CN111630156A - 获得包含特定群的脐带间充质细胞的组合物的方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了获得特定群的脐带间充质细胞的方法。包含所述特定细胞群的组合物被用于制备可用于细胞治疗的药物产品，如具有降低的射血分数的患者的心脏射血流问题。同时，所述亚群被用于制备药物产品，该药物产品可用于在关节磨损的情况下减轻疼痛和恢复功能，用于治疗呼吸问题如肺损害、急性肺损伤，如急性呼吸窘迫综合征，以及用于治疗皮肤病变，如慢性伤口和溃疡。

Description

获得包含特定群的脐带间充质细胞的组合物的方法及其用途

技术领域

本发明包含于医学领域内。特别地，本发明提供了获得特定群的脐带间充质细胞的方法，所述细胞被用于获得组合物，该组合物用于治疗和/或预防心力衰竭患者的射血不足；用于患有关节磨损问题患者减轻疼痛和改善功能；用于治疗呼吸问题以及用于皮肤病变。

背景技术

人多能基质细胞(h-MSCs)是具有特定特征(诸如表现出特定免疫表型、粘附和分化为不同的细胞系)的基质细胞，如“国际细胞治疗学会(International Society forCell Therapy)”[1]所定义。除了其他的特征外，这些细胞具有的特征是免疫调节能力，因为它们能够抑制同种反应性T淋巴细胞的响应。

考虑到这一点，背景为已经考虑将h-MSCs用于新的细胞治疗。细胞治疗，无论是自体的还是同种异体的(异基因的)，已经在各种疾病和病况中进行了广泛的研究，如帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化症、辐射诱发的肠损伤、炎性肠病、肝病、杜氏肌营养不良症和糖尿病，其显示出不同的结果[2,3]。

h-MSC的来源是从脐带获得的细胞。然而，这些细胞是异质的，表达不同的表面标记物并且具有不同的分化能力，出于这一原因，必须选择h-MSCs。目前，在科学界已达成共识，即以这样的方式定义h-MSC细胞，其基于表面标记物的表达特征来考虑同一性和纯度标准。具体而言，对于要被认为是间充质干细胞的细胞，其必须表达标记物：CD73、CD90和CD105，而标记物CD45、CD14、CD19必须缺失。进行该具有该表达模式的细胞的选择是为了防止其他类型的细胞的任何污染。也可以通过CD34的阴性表达来对其进行选择，标记物被用于排除造血前体的污染。另外，应缺失HLA-DR，其是一种主要的II类组织相容性复合物分子，是可能的免疫应答的预测因子[1]。

另外，为了被称为间充质细胞，它们必须具有分化为脂肪细胞、成软骨细胞和成骨细胞(在三个系中的分化)的潜力。最近已发现，可以从多种组织中获得h-MSCs，如脂肪组织、胎盘、牙髓和脐带。因此，结果是，除了具有传统的三个系的分化之外，这些细胞还可以分化为非传统系以产生细胞，如肌细胞、内皮细胞、肝细胞和神经元细胞。据信，h-MSCs的自我更新和分化的机制一组生长因子、受体、细胞内信号转导分子和转录因子而定。因此，这些因素可用于识别这些因素。采用一组h-MSCs用于特定系。

如已经提到的，h-MSCs是具有低免疫原性潜能的多能细胞，其可以从成体组织中分离，包括骨髓、脂肪组织和牙髓及其他来源。起源的生态位代表了评估细胞类型之间的生物学差异的重要因素，因为h-MSC的特性可能会受到微环境变化的极大影响。大多数实验和临床研究都使用了源自骨髓的MSC，但这些细胞在临床应用中具有缺点，包括获得细胞的侵入性程序，以及增殖和分化潜能的降低，这与供体的年龄和合并症(共病)直接相关。相反，除了具有较少细胞衰老且获得它们具有较低的伦理学考虑外，h-MSC脐带易于获得并在体外扩增。

我们的发明涉及获得脐带h-MSC，用于特定的细胞治疗、治疗和/或预防心力衰竭患者的射血不足，其还可用于患有关节磨损问题患者的减轻疼痛和改善功能，其对于治疗呼吸问题如肺部病变和治疗皮肤病变如慢性伤口和溃疡也很有用。

十多年来，细胞治疗已被评估为一种与射血分数(HFrEF)降低相关的心力衰竭的治疗。实验研究报道了通过包括转分化、细胞融合和旁分泌调制在内的机制，改善了心脏功能和受损心脏组织的再生。最近的综述表明，细胞治疗是安全的，并与HFrEF患者的生存、左心室功能和生活质量的中等程度的临床益处相关。利用不同的产品和细胞类型和给药途径，在患有缺血性和非缺血性心脏病的患者中进行了不同的临床研究。其中可以发现骨髓单核细胞和间充质干细胞(MSC)，它们可以是自体的或同种异体的。这些已经通过心肌内、冠状动脉内注射并且特别是通过静脉内注射来给药。

有几项临床研究可治疗心力衰竭的左心室射血分数(LVEF)。在由Lunde K,等人进行的利用100名患有心肌梗死的患者进行的临床研究中，使用了通过冠状动脉内注射给药的自体骨髓单核细胞(BMC)。结果，就LVEF而言，对照组和治疗组之间没有发现差异[4]。Perin EC.等人也在患有心力衰竭的患者中利用BMC细胞进行了随机研究，且与对照相比，BMC治疗的患者的LVEF没有任何改善[5]。Hare J.等人他们进行了临床研究，其中将来自骨髓的同种异体间充质干细胞用于治疗患有急性心肌梗死的患者。作为研究结果之一测量了LVEF，在治疗开始3个月后，观察到治疗患者的LVEF改善了3.6％，但无显著性，然而，在随访6个月后该优势消失[6]。

在另一项研究中，由于缺血性心肌病患有慢性心力衰竭的患者接受了BMC治疗。在60个月的随访后，接受BMC治疗的患者显示射血分数得到了改善[8]。使用骨髓细胞，Seth等人报道了在3年的随访后，相比对照，76％的属于“纽约心脏协会(New York HeartAssociation)”的功能性III类患者具有5.4％的射血分数改善[9]。

因此，在几十年的基础和临床研究后，细胞的总体益处和最佳来源以及给药途径仍未解决。

在关节磨损的问题中，骨关节炎(OA)是最常见类型的关节疾病，是一种退行性和进行性病症，其引起慢性疼痛、残疾、较差的生活质量和更高的死亡率。膝盖是最常受累的部位之一，且目前代表着全球健康问题。一方面，尽管该疾病的病程较慢，但尚无可改善疾病的骨关节炎药物(DMOAD)，并且由于人口老龄化，其流行正在增加，在75岁以上的人口中影响了35％的人。另一方面，由于高昂的医疗费用，该疾病代表了重要的经济负担，包括全膝关节置换术的进行性增加和过早报废。

由于其软骨形成分化能力和抗炎特性，因此基于h-MSC的细胞治疗可以为骨关节炎提供有用的生物学工具[10]。

临床前研究已表明在不同动物模型中进行MSC移植后的阳性结果，其旨在避免、阻碍或逆转软骨退化。从临床的角度来看，已经证明了一系列证据，这些证据主要集中在易患OA的病况上，如软骨局灶性缺损(CDF)和半月板问题。在不同的方案中，已经观察到患有CDF的患者的通过磁共振成像观察到的疼痛评分、组织学方面和形态学方面的改善[11]。经MSC治疗的部分半月板切除术患者发展退行性改变的风险降低3.5。就局部给药而言，几项研究表明，在平均随访5年后未发生严重不良事件[12]。

具体关于膝骨关节炎，近年来，进行6个月的随访，三项先导研究已显示了安全性和临床疗效的早期证据。这些方案基于骨髓MSC(BM)或脂肪组织(AD)的自体治疗[13]。

然而，到目前为止，很少有证据表明用于治疗膝骨关节炎的最佳细胞来源。因此，仍然需要用于该疾病的有效治疗和/或预防的组合物，如本发明的组合物。

考虑到上述背景，发明人开发了从脐带中获得特定群的间充质细胞的方法，所述细胞具有特定的特征，使其可以用于以下方面的安全有效的细胞治疗：改善患有心力衰竭患者心脏的射血容量，如关节磨损损伤中减少疼痛和改善功能、治疗呼吸问题如肺部病变，以及治疗皮肤病变如慢性伤口和溃疡。

附图说明

图1：人脐带的横断面图，其示出了解剖学隔室。

图2：脐带部分。(A)：表示去除羊膜和羊膜下层后的三个纵向切口。(B)：表示去除动脉和静脉后的结缔组织。(C)：表示用培养基将组织定位在板上的方式。

图3：根据国际细胞治疗学会的指导进行细胞定征。来源于脐带的细胞组合物表达了所有常见的MSC标记物，并显示出分化为软骨形成系、成骨系和成脂系的能力。(A)：通过流式细胞术分析细胞组合物，用针对已知MSC表面标记物(蓝色)及其各自的同种型(红色)标记的单克隆抗体对来自脐带的样品进行染色。所有脐带来源的细胞组合物均对CD105、CD73、CD90、CD44、CD146和CD49a呈阳性，但对CD14、CD34、CD31、CD45和HLADR呈阴性。(B)：经过特定的诱导和染色后，来源于脐带的细胞组合物分化的代表性图像：脂肪细胞(油红O)、骨细胞(茜素红)和软骨细胞(番红O)。刻度条＝200mm。所有数据均以至少4名供体的平均值±SEM(n＝3)表示。

图4：UC-MSCs和BM-MSCs在旁分泌因子中显示出不同的特征。通过RT-qPCR对TGFβ3表达进行定量，并通过ELISA测量HGF。来自不同来源的脐带的HGF所具有的分泌要比BM-MSC的分泌大，其有兴趣被用作选择方法。***p<0.001，+p<0.05，++p<0.001，UC-MSC-4相比于UC-MSCs-1、2和3。

图5：通过特定标记物进行的亚群定征，核准的细胞(lot CU-108-6)具有标记物CD44、CD56、CD105、CD254(RANKL)和CD325(N-钙粘蛋白)。

图6：UC-MSCs和BM-MSCs显示出相同的抑制促炎性T细胞的抑制物能力。将从患有扩张性心肌病伴心力衰竭和射血分数降低(HFrEF)的患者中获得的PHA激活的以CFSE标记的hPBMC，以1:10的比例(MSCs:hPBMC)与MSC或不与MSC共同培养。(A)：通过在培养72小时后降低CFSE的强度来评估T细胞增殖，左侧的图代表CFSE的代表性增殖图(浅色直方图代表激活的PBMC，且深色直方图代表与MSCs共培养的激活的PBMC)。(B)：来自PBMC和MSCs的共培养物中的Th1、Th2、CD8和调节性T细胞的分析。结果表示为使用了hPBMC(健康供体患者和DCM)、UC-MSC和BM-MSC至少3名不同的供体的至少3个独立实验的平均值±SEM。***p<0.001UC-MSCs或BM-MSC关于PHA。

图7：与BM-MSCs相比，来源于脐带的细胞组合物具有更高的迁移能力。通过16小时后对患有HFREF患者血清的响应的transwell测定来评估这些细胞类型的迁移能力。图像显示出了紫色晶体的代表性染色，而图显示出了迁移细胞％的定量。图中显示的数据对应于利用至少三名血清供体UC-MSCs和BM-MSCs的平均值±SEM。*P<0.05UC-MSC vs BM-MSCs。

图8：研究组中从基线到治疗后12个月的心脏磁共振测量值的变化。(A)：左心室的射血分数(LVEF)。(B)：左心室的最终舒张容积(LVEDV)。(C)：左心室的最终收缩容积(LVESV)。实线表示用来源于脐带的细胞组合物处理的组(每个方案n＝14)。虚线表示安慰剂组(每个方案n＝13，从1名患者撤消知情同意)。统计分析基于各组参考和随访措施之间混合效应的最大可能性的回归以及组之间的变异性进行。

