CN110101874A - 一种利用hgf转基因的干细胞治疗ards的方法 - Google Patents

一种利用hgf转基因的干细胞治疗ards的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110101874A
CN110101874A CN201811262291.6A CN201811262291A CN110101874A CN 110101874 A CN110101874 A CN 110101874A CN 201811262291 A CN201811262291 A CN 201811262291A CN 110101874 A CN110101874 A CN 110101874A
Authority
CN
China
Prior art keywords
msc
ards
mouse
cell
treatment
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811262291.6A
Other languages
English (en)
Inventor
张海波
黎毅敏
钟南山
亚瑟·斯勒茨基
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Institute Of Respiratory Health
First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Original Assignee
Guangzhou Institute Of Respiratory Health
First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Institute Of Respiratory Health, First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University filed Critical Guangzhou Institute Of Respiratory Health
Priority to CN201811262291.6A priority Critical patent/CN110101874A/zh
Publication of CN110101874A publication Critical patent/CN110101874A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1833—Hepatocyte growth factor; Scatter factor; Tumor cytotoxic factor II
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system

Abstract

本发明公开了一种利用HGF转基因的干细胞治疗ARDS的方法，本发明利用携带有人肝细胞生长因子(HGF)的重组间充质基质干细胞(mesenchymal stromal cells，MSC)在治疗急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)或制备治疗ARDS药物中的应用。本发明提供了一种新的ARDS治疗方法，利用HGF修饰过的MSC治疗ARDS，使得MSC对ARDS的治疗更有针对性，预防减少MSC对无适应症ARDS患者应用后可能会产生的有害性纤维化副作用，增强MSC临床治疗效果。

Description

一种利用HGF转基因的干细胞治疗ARDS的方法
技术领域
本发明涉及急性呼吸窘迫综合征(ARDS)技术领域，更具体地，涉及一种利用HGF转基因的干细胞治疗ARDS的方法。
背景技术
急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是一种具有高死亡率的危及生命的疾病。肺炎，误吸和败血症等各种因素都可诱发导致A RDS。ARDS的特点是急性发作，双侧肺浸润，低氧血症，肺水肿，并且如果不治愈的话，从渗出性炎性发展为增生期至纤维化期。大多数ARDS患者需要机械通气作为生命支持的基本途径，呼吸机引起的肺损伤(VILI)是“生物创伤”的结果，是与肺纤维化改变相关的严重并发症，导致更高的死亡率。目前，没有药物证实可以用来治疗ARDS。
骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymal stromal cells，MSC)已被证明可能可以被用于治疗ARDS，因为MSC能够分布到损伤部位，通过减少这些损伤部位肺泡渗漏、抑制炎症来支持损伤细胞旁组织的修复，抑制由内毒素诱导的ARDS 动物模型中的炎症和改善存活。MSC可将线粒体转入肺泡上皮，以改善肺功能，然而，MSC也产生分泌体，在博莱霉素或辐射诱导的肺损伤体内和体外模型中介导纤维增生。因为利用MSC也可能导致不好的结果，将MSC应用到人类的治疗活动中，必须十分谨慎。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一组急性呼吸窘迫综合征的治疗标志物。
本发明的第一个目的是提供一种重组载体在治疗ARDS或制备治疗ARDS 药物中的应用。
本发明的第二个目的是提供一种重组慢病毒在治疗ARDS或制备治疗ARD S药物中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种重组间充质基质干细胞在治疗ARDS或制备治疗ARDS药物中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种治疗ARDS的方法。
本发明的第五个目的是提供人HGF基因或/和蛋白或/和其激活剂在间充质基质干细胞治疗ARDS或制备治疗ARDS药物中的应用。
本发明的第六个目的是提供一种治疗ARDS药物的药物。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
发明人研究发现：(1)ARDS肺微环境的肺泡灌洗液(BALF)蛋白质谱在不同类型ARDS和ARDS的不同阶段表达不同。(2)肺微环境是对MSC治疗是否有益或有害效果的关键因素：ARDS患者肺微环具有高浓度的IL-6和纤维连接蛋白，并有低浓度总抗氧化能力时，MSC的给药会产生有害的影响；而当没有显著的IL-6或纤维连接蛋白时，MSCs的给药对肺组织的保护作用明显。(3) 转染了人肝细胞生长因子(HGF)或IL-10基因的修饰的MSCs相比较未被转染的MSCs，可以在不利的肺微环境中起治疗作用。(4)在MSC给药之前在肺组织过表达人类GPX-1恢复抗氧化能力，可增强MSC治疗ARDS作用。(5)ICU 患者血浆中存在与小鼠ARDS模型BALF中相似的蛋白质组表达谱模式。
