CN115624545A - 枸杞红素在制备治疗视网膜色素变性产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种枸杞红素在制备治疗视网膜色素变性产品中的应用。其中枸杞红素的剂量为1‑27mg/kg。治疗视网膜色素变性产品包括枸杞红素乳化液、枸杞红素粉剂、枸杞红素饮料或枸杞红素片剂。本发明制备的枸杞红素产品显著地提升了RP模型小鼠视网膜感光细胞的存活率，并且改善了小鼠的视觉行为和视网膜对光反应，治疗感光细胞退变，因此可以有效治疗视网膜色素变性。

Description

枸杞红素在制备治疗视网膜色素变性产品中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，更具体的说是涉及枸杞红素在制备治疗视网膜色素变性产品中的应用。

背景技术

视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)是一种感光细胞退变导致视觉丧失的严重疾病，是全球主要致盲性眼科疾病，在4000人中就有1人患有此疾病。RP主要是有遗传突变导致的，表现为视杆细胞先死亡，随后视锥细胞也接着死亡，患者失明。在临床上目前没有很好的治疗办法。

枸杞作为中国传统的药食同源且营养滋补的中药材，性平、味甘，且具有多种功能药效，即：明目润肺、滋补肝肾、等，成熟的宁夏枸杞果实中含有大量的类胡萝卜素类成份，其中尤其是玉米黄素双棕榈酸化合物约占类胡萝卜素物质总量的31％～56％，同时也是枸杞成熟果实的成份之一。枸杞红素即玉米黄素双棕榈酸酯。苏国辉院士团队已经证实：在慢性酒精性脂肪肝大鼠模型中，第五至第十周内每天灌胃25mg/kg单体药物枸杞红素便可通过MAPK通路的调控而达到显著的肝脏保护作用。但到目前为止，关于枸杞红素单体产品在眼科疾病研究领域中验证其是否发挥着显著的神经保护作用的研究很少。虽然暨南大学徐颖团队前期工作已报道一次性眼内注射枸杞红素单体能显著改善RP退变性小鼠rd10的视网膜结构与功能，并主要是通过STAT3,CCL2和MAPK信号通路发挥抗炎症，抗凋亡作用来达到保护效果(Liu F等，Journal of Neurochemistry,2021)，但眼内注射会对眼睛造成损伤，不能反复给药，作用时间有限。同时，枸杞红素为脂溶性原料，质地较为黏稠，难以利用，稳定性也较差。

因此，提供一种枸杞红素在制备治疗视网膜色素变性产品中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了枸杞红素在制备治疗视网膜色素变性产品中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

枸杞红素在制备治疗视网膜色素变性产品中的应用。

进一步地，所述枸杞红素的剂量为1-27mg/kg。

进一步地，所述枸杞红素的剂量为9mg/kg。

进一步地，所述治疗视网膜色素变性产品包括枸杞红素乳化液、枸杞红素粉剂、枸杞红素饮料或枸杞红素片剂。

进一步地，所述枸杞红素乳化液的制备方法包括以下步骤：

(1)将变性淀粉、阿拉伯胶、麦芽糊精按1-2：1-2：1-2的质量比溶解于55-70℃的水中，充分搅拌30-60min至完全溶解，冷却到48-58℃，制成固形物含量为15-20％的壁材溶液；

(2)将枸杞红素与油脂以1-2：1-2的质量比混合，作为芯材，边搅拌边加入到壁材溶液中，芯材和壁材溶液的体积之比为1：2-5，同时进行超声处理，然后以5000-7000r/min的速度由乳化机进行剪切2-5min，剪切温度为50-60℃，制得总固形物含量为25-35％的乳液；

(3)将乳液进行均质，均质压力为20-30MPa，均质次数为1-3次，得到枸杞红素乳化液。

优选地，步骤(2)所述超声处理的超声功率为500-1000W，超声时间为30-50min。

优选地，步骤(2)所述油脂选自玉米油、菜籽油或大豆油。

进一步地，所述枸杞红素粉剂的制备方法，是在枸杞红素乳化液的制备方法的基础上，还包括：

将枸杞红素乳化液喷雾干燥，进风温度为140-160℃，出风温度为65-95℃，进料温度为55-75℃，进料速度为30-60mL/h，然后过50-100目的振动筛，筛除尺寸过大的颗粒，计重分装，得到枸杞红素粉剂。