图9：实施例“患有股骨、髌骨和胫骨之间相互作用问题的患者”的研究和患者群体的设计。

图10：来自实施例2“患有股骨、髌骨和胫骨之间相互作用问题的患者的临床研究”的患者疼痛的WOMAC图表。

图11：用于评估实施例2“患有股骨、髌骨和胫骨之间相互作用问题的患者的临床研究”的患者功能的WOMAC图表。

图12：实施例2“患有股骨、髌骨和胫骨之间相互作用问题的患者的临床研究”的患者的总Womac指数图。

图13：实施例2“患有股骨、髌骨和胫骨之间相互作用问题的患者的临床研究”的患者的OMERACT–OARSI响应指数。

图14：通过实施例2“患有股骨、髌骨和胫骨之间相互作用问题的患者的临床研究”的患者的总WORMS得到结构结果。

图15：根据国际细胞治疗学会的指导进行细胞定征。来源于脐带的CU-989-6细胞组合物表达所有常见的MSC标记物，并显示出分化为软骨形成系、成骨系和成脂系的能力。(A)：通过流式细胞术分析细胞组合物CU-989-6，用针对已知的MSC表面标记物及其各自同种型的单克隆抗体对来自脐带的样品进行染色。所有脐带来源的细胞组合物均对CD73、CD90、CD105呈阳性，且对CD45、CD34、CD14、CD19和HLA-DR呈阴性。(B)：具有上述标记物的存在百分比加上本专利中提出的针对标记物CD44、CD56、CD105、RANKL和N-钙粘蛋白的选择标准的标记物的表。(C)：经过特定的诱导和染色后，来源于脐带的细胞组合物分化的代表性图像：骨细胞(茜素红)、脂肪细胞(油红O)和软骨细胞(番红O)。

图16：根据国际细胞治疗学会的指导进行细胞定征。来源于脐带的CU-745-3细胞组合物表达所有常见的MSC标记物，并显示出分化为软骨形成系、成骨系和成脂系的能力。(A)：通过流式细胞术分析了CU-745-3细胞组合物，用针对已知的MSC表面标记物及其各自同种型的单克隆抗体对来自脐带的样品进行染色。所有脐带来源的细胞组合物均对CD73、CD90、CD105呈阳性，且对CD45、CD34、CD14、CD19和HLA-DR呈阴性。(B)：具有上述标记物的存在百分比加上本专利中提出的针对标记物CD44、CD56、CD105、RANKL和N-钙粘蛋白的选择标准的标记物的表。(C)：经过特定的诱导和染色后，来源于脐带的细胞组合物分化的代表性图像：骨细胞(茜素红)、脂肪细胞(油红O)和软骨细胞(番红O)。

图17：根据国际细胞治疗学会的指导进行细胞定征。来源于脐带的CU-108-6细胞组合物表达所有常见的MSC标记物，并显示出分化为软骨形成系、成骨系和成脂系的能力。(A)：通过流式细胞术分析CU-108-6细胞组合物，用针对已知的MSC表面标记物及其各自同种型的单克隆抗体对来自脐带的样品进行染色。所有脐带来源的细胞组合物均对CD73、CD90、CD105呈阳性，且对CD45、CD34、CD14、CD19和HLA-DR呈阴性。(B)：具有上述标记物的存在百分比加上本专利中提出的针对标记物CD44、CD56、CD105、RANKL和N-钙粘蛋白的选择标准的标记物的表。(C)：经过特定的诱导和染色后，来源于脐带的细胞组合物分化的代表性图像：骨细胞(茜素红)、脂肪细胞(油红O)和软骨细胞(番红O)。

图18：根据国际细胞治疗学会的指导进行细胞定征。来源于脐带的CU-668-K细胞组合物表达所有常见的MSC标记物，并显示出分化为软骨形成系、成骨系和成脂系的能力。(A)：通过流式细胞术分析细胞组合物CU-668-K，用针对已知的MSC表面标记物及其各自同种型的单克隆抗体对来自脐带的样品进行染色。所有脐带来源的细胞组合物均对CD73、CD90、CD105呈阳性，且对CD45、CD34、CD14、CD19和HLA-DR呈阴性。(B)：具有上述标记物的存在百分比加上本专利中提出的针对标记物CD44、CD56、CD105、RANKL和N-钙粘蛋白的选择标准的标记物的表。(C)：经过特定的诱导和染色后，来源于脐带的细胞组合物分化的代表性图像：骨细胞(茜素红)、脂肪细胞(油红O)和软骨细胞(番红O)。

图19：根据国际细胞治疗学会的指导进行细胞定征。来源于脐带的CU-837-8细胞组合物表达所有常见的MSC标记物，并显示出分化为软骨形成系、成骨系和成脂系的能力。(A)：通过流式细胞术分析细胞组合物CU-837-8，用针对已知的MSC表面标记物及其各自同种型的单克隆抗体对来自脐带的样品进行染色。所有脐带来源的细胞组合物均对CD73、CD90、CD105呈阳性，且对CD45、CD34、CD14、CD19和HLA-DR呈阴性。(B)：具有上述标记物的存在百分比加上本专利中提出的针对标记物CD44、CD56、CD105、RANKL和N-钙粘蛋白的选择标准的标记物的表。(C)：经过特定的诱导和染色后，来源于脐带的细胞组合物分化的代表性图像：骨细胞(茜素红)、脂肪细胞(油红O)和软骨细胞(番红O)。

图20：用细胞组合物CU-745-3治疗4名患者的结果。根据指数西安大略省和麦克马斯特大学的骨关节炎指数(WOMAC)提供的用于比较治疗前的基线状态相对于给药治疗后3个月的评估的结果。

图21：用细胞组合物CU-745-3治疗3名患者的结果。根据指数西安大略省和麦克马斯特大学骨关节炎指数(WOMAC)提供的用于比较治疗3个月时患者的状况相对于给药治疗6个月时的评估的结果。

图22：1年时间内用细胞组合物CU-108-6和CU-745-3治疗3名患者的结果。根据心室射血分数的百分比提供的结果。

图23：细胞治疗用于治疗急性呼吸窘迫综合征的有效性。(A)：患有急性呼吸窘迫综合征的患者在用使用本文件中所述方法学获得的细胞组合物进行治疗前的胸部计算机断层扫描(隆突部分)。(B)用本发明的方法学选择的细胞组合物治疗后13天的患者的胸部计算机断层扫描(隆突部分)。

图24：通过使用通过本文所述方法选择的细胞组合物108-6和745-3的皮肤再生的改善的评估。(A)：在不同时间评估的伤口的代表性图像。(B)：在不同时间的伤口闭合百分比，使用Image J软件计算闭合百分比。(C)：14天后活组织检查中血管生成的定量，使用软件VesSeg-Tool进行分析。值表示均值±标准误，且为了比较细胞组合物组vs.盐水组的显著性，使用t检验(曼-惠特尼)，*p≤0.05。UC-MSC：通过本发明的方法获得的细胞组合物。

发明内容

本发明涉及获得脐带间充质干细胞的亚群的方法，任选地选自存在于脐动脉、静脉和羊膜下组织内面的周围的结缔组织。包含该特定细胞群的组合物被用于制备药剂，其被用于细胞治疗如具有降低的射血分数患者的心脏射血流问题。同时，该亚群被用于制备用于减轻疼痛和恢复关节磨损的功能的药物。并且其也可用于治疗呼吸问题如肺部病变，以及用于治疗皮肤病变如慢性伤口和溃疡。

获得包含特定群的脐带间充质细胞的组合物的方法包括以下阶段：

a)培养和扩增脐带间充质细胞，

b)通过N-钙粘蛋白CD44、RANKL、CD105和CD56标记物中的至少3种的存在来对其进行选择。

其中，任选地在阶段b)之后，通过产生肝细胞生长因子(HGF)来进行先前的选择，选择培养物，其在培养基中分泌超过1000pg/mL的HGF；优选在培养基中超过1500pg/mL，或超过2000pg/mL，且最尤其是超过2500pg/mL的HGF。

另外，任选地，在步骤b)之后，通过TGF-β3表达进行任选的选择，选择与评估的样品相比表达最高水平的相对表达的培养物。

在优选的实施方式中，任选地，脐带间充质细胞是特异性地从包围动脉和脐静脉的以及与羊膜下层的内面相邻的结缔组织细胞获得的。在该实施方式中，首先去除脐带中的羊膜层和羊膜下层，其次，穿过动脉和脐静脉做出3个纵向且平行的切口，以露出静脉和动脉，并将其从组织中去除。在获得的没有动脉和静脉的切口处涂上培养基，使得与静脉和动脉相邻的结缔组织与培养板直接接触。

另一方面，任选地在步骤a)中，将细胞培养至少8天，或至少10天。

为了获得间充质细胞，，根据它们的标记物，通过将表达超过95％的CD105、CD73和CD90且同时不表达，即表达少于2％的CD45、CD34、CD14和HLA-DR的那些选择为间充质细胞，通过细胞计数法选择培养的细胞。随后，所选择的间充质细胞根据阶段b)中建立的进行扩增和分离。

最后，在步骤b)中，选择细胞，因为其表达标记物CD105、CD44、RANKL或CD56中的至少2种和N-钙粘蛋白。更特别地，选择细胞，因为其表达标记物CD105、CD44或CD56中的至少1种、N-钙粘蛋白和RANKL。优选地，选择细胞，因为其表达标记物CD105、CD44或CD56中的至少2种、N-钙粘蛋白和RANKL，且最优选地选择细胞，因为其表达N-钙粘蛋白、RANKL、CD105、CD44和CD56。

组合物包含特定群的脐带间充质细胞，包括表达标记物CD105、CD44、RANKL或CD56中的至少2种和N-钙粘蛋白的间充质细胞，且其通过本发明的方法获得。

本发明还旨在包含来自根据描述的方法获得的特定群的脐带间充质细胞的细胞的组合物用于制备用于细胞治疗的药剂的用途。特别是制备有用的药物来治疗心脏射血流问题。更特别地，制备静脉内给药的用于治疗心脏射血流问题的药剂。其中其优选地用于制备可用于治疗心力衰竭的药物。

在另一实施方式中，通过本发明的方法获得的组合物可用于制备用于治疗疼痛和改善与关节磨损问题有关的功能的药剂。特别是用于治疗股骨、胫骨和髌骨之间的相互作用中的磨损；或用于治疗股骨头与髋臼之间的磨损；或用于治疗距骨、胫骨和腓骨之间的磨损；或用于治疗挠骨、尺骨和腕/腕骨之间的磨损，或用于治疗膝关节的磨损。即，本发明的组合物用于制备用于治疗脚踝、臀部、膝盖、腕部、肩膀、手指、肘颈和脊骨的关节上的磨损的药剂。

另一方面，通过本发明的方法获得的组合物可用于制备药剂，该药剂用于治疗呼吸问题，如肺部病变、急性肺部病变，如急性呼吸窘迫综合征和用于治疗皮肤病变，如慢性伤口和溃疡。

具体实施方式

定义

在本发明的上下文中，术语“间充质干细胞”(“MSCs”)是指来源于组织-中胚层的多能祖细胞。其具有分化成组成脂肪、骨骼、软骨和肌肉组织的细胞的能力。国际细胞治疗学会建立的最低标准提出，要确保MSC的同一性，细胞必须对于CD73、CD90和CD105标记物为阳性的，且对于CD45、CD34和CD14标记物为阴性的。MSCs几乎可以在人体的所有组织中找到。

如本申请中所使用的，“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的稀释剂”是指与药学给药相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂。这样的介质和剂用于药学活性物质的用途是本领域熟知的。可接受的媒介物、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对受体无毒，并且在不限制本发明范围的情况下，包括：另外的缓冲剂；防腐剂；共溶剂；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；螯合剂，如EDTA；金属配合物(例如，Zn蛋白配合物)；可生物降解的聚合物，如聚酯；成盐的抗衡离子，如钠，多羟基糖醇；氨基酸，如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸和苏氨酸；有机糖或糖醇，如乳糖醇、水苏糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌肉肌糖(myoinisitose)、肌肉肌醇(myoinisitol)、半乳糖、半乳糖醇、甘油、环溶胶(例如，肌醇)、聚乙二醇；含硫的还原剂，如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量蛋白质，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或其他免疫球蛋白；以及亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮。