进一步发现，构建的小鼠模型与临床患者(CCU病人和ARDS病人)，在肺内微环境的总抗氧化能力(TAC)、白细胞介素-6(IL-6)和纤维连接蛋白(FN) 的量的分布有类似的规律，并根据小鼠间充质干细胞给药后的情况给出ARDS 治疗策略：
正常小鼠选用未经修饰的MSC治疗有很好的治疗效果，此时其肺内微环境总抗氧化能力、IL-6和纤维连接蛋白的量相应于现有CCU病人肺内微环境总抗氧化能力、IL-6和纤维连接蛋白的量(TAC>250μmol/ml，IL-6<10ng/ml且FN<500 ng/ml)；
盐水灌注小鼠模型，发明人(1)仅仅使用基因修饰的MSC(MSCIL-10或 MSCHGF)、或(2)使用修饰过的慢病毒(LVGPx-1)进行治疗后，再选用未经修饰的MSC治疗，均取得了很好的效果，此时其肺内微环境总抗氧化能力、IL-6 和纤维连接蛋白的量相应于一部分ARDS病人肺内微环境总抗氧化能力、IL-6 和纤维连接蛋白的量(TAC为200～250μmol/ml，IL-6为10～30ng/ml且FN 为500～900ng/ml)；
盐酸灌注小鼠模型，给予MSC后可能会进一步加重肺损伤，故不合适进行任何MSC干预治疗，此时其肺内微环境总抗氧化能力、IL-6和纤维连接蛋白的量相应于另一部分ARDS病人肺内微环境总抗氧化能力、IL-6和纤维连接蛋白的量(TAC<200μmol/ml，IL-6>30ng/ml且FN>900ng/ml)。
因此，本发明要求保护以下内容：
一种重组载体在治疗ARDS或制备治疗ARDS药物中的应用，所述重组载体携带有人HGF基因。
优选地，所述重组载体为重组慢病毒载体。
一种重组慢病毒在治疗ARDS或制备治疗ARDS药物中的应用，所述重组慢病毒携带有人HGF基因。
一种重组间充质基质干细胞在治疗ARDS或制备治疗ARDS药物中的应用，所述重组间充质基质干细胞为被包含慢病毒载体携带有人HGF基因转染后的间充质基质干细胞。
一种重组间充质基质干细胞在治疗ARDS或制备治疗ARDS药物中的应用，所述重组间充质基质干细胞过表达人HGF基因或/和蛋白。
优选地，所述间充质干细胞为骨髓来源的间充质干细胞。
一种治疗ARDS的方法，当ARDS患者的肺内微环境中，总抗氧化能力为 200～250μmol/ml，白细胞介素-6为10～30ng/ml，且纤维连接蛋白为500～900 ng/ml时，用所述重组间充质基质干细胞对ARDS患者进行细胞治疗给药。
所述白细胞介素-6为Interleukin-6(IL-6)；
所述纤维连接蛋白为fibronectin(FN)；
总抗氧化能力(TAC)为溶液的各种抗氧化物(antioxidant)总抗氧化能力。
优选地，人IL-6采用ELISA法测得。
优选地，人FN采用ELISA法测得。
优选地，总抗氧化能力采用Total Antioxidant Capacity Assay Kit试剂盒(Abcam ab5329)测得。
人HGF基因或/和蛋白或/和其激活剂在MSC治疗ARDS或制备治疗ARDS 药物中的应用。
一种治疗ARDS药物的药物，含所述重组载体、所述重组慢病毒、所述重组MSC、或所述人HGF基因或/和蛋白或/和其激活剂中的一种或几种。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种新的ARDS治疗方法，利用HGF修饰过的MSC治疗ARDS，并达到一个很好的治疗效果，使得的ARDS的MSC治疗更有针对性，预防减少MSC对无适应症ARDS患者应用后可能会产生的有害性纤维化副作用，增强MSC临床治疗效果。
附图说明
图1为其急性肺损伤的特征；A：在生理盐水(NS)或盐酸(HCl)滴注后 24h，从左心室采集的血用于测量PaO2/FiO2比值(动脉分压氧/吸入氧分数)，支气管肺泡灌洗液(BALF)的Albumin白蛋白水平，使用小鼠呼吸机测定动态压力容积曲线回路以评估肺顺应性，中性性细胞浸润表示为通过细胞分类计数方法计算的BAFLF中的中性粒细胞数占细胞总数的百分比；B：在NS或HCl灌注48h后，测定支气管肺泡灌洗液白蛋白水平，测定肺顺应性、总细胞数和中性粒细胞浸润；C：在48小时，使用小鼠特异性多因子Luminex检测试剂盒支气管肺泡灌洗液的促炎性细胞因子水平(TNF-α，IL-6，MCP-1，IL-1β，IFN-γ，and MIP-2)、抗炎细胞因子水平(IL-4，IL-10，IL-23，IL-12，IL-13，VEGEF)，以及趋化因子；D：在48小时，用小鼠特异性总转化生长因子β1 ELISA检测支气管肺泡灌洗液早期纤维化标志物；肺组织用SIRCOLassay测定胶原蛋白含量；检测胶原酶1和α-SMA mRNA的相对正常对照组的表达，使用GAPDH作为内参基因；数据以平均值±标准误的形式进行表示，n＝6，*P<0.05，与NS比较(T-test)。
图2为MSC治疗保护了ARDS小鼠机械通过引起的肺损伤，但是在HCl 灌注诱导的肺损伤中MSC治疗使得肺损伤恶化(无论是否进行机械通气)；A：小鼠接受盐酸或NS滴注48小时后，接受MSC治疗组或溶液对照组，然后暴露于低压(LP)或高压(HP)机械通气2小时，自发呼吸(SB)组作为对照组，第14天的肺切片用Masson三色染色(蓝色)；B：对病例样本进行Ashcroft评分盲评、用RT-PCR检测Collagen-1 mRNA表达、肺顺应性检测；C：在第7天和第14天进行微型计算机断层扫描，6个深度区域的肺横切面图像用于密度测定分析；D：第7天，免疫荧光标记1型(AQP5、绿色)和2型(SPC、红色) 肺泡上皮细胞和间充质细胞(α-SMA，红色)；E：MSC给药后第48h(第4天) 免疫荧光标记2型肺泡细胞(SPC、红色)、成纤维细胞(波形蛋白、红色)、增殖细胞(Ki67、绿色)和核染色DAPI(蓝色)；数据以平均值±标准误的形式进行表示，n＝6，P<0.05；*与未处理对照组比较，与未处理对照组和NS+PBS 比较，γ与NS+PBS接受机械通气组比较，#与未处理对照组、NS+PBS、NS+MSC 和HCL+PBS接受机械通气组比较。