进一步地，所述枸杞红素饮料的制备方法，包括以下步骤：

(1)将变性淀粉、阿拉伯胶、麦芽糊精按1-2：1-2：1-2的质量比溶解于55-70℃的水中，充分搅拌30-60min至完全溶解，冷却到53℃，制成固形物含量为20-30％的壁材溶液；

(2)将枸杞红素与油脂以1-2：1-2的质量比混合，作为芯材，边搅拌边加入到壁材中，芯材和壁材溶液的体积之比为1：2-5，不断搅拌，同时进行超声处理，超声功率为1000W，超声时间为30-50min，然后以5000-7000r/min的速度进行剪切操作1-3min，剪切温度为55℃，得到总固形物含量为30％的乳液；

所述油脂选自玉米油、菜籽油或大豆油；

(3)按重量份计，将65-85份乳液、3-5份白砂糖、2-5份稳定剂混合，水作为余量补足100份，进行化料，化料温度为55-60℃，化料时间为30-60min；

所述稳定剂中果胶、卡拉胶、CMC-Na的质量比为1-2：1-2：1-2；

(4)进行1次均质，均质温度为55-60℃，一级压力为13-15Mbar，二级压力为2-3Mbar；

(5)采用管式杀菌，杀菌温度为135-137℃，杀菌时间为5-7s；

(6)进行无菌灌装，得到枸杞红素饮料。

进一步地，所述枸杞红素片剂的制备方法，是在枸杞红素乳化液的制备方法的基础上，还包括：

(1)将所得枸杞红素乳化液喷雾干燥，进风温度为140-160℃，出风温度为65-95℃，进料温度为55-75℃，进料速度为30-60mL/h，然后过50-100目的振动筛，筛除尺寸过大的颗粒，得到微胶囊粉末；

(2)将PVP-K30在60％的食用级酒精中溶解，定容至质量浓度为5％，得到粘合剂溶液；

(3)按重量百分比计，分别称取枸杞红素微胶囊粉末30％，山梨糖醇50％，低聚木糖2％，麦芽糊精3％，微晶纤维素10-13％，混合均匀，边搅拌边加入2-5％的粘合剂溶液，制成软材，放入摇摆颗粒机中，用14目尼龙筛进行制粒，制好的颗粒放入平板中于50-60℃下烘干至含水量≤5％，再次放入摇摆制粒机中进行整粒，过60目筛，将干燥后的颗粒进行压片，规格为0.5克/片，压片后进行薄膜包衣，得到枸杞红素片剂。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供了枸杞红素在制备治疗视网膜色素变性产品中的应用，以及所述产品的制备方法。不仅确定了枸杞红素最佳的应用剂量，且制备成相关产品后提升了其稳定性。本发明制备得到的枸杞红素产品可显著提升RP模型小鼠视网膜感光细胞的存活率，并且改善了小鼠的视觉行为和视网膜对光反应，因此可以有效治疗视网膜色素变性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1A为实验一的五组RP模型小鼠的视网膜冰冻切片DAPI染色；五组分别为对照组灌胃口服玉米油(corn oil)的RP模型小鼠，以及灌胃口服剂量为1mg/kg、3mg/kg、9mg/kg和27mg/kg枸杞红素的RP模型小鼠，显示距离视神经1000um处各个核层DAPI染色。

图1B为实验一的五组小鼠视网膜离视神经1000μm处ONL厚度统计结果。ONL：外核层。*：p<0.05。数据分析采用one-way ANOVA方法检验。各组样本数：corn oilN＝7；1mg/kgN＝4；3mg/kg N＝8；9mg/kg N＝9；27mg/kg N＝3。