如本申请中所使用的，术语“治疗(treatment)”和“疗法(therapy)”是指旨在解决健康问题，使用的意图是治愈和/或缓解疾病和/或症状的一组卫生、药理、外科和/或物理手段。术语“治疗(treatment)”和“疗法(therapy)”包括预防性、治愈性和姑息性的方法，因为二者均旨在维持和/或恢复个体或动物的健康。不论症状、疾病和无能的起源如何，在本申请的上下文中，给药合适的药物以减轻和/或治愈健康问题应被解释为一种治疗或疗法的形式。

如本申请中所使用的术语“预防”是指用于预防疾病和/或症状的发作和/或发展的一组卫生、药理、外科和/或物理手段。术语“预防”包括预防性方法，因为这些方法用于维持动物或个体的健康。

在本申请中，术语“个体”、“患者”或“受试者”可互换使用，并且不旨于以任何方式进行限制。“个体”、“患者”或“受试者”可以是任何年龄、性别和身体状况。

术语“治疗有效量”是指具有治疗作用并且能够预防和/或治疗疾病和/或损伤的活性成分和/或细胞的量。

术语“心力衰竭”是指心脏无法满足其需求，且具体是心脏无法以正常效率泵血。在优选的实施方式中，心力衰竭是射血分数降低的慢性心力衰竭。

术语“具有降低的射血分数的心力衰竭”是指这样的心脏病况，其中患者患有心脏排出的血液量不足，通常在超声心动图上以左心室射血分数为40％或更少来证明。

术语“慢性”是指持续较长时间或不断重复的病况和/或疾病。

发明人已经开发出一种方法来从脐带中获得细胞群，其特别适合于治疗心室射血问题和关节磨损问题，特别是由于股骨、髌骨和胫骨之间的相互作用而引起的磨损。并且还用于治疗呼吸问题如肺部病变和用于治疗皮肤病变如慢性伤口和溃疡。

一般而言，本发明的方法包括特异性地获得包围动脉和脐静脉的以及与脐带的羊膜下层的内面相邻的结缔组织细胞；培养并扩增获得的细胞，确认这些是间充质细胞，并且细胞还对N-钙粘蛋白、CD44、RANKL、CD105和CD56标记物中的至少3种有响应。任选地，但优选在通过所示标记物选择后，通过产生肝细胞生长因子(HGF)来进行选择，选择分泌超过1000pg/mL HGF的细胞培养物。与该最后阶段平行地，通过RT-qPCR进行TGF-β3表达的评估。

如本发明的背景所指出的，当例如在细胞治疗中使用时，不同的蛋白质表达模式，如生长因子和表面标记物(CDs)与这些细胞的分化和潜能有关。发明人已经确定，从脐带内的结缔组织的某些区域获得的间充质细胞，如下所详述的，并且同时表达选自N-钙粘蛋白、CD44、RANKL、CD105和CD56的5种标记物中的至少3种，并且任选地分泌大量肝细胞生长因子(HGF)，且当用于不同的细胞治疗时，TGF-β3表达具有更好的效果。具体而言，这些细胞可用于治疗，以在以下方面提供更好的结果：改善心室射血问题、关节磨损，用于治疗呼吸问题，以及用于治疗皮肤病变。

被选为本发明细胞亚群标记物的这些分子可以诱导或阻断分化系：

-N-钙粘蛋白是一种在细胞-细胞通信中起作用的跨膜蛋白。该蛋白也与细胞粘附有关，并参与心肌分化[14]。由于其表达谱的变化，其也被描述为重要的调节剂，用于来自骨髓的间充质干细胞的骨生成[15,16]。

-CD44是参与h-MSCs的细胞生长、存活和分化的蛋白质的标记物[17]。该分子已被提出作为与透明质酸相互作用的3D基质中软骨形成通路活化的候选物[18]。

-RANKL已被认为是破骨细胞形成中的重要蛋白质，因此，当存在时，其能够抑制成骨通路[19]。

-尽管CD105是h-MSC中的典型标记物，但其是β型组织转化因子(TGF-β)的信号转导的重要辅助受体，还与心脏基质细胞的血管形成旁分泌刺激有关[20]。

-CD56是一种表面蛋白，据报道与其他标记物如MSCA-1组合时，与其不存在时相比，它们具有更大的分化为软骨形成和胰腺通路的潜力。该蛋白也与细胞迁移、细胞-细胞和细胞-基质相互作用有关。该分子在心脏中的具有的表达谱表明其可能调节不同的事件，如不同细胞类型之间的相互作用。

另外，这5种标记物还可用于选择有助于改善呼吸损伤问题的细胞。这些被选为细胞亚群标记物的分子可以调节以下响应：

-CD44：是间充质细胞用于促进抗炎响应和高吞噬活性以治疗呼吸损伤模型如急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的细胞外囊泡中存在的标记物[27]

-RANKL：已有描述，RANKL在间充质细胞中的表达调节着主要肥厚性(hypertropability)复合物的II类分子(MHC II)，其干扰了炎症响应[28]。

-CD105：研究已经证实CD105阳性细胞可用于治疗呼吸病变，如ALI或其更严重的ARDS形式[29]。另外，已经提出该标记物在血管生成、内皮细胞增殖和脉管系统发育中发挥着作用[30]；这对于患有ARDS的患者中的气体交换界面的修复至关重要[31]。

-CD56：考虑到输注的MSC细胞的分布，它主要在肺中容纳这些细胞[32]，并且CD56是由与细胞-细胞和细胞-基质相互作用有关的间充质干细胞表达的标记物[33]，该标记物的存在将促进与肺中受影响组织的相互作用。

-N-钙粘蛋白：对于间充质细胞，已经描述了N-钙粘蛋白负责调节血管内皮生长因子(VEGF)，其是血管形成(血管生成)中的关键因子[34]。另外，已经描述了MSCs借助于VEGF治疗肺部病变的治疗重要性[35]。

因此，MSC中N-钙粘蛋白标记物的存在在治疗肺部病变中起着作用

此外，这5种标记物还可用于选择有助于改善皮肤伤口问题的细胞。这些被选为细胞亚群的标记物的分子可以调节以下响应：

-CD44：其是一种已被用于鉴定干细胞的细胞表面粘附受体[36]，具体而言，由于细胞迁移，该标记物的表达在皮肤伤口的组织再生中起着基本作用[37,38]。

-RANKL：已有描述，RANKL在间充质细胞中的表达调节了主要肥厚性(hypertropability)复合物(MHC II)的II类分子[28]。该复合物直接与伤口修复机制相互作用[39]。

-CD105：该标记物与血管生成、内皮细胞增殖和脉管系统的发展有关[30]，这是治疗伤口的关键要素。具体来说，这是干细胞用于长期调节炎症期和造血细胞重新聚集的标记物[40]。

-CD56：是由间充质干细胞表达的标记物，其与通过细胞-细胞和细胞-基质相互作用的细胞粘附有关[33]，因此，该标记物的存在将促进MSC粘附于受影响区域。

-N-钙粘蛋白：对于间充质细胞，已经描述了N-钙粘蛋白负责VEGF的调节，其是组织再生中血管形成(血管生成)的关键因素[3.4]。因此，MSC中N-钙粘蛋白标记物的存在在伤口治疗中起着作用。

人MSCs可以分泌肝细胞生长因子(HGF)，该蛋白可以起旁分泌或自分泌的作用，并可以调节不同类型细胞和组织中的细胞生长、运动性和形态发生[21]。HGF以其前体形式合成和分泌，并响应于对一些组织如肝、肾、肺和胃等的损伤而被蛋白水解激活，从而参与组织的修复和再生，与凝血和纤溶系统相关[21]。例如，已经描述了HGF在介导伤口愈合和心脏保护响应中存在[23]。

另外，人MSCs还可以产生转化生长因子β-3(TGF-β3)，该因子是细胞因子家族的一种蛋白质，其与胚胎发生、发育和细胞分化有关。研究表明，TGF-β3的存在有助于改善软骨细胞II型胶原和糖胺聚糖(GAGs)的合成，并且这种合成有助于将UC-MSC与软骨细胞区分开[24]。另一方面，TGF-β3也因其抗纤维化活性[25]及其在组织再生中的作用[26]而闻名。

尽管所有选定的标记物都是已知的，但目前尚无文件可以预期获得具有这些特征的细胞亚群的方法，N-钙粘蛋白、CD44、RANKL、CD105和CD56标记物中的至少3种的存在与利用这些细胞的疗法的更高疗效的相关性也不明显，尤其对于治疗和/或预防心力衰竭患者的射血不足，并且还可以用于具有关节磨损问题患者中减轻疼痛和改善功能；用于治疗呼吸问题如肺损伤、急性肺损伤如急性呼吸窘迫综合征，以及用于治疗皮肤病变如慢性伤口和溃疡。

脐带处理

为了实施本发明的方法，经知情同意后通过剖腹产提取足月人胎盘来获得脐带，从健康供体获得并无菌储存在抗生素缓冲溶液中。

将脐带存储在无菌缓冲液，如Hank's生物碳酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。更优选地，将脐带存储在PBS溶液中。

如同所指示的，分别用浓度在50-300单位/ml和50-300μg/ml之间的抗生素如青霉素和链霉素处理脐带。更优选地，分别用100单位/ml和100μg/ml的青霉素和链霉素处理脐带。

在优选的实施方式中，应根据本发明的方法将脐带切片，并在不超过5小时的时间内用缓冲溶液和抗生素洗涤。更优选地，该过程不超过4小时。更优选地，切片和洗涤过程不应花费超过3小时。

在任选的实施方式中，本发明的目标组织位于存在于脐动脉、脐静脉周围的层内，并且结缔组织外面与羊膜下层接触，如图1所示。将脐带横切成8至10cm的小段后，将羊膜层和羊膜下层去除，以露出包含静脉和脐动脉的结缔组织。

如图2A所示，通过结缔组织的三个平行的纵向切口，如图2B所示露出并去除静脉和脐动脉，然后将这些动脉和脐静脉周围的层接种到培养板中并维持在稳定培养基中，如图2C所示。重要的是，目标组织与培养板直接接触。

稳定培养基可以由以下任何要素组成，如细胞培养基、糖、抗生素、抗真菌剂和氨基酸。优选地，培养基应包含培养基，如DMEM-F12，具有或不具有高葡萄糖浓度的DMEM，具有或不具有高葡萄糖浓度的α-MEM，抗生素如青霉素和链霉素，抗真菌剂如两性霉素和氨基酸如L-谷氨酰胺。更优选地，培养物中应包含10ml的Eagle最低必需培养基(MEM)、具有高葡萄糖连接性(Gibco,Gran Island,USA)的补充有10％热灭活的胎牛血清(FBS；Gibco,USA)、1％青霉素/链霉素和2mM L-谷氨酰胺(LG)(Gibco,Gran Island,USA)的α改性(α-MEM)(Gibco,Gran Island,USA)。

通过外植体分离细胞亚群

为了获得存在于包围脐动脉和静脉的层中的细胞群，必须将组织植入如图2C所示的培养板中，使包围动脉和脐静脉的层进入底部内部板。这种外植体技术允许从结缔组织中获得能够迁移并粘附于斑块的细胞群。在细胞粘附的10至15天的标准时间的情况下，能够迁移并粘附于板的细胞群将来自所有结缔组织。采用不同的方法，本发明提出的技术的目的是仅获得存在于包围脐动脉和静脉的层中的细胞群，因此，迁移/粘附时间必须比通常的外植体技术短。在优选的实施方式中，允许细胞迁移出结缔组织并粘附于斑块内底部的时间不应超过10天。更优选地，细胞迁移和粘附的时间不应长于8天。

在首个48小时内，包围动脉和脐静脉的组织很可能会粘附于斑块，一旦这发生，应每3天用新鲜培养基替换稳定培养基，并连续分开培养直到第3代。

必须以相同的方式重复此过程来获得存在于脐动脉和静脉周围的层中的细胞群，以获得位于被羊膜下组织包围的结缔组织外面组织中的细胞。

一旦细胞培养物达到70％-80％的融合度，就必须从斑块中分离细胞，并根据获得细胞的组织片段将其重新接种在单独的瓶子中。在优选的实施方式中，可以通过TrypLE^TMExpress(Gibco,Gran Island,USA)将细胞与板分离，并随后以2,500细胞/cm²的密度接种在500cm²的烧瓶(Nunc,Denmark)中，以鉴定从中提取细胞的组织片段。