图3为MSC用药第14天对急性肺损伤模型的影响；A：急性肺损伤模型的示意图，在第0天气管内灌注(IT)HCl或NS(3mL/kg)，第2天通过气管内和静脉途径输送MSC、PBS或成纤维细胞，输送十五分钟后，动物接受自发性呼吸 (SB)、低压(LP)或高压(HP)通气2小时；B：第14天，用免疫荧光法检测HP±MSC或HCl±MSC的SPC和α-SMA，每个切片随机挑选6个视野，计算相对荧光量比细胞核数量的比值；C：所有的机械通气组中NS/HCl滴注±MSC 用药14天后，用RT-PCR检测SPC，E-cadherin、α-SMA和Vimentin的相对表达，使用GAPDH作为内参基因，结果为未处理对照组的相对表达倍数；D：药 14天后，炎症评分，Ashcroft评分，弹性系数，Collagen-1、SPC和α-SMA的 mRNA表达量；数据以平均值±标准误的形式进行表示，n＝6，P<0.05；(B&C)* 与未处理对照组未处理对照组比较，与未处理对照组未处理对照组和NS+PBS 比较，γ与NS+PBS和NS+MSC接受机械通气比较，￥与NS+MSC w接受机械通气比较，(D)ψMSC与成纤维细胞组比较(ANOVA)。
图4为MSC用药第28天对急性肺损伤模型的影响；A：28天时Masson三色染色的肺切片的Ashcroft纤维化评分；B：28天时免疫荧光染色SPC(红色)、α-SMA(绿色)和核标记DAPI(蓝色)；C：28天时，使用RT-PCR检测SPC、 E-cadherin、α-SMA和Vimentin的表达；数据以平均值±标准误的形式进行表示， n＝6，P<0.05，与NS+PBS比较，与NS+PBS和NS+MSC接受机械通气组比较， #与NS+PBS、NS+MSC和HCl+PBS接受机械通气组比较(ANOVA)。
图5为急性肺损伤模型14天后给予MSC治疗具有保护作用；第0天灌注 NS或HCl在，第2天进行机械通气(SB/LP/HP)，第14天进行MSC或PBS治疗，第28天处死小鼠；A：Masson’strichrome染色组织切片；B：病理学肺纤维化评分(Ashcroft评分)、肺顺应性、肺组织总RNA进行RT-PCR检测Collagen-1 mRNA表达量，GAPDH作为内参基因，ΔΔCT法计算相对表达量；C：RT-PCR 检测E-cadherin、SPC、波形蛋白和α-SMA的mRNA表达；数据以平均值±标准误的形式进行表示，n＝6，P<0.05，*与NS+PBS比较。
图6为MSC在小鼠肺组织的分布图，血浆和支气管肺泡灌洗液中关键蛋白谱的相关性，以及在不同肺损伤模型中MSC给药后肺蛋白质组学分析；A：NS或HCl滴注48h后转染MSCLuc用生物发光法跟踪培养12天；B：用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定生理盐水(NS)和HCl处理小鼠48h内的血浆(P)和肺泡灌洗液(BAL)炎性介质水平，研究相关性r＝相关强度,R2＝曲线拟合，P＝皮尔森相关系数(GraphPad)；C：总抗氧化能力(TAC)、白细胞介素-6和纤维连接蛋白(FN)是功能性组的3个标志物，测定小鼠腹腔注射TAC、IL-6和FN的浓度，并绘制在单纯通气和HCl灌流小鼠中的TAC、IL-6和FN浓度图。黄色盒代表生理盐水组中测量的3种蛋白质的平均值区域。
图7为基因修饰的MSCs对HCl处理的肺保护作用；A：携带hIL-10 (MSCIL-10)、hHGF(MSCHGF)或两者1:1的混合物(总的慢病毒数量一致)的MSC 在HCL处理48后进行给药，携带荧光素酶报告基因(MSCLuc)的MSC作为对照。 24小时后测定促炎症因子(IL-6、TNF-α、IL-1β、MCP-1、MIP-2)、抗炎(IL-10) 和促纤维化[TGF-β1、VEGF、纤维蛋白原(FGN)和纤维连接蛋白(FN)]因子； B：第7天后对炎症和Ashcroft评分(纤维化)进行盲评；C：HCl处理4h后，LVGPx-1(4.5×106的慢病毒/每只小鼠，重悬于70μl PBS)或者LVLuc气管内进行慢病毒的体内转染，在48小时后测定氧化应激标志物[总抗氧化能力(TAC)、 H2O2、丙二醛(MDA)和羧基化蛋白]、促炎细胞因子(IL-6、TNF-α、MCP-1、 MIP-2和IL-1β)以及促纤维化介质(VEGF、TGF-β)；D：HCl±LVGPx-1处理48h 后转染MSC，第7天对支气管肺泡灌洗液中纤维连接蛋白的测定；对炎症和 Ashcroft score(纤维化)进行盲评；数据以平均值±标准误的形式进行表示，n＝6， P<0.05，*与NS(A&B)或未处理对照组(C&D)相比，与HCl或HCl+溶液对照(veh)相比，γ与HCl+MSCLuc相比，#与HCl和HCl+MSCLuc相比(B)，或与 HCl和HCl+MSC相比(D)(ANOVA)。
图8为在MSC用药后的急性肺损伤模型中检测肺泡上皮细胞，间充质细胞和增殖细胞，HP或HCl诱导的损伤的急性肺损伤模型的第2天进行MSC或PBS 给药；A：在第7天免疫荧光标记1型肺泡上皮细胞(AQP5，绿色)、2型肺泡上皮细胞(SPC，红色)肺泡上皮细胞和间充质细胞(α-SMA，红色)，三个随机fields/slide用于定量表达水平；B：第14天通过westernblot在在肺组织中检测E-钙粘蛋白和α-SMA的蛋白质水平；β-肌动蛋白用作上样对照，密度图表示6 次实验的平均值；C：在MSC或PBS用药后48小时，免疫荧光标记2型(SPC，红色)，成纤维细胞(波形蛋白，红色)和增殖细胞(Ki67，绿色)，每张切片选择三个视野用于定量表达水平(n＝6/组)，每一视野中Ki67阳性细胞数占总细胞核的数之比；数据以平均值±标准误的形式进行表示，n＝6，P<0.05，*与未处理对照组未处理对照组比较，与HP+PBS或HCl+PBS比较(ANOVA)。
图9为进行MSC治疗前后的蛋白组学；A：在NS或HCl滴注2天后细胞用药之前收集支气管肺泡灌洗液的进行非标定量技术质谱(第2天)；B：MSC 或PBS用药2天后(Day 4)，将蛋白质与第2天的初始状态进行比较，并与第4 天PBS用药组进行比较，筛选差异表达两倍以上的蛋白(P<0.05，每组3只，(n＝3) T检测t检验)，将这些蛋白质进行功能分类，并进行蛋白质组表达谱分析，Y 轴表示在前六个功能组中出现/增加(+)或消失/减少(-)的蛋白质的数量。
图10为蛋白质组学热图和ELISA；A：未处理对照组、NS和HCl组处理两天后的质谱鉴定到的蛋白绘制的热图；B：NS、HP、HCl和HP+HCl组±MSC 用药后2天(即开始实验4天)的质谱鉴定到的蛋白绘制的热图；C：在NS或 HCl滴注后2天收集支气管肺泡灌洗液的使用小鼠特异性ELISAs验证微环境关键炎症因子；A和B中未处理对照组用于计算其他组的样品的相对丰度，颜色尺度代表丰富的梯度，以红色为代表的高丰度和绿色代表的较低丰度；数据以平均值±标准误的形式进行表示，n＝6，P<0.05，*与NS进行比较。