图2A为视动检测系统示意图。

图2B为实验一的灌胃口服玉米油(corn oil)和剂量9mg/kg枸杞红素的RP模型小鼠的视敏度(cpd)。*：P＜0.05。数据分析采用T-test方法检验。各组样本数：corn oil N＝4；9mg/kg N＝6。

图3A、B分别为实验一的在暗适应scotopic0.1cds/m²(A)和3cds/m²(B)光照下，灌胃口服玉米油(corn oil)和剂量9mg/kg枸杞红素的RP模型小鼠的视网膜电位反应。

图3C、D分别为实验一的暗适应下各个光强下的a波和b波振幅。数据分析采用2wayANOVA方法检验。*：P＜0.05。各组样本数：corn oil N＝5；9mg/kg N＝5。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实验一

本实验采用MNU化学诱导型视网膜退变模型小鼠作为实验动物，开展灌胃口服枸杞红素制品治疗RP的动物实验，先根据灌胃不同浓度的枸杞红素小鼠视网膜ONL的厚度，选出最佳保护效果的枸杞红素的浓度，后续在该浓度下通过视网膜形态、视网膜电位记录和视觉行为实验进一步验证枸杞红素制品是否可以保护视网膜感光细胞，以期为枸杞红素制品临床治疗视网膜色素变性提供重要参考。

具体试验如下：

1.实验材料

1.1供试品

枸杞红素制品，百瑞源枸杞股份有限公司；

1.3实验系统：

动物种系：化学诱导型RP模型小鼠

动物级别：SPF级

动物性别和数量：雄

动物体重：7周时体重约20g

动物年龄：7周

动物来源：化学诱导型RP模型小鼠需要后期造模，选用7周大小的C57/BL小鼠，购买于广州言诚生物科技有限公司。

饲养条件：饲养于暨南大学大气楼鼠房，所有动物保证处于标准的12/12h光照周期的实验环境，并保证充足食物和水的供应。

检疫过程：所购买的小鼠均为有实验动物质量合格证的SPF级小鼠。实验小鼠购入后，按照实验动物入室标准操作规程进入隔离实验室，动物管理人员每日检查一次，检疫期为10天。

饲料：SPF级鼠粮。

饮水：纯净水。

垫料：SPF级垫料。

标识：填写笼盒标签，包括：笼号、课题组名称、负责人、试验名称、基因型、动物性别等信息。

2、实验方法

2.1小鼠模型、试验准备

本次实验选用视网膜退变模型小鼠为化学诱导型RP模型小鼠，是使用1％MNU(40mg/kg体重)腹腔注射特异性诱导感光细胞凋亡。

试验前的主要准备包括记录C57小鼠的身体状况和眼部状况，排除身体及眼部有异常的小鼠，而后每日以灌胃的方式给药。

2.2试验方法

选取7周大小的雄性C57小鼠，将枸杞红素提取物和玉米油按照0.1ml/10g(10ml/kg)体重的标准灌胃，每天晚上在同一时间段给小鼠进行灌胃(对照组玉米油corn oil，1mg/kg、3mg/kg、9mg/kg、27mg/kg的枸杞红素)，灌胃7天后，进行1％MNU(40mg/kg体重)的腹腔注射诱导视网膜损伤，损伤后继续灌胃枸杞红素一周，观察灌胃枸杞红素对RP模型小鼠的治疗效果，在第16天下午，将所有小鼠处死，视网膜取材。取小鼠视网膜冰冻切片进行DAPI染色，分别观察感光细胞层厚度(主要观察及测量ONL层)。根据感光细胞层的厚度，选出具有最佳保护效果的枸杞红素浓度。在选出最佳剂量9mg/kg体重的枸杞红素后，选取7周C57小鼠，灌胃对照溶剂或剂量9mg/kg的枸杞红素7天后，1％MNU造模，然后再持续灌胃一周。在第15天上午进行视动系统检测。在第16天上午进行视网膜电位记录观察小鼠视网膜的对光反应能力，在第16天下午，将所有检测完成的小鼠行视网膜取材。取小鼠视网膜冰冻切片进行DAPI染色，分别观察感光细胞层厚度(主要观察及测量ONL层)。