应将细胞培养物传至第3代，以随后根据国际细胞治疗学会的指导[1]进行定征。

根据国际细胞治疗学会的指导进行定征

在优选的实施方式中，应根据国际细胞治疗学会的指导，使用针对标记物CD105、CD73、CD90、CD45、CD34、CD14、HLA-DR的细胞计数法和成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞中的体外分化进行定征，如图3所示。

在优选的实施方式中，组合物中至少90％的细胞是CD105阳性的。优选地，至少91％、92％、93％或94％的细胞是CD105阳性的。更优选地，95％或更多的细胞是CD105阳性的。

在优选的实施方式中，组合物的至少90％的细胞是CD73阳性的。优选地，至少91％、92％、93％或94％的细胞是CD73阳性的。更优选地，95％或更多的细胞是CD73阳性的。

在优选的实施方式中，组合物的至少90％的细胞是CD90阳性的。优选地，至少91％、92％、93％或94％的细胞是CD90阳性的。更优选地，95％或更多的细胞是CD90阳性的。

在优选的实施方式中，组合物中至少90％的细胞是CD105、CD73和CD90阳性的。优选地，至少91％、92％、93％或94％的细胞是CD105、CD73和CD90阳性的。更优选地，95％或更多的细胞是CD105、CD73和CD90阳性的。

在优选的实施方式中，组合物中少于10％的细胞是CD45阳性的。优选地，少于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％或3％的细胞是CD45阳性的。更优选地，2％或更少的细胞是CD45阳性的。

在优选的实施方式中，组合物的少于10％的细胞是CD34阳性的。优选地，少于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％或3％的细胞是CD34阳性的。更优选地，2％或更少的细胞是CD34阳性的。

在优选的实施方式中，组合物中少于10％的细胞是CD14阳性的。优选地，少于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％或3％的细胞是CD14阳性的。更优选地，2％或更少的细胞是CD14阳性的。

在优选的实施方式中，组合物的少于10％的细胞是HLA-DR阳性的。优选地，少于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％或3％的细胞是HLA-DR阳性的。更优选地，2％或更少的细胞是HLA-DR阳性的。

在优选的实施方式中，组合物的少于10％的细胞是CD45、CD34、HLA-DR和/或CD14阳性的。优选地，少于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％或3％的细胞是CD45、CD34、HLA-DR和/或CD14阳性的。更优选地，2％或更少的细胞是CD45、CD34、HLA-DR和/或CD14阳性的。

在优选的实施方式中，组合物的至少70％的细胞是活的。优选地，至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％或79％的细胞是活的。更优选地，80％或更多的细胞是活的。

在优选的实施方式中，组合物不包括肉眼可见的聚集物、病原微生物(细菌、支原体、梅毒、HBV、HCV、HIV、CMV和真菌)污染和超过0.5EU/ml的内毒素浓度。

通过该程序获得的细胞可被认为是适合细胞治疗的间充质细胞。

MSC亚群定征

一旦将细胞确认为间充质细胞，本发明人已经开发了通过细胞计数法基于5种标记物进行细胞培养物的选择。将通过标记物CD105、CD56、CD44、RANKL和N-钙粘蛋白中的至少3种的存在来选择这些细胞培养物。发明人已经确定，对这些标记物有响应的细胞特别适用于治疗心室射血问题和关节磨损问题，例如在股骨、髌骨和胫骨之间的相互作用中；用于治疗呼吸问题如肺损伤、急性肺损伤如急性呼吸窘迫综合征，以及用于治疗皮肤病变如慢性伤口和溃疡。

发明人已经对这些细胞进行了详细的定征，具有以下任何特征的细胞更可能有效地治疗心脏的心室射血不足，并减轻疼痛和恢复由股骨、髌骨和胫骨之间的相互作用产生的磨损的功能；用于治疗呼吸问题如肺损伤、急性肺损伤如急性呼吸窘迫综合征，以及用于治疗皮肤病变如慢性伤口和溃疡。

从亚群定征程序开始，必须洗涤、重悬和孵育从MSC验证中获得的细胞培养物。最优选地，应在pH 7.3和4℃下用无菌PBS将细胞培养物连续洗涤4次。

一旦洗涤完成，应将细胞培养物重悬，在优选的实施方式中，将其用pH 7.3的无菌PBS以1*10⁶的溶液浓度重悬。

混合后，应孵育细胞培养物，在优选的实施方式中，在冰上和黑暗中与抗N-钙粘蛋白、CD44、RANKL、CD105和/或CD56的一抗混合物一起孵育30min。

为了将样品放入流式细胞仪中，应将细胞培养物用10ml的pH 7.3的无菌PBS重悬在无菌的12x75 mm丙烯管中。

对于细胞计数法，更优选地，应使用BD FACS Canto II流式细胞仪。最优选地，亚群应表达CD44、CD56、CD105、N-钙粘蛋白和RANKL，或者这些标记物的组合。

在优选的实施方式中，对于待核准的细胞培养物，组合物中至少10％的细胞是CD44阳性的。优选地，至少10％、11％、12％、13％或14％的细胞是CD44阳性的。更优选地，15％或更多的细胞是CD44阳性的。

在优选的实施方式中，对于待核准的细胞培养物，组合物中至少15％的细胞是CD56阳性的。优选地，至少15％、16％、17％、18％或19％的细胞是CD56阳性的。更优选地，20％或更多的细胞是CD56阳性的。

在优选的实施方式中，对于待核准的细胞培养物，组合物中至少50％的细胞是CD105阳性的。优选地，至少91％、92％、93％或94％的细胞是CD105阳性的。更优选地，95％或更多的细胞是CD105阳性的。

在优选的实施方式中，对于待核准的细胞培养物，组合物中至少10％的细胞是N-钙粘蛋白阳性的。优选地，至少10％、11％、12％、13％或14％的细胞是N-钙粘蛋白阳性的。更优选地，15％或更多的细胞是N-钙粘蛋白阳性的。

在优选的实施方式中，对于待核准的细胞培养物，组合物中至少1％的细胞是RANKL阳性的。优选地，至少1％、2％、3％或4％的细胞是RANKL阳性的。更优选地，5％或更多的细胞是RANKL阳性的。

在优选的实施方式中，对于待核准的细胞培养物，组合物中至少10％的细胞对于标记物CD44、CD56、CD105、N-钙粘蛋白和RANKL中的至少3种是阳性的。优选地，至少11％、12％、13％、14％的细胞对于标记物CD44、CD56、CD105、N-钙粘蛋白和RANKL中的3种是阳性的。更优选地，15％或更多的细胞对于标记物CD44、CD56、CD105、N-钙粘蛋白和RANKL中的至少3种是阳性的。

随后可以通过定征其细胞外产物及其RNA表达来评估满足国际细胞治疗学会和上述亚群的标记物的组的要求的细胞培养。

根据分泌因子的水平进行亚群定征

在优选的实施方式中，应收集来自不同细胞培养物的上清液，并应测量分泌的肝细胞生长因子(HGF)的水平，如图4所示。选择分泌更多HGF的细胞培养物。

在优选的实施方式中，应使用ELISA DuoSet Development System(R&D Systems,Minneapolis,MN)测量不同的上清液。

在优选的实施方式中，应选择在培养基中分泌超过1000pg/ml的肝细胞生长因子(HGF)的细胞培养物。优选地，在培养基中分泌超过1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800或2900pg/ml的HGF的细胞培养物。更优选地，应选择在培养基中分泌超过2500pg/ml的HGF的细胞培养物。最优选地，应选择在培养基中分泌3000pg/ml或更多的细胞培养物。

根据基因表达水平进行亚群定征

在优选的实施方式中，应采集每种细胞培养物的样品并通过RT-qPCR评估TGF-β3的表达，如图4所示。选择表达更大量的TGF-β3的培养物。

在优选的实施方式中，应使用通用SYBR Green定量PCR方案(Merck)RT-qPCR试剂盒测量TGF-β3表达。

核准上述特征的细胞培养物被混合。

一旦将细胞混合物的最终溶液分类，该溶液将被称为“来源于脐带的细胞组合物”，该溶液可以立即使用或其可以冷冻保存以备后用。如果必须使用储存的细胞组合物，则取决于每次治疗所需细胞的数量，必须解冻和扩增冷冻保存的小瓶。在优选的实施方式中，应解冻冷冻保存的小瓶并用补充5％人血小板溶解产物(hPL)的α-MEM扩增至第5-6代。

实施例

实施例1.获得本发明的细胞亚群。

为了获得本发明的细胞亚群，从足月人胎盘中采集脐带样品，在健康供体的知情同意下，通过剖腹产术提取该胎盘；随后将其无菌存储在含有抗生素的缓冲溶液中，如“脐带处理”部分中详细描述的。

随后，按照图2A中提供的模型，将脐带切成8-10cm的段，然后做出三个纵向切口以露出，并然后去除静脉和脐动脉，如图2B所示。将包围动脉和静脉的内面放置在与培养板底部接触的位置，如图2C所示。将迁移并粘附于板上的细胞用在“通过外植体分离细胞亚群”部分中详述的培养基扩增至第3代。

借助于在“MSC亚群的定征”部分中描述的方案验证了获得的不同板。获得的标记物CD105、CD73、CD90、CD45、CD34、CD14、HLA-DR以及成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞中的体外分化的结果如图3所示。大多数板核准该验证，对于CD105、CD73、CD90具有更高的百分比98％，且对于CD45、CD34、CD14、HLA-DR为少于1％。

另外，根据标记物CD105、CD56、CD44、RANKL和N-钙粘蛋白的组，对根据国际细胞治疗学会的指导核准的细胞培养物进行评估。被评估的细胞培养物标记了所有被评估标记物的存在，由此其被核准用于进行下次验证。另外，在这种情况下，如图5所示，还满足了要求，即评估的培养物对于至少3种标记物标记超过15％。

对于核准的培养物，评估了不同细胞培养物上清液中HGF的分泌，如图4所示。对于大多数评估的细胞培养物，HGF的水平均大于2500pg/ml。

平行地，通过RT-qPCR评估TGF-β3的表达，如图4所示。根据上述评估核准的培养物显示较高的TGF-β3表达。

最后，将通过所有测试的细胞培养物混合在来源于最终脐带的细胞组合物中，将该溶液冷冻保存以备后用。当使用组合物时，使用补充有5％人血小板裂解物(hPL)的α-MEM将细胞扩增至第6代。

实施例2.具有降低的射血容积的患者

上述的任何组合物均可用于治疗以下描述的任何患者。发明人已经为特定的患者亚组开发了有效的治疗性和/或预防性治疗。

在优选的实施方式中，患者患有慢性心力衰竭，具有心室腔的射血容积下降。

纳入标准

在优选的实施方式中，患者患有慢性心力衰竭，其扩张的射血分数降低，收缩性心室功能不全通过超声心动图评估由左心室射血分数为40％或更少来界定，如表1所示。

表1 具有降低的射血容积的患者的基线特征。

BMI：体质指数。ACEI：血管紧张素转换酶抑制剂。ARB：血管紧张素II受体阻滞剂。NYHA：纽约心脏协会(New York Heart Association)。GFR：根据CKD-EPI公式的肾小球滤过率。LBBB：左束支传导阻滞。LAFB：左前束状传导阻滞。RBBB：右束支传导阻滞。LVEF：左心室射血分数。LVESV：左心室的最终收缩容积。LVEDV左心室的最终舒张容积。NS：各组之间p>0.05。

在优选的实施方式中，患者不应患有射血分数降低的末期心力衰竭。在可选的实施方式中，患者不应患有复发性心肌缺血。在可选的实施方式中，患者不患有不受控制的室性心动过速。在可选的实施方式中，患者不应患有恶性疾病，其中患者具有的预期寿命为少于1年。在可选的实施方式中，患者不应患有明显的心室不同步。在可选的实施方式中，患者不应患有血液病。在可选的实施方式中，患者不应患有最近的脑血管疾病，其中所述疾病已在最近3个月内发生。在可选的实施方式中，患者必须具有200μM或更低的血清肌酐水平。在可选的实施方式中，患者不应患有心房颤动，其中所述患者在最近3个月内没有最佳心率控制。