图11为基因修饰的改善肺内微环境后MSC给药治疗的效果；A：MSC表面标记物表达，携带有hIL-10、hHGF或荧光蛋白酶的慢病毒转染MSC，2天后收集被转染的MSC(每个图表代表在x轴表示单个荧光团，y轴表示侧向散射)； B：MSCLuc、MSCIL-10或MSCHGF，在HCl造成肺损伤后48h进行用药，PBS作为对照，在MSC用药1、2和5天后处死小鼠，通过ELISA测量BALF和肺组织匀浆中的hIL-10和hHGF蛋白水平，数据以平均值±标准误的形式进行表示， n＝6，P<0.05，*与HCl和HCl+MSCLuc比较；C：LVLuc静脉注射未损伤小鼠或 HCl损伤4h后的小鼠，(每只小鼠注射4.5×106LVLuc慢病毒重悬于70μl PBS，气管内细胞给药)，以发光表示总通量强度，红色为最高强度，蓝色为最低强度，被叠加在摄影图像上，在7天的时间内扫描小鼠，所有的图像一起分析，以产生均匀的荧光范围，该图描绘了3只小鼠/组的平均总荧光，未处理对照组小鼠作为对照，P<0.05，*与未处理对照组比较；D：HCl损伤小鼠48小时后，进行LVGPx-1用药，人GPx-1特异性RT-PCR引物用来检测小鼠肺组织中hGPX-1 mRNA表达，采用GPX-1酶动力学测定法测定肺组织GPX活性水平，正常未接受处理未处理对照组组代表肺组织基础GPX-1活性；E：LVLuc or LVGPx-1 2天后收集肺切片，用hGPX-1特异性抗体进行免疫组化检测GPX-1阳性细胞；F：HCl±LVGPx-1 48h 进行MSC用药，在第7天用Masson’s trichrome染色肺切片观察MSC给药对 GPX-1治疗肺的影响，蓝色为可视化胶原，数据以平均值±标准误的形式进行表示，n＝6，P<0.05，*与未处理对照组比较。
图12为与ARDS患者肺微环境相关的关键生物标志物以及抑制混合物对暴露于ARDS患者血浆的人类小气道上皮细胞(SAECs)和人MSCs中IL-6，纤维连接蛋白和氧化应激的影响；A：采集ARDS诊断48小时内的血浆标本(n＝33)，与心脏内科监护室(CCU)的对照患者作(n＝20)比较，ARDS患者，基于PaO2/FiO2，进一步分为轻度(n＝9)，中度(n＝12)和重度(n＝10)，数据以平均值±标准误的形式进行表示，n＝6，*P<0.05与CCU的对照患者相比，与轻度ARDS相比；B：测定CCU和ARDS患者入院时血浆总抗氧化能力(TAC)、IL-6和纤维连接蛋白(FN)浓度，黄盒代表了轻度ARDS患者三种蛋白浓度的平均值；C：人小气道上皮原代细胞(SAEC)接种于transwell系统的下腔，人间充质干细胞(hMSC) 接种于transwell系统的上腔，在无血清培养基(-)或含有30％血浆的培养基刺激细胞30分钟，该培养基血浆来自健康志愿者(HV)或ARDS患者，在存在或不存抑制混合物(IFO)或对照混合物(C)的情况下刺激细胞，检测共培养基 IL-6、FN、TAC和LDH水平，RT-PCR检测E-cadherin和N-cadherin在SAECs 的mRNA表达，数据以平均值±标准误的形式进行表示，n＝3或6，P<0.5，*与 HV比较，与血浆刺激组±hMSC比较，#与血浆治疗组±IFO鸡尾酒比较；D： MSC治疗ARDS的概念性策略。
图13为人类小气道上皮细胞(SAECs)和人MSC分别与ARDS患者血浆的共培养；将原代人小气道上皮细胞(SAEC)接种在transwell系统的下室中，并将人MSC(hMSC)置于上室中，在存在或不存在针对IL-6，FN和氧化剂的抑制混合物(IFO)的情况下，用无血清培养基(-)或含有30％来自健康志愿者(HV)或ARDS患者的血浆的培养基刺激细胞30分钟，在存在或不存低剂量或高剂量的抑制混合物(IFO)或对照混合物(C)的情况下刺激细胞，SAEC通过荧光免疫技术检测E-钙粘着蛋白和N-钙黏着蛋白表达。
图14为ARDS血浆刺激后第5天的人MSC表型分析；MSC在无血清培养基中进行培养，培养基中含有30％来自健康志愿者(HV)或存在或缺失抑制混合物(IFO)处理的ARDS患者的血浆。培养72h后更换新培养基(存在或缺失抑制混合物(IFO))，第5天收集细胞，通过流式细胞仪分别分析负表面标记 CD45、CD34、CD117、阳性标记物CD105和CD90。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
1、随机化
使用计算机生成的随机化代码将小鼠随机化，包括三个模型(有无机械通气的NS或HCl)、治疗(PBS、MSC或成纤维细胞)和时间点(48h、7、14和28 天)。
2、病人样本的采集
本研究已获得广州医科大学附属第一医院研究伦理委员会的批准。从2013 年3月至2016年4月在一般重症监护病房(ICU)招募ARDS患者33人，以及心脏内科重症监护室(CCU)招募没有发生肺部并发症的心血管病患者20人作为对照。并在在ICU/CCU患者入院48小时内收集血样。健康志愿者样本采集自体检合格人士。所所有血液样本用一次性使用真空采血管采集。
3、滴注HCl
用氯胺酮盐酸盐(50mg/kg)和赛拉嗪(10mg/kg)麻醉小鼠，并使用切割成14mm长度的20Ga血管造影管[BD REF 381134]内插管。通过血管造影管[以 3ml/kg的用量(即，对于25g小鼠为75μl)滴注pH为1的1nmol/L盐酸(HCl) (BioShopCAS#7647-01-0)或0.9％NaCl的生理盐水(NS)，然后加入100μl 空气。立即将小鼠与Servoi(Maquet)呼吸机连接10分钟以使HCl/NS均匀分布。
呼吸机设置：吸气峰压(PIP)14cm H2O，呼气末正压(PEEP)0cm H2O，呼吸频率(RR)90(呼吸次数/分钟)和吸入氧气浓度为的50％。从呼吸机取下后，将动物保持在温热的充氧的温室中1小时并转移回动物房。
4、机械通气
HCL/NS灌流后两天，小鼠再次麻醉，气管插管，通气2小时。
低压(LP)的具体方式为：
吸气压力峰值(PIP)10cm H2O，呼气末正压(PEEP)2cm H2O，呼吸频率(RR) 120次/min，吸入氧分数(FiO2)50％；
高压(HP)的具体方式为：
PIP 22cm H2O，PEEP 0cm H2O，RR 70，FiO2 50％。
5、气管内细胞给药(IT)
使用1～4％的七氟烷麻醉小鼠，通过口咽显露气管开口，并且使用无菌的长度延长的移液管尖端将使用50μl PBS悬浮的0.5×106个细胞直接滴注到气管开口上方，将舌头缩回约20次直至所有的液体都均匀分散。
6、静脉内细胞给药(IV)
用31Ga针将100μl PBS悬浮的0.5×106个细胞尾静脉注射。
7、支气管肺泡灌洗
用0.5ml无菌PBS灌洗右肺3次。洗液在离心4℃1000g 5min，收集上清液进行蛋白质组学和其他检测。沉淀细胞用于制作细胞涂片，进行计数分析。