2.3剂量和分组

前期实验主要实验分五组，分别为灌玉米油的对照组的RP模型小鼠，灌胃剂量为1mg/kg、3mg/kg、9mg/kg、27mg/kg的枸杞红素的RP模型小鼠。后期实验分为对照组和剂量9mg/kg枸杞红素。

给药方法为灌胃给药。

2.4供试品配制和保存

枸杞红素提取物由百瑞源枸杞股份公司提供，-20℃避光储存于玻璃瓶中。枸杞红素提取物中枸杞红素的含量为30mg/g(3％)，配制浓度为1mg/kg、3mg/kg、9mg/kg、27mg/kg的枸杞红素，给药体积固定为10ml/kg，具体配方如下：使用电子天平称取0.1g、0.3g、0.9g、2.7g枸杞红素提取物，并放置于灭菌后并写好标记的EP管中，加入玉米油，震荡溶解，并定容到30ml，将其震荡至完全溶解，使用锡箔纸避光保存在-4℃的冰箱中，使用前需要摇匀。

2.5供试品的给予实验开始时，每天在同一时间段给小鼠灌胃。灌胃前先检查小鼠眼部情况，称量小鼠体重，记录体重，按照给药容量：0.1ml/10g体重的标准灌胃，灌胃7天后，在第七天行MNU腹腔注射，而后继续灌胃7天。

2.6观测的指标、时间和内容

2.6.1视觉行为-视动检测在灌胃14天后，第15天上午进行视动检测。视动检测借助于啮齿物在对不同频率光栅的分辨能力，检测小鼠并量化地评价动物高级视觉能力。小鼠提前暗适应至少3小时，实验开始之前需检查小鼠眼睛无血丝、白内障等异常情况再开展实验，实验开始时房间关灯，仅留红灯。具体操作如下：

①先打开电脑，在系统上方先打开电脑，在系统上方30cm设置一个摄像装置(手机)。实验开始之前使用75％酒精喷洒视动系统，并以纸巾擦拭干净，避免之前实验动物残留的气味、鼠屎毛发等杂质对测试小鼠带来干扰；电脑上打开MatLab软件，然后运行不同空间频率的正弦光栅(100％contrast)，空间频率包括0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35，0.4，0.45，0.5cpd；各个频率的光栅先顺时针方向旋转30s，再逆时针方向旋转30s，每个频率之间隔10s，光栅运行速度12degree/s。

②在程序起始的暗适应时期，将小鼠放置到视动台子中心区域，放置下去立即开始按摄像头记录，同时要保持安静的环境。完成后清理视动系统台子并通气等待1min，避免酒精散发的气味影响后续实验。

③记录完成后，留存小鼠头部运动影像用于后续的整理分析。当光栅旋转时小鼠的头部随着光栅旋转超过30度，即判定为小鼠能看到当前光栅。

2.6.2视觉功能-视网膜电位记录在灌胃14天后，第16天上午进行进行视网膜电位记录。

在ERG(视网膜电位记录)记录之前，将小鼠放入黑暗环境适应至少6小时，实验时需要将室内的灯关闭，仅留一盏小红灯。具体实验步骤如下：

①麻醉和扩瞳。使用0.14mg/ml的1.25％的三溴乙醇将小鼠进行麻醉，然后在两侧眼睛上各滴一滴复方托吡卡胺滴眼液(扩瞳药)，作用5分钟使小鼠眼球瞳孔扩开。在记录过程中，小鼠置于37℃恒温加热水浴平台上以避免小鼠体温过低死亡。