在优选的实施方式中，患者不应患有选自由以下组成的组的任何疾病：射血分数降低的末期心力衰竭、反复发作的心肌缺血、不受控制的室性心动过速、恶性疾病(其中患者具有的预期寿命为少于1年)、已显示的心室不同步、血液疾病、最近的脑血管疾病(其中最近3个月内发生疾病)和心房颤动(其中患者最近3个月内没有最佳频率的心脏控制)。

在优选的实施方式中，患者应具有200μM或更低的血清肌酐水平。在优选的实施方式中，患者不应患有充血性心力衰竭。在优选的实施方式中，患者必须是男性。

给药

可以通过以下描述的任何方式将上文描述的任何组合物给药于上文描述的任何患者。

可以通过任何已知的方法来给药组合物。例如，可以经静脉内、病灶内、血管内、动脉内、皮下、脑内、肌内、腹膜内或心室内给药组合物。在优选的实施方式中，经静脉内、动脉内或心室内给药组合物。更优选地，经静脉内给药组合物。

只要剂量包括治疗有效量，可以将任何量的细胞给药于患者。在优选的实施方式中，每千克(kg)患者体重给药至少1x10⁵个细胞。优选地，每kg患者体重给药至少1x10⁵、2x10⁵、3x10⁵、4x10⁵、5x10⁵、6x10⁵、7x10⁵、8x10⁵或9x10⁵个细胞。更优选地，每kg患者体重给药约1x10⁶个细胞。术语“约”是指±10％的可变性。

可以给药氢化可的松以防止任何类型的过敏反应。在优选的实施方式中，在给药组合物之前，将至少50mg的氢化可的松给药患者。优选地，将60、70、80或90mg的氢化可的松给药于患者。更优选地，在给药组合物之前，将100mg的氢化可的松给药于患者。

可以给药氯苯那敏以防止输血后反应。在优选的实施方式中，在给药组合物之前，将至少5mg的氯苯那敏给药患者。优选地，将6、7、8或9mg的氯苯那敏给药于患者。更优选地，在给药组合物之前，将10mg的氯苯那敏给药于患者。

在优选的实施方式中，在给药组合物之前，将至少50mg的氢化可的松和/或至少5mg的氯苯那敏给药患者，并且在给药氢可的松和/或氯苯那敏后至少10分钟给药组合物。优选地，在给药氢化可的松和/或氯苯那敏后至少15、20或25分钟给药组合物。更优选地，在给药氢化可的松和/或氯苯那敏后至少30分钟给药组合物。

在优选的实施方式中，在给药组合物之前将100mg的氢化可的松和10mg的氯苯那敏给药于患者，并在给药氢化可的松和/或氯苯那敏后至少30分钟给药组合物。在优选的实施方式中，在治疗开始时给药一次氢化可的松和/或氯苯那敏，以避免任何输注反应。

在优选的实施方式中，组合物与一种或多种选自由以下组成的组的治疗剂一起用于联合治疗：血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素II受体阻滞剂、β阻滞剂、利尿剂、拮抗剂、醛固酮、正性肌力药和地高辛，和/或与选自由以下组成的组的外科干预或医疗设备联合：冠状动脉搭桥手术、心脏瓣膜的修理或更换、植入式心脏复律除颤器、心脏再同步治疗、双心室刺激、泵浦心脏和心脏移植。

血管紧张素转化酶抑制剂的实例包括：贝那普利、卡托普利、依那普利、福辛普利、赖诺普利、莫西普利、培哚普利、奎那普利、雷米普利、西拉普利、地拉普利、培哚普利、莫西普利、螺普利、替莫普利、依米拉普利(imilapril)和群多普利。

血管紧张素II受体阻滞剂的实例包括：氯沙坦、坎地沙坦、替米沙坦、奥美沙坦、缬沙坦、厄贝沙坦、依普沙坦、他托沙坦和阿奇沙坦。

β受体阻滞剂的实例包括：醋丁洛尔、阿替洛尔、倍他洛尔、富马酸比索洛尔、卡替洛尔、卡维地洛、艾司洛尔、拉贝洛尔、酒石酸盐和琥珀酸酯形式的美托洛尔、纳多洛尔、奈比洛尔、喷布洛尔(penbutolol)、吲哚洛尔、普奈洛尔(propanolol)、索他洛尔、左布诺洛尔、美托洛尔(metolololol)、塞利洛尔、布新洛尔和噻吗洛尔(timolol)。

利尿剂的实例包括：氯噻嗪、氯噻酮、吲达帕胺、氢氯噻嗪、甲氯噻嗪(methiclotiazide)、美托拉宗、布美他尼、呋塞米、依他尼酸(ethacrynate)、托拉塞米、阿米洛利盐酸盐和氨苯蝶啶。

醛固酮拮抗剂的实例包括：螺内酯、依普利酮、依普利酮(inspra)、坎利酮、坎利酸钾和螺内酯。

正性肌力药物的实例包括：多巴酚丁胺、异丙肾上腺素、依洛昔酮、米力农、氨力农、普瑞特罗、多巴胺、左西孟旦、地高辛、去甲肾上腺素、肾上腺素、麻黄碱、甲氧明、苯肾上腺素、异波帕胺、多培沙明、胰高血糖素、钙、沙丁胺醇、吡布特罗。

在优选的实施方式中，组合物应给药一次和/或可以给药多于一次。在优选的实施方式中，患者接受治疗方案，其中在治疗开始时将剂量给药患者。在优选的实施方式中，治疗应持续不超过12个月。

研究的预期结果

预期的安全性结果包括静脉输注来源于脐带的细胞组合物或安慰剂后立即发生的不良事件；发生全球死亡、重大心血管事件(由心血管死亡、因代偿失调的心力衰竭(HF)导致的住院、非致命性心肌梗死的组合结果所界定的)以及其他不良事件，包括心脏病发作、持续性室性心律不齐和恶性事件。

预期的主要疗效评估标准是在超声心动图上左心室射血分数(LVEF)的变化。另外，通过超声心动图评估的LVEF绝对增加5％被认为是对治疗的临床显著响应。次要疗效评估标准包括超声心动图上左心室的最终收缩容积(LVESV)和最终舒张容积(LVEDV)的变化；

心脏磁共振成像(CMR)中的LVEF、LVESV和LVEDV；纽约心脏协会(NYHA)的功能分类；生活质量问卷的总体得分；通过心肺运动试验评估的最大耗氧量峰值(VO2峰值)和通气效率(VE/VCO2待定)；脑利钠肽(BNP)和高灵敏度C反应蛋白(HSCRP)。

实施例2.1：研究设计和患者群体

试验为1/2期、随机、双盲、安慰剂对照的临床试验。研究是在智利的ClínicaSanta María和Clínica Dávila进行的。从这些私立卫生中心或公立医院转诊参与者，并在2012年12月至2014年6月之间随机分配他们。实验设计得到参与卫生中心伦理委员会和智利大都会卫生服务局的批准。在注册之前，所有患者均同意参加并签署了机构审查委员会批准的知情同意书。该研究已在Clinicaltrials.gov(NCT01739777)上登记。

符合条件的患者按1：1随机分配，以经静脉内输注来源于脐带的细胞组合物或安慰剂。随机表是由与研究无关的人用计算机生成的。在基线以及预先确定的3、6和12个月的随访时间点对所有患者进行评估。这些评估由以下内容组成：对不良事件的临床评估和NYHA的功能分类；明尼苏达州心力衰竭生活质量问卷(MLHFQ)和堪萨斯城心肌病问卷调查(KCCQ)；实验室分析，包括全血细胞计数、肝肾功能检查、脑钠肽(BNP)和高敏感性C反应蛋白(HSCRP)；静止ECG、平均信号ECG、24小时Holter ECG监测；经胸超声心动图、心脏磁共振成像(CMR)和心肺运动测试。临床研究人员、研究护士和患者对治疗调配不知情。

就人口统计学变量、心血管危险因素、NYHA类别和心电图(表1)而言，来源于脐带的细胞组合物和安慰剂患者的基线特征没有差异。缺血性心肌病是HFrEF的主要病因(21名患者，70％)。就改变心脏重塑的治疗剂而言，组之间没有差异。没有患者有植入式心脏电子设备。每组中有一名患者离开了束的分支阻滞，尽管在开始时都没有表现出心室不同步。安慰剂治疗的患者在基线时具有较高水平的BNP，且LVEDV高出25％(p<0.05)。

实施例2.2来源于脐带的细胞组合物的制备、定征和输注。

基于来源于脐带的细胞组合物的治疗是在良好生产规范(GMP)下和在根据FDA指南“工业指导：当前良好组织规范(CGTP)和在对人细胞、组织以及基于细胞和组织的产品(HCT/Ps)制造商的附加要求”的条件下开发的。经健康供体的知情同意后，通过剖腹产术从人胎盘中获得脐带。按照本文件“具体实施方式”部分中所述的方法学处理脐带。

实施例2.3：旁分泌因子。

为了比较BM-MSCs和来源于脐带的细胞组合物之间的生长因子分泌水平，将3X10⁴个细胞接种在6孔板中的无血清培养基中。在孵育24小时后，收集条件培养基，并使用DuoSet ELISA Development System(R&D Systems),Minneapolis,MN)测量血管内皮生长因子(VEGF)和肝细胞生长因子(HGF)的分泌水平。另外，使用用于RNA提取的RNeasy迷你试剂盒(Qiagen,USA)测量TGFβ1的相对表达，并在使用用于RT-PCR(Invitrogen,USA)的SuperScript III第一链合成在20μl反应混合物中合成互补DNA。使用SYBR Green试剂(QPCR Master Mix,Agilent Technologies)进行RT-qPCR。先前已选择了所有有效的分离器组，且其序列为：B2M(F:5'TTCAGTTTACTCACGTCATCC 3',R:5'ACACGGCAGGCATACTCATC3')，TGFβ1(F:5'ACAATTCCTGGCGATACCTCAGCA3',F:5'TGCAGTGTGTCTCCTGTCTCCTGCATT')。

如图4所示，与BM-MSCs相比，来源于脐带的细胞组合物显示更高的TGF-β3基因表达(p<0.001)。应该提到的是，与BM-MSCs相比，来源于脐带的细胞组合物显示高出55倍的HGF表达(p>0.0001)(图4)，前者在一些情况下显示检测不到HGF水平。该最后因素是选择要使用哪些脐带和/或细胞群的关键测试。

实施例2.4免疫调节效应

如图6所示，通过评估其对于体外PHA刺激后外周血单核细胞(PBMCs)增殖响应的影响，分析了来源于脐带的细胞组合物的免疫抑制特性。

最优选地，在体外进行了在该测定中包括的4名HFrEF患者的不同T细胞亚群的增殖，以评估来源于脐带的细胞组合物和BM-MSC的免疫调节作用。根据生产商的说明，通过Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare,Amersham,RU)(1,077g/ml)的密度梯度从人外周血中分离出单核细胞。

PBMC细胞按照制造商的方案用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE,LifeTechnologies,Carlsbad,CA)染色，与MSC一起在96孔板中以1:10的比例(MSCs:hPBMC)在补充有10％FBS、1％LG、1％非必需氨基酸(sigma-Aldrich,USA)、100mM丙酮酸钠(sigma,USA)、25mMb巯基乙醇(Gibco,NY)和15mg/ml的植物血凝素(PHA)(Sigma,USA)的培养基RPMI(Roswell Park Memorial Institute medium)(Sigma-Aldrich,USA)中共培养。

72小时后，在存在布雷菲德菌素A(Biolegend,San Diego,CA,)的情况下，用50ng/ml的佛波肉荳蔻醋酸(PMA)(Sigma Aldrich)和1μg/ml离子霉素(Sigma-Aldrich)刺激PBMCs 4小时。