8、蛋白质组学分析
采用液相色谱串联质谱(LC/MS/MS)进行分析(Q ExactiveTM混合四极杠杆质谱仪，Thermo Scientific)。输出的与两个的小鼠数据库进行比对：PEAKS Studio Version-7.0(2014-03-21)和X！Tandem Version-CYCLONE(2010-12-01-1)。然后利用蛋白质组学数据分析软件Scaffold(Version-Scaffold_4.3.2)将所产生的数据进行蛋白质鉴定。蛋白质的相对丰度用Peaks Studio(V7)生成的热图表示。
简而言之，用聚类分析所有实验组蛋白质；在热图上表示的蛋白通过筛选标准为：肽阈值最低为95.0％，蛋白阈值最低为95.0％，两个肽，肽假发现率(FDR) 为0.1％，蛋白质FDR为0.0％。样品中具有相似表达趋势蛋白的通过聚类分析聚集在一起。每个样本的丰度的log2相对于平均丰度的log2的比值被用来采用欧氏距离相似性度量的邻接算法进行层次聚类。
比较各组(n＝3)所鉴定到的蛋白质(即治疗与对照)，在至少66％的治疗组中检测到蛋白质被称为“出现”。相似的，对至少66％的照组中检测到，但在治疗组中未检测到的蛋白质被称为“消失”。在所有组中检测到的蛋白质的命中数与对照组进行比较，以是否超过2倍的作为阈值，以将蛋白质归类为“增加”或“减少”。通过T检验表征每个比较组合之间倍数变化的意义。然后通过 Benjamin-Hochberg方法进行整体错误校正，筛选出FDR小于0.2。鉴定到的蛋白根据NCBI的注释(Uniport，Gene cards)和文献注释进行功能分类。
通过报告小鼠BALF或CCU和ARDS患者血浆中总抗氧化能力(TAC)、IL-6 和纤维连接蛋白(FN)的水平，制备三维散点图。
9、生理生化指标的测量
(1)呼吸力学：使用基于动态压力/容积回路的FlexiVent rodent ventilatorsystem测量肺力学(Scireq,Montreal,Canada)。
(2)血气测定：通过心脏穿刺从左心室采集血液，使用Siemens，CIBA-corning#248血气分析仪立即测定血气成分。
(3)Micro-CT显微CT：小型啮齿动物Ge轨迹超螺旋CT扫描仪(STARR facility，University Health Network，Toronto，ON)用来进行俯卧位的解剖扫描(像素大小150μm，分辨率～350μm)；将肺切片图像根据密度分析分为6个深度区进行：开放空间具有最大像素密度(黑色)，结缔组织具有最小像素密度(白色)；设定阈值用于定义高密度组织(灰色区域)；高密度组织的百分比计算如下：[高密度面积/总面积]×100％。
(4)Ashcroft评分
左肺用4％缓冲甲醛充气至22cmH2O的充气压力，切下，固定并包埋于石蜡中。切4μm厚的片用Masson三色染色剂进行染色，进行可视化。组织学评分是由独立的病理学家在不清楚对实验分组情况下盲进行。由病理学家对10个随机放大200倍的样本进行评分：0，正常肺；1，分离的轻度纤维化改变；2，明显的纤维变性伴有结状形成但未连接；3，连续纤维化壁；4，单一纤维化肿块 (≤10％的视野)；5，汇合的纤维化质量(>10％和≤50％的视野)；6.大的连续纤维化肿块(>50％的视野)；7，肺泡几乎消失了纤维团，但仍有五个气泡；8，完全闭塞纤维样肿块。
(5)炎症评分
如上处理肺切片并用苏木精和伊红染色。由病理学家对10个随机200倍放大的样本进行评分：0，没有发炎；1，轻度，炎性细胞浸润血管周围/周围细支气管腔室；2，适度的炎性细胞浸润，适度延伸至肺泡实质；3，严重的炎性细胞浸润，肺泡实质中发现较大程度的炎性病灶。
10、MSC培养
Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM，Invitrogen，12440)：10％胎牛血清(Atlanta Biologicals，S11550)，10％马血清(Hyclone，SH30074.03)，100U/ ml青霉素，100μg/ml链霉素，0.25μg/ml两性霉素B(Invitrogen，15140-062)， 2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen 25030-081)。
MSC在使用前复苏并培养4天。
11、慢病毒
1)LVIL-10为携带人白细胞介素-10(NM_000572)的慢病毒；
2)LVHGF为携带人肝细胞生长因子(NM_000601)的慢病毒；
3)LVGPx-1为携带人谷胱甘肽过氧化物酶-1(NM_000581)的慢病毒；
4)LVLuc为携带萤火虫荧光素酶(M15077)的慢病毒；
5)LVGFP为携带绿色荧光蛋白(P42212-1)的慢病毒。
12、慢病毒转导MSC
VSVg-型慢病毒由University Health Network Vector Core Facility(Toronto, ON)提供。每个T25烧瓶中分装5×105个MSC，慢病毒与细胞仪30:1的比例进行孵育，孵育于在5毫升(含有10％IMDM和5mg/ml FBS)鱼精蛋白硫酸盐 (P3369,Sigma,Oakville,ON)。18小时后，洗涤细胞并再孵育48小时。此时，细胞从板分离，洗涤并运送到动物体内。这些骨髓间充质干细胞的一部分被用于细胞表型分析。
13、慢病毒体内转运
小鼠接受HCl滴注(如前文描述)，然后4小时后用4％异氟烷麻醉动物，并且以4.5×106LVGPx-1或LVLuc的浓度悬浮在70μlPBS中。通过IT途径滴注(如前文描述)。
14、流式细胞术技术
BD LSRFortessaTM X-20流式细胞仪用来检测MSC表面标记.Cells(0.5× 106)悬浮于100μl(1％sodium azide，10％FBS)用下列抗小鼠荧光缀合的第一抗体进行单一标记：干细胞抗原1-FITC(eBioscience，11-5981-81)；CD29-PE (eBioscience，12-0291-81)；CD34-FITC(eBioscience，11-0341-81)；CD11-b (Cedarlane，CL8941F)；CD86-PE(eBioscience，12-0861-81)；CD45-FITC (eBioscience，11-0451-81)。使用同种型匹配的对照物作为每个抗体进行荧光检测的对照。
15、人肺上皮细胞与MSC体外共培养
来自健康志愿者或ARDS患者的血浆样本被用来刺激人类小气道上皮细胞(SAECs；CC-2547，Lonza，Walkersville，MD)和人骨髓基质细胞(hMSCs；240L， DJ Prockop博士，再生医学研究所，德克萨斯A&M健康科学中心)。在transwell 共培养体系中，hMSCs接种在上腔室，SAECs接种在下腔室(C3460，康宁，特克斯伯里，马萨诸塞州)。