②填写小鼠信息。打开软件，填写小鼠的信息，包括基因型，给药情况，雌雄，出生日期等。

③插电极。将两个参考电极插入小鼠眼眶附近，另一根参考电极插入小鼠尾部附近。两个记录电极轻扣在小鼠眼睛角膜上。检查一遍电极是否插好。

④记录和保存。电极插好后边可以开始记录。在罗兰系统中，开始记录暗适应情况下(Scotopic0.01，0.1和3.0cds/m²)视网膜各层神经元的反应情况。随后，在背景为20cds/mcds/m²的绿光下明适应5分钟，然后，刺激光强为photopic3.0和photopic10.0cds/m²观察视网膜各层神经元的反应情况。(记录过程中，如果发现小鼠眼球过于干燥可以滴加1％水合甲基纤维素滋润小鼠眼睛)最后记录到的结果需要保存下来。

⑤分析结果。记录所得到的曲线，首先有一个向下的波谷，称为a波，在暗适应的弱光刺激，主要为视杆细胞对光的群体反应，光刺激强度增后，为视杆和视锥细胞的混合反应；在明适应条件下，由于视杆细胞已经被漂白，主要为视锥对光的群体反应。a波之后，有一个向上的波，称为b波，为给光双极细胞对光的群体反应。统计的是a波(基线到波谷)和b波(波谷到波峰)的幅度，以此判定感光细胞和给光双极细胞对光反应能力的强弱。

2.6.3视网膜免疫组化

2.6.3.1取材和包埋

断颈处死小鼠后，取出小鼠眼球，随后，将眼球沿着角膜缘剪开，只剩下视杯，放入4％PFA中固定30分钟。然后用1XPBS洗3次，每次5分钟。然后，将视杯置于24孔板中的30％蔗糖溶液中脱水过夜。待视杯沉到24孔板的孔管底，说明视杯已经脱水完全。然后取出视杯，用镊子取出晶状体，用OCT将视杯进行包埋，迅速置于-80℃冰箱冷冻保存。

2.6.3.2冰冻切片

待OCT完全地凝固后，取出包埋好的组织块置于切片机温箱中复温30min。取出包埋块，固定在Leica冰冻切片机头上(其中冻头温度-21℃，机箱温度-20℃，)，调整切片角度与参数，视网膜切片厚为15μm。每只眼球切6套，每套都带有视神经的切片以确保所切区域在视网膜中处于相似的中心-外周位置以便比较。切好的片子放在烘片机上，设置37℃烘片2小时。烘完后，收在玻片盒里，保存于-80℃冰箱。

2.6.3.3DAPI染色与免疫荧光染色

(1)DAPI染色：将待染色的片子从-80℃冰箱中取出，37℃烘片15min。将切片置于避光湿盒内，用1XPBST洗三次，每5分钟，然后加入DAPI溶液(1：1000)，室温孵育5分钟，最后加入抗荧光淬灭封片剂，随后封片。

2.6.3.4拍片与图片分析染色完成后，选取含有视神经乳头片子置于蔡司荧光显微镜下观察，并拍照。在物镜20倍镜下拍照。对于DAPI染色切片所拍照的图片，在ImageJ软件下测量视网膜中外核层(ONL)的厚度。

2.7统计方法

所有样本计量均采用均数±标准误(X±SEMs)表示，采用Graphpad软件进行统计分析。数据间比较采用T-test、2wayANOVA等方法统计，p<0.05时，认为有显著性差异。

3结果

3.1枸杞红素制剂增加RP模型小鼠感光细胞层厚度，最优剂量为9mg/kg

图1A为五组RP模型小鼠的视网膜冰冻切片DAPI染色；五组分别为对照组灌胃口服玉米油(corn oil)的RP模型小鼠，以及灌胃口服剂量为1mg/kg、3mg/kg、9mg/kg和27mg/kg枸杞红素的RP模型小鼠，显示距离视神经1000um处各个核层DAPI染色。图1B为五组小鼠视网膜离视神经1000μm处ONL厚度统计结果。ONL：外核层。*：p<0.05。数据分析采用one-wayANOVA方法检验。各组样本量：corn oil N＝7；1mg/kg N＝4；3mg/kg N＝8；9mg/kg N＝9；27mg/kg N＝3。