对于表面染色，将细胞与抗人CD4、CD8、CD3和CD25的抗体(BD Biosciences,USA)在黑暗中于4℃下一起孵育30分钟。使用BD Cytofix/Cytoperm溶液，按照制造商的方案利用抗人IL-17、IL4和IFNγ的抗体(eBioscience,USA)进行细胞内染色。为了评估转录因子，用染色缓冲液和特异性抗体(eBioscience,USA)根据制造商的方案评估FoxP3的表达。如图6所示，使用FACS Canto II流式细胞仪(BD Biosciences)获取细胞，并利用FlowJo软件(Tristar,Stanford)分析表型和增殖，通过CFSE荧光的减少来进行计算。

在1:10的比例下，与BM-MSCs相比，来源于脐带的细胞组合物显示对T细胞增殖的类似的抑制作用，关于无MSC存在下PHA诱导的增殖，对UC-MSCs和BM-MSCs的抑制百分比分别为21.53％±3.85％和23.96％±4.50％(p<0.005vs.对照)(图6A)。协同T细胞1、协同T细胞2和细胞毒性T细胞在与来源于脐带或BM-MSCs的细胞组合物共培养后表现出降低其增殖的趋势(p>0.05)。未观察到来源于脐带的细胞组合物的共培养物对调控T细胞的增殖的影响(图6B)。

实施例2.5迁移特征

对于迁移实验，利用Transwell两室细胞培养方法(Corning,Cambridge,MA)，用8μm孔聚碳酸酯膜进行细胞迁移测定，如图7所示。将Transwell膜的上侧在37℃下于PBS(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)中用0.1％的明胶涂覆2h。将来源于脐带的细胞组合物和BM-MSCs分别以每100μl的1％DMEM P/S、0.1％FBS 15,000个细胞的密度接种在Transwell装置的上腔室中。允许细胞迁移至仅包含DMEM或补充有5％的分离自HFrEF患者的血清的DMEM的下腔室中的培养基(500μl)。将Transwell系统在37℃下于含5％CO2的潮湿气氛中孵育16h。孵育后，用棉签拭子小心地从Transwell插入物的上面去除非迁移性细胞。用70％的甲醇固定保留在Transwell插入物中的结合细胞，并用于20％甲醇中的1％紫色晶体染色1h。洗涤后，在明视野倒置显微镜下以20X放大倍数对从膜的顶部迁移至底部的染色细胞进行计数。迁移的细胞数表示为对照值(仅DMEM)的变化百分比。每个实验以生物学一式三份和实验一式三份进行。如图7所示，响应于HFrEF患者的血清，与BM-MSCs相比，来源于脐带的细胞组合物中的迁移细胞百分比明显更高(41.18±6.53vs.29.67±8.35；p<0,01)。因此证实了，通过本发明提出的方法学获得的细胞具有高迁移性。

实施例2.6：安全性

使用Luminex 200(Kashi Clinical Laboratories Inc Portland)，在输注治疗的第0、15和90天，对一组12名患者(7名用UC-MSC治疗，5名接受安慰剂)评估了对来源于同种异体脐带的细胞组合物的输注的体液免疫响应。

没有发生与来源于脐带的同种异体细胞组合物或安慰剂的输注相关的急性不良事件。没有个体评估输注后产生的针对同种抗原的抗体。值得注意的是，于输注脐带来源的细胞组合物之前，在52种不同HLA特异性下具有基线反应性的患者在第90天时对这些特异性中的16种失去了反应性。另外，由于对输注的细胞进行了分型，因此有可能检测到未在给药脐带的细胞组合物中表达的特异性的仅21％消失，这与在给药脐带的细胞组合物中存在的100％的特异性相反(p＝0.004)。该结果不仅证实了对来源于脐带的细胞组合物没有体液免疫反应，而且还证实了MSC优先抑制对其自身HLA分子的反应性，如从文献所知的。

实施例2.7：临床相关事件

整个12个月的随访中的临床相关事件如表2所示。安慰剂组的死亡患者在随访5个月时患有急性心肌梗死。在静脉输注脐带来源的细胞组合物后5个月，一名脐带来源的细胞组合物的患者发展出了急性淋巴细胞性白血病，在基线和随访3个月时缺乏暗示白血病的临床和实验室要素。安慰剂组的一名患者发展出了恶性黑色素瘤。关于重大心血管事件，安慰剂组中的三名患者和UC-MSC中的一名因其心力衰竭的代偿失调而住院，安慰剂组中只有一名患者经历了急性冠脉综合征。没有患者表现出急性缺血性中风。在随访期间未诊断出新发生的室上性心律失常、持续性室性心律失常、房室阻塞或束支传导阻滞，并且在HolterECG监测中未观察到任何异常。随访时，安慰剂组中24小时ECG监测显示室性早搏配合物数量增加，尽管Lowen分类的平均值没有变化。随访中在时域或频率上未观察到明显变化。完成这项研究后，在CMR中未观察到胸腔异位组织形成。在监测点期间，全血细胞计数、肾和肝功能未见明显异常。

表2 12个月随访时临床相关事件的发生率。

NS：组间p>0.05。

实施例2.8：心脏图像

表3显示了在基线和随访时评估的超声心动图参数。与基线相比，从3个随访月开始用来源于脐带的细胞组合物处理的组中的LVEF升高(+3.71±5.01％p＝0.010)，并在6个月(+5.43±4.99％,p＝0.001)和12个月(+7.07±6,22％,p＝0.001)时继续。左心室容积无变化。安慰剂组在这些变量上没有显示出很大差异。两组从基线到第12个月的LVEF变化均存在显著差异(+7.07±6.22％vs+1.85±5.60％,p＝0.028)。关于治疗响应，来源于脐带的细胞组合物组中的11名患者和安慰剂组中的3名患者显示LVEF的临床相关改善(78.6％相对于35.7％；p＝0.054)。脐带来源的细胞组合物组的响应者在6个月时具有+6.73±4.82％的平均增加(与基线相比，p＝0.005)，且在12个月时为+9.18±5.15％(与基线相比，p＝0.002)。另外，在给药来源于脐带的细胞组合物后12个月时，14名患者中的7名显示LVEF显著增加和LVEF>40％，而安慰剂组中只有1个满足两种条件(50,0％vs.7.1％p＝0.0365)。

CMR的测量值示于表3中。用静脉输注的来源于脐带的细胞组合物治疗的患者显示LVEF(p＝0.0003)和LVEDV(p＝0.012)的增加(图8)。LVEF的最显著改善是在随访6个月时(+4.67±4.51,p＝0.005)。在12个月时用来源于脐带的细胞组合物治疗的LVEDV增加(p＝0.033)。未观察到安慰剂组(n＝13)中LVEF或左心室容积的变化。安慰剂组中的一名患者撤回了对CMR的知情同意。

表3 基线和随访点时主要和次要功效的结果

TTE：经胸超声心动图。CMR：心脏磁共振。LVEF：左心室射血分数(％)。LVESV：左心室的最终收缩容积(ml)。LVEDV：左心室的最终舒张容积(ml)。NYHA：纽约心脏协会。MLHFQ：“明尼苏达州心力衰竭生活质量”问卷。KCCQ-CS：问卷“堪萨斯城心肌病问卷临床摘要”。VO2峰值：最大耗氧量(ml/Kg/min)。VE/VCO2：二氧化碳产生率的最小通风速度。BNP：脑利钠肽(pg/ml)。HSCRP：高灵敏度C反应蛋白(mg/L)。*P<0.05，相对于安慰剂。

p<0.05相对于基线条件。

p<0.0167针对基线条件。

实施例2.9：功能状态、生活质量和临床生物标记

结果总结在表3中。从3个月开始，用来源于脐带的细胞组合物治疗的患者中NYHA类别有了明显改善(-0.54±0.56；p＝0.011)，其在12个月随访时保持(-0.62±0.46,p＝0.003)。只有用来源于脐带的细胞组合物治疗的组经历了MLHFQ从基线到所有随访点的改善(p<0.05)。两组均在随访的3个月和6个月时经历了KCCQ的临床总结的初步改善，仅在用来源于脐带的细胞组合物治疗的组中于试验结束时改善持续(p＝0.014)。用来源于脐带的细胞组合物治疗的患者在12个月时显示VE/VCO₂的改善(-1.89±3.19,p＝0.023相对于基线)，而未观察到VO₂峰值的差异。如表3所示，其他运动能力变量未发现差异，包括METS、无氧阈值下的氧气消耗、最大呼吸交换率和细胞治疗后的运动时间。随访3个月和12个月时，用来源于脐带的细胞组合物治疗的组中的BNP水平稍微降低。

结论

通过本发明获得的细胞亚群的静脉内输注在最佳医学治疗下在该组HFrEF患者中是可行和安全的。这种同种异体治疗不会在测试的个体中诱导体液免疫响应。干预导致左心室功能、功能状态和生活质量显著改善。因此，验证了本发明中所描述的来源于脐带的细胞组合物的方案用于本应用的用途。

实施例3.患有股骨、髌骨和胫骨之间的相互作用问题的患者。

上述的任何组合物均可用于治疗以下描述的任何患者。发明人已经为特定的患者亚组开发了有效的治疗性和/或预防性治疗。

在优选的实施方式中，患者具有膝盖疼痛和功能问题。优选地，由于股骨、髌骨和胫骨之间的相互作用所产生的磨损，患者具有膝盖疼痛和功能问题。

纳入标准

在优选的实施方式中，患者应患有症状性膝骨关节炎(OA)。更优选地，患者入选前12个月内应患有受影响关节的每天疼痛。

如表4所示，患者必须在40-46岁年龄之间。在可选的实施方式中，患者必须具有根据Kellgren-Lawrence量表的I、II或III级的放射照相改变和稳定的目标膝盖。

在可选的实施方式中，患者不应患有有症状性双侧膝OA。在可选的实施方式中，患者不应患有具有于MRI中的髁或胫骨平台的全身性骨髓水肿。在可选的实施方式中，患者不应具有通过Valgus定义的大于10°的轴向偏移的膝盖偏移，和/或根据Varus的大于5°的膝盖变形。在可选的实施方式中，患者在开始治疗前的最后6个月内不应使用口服的或经静脉内给药的类固醇或透明质酸。在可选的实施方式中，患者不应具有同侧的髋部或踝部疼痛。在可选的实施方式中，患者不应有任何局部或全身感染。在可选的实施方式中，患者不应患有任何形式的继发性关节炎。在可选的实施方式中，患者不应患有任何先前的恶性肿瘤。

表4 患有膝盖疼痛和功能问题的患者的基线特征。

给药

可以通过以下描述的任何方式将上文描述的任何组合物给药于上文描述的任何患者。

可以通过任何已知的方法来给药组合物。例如，可以经静脉内、病灶内、血管内、动脉内、皮下、脑内、肌内、腹膜内或心室内给药组合物。在优选的实施方式中，经病灶内、皮下或关节内给药组合物。优选地，经关节内给药组合物。

只要剂量包括治疗有效量，可以将任何量的细胞给药于患者。在优选的实施方式中，每名患者给药至少1x10⁶个细胞。优选地，每名患者给药至少5x10⁶、10x10⁶或15x10⁶个细胞。更优选地，每名患者给药至少约20x10⁶个细胞。术语“约”是指±10％的可变性。

最优选地，将悬浮于最终体积为3ml(盐溶液，5％AB血浆)中的，并根据研究设计以一次或多次指定剂量分配在5ml注射器中的总共20x10⁶个细胞经关节腔内注射。

给药于患者的剂量数量必须与治疗持续时间有关。在优选的实施方式中，在治疗开始时，应给药至少一次剂量来进行治疗，该治疗不应持续超过52周。优选地，应给药至少两次剂量进行治疗，治疗开始时一剂，且治疗中期一剂，治疗持续不超过52周。更优选地，将给药至少两次剂量来进行治疗，治疗开始时一剂，且治疗的第24周时一剂，治疗持续不超过52周。

研究的预期结果

试验的主要评估标准是安全性。通过不良事件通用术语标准(CTCAE)的分类对不良事件(EA)进行编码。每次访视均记录有AE，并根据严重程度、发生率以及与关节内浸润的关系进行描述。