SAEC在小气道上皮细胞生长培养基(SAGM)中培养，辅以供应商 (CC-3118，Lonza)推荐的补充物，生长到12孔transwell的地表面铺满有70％细胞。
人间充质干细胞生长在跨孔聚酯膜4μm的插入物上，用于共培养。
将健康志愿者的血浆样品随机分为3组，将ARDS患者的血浆样品随机分为6组进行体外研究
用无血清SAGM、含30％HV(健康志愿者)血浆的、含30％ARDS血浆的无血清培养基，用对照混合物(C)或抑制混合物(IFO)以低剂量或高剂量刺激SAEC 30分钟，以检测其对IL-6，FN和氧化应激的抑制作用。
其中，抑制混合物(IFO)含有：IL-6中和抗体(mabg-hil6-3 Invivogen，SanDiego，CA)、FN结合抑制剂RGDS肽(15359，Cayman chemical，Ann Harbor， MI)、氧化剂抑制剂GPx-1模拟物Ebselen(60940-34-3，Sigma-Aldrich，Oakville， ON)。
对照混合物(C)含有：小鼠IgG、DMSO、甲醇。
hMSCs和SAECs在培养基中共培养24h，收集上清液和RNA。使用人IL-6 ELISA(887066，Sigma Aldrich)，人FN ELISA(AB1088 47，ABCAM)，总抗氧化能力测定(STA-360，OxISVIDED，细胞BiOLABS)，检测IL-6，FN和总抗氧化能力的量。LDH法(11644793001，RoCH，Laval，QC)检测细胞毒性， SAEC+C组作为基线。
流式细胞技术：在6孔板上培养人骨髓间充质干细胞，分别用无血清SAGM 或含30％HV或ARDS血浆的无血清培养基和对照混合物(C)或高剂量的抑制混合物(IFO)处理，第三天更换含有相同处理物的新培养基。第五天利用流式细胞技术(BD LSRFortessaTM X-20)分离hMSCs。使用APC小鼠抗人CD105， BV-421小鼠抗人CD90，FITC小鼠抗人CD34，FITC小鼠抗人CD117和FITC 小鼠抗人CD45(323208，328122，343604，313232，68508，BioLegend)进行检测。
16、试剂和生物化学分析
(1)小鼠ELISAs
纤维蛋白原(CSB-E08202m，Cusabio)；纤维连接蛋白(FN，ab108849，Abcam)；超氧化物歧化酶1(LS-F4235，LifeSpan Bio)；α-胰蛋白酶抑制剂重链H-4(ITIH， LS-F9399，LifeSpan Bio)；组蛋白2A(025701，US-Biologicals)；表面活性剂相关蛋白A(CSB-E08685mCusabio)；谷胱甘肽-S-转移酶ω1(SEA623Mu， Cloud-Clone corp)；白蛋白(Abcamab108791)。
(2)人ELISAs
IL-10(KH0102,Invitrogen)；HGF(KAC2211,Invitrogen)；纤维蛋白原 (CSB-E13656h，Cusabio)；ITIH(LS-F6535，LifeSpan Bio)；前胶原肽-3 (SEA573Hu，USCN)；表面活性蛋白D(CSB-E11166h，Cusabio)；IL-6(KHC0061C， Invitrogen)；Fibronectin(BMS2028，eBioscience)。
(3)测定
总抗氧化能力(小鼠，SAT-360，OxySelect)(人，ab65329，Abcam)；过氧化氢(SAT-344，OxySelect)；丙二醛(LS-F10558，LifeSpan BioSciences)；氮氧化物合酶(ab65328，Abcam)；蛋白质羰基化(ALX-850-312-K101，Enzo)；GPx-1活性测定(703102，CaymanChemical)；SiRCOL胶原测定(S1000，Biocolor)；蛋白质 (22660，Pierce，ThermoFisherscientific)；luminex多重分析小鼠和人(E-Bioscience， Affymetrix，San Diego，CA)。
(4)Western blot
兔抗鼠α-smooth muscle actin(ab5694，Abcam)；鼠抗兔上皮细胞钙粘蛋白 (G-10，sc-8426，Santacruz)；兔抗鼠β-肌动蛋白(ab8227，Abcam)。
(5)RT-PCR
肺组织总RNA提取采用Trizol reagent(15596-026，Life technologies)，RNA 使用DNAse I(EN0521，Fermentas)处理，并进行反转录(RevertAidTM H Minus First StrandcDNA Synthesis Kit，K1632，Fermentas)。Power SYBR Green(4367659 AppliedBiosystems)用于RT-PCR，GAPDH为内参基因，RT-PCR用到的引物见表1。
表1：
退火温度(TM)，引物对效率(E)，小鼠(m)，人(h)。
17、免疫荧光与免疫组织化学
在小鼠肺组织切片中用下列主要抗体进行抗原检测：山羊抗小鼠前表面活性蛋白C(sc-7706，Santa Cruz)、兔抗小鼠水通道蛋白5(ab78486，Abcam)、兔抗小鼠α-平滑肌肌动蛋白(ab5694，Abcam)、兔抗小鼠纤维连接蛋白(ab23750， Abcam)；兔抗萤火虫GFP(ab6556，Abcam)；小鼠抗兔Ki67-Alexa 488偶联 (NBP2-22112AF488，Novus Bio，Oakville，ON)，兔抗小鼠Vimentin(ab92547， Abcam)。使用合适的AlEXA594或AlEXACA48(IVITONGROD)偶联的二级抗体进行荧光标记。DAPI(1μg/ml)用于核标记。
用山羊抗人GPx-1抗体(NB100-40805，Novusbio.)和带有HRP偶联二级抗体(Vector.ies，Burlingame，CA)的Vecta-stain ABC检测试剂盒，进行免疫组织化学，然后进行苏木素反染色。
图像分析：使用Zeiss LSM700共聚焦显微镜在630倍放大倍率的SPC、AQP5 和α-SMA标记的肺切片上捕获的图像使用J软件(美国国立卫生研究院)进行分析。简言之，对于每幅图像，核染色(DAPI，蓝色)和目标通道(SPC，红色或 AQP5，绿色)被分离，在目标通道中，基于IgG控制将阈值检测水平调整到固定阈值水平，并转换为二值图像。在每个字段的％面积由阳性信号覆盖，并确定平均3个随机视野。