本实验统计距离视神经穿出位置1000μm处的视网膜外核层厚度。正常C57小鼠的视网膜ONL厚度约60μm，RP小鼠的视网膜由于感光细胞退变，胞体层ONL厚度明显变薄。对照组(corn oil)的RP模型小鼠的ONL厚度为14.0±4.4μm(与正常C57小鼠相比，P＜0.0001)。经过灌胃口服枸杞红素治疗后，ONL厚度有所增加。灌胃口服剂量1mg/kg、3mg/kg、9mg/kg和27mg/kg枸杞红素的RP模型小鼠视网膜外核层ONL厚度分别为15.8±5.4μm、19.0±2.9μm、26.8±2.6μm和21.2±1.6，其中剂量9mg/kg的ONL厚度显著高于对照组(p<0.05，one-wayANOVA)。因此，灌胃口服枸杞红素可以减少RP模型小鼠视网膜感光细胞的死亡，剂量9mg/kg的枸杞红素的治疗效果最佳。

在接下来的视觉行为和视网膜对光反应测试中选取了剂量9mg/kg进行检测。

3.2枸杞红素制剂显著提高RP模型小鼠的视觉敏锐度

图2A为视动检测系统示意图。图2B为灌胃口服玉米油(corn oil)和9mg/kg枸杞红素的RP模型小鼠的视敏度(cpd)。*：P＜0.05。数据分析采用T-test方法检验。各组样本数：corn oil N＝4；9mg/kg N＝6。

本实验通过视动系统(图2A)，评估小鼠的最高视敏度。正常C57小鼠的视敏度为0.38±0.02cpd，RP小鼠的视敏度远远低于正常小鼠。对照组(corn oil)灌胃的RP小鼠视敏度为0.18±0.08cpd(P＜0.001vs.正常小鼠)。经过灌胃口服剂量9mg/kg的枸杞红素治疗后，RP模型小鼠的视敏度显著提高到0.35±0.02cpd(P<0.05vs.对照)。因此，枸杞红素制剂可以显著提高RP模型小鼠的对精细光栅的视觉分辨能力。

3.3枸杞红素显著提高RP模型小鼠视网膜对光反应

图3A、B分别为在暗适应scotopic0.1cds/m²(A)和3cds/m²(B)光照下，灌胃口服玉米油(corn oil)和剂量9mg/kg枸杞红素的RP模型小鼠的视网膜电位反应。图3C、D分别为暗适应下各个光强下的a波和b波振幅。数据分析采用2way ANOVA方法检验。*：P＜0.05。各组样本数：corn oil N＝5；9mg/kg N＝5。

在RP小鼠进行6小时以上的暗适应后，开展了视网膜电位记录。首先记录在暗场下(scotopic0.01，0.1，3.0cds/m²)的视网膜电位，这时候主要记录的是视杆细胞或者视杆和视锥混合的对光反应。然后再明适应5分钟，漂白视杆细胞，记录视锥细胞的对光反应。

由于RP小鼠感光细胞退变，RP小鼠的视网膜对光反应几乎消失，代表感光细胞群体光反应的a-wave和下游双极细胞的b-wave幅度很小。在枸杞红素制品治疗之后，在各个光强下的暗适应a-wave、b-wave幅度都有所增加。在最强的闪光刺激下(3.0cds/m²)，a-wave、b-wave幅度均显著高于对照玉米油组(p<0.05，2-way ANOVA)。该光强下，对照组的RP模型小鼠的a-wave，b-wave振幅分别为22.80±9.98μV和67.99±30.50μV，枸杞红素的RP模型小鼠的a-wave、b-wave振幅显著提高到48±15.18μV(P<0.05)和181.30±48.82μV(P<0.05)。

在明适应背景下，枸杞红素治疗后RP小鼠的a-wave没有明显变化，b波的振幅与对照组相比有增加的趋势，但未达到统计学意义。

五、效果

与对照组灌胃口服玉米油(corn oil)的RP模型小鼠相比，剂量9mg/kg枸杞红素的RP模型小鼠视网膜外核层(ONL)中感光细胞存活率显著提高，视敏度明显提升；枸杞红素对于RP模型小鼠暗适应条件下视网膜电位的a波的幅度和b波的幅度均有所提升。因此，剂量9mg/kg的枸杞红素可以改善RP模型小鼠视网膜的退变。