试验的次要目标是疗效。以下临床终点西安大略省和麦克马斯特大学的关节炎指数(WOMAC)、疼痛的视觉模拟量表(VAS)、通过简表36(SF-36)问卷调查的生活质量、患者总体评估(PGA)和OMERACT-OARSI受访者索引标准。为了进行结构评估，由一名公正的放射科医生进行基线和随后6个月和12个月时的MRI。使用全器官磁共振成像(WORMS)评分。

实施例3.1：研究设计和患者群体

该试验对应于一项随机、双盲、对照比较器、针对来源于同种异体脐带的细胞组合物活性比较器的I/II期研究，其评估了膝盖OA中来源于脐带的细胞组合物的关节内注射的安全性和有效性，如图9所示。患者在临床研究之前提供了其书面知情同意书。所有受试者均于2015年11月至2016年1月之间在智利Universidad de los Andes临床中心招募。选择了四十名患者，并将29名患者连续分配至治疗组：MSC-1组在研究开始时以注射剂的形式接受了一定剂量的来源于脐带的细胞组合物。在研究开始时和之后的6个月，MSC-2组接受了连续剂量的来源于脐带的细胞组合物。对照组(n＝9)在研究开始时和之后的6个月接受透明质酸(HA)。使用了电子数据输入系统来进行随机化。所有数据对于执行程序和评估临床数据的人员都被掩盖了。每组中的一名患者在给药治疗前退出研究(图8)。研究已在ClinicalTrials.gov上进行了登记(NCT02580695)，并根据良好临床规范(GCP)的指南和赫尔辛基宣言来进行。从智利卫生部区域伦理委员会获得了批准(CECSSMO131015)。

实施例3.2来源于脐带的细胞组合物的制备、定征和输注

Dávila诊所伦理委员会和东部大都会卫生服务局(SSMO)批准了来源于脐带的细胞组合物的制造。基于来源于脐带的细胞组合物的疗法是在良好生产规范(GMP)下，在根据FDA指南“工业指导：当前良好组织规范(CGTP)和对人细胞、组织以及基于细胞和组织的产品(HCT/Ps)制造商的附加要求”的条件下开发的。经健康供体的知情同意后，通过剖腹产从人胎盘获得脐带。按照本文件的“具体实施方式”部分中所述的方法学处理脐带。

实施例3.3：安全性

在试验期间没有记录到严重的不良事件。关于与关节内注射有关的AS，没有发生感染事件。注射后第一周的渗漏物评估为中度至中等，在MSCs组中较高，但没有达到统计学显著性(第1次注射，34％MSC1,33％MSC2 vs.25％HA,p＝0.64，以及第2次注射MSC2 41％vs.HA 37.5％,P＝0.76)，如表5所示。

表5 患OA膝盖中来源于脐带的细胞组合物的关节内注射的安全性

实施例3.4：临床结果

对于来自基线的平均值的变化，只有来源于脐带的细胞组合物的组显示出显著的改善。三个研究组之间的比较表明，如图10和图11所示，来源于脐带的细胞组合物的两个组相比HA在6个月时使得疼痛和功能方面具有统计性优越性。另外，在图11所示的总WOMAC评估中描述的所有临床结果中，用来源于脐带的细胞组合物治疗两次的患者均优于HA(WOMAC_总的MSC2 4.44±1.76相对于HA12.6±4,5,95％CI 5.1,21.3,p<0.01)。在随访结束时，通过OMERACT-OARSI响应率标准测量的，相比MSC连续剂量组中的患者的100％，HA组中62.5％的患者是响应者(p<0.05)，如图13所示。

实施例3.5：结构结果

对于结构变化的评估，在12个月时未观察到WORMS评分的14个特征的变化，包括半月板、软骨、滑膜炎、骨赘和关节下骨髓，如图14所示。

结论

通过本发明获得的来源于脐带的细胞组合物的静脉内注射在该组患者中是可行和安全的。这种同种异体治疗方法证明了来源于脐带的细胞组合物在膝OA中的安全性和临床疗效，并提供了将这种细胞疗法视为治疗OA的替代疗法的证据。因此，验证了本发明中描述的来源于脐带的细胞组合物的方案用于该应用中以及用于与髋、踝和腕的OA中相似的应用中的用途。更具体地说，来源于脐带的细胞组合物可能对股骨头部与髋臼之间、距骨-胫骨-腓骨之间以及腕/腕骨的挠骨-尺骨之间产生的磨损具有作用。

据我们所知，本实例是第一个比较两个连续剂量的来源于脐带的细胞组合物相对于单一剂量的细胞疗法以及相对于活性比较剂如透明质酸的试验。

实施例4.获得本发明的细胞亚群用于临床应用。

为了获得本发明的细胞亚群，采集了获自足月人胎盘的5种不同脐带的样品，在健康供体知情同意后，通过剖腹产术提取这些胎盘；随后将其无菌存储在含有抗生素的缓冲溶液中，如“脐带处理”部分中详细描述的。

随后，按照图2A中所示的模型，将脐带横切成8-10cm的段，然后做出三个纵向切口以露出，并然后去除静脉和脐动脉，如图2B所示。如图2C所示，将包围动脉和静脉的内部面放置在与培养板底部接触的位置。用在“通过外植体分离细胞亚群”部分中详述的培养基来扩增迁移并粘附在板上的细胞。

借助于“根据国际细胞治疗学会的指导进行定征”部分所述的方案验证了不同批次的细胞。在成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞中获得的标记物CD73、CD90、CD105、CD45、CD34、CD14、CD19、HLA-DR和体外分化的结果如图15-19所示。表6显示了结果。

表6 根据国际细胞治疗学会的指导对细胞批次进行定征。

*(Dominici等人2006)。

由于CU-989-6和Cu-837-8脐带的分离的细胞批次具有少于95％的CD73标记物存在，因此无法使用这些批次，因为它们不符合“根据国际细胞治疗学会的指导进行定征”部分中描述的该选择方法的第一个要求(Dominici等人2006.Minimal criteria fordefining multipotent mesenchymal stromal cells.The International Society forcellular Therapy position statement.Cytotherapy Vol.8,No.4,315-317)。

细胞批次CU-745-3、CU-108-6和CU-668-K确实符合间充质干细胞的选择标准，因此分析了“MSC亚群的定征”部分中描述的标记物，结果可在图16、17和18以及表7中找到。

表7 根据本专利中所述的选择标记物进行MSC亚群的定征

分析的来自3个不同脐带的群体具有标记物CD44、CD56、CD105、RANKL和N-钙粘蛋白，因此代表了所需的亚群。具体而言，评估的3种细胞培养物具有低浓度、中浓度和高浓度的CD44、CD56、RANKL和N-钙粘蛋白标记物。因此，证明仅本发明标记物的存在就足以获得所需的治疗结果。

一旦核准了细胞亚群的定征，就将不同的批次冷冻保存以备后用。具体而言，在以下实例中使用了这样的批次：

·对于实施例3“具有股骨、髌骨和胫骨之间相互作用问题的患者”，对于实施例6，“间质性亚群用于具有减少的射血容积的患者”，以及对于实施例8“使用间充质亚群治疗皮肤伤口”，使用了批次CU-108-6。

·实施例5“间充质亚群用于具有股骨、髌骨和胫骨之间相互作用问题的患者”中，对于实施例6“间充质亚群用于具有减少的射血容积的患者”，以及对于实施例8“使用间充质亚群治疗皮肤伤口”，使用了批次745-3。

·实施例7“间质性亚群用于患有呼吸损伤的患者”中使用了批次CU-668-K。

实施例5.间质性亚群用于患有骨关节炎的患者。

可以将通过本文所述的选择标准“MSC亚群定征”核准的任何组合物给药于本文所述的任何适应症。具体地，将实施例4“获得本发明的细胞亚群用于临床应用”中选择的CU-745-3细胞组合物用于本实施例的患者的治疗。

发明人已经针对特定群的适应症开发了有效的治疗性和/或预防性治疗。

在一种实施方式中，对其施用本发明的治疗的患者患有膝盖中的疼痛和功能问题。由于股骨、髌骨和胫骨之间的相互作用中生成的退行性病症，治疗在患有疼痛和膝盖功能问题的患者中可能尤其有用。

施用本发明治疗的患者患有症状性骨关节炎。治疗在患有损害症状性骨关节炎的部位的一个或多个关节的疼痛和功能性阳痿的患者中可能特别有用。

纳入标准

本发明的治疗候选对象选自患有骨关节炎(OA)的患者。并且特别是在入选前6个月内每天在受影响的关节处出现功能受限的慢性疼痛的患者中。

具有根据Kellgren-Lawrence量表的I、II或III级放射学改变的患者也被认为是本发明治疗的候选者。重要的是，接受治疗的患者不应有任何局部或全身感染。同样，候选患者不应有任何形式的继发性关节炎，也不应有任何先前的恶性肿瘤。

对于该实施例，治疗了满足用批号CU-745-3的已开发细胞组合物指示的纳入标准的7名患者，因为他们符合本发明的选择方法。

给药

通过本文件中描述的选择标准“MSC亚群的定征”核准的任何组合物，都可以通过本领域中可用的任何方式，例如以下所述的那些给药于符合纳入标准的任何患者。

可以通过任何已知的方法来给药细胞组合物。例如，可以经静脉内、病灶内、关节内、血管内、动脉内、皮下、脑室内、肌内、腹膜内或心室内给药细胞组合物。在优选的实施方式中，经病灶内、皮下或关节内给药组合物。优选地，经关节内给药组合物。

只要剂量包括治疗有效量，可以将任何量的细胞给药于患者。在优选的实施方式中，向每名患者给药至少1x10⁶个细胞。优选地，向每名患者给药至少5x10⁶、10x10⁶或15x10⁶个细胞。更优选地，向每名患者给药至少约20x10⁶个细胞。术语“约”是指±10％的可变性。

最优选地，根据研究设计，将悬浮于最终体积为3ml(盐溶液，5％AB等离子体)中，且以一种或多种指定剂量分配在5ml注射器中的总共20x10⁶个细胞经关节内注射。

给药于患者的剂量数量必须与治疗持续时间有关。在优选的实施方式中，在治疗开始时应给药至少一次剂量进行治疗，该治疗不应持续超过52周。优选地，应给药至少两次剂量进行治疗，一次在治疗开始时，且一次在治疗中期，治疗持续不超过52周。更优选地，将给药至少两次剂量进行治疗，一次在开始时，且一次在治疗中期，治疗持续不超过52周。

治疗结果

为了评估疗法的疗效，基于西安大略临床调查表和麦克马斯特大学关节炎指数(WOMAC)对患者的进展进行了分析。该分析分为两个比较，第一个比较关注患者的3个月进展，这些结果显示在下面的图20中。

如从图20中可以看出的，根据依据总WOMAC测量在平均多于4.5个点验证的临床指数，在治疗3个月时，给药的细胞组合物有助于减轻疼痛、僵硬并改善功能。具体而言，在3个月时，见到疼痛和僵硬分别减少了3.3和1.3个点，更尤其是在功能性方面，根据WOMAC指数，患者的平均水平提高了平均10个点。

第二个比较显示了治疗后3个月和6个月的演变，这些结果如下图21所示。

如可以看出的，根据WOMAC总指数，在6个月时，所给药的细胞组合物相对于3个月时还减轻了疼痛、僵硬并改善了功能2.3个点。具体而言，在6个月时，看出疼痛和僵硬平均分别减少了2个和1.3个点，更尤其是对于功能性情况，患者的平均水平改善了平均3.7个点。

因此，证明了通过本文件描述的方法学选择的细胞组合物有益于患有骨关节炎的患者。

实施例6.间质性亚群用于具有降低的射血容积的患者

纳入标准

本发明的治疗候选对象选自患有慢性心力衰竭的患者，其在扩张期具有降低的射血分数，具有由通过超声心动图评估的40％或更少的左心室射血分数限定的收缩期心室功能障碍。

对于本实施例，用从符合本发明选择方法的批次CU-108-6和CU-745-3开发的细胞组合物治疗3名患者。

给药

可以通过以下描述的任何方式将上文描述的任何组合物给予上文描述的任何患者。

可以通过任何已知的方法给药组合物。例如，可以经静脉内、病灶内、血管内、动脉内、皮下、脑内、肌内、腹膜内或心室内给药组合物。在优选的实施方式中，经静脉内、动脉内或心室内给药组合物。更优选地，经静脉内给药组合物。