为了检测SPC和波形蛋白阳性细胞增殖，我们在1000倍放大(蔡司LSM700 共聚焦显微镜)下拍摄图像(n＝6/组)。计算Ki67+细胞/视野的百分比相对于细胞核/场的总数。然后计数Ki67+或Vimentin+细胞的数目，并表示为总Ki67+ 细胞/场的％。
18、生物发光成像
Xenogen IVIS 100 in vivo成像系统用于检测荧光素酶标记细胞或慢病毒(STTARR facility at University Health Network,Toronto,ON)。在扫描前15分钟，将胸毛剃除，150mg/kg Dluciferin(P1043)腹腔注射(IP)。图像采集和分析是由活体图像软件(XyGoin BioScIsTs)完成的。D-荧光素/荧光素酶反应发出的光的总通量强度在10分钟的间隔内测量30分钟。
实施例1小鼠肺损伤模型的构建及其对MSC给药的反应
一、小鼠肺损伤模型的构建
1、实验方法
将14-16周的雄性C57BL/6小鼠麻醉并插管，然后以3ml/kg滴注HCl(1N， pH 1)或生理盐水(NS)，并且机械通气10分钟使滴注的液体在肺内均匀分布。
滴注后48小时后将小鼠麻醉，并再次插管以进行低压(LP)或高压(HP) 机械通气，并以保留自主呼吸(SB)的小鼠作为对照。
共得到6组小鼠模型：
(1)HCl+SB；
(2)NS+SB；
(3)HCl+LP；
(4)NS+LP；
(5)HCl+HP；
(6)NS+HP。
检测小鼠模型的各项生理生化指标和基因蛋白表达情况。
2、实验结果
酸吸入是导致小鼠ARDS肺损伤的一个重要原因。该模型的小鼠血氧下降，肺通透性增加，肺顺应性降低和炎症反应增加(图1A-C)。第2天观察到，在肺组织中，蛋白水平上转化生长因子-β1(TGF-β1)胶原蛋白的增加，以及基因表达水平上胶原蛋白-1和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的增加(图1D)，这表明了肺纤维化进程的起始。
为了产生不同的肺损伤微环境，小鼠用低峰吸气压力(LP)或高压(HP) 机械通气2小时后脱机，拔管并观察28天。14天时，高压(HP)组的Ashcroft 评分(纤维化)和collagen-1基因表达明显高于自发性呼吸组(图2A和B)。48小时后，接受了HCl滴注和HP通气的双重打击小鼠表现出最高的Ashcroft评分、 collagen-1表达和肺顺应性(图2A和B)。
二、小鼠肺损伤模型的MSC治疗
1、实验方法
将构建的肺损伤模型小鼠随机分为三组，分别进行MSC、PBS(溶剂对照组，没有细胞)或小鼠肺成纤维细胞(细胞对照组)给药(图3A)
具体的给药方式为：
先进行气管内细胞给药(IT)，15分钟后进行静脉内细胞给药(IV)。
为了了解MSC对肺泡上皮细胞系的完整性是否有影响，MSC给药后用表面标记物水通道蛋白-5(AQP5)对肺泡上皮I型细胞(AECI)进行染色，用表面活性蛋白C(SPC)对II型细胞(AECII)进行染色。
2、实验结果
单纯HP组，MSC的用药减少肺损伤、Ashcroft评分和collagen-11 mRNA 表达(图2A和B)。相反的，在接受HCl的小鼠中，无论是否接受机械通气， MSCs用药都导致了Ashcroft评分和collagen-1基因表达升高(图2A和B)，并减少了肺通气(图2C)。MSC给药对肺纤维化的促进作用持续到28天(图4A-C)。我们还观察到，如果在HCl诱导的损伤后14天给予MSC，则给予MSC是保护性的(图5A-C)。
结果表明，MSC本身不可能是纤维化的来源，因为它们在第7天(图6A) 后在肺中不存在。由于MSC在TGF-β1的旁分泌中有促进纤维化的作用，结果表明，在HCL滴注的肺中，MSC给药后支气管肺泡灌洗液中，TGF-β1及其他纤维化标志物纤维连接蛋白和纤维蛋白原增加(图7A)。在HCl处理的肺组织中，通过共同染色细胞核中的成纤维细胞表面标记波形蛋白和细胞增殖标志物 Ki-67显示纤维增生(图2D，图8A)。
在HP通气小鼠中，被破坏的AECI结构和减少的AECII数目被部分恢复，这表明MSC给药后AQP5和SPC的表达增加(图2E，图8B)。
在HCl处理组中，给药7天(图2E，图8B)、14天(图3B和C，图8C)、28 天(图4B和C)后，这种上皮细胞的恢复仍然受到抑制，并与间充质标志物α-SMA 和波形蛋白基因和蛋白表达增加有关，表明HCl滴注抵消了MSC用药带来的对上皮细胞的修复。肺纤维化的小鼠在炎症、纤维化与细胞表面标志物没有变化(图 3D)。
同时，结果显示不同的处理的小鼠模型，肺内微环境具有不同的特点。
三、小鼠MSC治疗时的肺微环境的蛋白质组学分析
1、实验方法
为了了解MSCs给药在肺损伤条件下的作用机制，在MSC给药时，对小鼠进行了支气管肺泡灌洗液的蛋白质组学分析。
2、实验结果
结果发现，在HCl滴注后，涉及炎症、凝血和纤维化的蛋白富集上调(图 1C&D，图9A，图10A&C)。生理盐水和HCl滴注后，抗氧化酶和相关蛋白均下调，HCl引物组更为明显(图9A，图10A&C)。蛋白组学质谱体现了肺内环境状况并能预测ARDS病人应用MSC的效果(图9B，图10B)。
发现肺内微环境的白细胞介素6、纤维连接蛋白和总抗氧化能力，这3个指标在支气管肺泡灌洗液和血浆中检测到的因子的蛋白质水平具有很好的一致性 (图6B)，并以此来表征肺内微环境，NS组的这三个指标的平均值(黄盒)用做 cut off points的参考标准(图6C)。
综上所述，在不同的小鼠肺损伤模型中，MSCs的用药结果不同。肺微环境中最引人注目的发现是，涉及凝血、纤维化和炎症中的蛋白的表达量上升导致了在小鼠接受MSC治疗后的有害作用。肺微环境谱具有高水平的IL-6和纤维连接蛋白，以及低总抗氧化能力时，MSCs的给药会产生有害的影响；而当没有显著的IL-6或纤维连接蛋白时，MSCs的给药对肺组织的具有明显保护作用。
实施例2人ARDS患者的肺微环境表征因子
1、实验方法
为了进一步研究在小鼠中观察到的结果的相关性，检测了在ICU或CCU中的，入院48小时内ARDS和心脏患者血浆中的关键蛋白。
2、实验结果
在ARDS患者中观察到类似小鼠模型中存在的蛋白质组学模型(图12A)，具有很好的一致性。
利用CCU和ARDS患者的肺内微环境的总抗氧化能力、IL-6和纤维连接蛋白的浓度做3D散射图。CCU和ARDS患者的肺内微环境有着不同的特点，以轻度ARDS患者3个因子的平均值的区域(黄色框)作为参考范围，将适应MSC 治疗的ARDS患者从中筛选出来(图12B)。因此，了解肺微环境对于是否需要利用确定MSC治疗是至关重要的。