实施例1制备枸杞红素乳化液

(1)将变性淀粉、阿拉伯胶、麦芽糊精按1：1：1的质量比溶解于60℃的水中，充分搅拌30min至完全溶解，冷却到53℃，制成固形物含量为15-20％的壁材溶液；

(2)将30mg/g的枸杞红素与油脂以1：1的质量比混合，作为芯材，边搅拌边以一定比例加入到壁材溶液中，同时进行超声处理，超声功率为700W，超声时间为45min，然后以6000r/min的速度进行剪切5min，剪切温度为55℃，制得乳液，HPLC方法测得枸杞红素含量在8-14mg/kg；

所述油脂选自玉米油、菜籽油或大豆油；

(3)将乳液进行均质，均质压力为23MPa，均质次数为3次，得到枸杞红素乳化液。

实施例2制备枸杞红素乳化液

(1)将变性淀粉、阿拉伯胶、麦芽糊精按1：2：1的质量比溶解于65℃的水中，充分搅拌60min至完全溶解，冷却到53℃，制成固形物含量为20％的壁材溶液；

(2)将30mg/g的枸杞红素与油脂以2：1的质量比混合，作为芯材，边搅拌边以一定比例加入到壁材溶液中，同时进行超声处理，超声功率为1000W，超声时间为50min，然后以7000r/min的速度进行剪切3min，剪切温度为55℃，制得乳液，HPLC方法测得枸杞红素含量在7-15mg/kg；

所述油脂选自玉米油、菜籽油或大豆油；

(3)将乳液进行均质，均质压力为20MPa，均质次数为3次，得到枸杞红素乳化液。

实施例3制备枸杞红素乳化液

(1)将变性淀粉、阿拉伯胶、麦芽糊精按2：2：1的质量比溶解于65℃的水中，充分搅拌60min至完全溶解，冷却到53℃，制成固形物含量为15-20％的壁材溶液；

(2)将30mg/g的枸杞红素与油脂以1：1.5的质量比混合，作为芯材，边搅拌边以一定比例加入到壁材溶液中，同时进行超声处理，超声功率为700W，超声时间为45min，然后以7000r/min的速度进行剪切3min，剪切温度为60℃，制得乳液，HPLC方法测得枸杞红素含量在7-10mg/kg；

所述油脂选自玉米油、菜籽油或大豆油；

(3)将乳液进行均质，均质压力为20MPa，均质次数为3次，得到枸杞红素乳化液。

对比例1制备枸杞红素乳化液

(1)将变性淀粉、阿拉伯胶、麦芽糊精按3：3：1的质量比溶解于65℃的水中，充分搅拌60min至完全溶解，冷却到53℃，制成固形物含量为15-20％的壁材溶液；

(2)将枸杞红素与油脂以1：2的质量比混合，作为芯材，边搅拌边以一定比例加入到壁材溶液中，同时进行超声处理，超声功率为700W，超声时间为45min，然后以7000r/min的速度进行剪切3min，剪切温度为60℃,HPLC方法测得枸杞红素含量在3-6mg/kg，所述油脂选自玉米油、菜籽油或大豆油；

(3)将乳液进行均质，均质压力为20MPa，均质次数为3次，得到枸杞红素乳化液。

对比例2制备枸杞红素乳化液

(1)将变性淀粉、阿拉伯胶、麦芽糊精按3：3：1的质量比溶解于65℃的水中，充分搅拌60min至完全溶解，冷却到53℃，制成固形物含量为15-20％的壁材溶液；

(2)将枸杞红素与油脂以1：2的质量比混合，作为芯材，边搅拌边以一定比例加入到壁材溶液中，然后以7000r/min的速度进行剪切3min，剪切温度为60℃，HPLC方法测得枸杞红素含量在0-2mg/kg；