只要剂量包括治疗有效量，可以将任何量的细胞给药于患者。在优选的实施方式中，每千克(kg)患者体重给药至少1x10⁵个细胞。优选地，每kg患者体重给药至少1x10⁵、2x10⁵、3x10⁵、4x10⁵、5x10⁵、6x10⁵、7x10⁵、8x10⁵或9x10⁵个细胞。更优选地，每kg患者体重给药约1x10⁶个细胞。术语“约”是指±10％的可变性。

在优选的实施方式中，组合物与一种或多种选自由以下组成的组的治疗剂一起用于联合治疗：血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素II受体阻滞剂、β阻滞剂、利尿剂、拮抗剂、醛固酮、正性肌力药和地高辛，和/或与选自由以下组成的组的外科干预或医疗装置联合：冠状动脉搭桥手术、心脏瓣膜的修理或更换、植入式心脏复律除颤器、心脏再同步治疗、双心室刺激、泵浦心脏和心脏移植。

所述治疗剂的实例在实施例1中有提及。

在一种实施方式中，本发明的组合物仅给药一次。优选给药2次或更多次。

治疗的结果

为了评估治疗的疗效，寻求超声心动图中左心室射血分数(LVEF)的变化。另外，通过超声心动图评估的LVEF绝对增加5％被认为是对治疗的临床显著响应。

接下来，在图22中示出了用本文件中描述的细胞组合物治疗的3名患者的随访。

如可以看出的，患者在3、6和12个月时改善了其左心室射血分数。绝对增加大于14％，表明有明显的临床响应。因此，证明了通过本文件中描述的方法学开发的细胞组合物有益于具有减少的射血分数的心力衰竭患者。

应当注意，在提及的患者中，在静脉内输注本发明的组合物后没有观察到立即的不良事件；发生全球死亡、重大心血管事件(由心血管死亡、因代偿失调的心力衰竭(HF)导致的住院、非致命性心肌心脏病发作的组合结果所界定的)和其他不良事件，包括心脏病发作、持续性室性心律不齐和恶性事件。

实施例7.间质性亚群用于患有呼吸损伤的患者

本实施例包括使用通过本发明的选择方法选择的细胞组合物来治疗患有呼吸损伤如肺损伤、急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征的患者。具体而言，本实施例包括对患有急性呼吸窘迫综合征的患者进行治疗。

纳入标准

本发明的治疗候选者选自患有呼吸损伤的患者。特别是有任何类型的急性肺损伤，如任何病因的急性呼吸窘迫综合征的患者。具有少于200的氧气血压比相对于吸入氧气分数PAO2/FIO2(称为PAFI或Kirby指数)的患者也被视为本发明的治疗候选者。

对于本实施例，用开发的符合本发明选择方法的批次CU-668-K的细胞组合物治疗1名患者。

给药

可以通过以下描述的任何方式将通过本文所述的选择标准“MSC亚群的定征”核准的任何组合物给药于所述的任何患者。

可以通过任何已知的方法给药组合物。例如，可以经静脉内、病灶内、肺内、血管内、动脉内、皮下、脑内、肌内、腹膜内或心室内给药组合物。在优选的实施方式中，经病灶内、皮下或关节内给药组合物。优选地，经关节内给药组合物。

只要剂量包括治疗有效量，可以将任何量的细胞给药于患者。在优选的实施方式中，每千克患者给药至少1x10⁴个细胞。优选地，每千克患者给药至少5x10⁴、1x10⁵或5x10⁵个细胞。更优选地，每千克患者给药至少约8x10⁵个细胞。术语“约”是指±10％的可变性。

最优选地，在至少15min时间内经静脉内向每千克患者注射总共1x10⁶个细胞。

在一种实施方式中，本发明的组合物仅给药一次。优选给药2次或更多次。

治疗的结果

为了评估治疗的疗效，我们寻求观察肺部炎症的改善，其特征是肺泡凝结和胸部CT扫描显示的肺部毛玻璃图案(浅灰色)。

图23显示了用通过本文件中描述的方法学选择的细胞组合物治疗患有急性呼吸窘迫综合征患者的结果。如可以看出的，在接受治疗后的第13天，看出急性肺浸润减少。具体而言，在计算机断层扫描中，可能观察到肺泡凝结和毛玻璃图案区域的显著减少，且急性肺损伤引起的慢性损伤继发的肺纤维化区域持续存在。该层析成像的改善与气体交换和肺顺应性的改善有关。

因此，通过本文描述的方法选择的细胞组合物对于治疗肺损伤、急性肺损伤如急性呼吸窘迫综合征是有效的。

实施例8.使用间质性亚群治疗皮肤伤口

本实施例包括使用通过本文所述的选择方法选择的细胞组合物来治疗皮肤伤口。为此，使用具有基于“小鼠切除伤口夹层模型”模型[35]的切割伤口的小鼠模型来用所选的细胞组合物进行治疗。在本实施例中，使用了所选细胞组合物的皮内注射，其中比较了用组合物处理的7只动物相对于用盐溶液处理的9只动物。

对于本实施例，使用了用本文所述方法学选择的2种细胞组合物，使用的批次为108-6和745-3。

给药

可以通过以下描述的任何方式将通过本文所述的选择标准“MSC亚群的定征”核准的任何组合物给药于所述的任何患者。

可以通过任何已知的方法来药组合物。例如，可以经静脉内、皮内、病灶内、关节内、血管内、动脉内、皮下、脑内、肌内、腹膜内或心室内给药组合物。在优选的实施方式中，经病灶内、皮下或关节内给药组合物。优选地，经皮内给药组合物。

只要剂量包括治疗有效量，可以将任何量的细胞给药于患者。在优选的实施方式中，每平方厘米伤口给药至少1x10⁵个细胞。优选地，每平方厘米伤口给药至少10x10⁵、20x10⁵或25x10⁵个细胞。更优选地，每平方厘米伤口给药至少约3x10⁶个细胞。术语“约”是指±10％的可变性。

最优选地，每平方厘米伤口将经皮内，作为贴剂或支架注射总共3.5x10⁶个细胞。

在一种实施方式中，本发明的组合物仅给药一次。优选给药2次或更多次。

治疗的结果

为了评估治疗的有效性，寻求了组织再生的改善，无论是随着时间的推移闭合伤口还是在组织中形成血管。

在该文件中描述的细胞组合物的治疗结果如图24所示。如可以看出的，在十四天中，细胞组合物显示出更好的伤口闭合(图24A)。具体来说，细胞组合物具有的14天闭合百分比为94.67+/-1,136(SEM，平均值的标准误)，而盐溶液具有的闭合百分比仅为84.14+/-3,322(SEM)，这种差异具有统计显著性(图24B)。对于血管生成，与盐溶液相比，细胞组合物具有的在伤口中的血管形成百分比要高得多(图24C)，具体而言，细胞组合物具有的血管形成为68.10+/-6.247(SEM)相对于盐组合物具有的49.2+/-5,755(SEM)，这种差异具有统计显著性。

因此，通过本文所述的方法选择的细胞组合物有利于皮肤伤口的再生。

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Claims (36)

1.获得包含特定群的脐带间充质细胞的组合物的方法，其特征在于，其包括以下阶段：

a)培养和扩增脐带间充质细胞，

b)针对标记物N-钙粘蛋白、CD44、RANKL、CD105和CD56中的至少3种的存在来对其进行选择。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，任选地在步骤b)之后通过产生肝细胞生长因子(HGF)来进行选择，选择在培养基中分泌超过1000pg/mL的HGF的培养物。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，选择在所述培养基中分泌超过1500pg/mL的HGF的所述培养物。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，选择在所述培养基中分泌超过2000pg/mL的HGF的所述培养物。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，选择在所述培养基中分泌超过2500pg/mL的HGF的所述培养物。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脐带间充质细胞任选地特异性地从包围动脉和脐静脉的以及与羊膜下层内部面相邻的结缔组织细胞获得。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，任选地在步骤b)之后，通过TGF-β3表达进行任选的选择，选择与评估的样品相比表达最高水平的相对表达的培养物。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述脐带中，首先去除羊膜层和羊膜下层，其次，穿过所述动脉和所述脐静脉做出3个纵向且平行的切口，以露出静脉和动脉，并将其从所述组织中去除。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将获得的没有动脉和静脉的所述切口放置在具有培养基的板中，使得与所述静脉和动脉相邻的所述结缔组织与培养物的所述板直接接触。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将步骤a)中的所述细胞培养至多达10天。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，将阶段a)中的所述细胞培养至多达8天。

12.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于，通过细胞计数法根据所培养的细胞的标记物选择所述所培养的细胞，将间充质细胞选择为表达超过95％的CD105、CD73和CD90，且同时不表达，即其表达少于2％的CD45、CD34、CD14和HLA-DR的那些间充质细胞。

13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所选择的间充质细胞根据步骤b)的规定进行扩增和分离。

14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤c)中，选择所述细胞，因为其表达标记物CD105、CD44、RANKL或CD56中的至少2种和N-钙粘蛋白。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，在步骤b)中，选择所述细胞，因为其表达标记物CD105、CD44或CD56中的至少1种、N-钙粘蛋白和RANKL。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，在步骤b)中，选择所述细胞，因为其表达标记物CD105、CD44或CD56中的至少2种、N-钙粘蛋白和RANKL。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，在步骤b)中，选择所述细胞，因为其表达N-钙粘蛋白、RANKL、CD105、CD44和CD56。

18.包含特定群的脐带间充质细胞的组合物，其特征在于，其包括表达所述标记物CD105、CD44、RANKL或CD56中的至少2种和N-钙粘蛋白的间充质细胞，且其通过权利要求1至17中任一项所述的方法获得。

19.包含来自根据权利要求1至17中任一项所述的方法获得的或如权利要求18中限定的特定群的脐带间充质细胞的细胞的组合物的用途，其特征在于，其用于制备用于细胞治疗的药物。

20.根据权利要求19所述的用途，其特征在于，其用于制备有用的药物以治疗心脏射血流问题。

21.根据权利要求19所述的用途，其特征在于，其用于制备静脉内给药的有用的药物以治疗心脏射血流问题。

22.根据权利要求21所述的用途，其特征在于，其用于制备有用的药物以治疗心力衰竭。

23.根据权利要求19所述的用途，其特征在于，其用于制备有用的药物以治疗疼痛和改善与关节磨损问题相关的功能。

24.根据权利要求23所述的用途，其特征在于，其用于制备有用的药物以治疗股骨、胫骨和髌骨之间的相互作用中的磨损和拉伤。

25.根据权利要求23所述的用途，其特征在于，其用于制备有用的药物以治疗股骨头与髋臼之间的磨损。

26.根据权利要求23所述的用途，其特征在于，其用于制备有用的药物以治疗距骨、胫骨和腓骨之间的磨损。

27.根据权利要求23所述的用途，其特征在于，其用于制备有用的药物以治疗桡骨、尺骨和腕/腕骨之间的磨损。

28.根据权利要求23所述的用途，其特征在于，其用于制备有用的药物以治疗膝关节上的磨损和拉伤。

29.根据权利要求23所述的用途，其特征在于，其用于制备有用的药物以治疗脚踝、臀部、膝盖、手腕、肩膀、手指、肘部、颈和脊骨关节上的磨损和拉伤。

30.根据权利要求19所述的用途，其特征在于，其用于制备有用的药物以治疗呼吸问题。

31.根据权利要求30所述的用途，其特征在于，其用于制备有用的药物以治疗肺损伤。

32.根据权利要求31所述的用途，其特征在于，其用于制备有用的药物以治疗急性肺损伤。

33.根据权利要求32所述的用途，其特征在于，其用于制备有用的药物以治疗急性呼吸窘迫综合征。

34.根据权利要求19所述的用途，其特征在于，其用于制备有用的药物以治疗皮肤病变。

35.根据权利要求34所述的用途，其特征在于，其用于制备有用的药物以治疗慢性伤口。

36.根据权利要求34所述的用途，其特征在于，其用于制备可用于治疗皮肤溃疡的药物。

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