活跃，平均荧光强度为957.03±53.87(与正常C57小鼠相比，P＜0.001)。经过LbGP治疗后的RP模型小鼠视网膜内的Müller胶质细胞增生减弱，平均荧光强度为674.3±48.21(与未经治疗的RP模型小鼠相比，P＜0.05)。经过luteolin治疗后的RP模型小鼠视网膜内的Müller胶质细胞增生稍减弱，平均荧光强度为872.9±19.68(与未经治疗的RP模型小鼠相比，P＞0.05)。经过LbGP与luteolin联合治疗后的RP模型小鼠视网膜内的Müller胶质细胞增生减弱，荧光强度为605.85±21.92(与未经治疗的RP模型小鼠相比，P＜0.01)。因此，LbGP与luteolin联合用药显著降低了Müller胶质细胞增生。
三、结论
与对照组未经治疗的RP模型小鼠相比，LbGP与Luteolin联合用药的RP模型小鼠视网膜外核层(ONL)中感光细胞存活率显著提高，在黑箱中的停留时间显著延长，视敏度明显提升；LbGP与Luteolin联合用药对于RP模型小鼠暗适应条件下视网膜电位的a波的幅度和b波的幅度均有所提升。LbGP与Luteolin联合用药改善RP模型小鼠视网膜感光细胞的变性及减弱RP模型小鼠视网膜Müller胶质细胞增生。
四、讨论
视网膜感光细胞或者色素上皮由于变性、基因缺陷损伤等原因致使其死亡或者退变，进而引起视网膜结构的变化，直至其视觉功能的完全丧失。因此，抑制或者逆转视网膜内感光细胞的变性死亡，均会为该眼科疾病临床治疗带来极大希望。本实验证明，经过LbGP与Luteolin联合用药治疗后的RP模型小鼠，对RP模型小鼠视网膜感光细胞的存活率、明暗辨别能力、视敏度都有显著提升，且可以改善小鼠视网膜感光细胞的变性及减弱RP模型小鼠视网膜Müller胶质细胞增生。因此，LbGP与Luteolin联合用药对退变视网膜具有一定的保护作用，推测可能与其抗炎抗凋亡的作用相关。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.枸杞糖肽和木犀草素联用在制备防治感光细胞病变相关疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述感光细胞病变相关疾病包括视网膜色素变性。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述防治包括：增加感光细胞层厚度、改善明暗分辨能力、提高视觉敏锐度、提高视网膜对光反应的能力、改善视网膜感光细胞的变性和/或减弱视网膜Müller胶质细胞增生。
4.一种组合物，其由枸杞糖肽和木犀草素组成。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述枸杞糖肽和木犀草素的质量比为(10～120)：(5～20)。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述枸杞糖肽和木犀草素的质量比100：10。
7.一种防治感光细胞病变相关疾病的药物，其包括权利要求4～6任一项所述的组合物。
8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，还包括其他治疗感光细胞病变的药物。
9.根据权利要求7或8所述的药物，其特征在于，其剂型为口服液、注射液或滴眼液。
10.一种防治感光细胞病变相关疾病的方法，其特征在于，包括给予权利要求7～9任一项所述的药物。
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