所述油脂选自玉米油、菜籽油或大豆油；

(3)将乳液进行均质，均质压力为20MPa，均质次数为3次，得到枸杞红素乳化液。

实验二

将实施例1-3、对比例1-2中所得产品按照同实验一的方法饲喂RP模型小鼠；并按照同实验一的方法检测小鼠ONL厚度、视敏度等指标。结果如表1所示：

表1

由表1可知，各实施例中，实施例2的效果最好，表明在实施例2的各工艺参数下，枸杞红素的稳定性效果最好，功效保留效果最好，进一步分析对比例，发现在无超声工艺和乳化参数在保护范围外的的样品的枸杞红素效果均差于实施例，表明所采取的工艺及工艺参数能够有效保证枸杞红素的稳定性。

应用实施例1制备枸杞红素粉剂

将实施例1得到的枸杞红素乳化液喷雾干燥，进风温度为140-160℃，出风温度为65-95℃，进料温度为55-75℃，进料速度为30-60mL/h，然后过50-100目的振动筛，筛除尺寸过大的颗粒，计重分装，得到枸杞红素粉剂，得到枸杞红素有效含量在9-14mg/g的粉剂。

应用实施例2制备枸杞红素饮料

(1)按重量份计，将实施例1得到的65-85份乳液、3-5份白砂糖、2-5份稳定剂混合，水作为余量补足100份，进行化料，化料温度为55-60℃，化料时间为30-60min；所述稳定剂中果胶：卡拉胶：CMC-Na的质量比为1：2：1；

(2)进行1次均质，均质温度为55-60℃，一级压力为13-15Mbar，二级压力为2-3Mbar；

(3)采用VTIS杀菌，杀菌温度为135-137℃，杀菌时间为5-7s；

(4)进行无菌灌装，得到枸杞红素含量在5-13mg/g的饮料。

应用实施例3制备枸杞红素片剂

(1)将实施例1得到的乳液进行均质，均质压力为20-30MPa，均质次数为1-3次，得到枸杞红素乳化液；

(2)将所得枸杞红素乳化液喷雾干燥，进风温度为140-160℃，出风温度为65-95℃，进料温度为55-75℃，进料速度为30-60mL/h，然后过50-100目的振动筛，筛除尺寸过大的颗粒，得到微胶囊粉末；

(3)将PVP-K30在60％的食用级酒精中溶解，定容至质量浓度为5％，得到粘合剂溶液；

(4)按重量份计，分别称取枸杞红素微胶囊粉末60％，山梨糖醇20％，低聚木糖2％，麦芽糊精3％，微晶纤维素15％，混合均匀，边搅拌边加入粘合剂溶液，制成软材，放入摇摆颗粒机中，用14目尼龙筛进行制粒，制好的颗粒放入平板中于50-60℃下烘干至含水量≤5％，再次放入摇摆制粒机中进行整粒，过60目筛，使颗粒均一，将干燥后的颗粒用ZP35B旋转式压片机进行压片，规格为0.5克/片，压片后使用BG-80D高效薄膜包衣机进行薄膜包衣，得到枸杞红素枸杞红素含量在6-9mg/g的片剂。

实验三

将上述应用实施例中的粉剂按照重量取溶解到取1倍纯水中取2g、饮料直接取用2ml、压片按单片重溶解在1倍重的纯水中取2g，同时以纯水为对照组。然后按照同实验一的方法饲喂RP模型小鼠；并按照同实验一的方法检测小鼠ONL厚度、视敏度等指标。结果如表2所示：

表2

由表2结果可知，应用实施例中的小鼠ONL厚度、视敏度数值高于对照组；视网膜对光的反应的a-wave、b-wave的振幅也高于对照组。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (4)

1.枸杞红素在制备治疗视网膜色素变性产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述枸杞红素的剂量为1-27mg/kg。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述枸杞红素的剂量为9mg/kg。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗视网膜色素变性产品包括枸杞红素乳化液、枸杞红素粉剂、枸杞红素饮料或枸杞红素片剂。

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