进一步发现，构建的小鼠模型(图6C)与临床患者(CCU病人和ARDS病人)(图12B)，在肺内微环境的总抗氧化能力(TAC)、白细胞介素-6(IL-6)和纤维连接蛋白(FN)分布有类似的规律，并根据小鼠间充质干细胞给药后的情况给出ARDS治疗策略(图12D)：
正常小鼠选用未经修饰的MSC治疗有很好的治疗效果，此时其肺内微环境总抗氧化能力、IL-6和纤维连接蛋白的量相应于现有CCU病人肺内微环境总抗氧化能力、IL-6和纤维连接蛋白的量(TAC>250μmol/ml，IL-6<10ng/ml且FN<500 ng/ml)；
盐水灌注小鼠模型，发明人(1)仅仅使用基因修饰的MSC(MSCIL-10或 MSCHGF)、或(2)使用修饰过的慢病毒(LVGPx-1)进行治疗后，再选用未经修饰的MSC治疗，均取得了很好的效果，此时其肺内微环境总抗氧化能力、IL-6 和纤维连接蛋白的量相应于一部分ARDS病人肺内微环境总抗氧化能力、IL-6 和纤维连接蛋白的量(TAC为200～250μmol/ml，IL-6为10～30ng/ml且FN 为500～900ng/ml)；
盐酸灌注小鼠模型，给予MSC后可能会进一步加重肺损伤，故不合适进行任何MSC干预治疗，此时其肺内微环境总抗氧化能力、IL-6和纤维连接蛋白的量相应于另一部分ARDS病人肺内微环境总抗氧化能力、IL-6和纤维连接蛋白的量(TAC<200μmol/ml，IL-6>30ng/ml且FN>900ng/ml)。
实施例3基因修饰过的MSC的给药
1、实验方法
为了克服MSCs产生的不利的影响，避免有害的肺微环境(即前纤维化、促凝血和促炎症)，我们将携带人肝细胞生长因子(LVHGF)或人白细胞介素-10 (LVIL-10)慢病毒瞬时转化MSC得到携带人肝细胞生长因子(MSCHGF)或人白细胞介素-10(MSCIL-10)的MSC。
携带hIL-10(MSCIL-10)或hHGF(MSCHGF)的MSC在HCl处理48后进行给药，携带荧光素酶报告基因(MSCLuc)的MSC和PBS作为对照。
具体给药方式：先进行气管内细胞给药(IT)，15分钟后进行静脉内细胞给药(IV)。
检测BALF和肺组织匀浆的各项生理生化指标和基因蛋白表达情况。
2、实验结果
修饰后的MSC不影响细胞表型标记物的表达，同时在体内产生HGF和IL-10 (图11A&B)。与用未修饰MSCs治疗的小鼠相比，用MSCHGF或MSCIL-10治疗的小鼠，24小时后降低了促炎细胞因子、TGF-β1、纤连蛋白和纤维蛋白原(图7A)，并且7天后降低了炎症评分和Ashcroft评分(图7B)。同时发现，HCl处理的小鼠，肺内长期存在有未处理的MSC(图6A)
实施例4 MSC给药前肺微环境的校正
发明人发现，由于HCl滴注后，支气管肺泡灌洗液中脂质过氧化产物MDA 和羰基蛋白的浓度升高(图7C)，这是支气管肺泡灌洗液中氧化应激介导的细胞损伤的标志物；同时，滴注PBS后，抗氧化剂谷胱甘肽过氧化物酶-1(GPx-1)和谷胱甘肽S-转移酶(GST)的表达降低，并且通过HCl滴注进一步降低，因此，选用GPX-1解游离脂肪酸(H2O2)和过氧化氢并保护膜磷脂，以改善肺微环境。
1、实验方法
构建了携带有人GPx-1的慢病毒(LVGPx-1)，在HCl损伤小鼠48小时后对小鼠通过慢病毒的体内转染进行LVGPx-1用药，人GPx-1特异性RT-PCR引物用来检测小鼠肺组织中hGPX-1mRNA表达。采用GPX-1酶动力学测定法测定肺组织GPX活性水平，用hGPX-1特异性抗体进行免疫组化检测GPX-1阳性细胞。
HCl±LVGPx-1 48h进行MSC用药，在第7天用Masson’s trichrome染色肺切片观察MSC给药对GPX-1治疗肺的影响，以LVLuc作为对照。
2、实验结果
携带有人GPx-1的慢病毒(LVGPx-1)(图11C-E)，以修正肺微环境的强的氧化性。在使用了LVGPx-1 2天后，强抗氧化能力，降低了H2O2、趋化因子和细胞因子的产生(图7C)。这些保护作用在LVGPx-1诱导2天后由MSC给药进一步放大，这通过shcroft评分降低；支气管肺泡灌洗液中纤连蛋白水平降低而证实(图7D，图11F)。
在特定的损伤严重程度下，与单独的MSC治疗相比，在MSC施用之前通过过表达GPx-1来校正微环境能够减少HCl诱导的肺损伤。使用LVGPx-1来恢复抗氧化能力可以将MSCs的其他有害作用转变为保护性结果，MSC用药之前对肺微环境的校正是必要的，这将促进MSCs的有益效果。
实施例5 ARDS患者血浆对人肺表皮细胞和MSC之间相互作用的影响
1、实验方法
来自健康志愿者(HV)或ARDS患者的血浆样本被用来刺激人类小气道上皮细胞和人骨髓基质细胞。在transwell共培养体系中，hMSCs接种在上腔室， SAECs接种在下腔室。
SAEC在小气道上皮细胞生长培养基(SAGM)中培养，辅以供应商 (CC-3118，Lonza)推荐的补充物，生长到12孔transwell的表面铺满有70％细胞。
人间充质干细胞生长在跨孔聚酯膜4μm的插入物上，用于共培养。
将健康志愿者的血浆样品随机分为3组，将ARDS患者的血浆样品随机分为6组进行体外研究
无血清SAGM、含30％HV血浆或含30％ARDS血浆的无血清培养基培养，分别添加对照混合物(C)或抑制混合物(IFO)以低剂量或高剂量刺激SAEC 30 分钟，以检测其对IL-6，FN和氧化应激的抑制作用。
其中，抑制混合物(IFO)含有：IL-6中和抗体、FN结合抑制剂RGDS肽、氧化剂抑制剂GPx-1模拟物Ebselen。其中，IL-6中和抗体，100ng/ml(低剂量) 或1ng/ml(高剂量)；FN结合抑制剂RGDS肽，100μM(低剂量)或1mM(高剂量)；氧化剂抑制剂GPx-1模拟物Ebselen，50μM(低剂量)或100μM(高剂量)，以上均为终浓度。
对照混合物(C)含有：小鼠IgG、DMSO、甲醇。其中，小鼠IgG1μg/ml； DMSO 10μl/ml；甲醇2μl/ml，以上均为终浓度。
hMSCs和SAECs在培养基中共培养24h，收集上清液和RNA。检测IL-6， FN和总抗氧化能力的量。LDH法检测细胞毒性，SAEC+C组作为基线。
在6孔板上培养人骨髓间充质干细胞，分别用无血清SAGM或含30％HV 或ARDS血浆的无血清培养基和对照混合物(C)或高剂量的抑制混合物(IFO) 处理，第三天更换含有相同处理物的新培养基。第五天利用流式细胞技术(BD LSRFortessaTM X-20)分离hMSCs。检测CD105、CD90、CD34、CD117、CD45。
2、实验结果
与用健康志愿者血浆刺激的细胞相比，ARDS患者血浆中IL-6、FN的产生和细胞毒性增加，TAC减少(图12C)。显示与mRNA和蛋白水平上的N-钙粘蛋白上调有关(图12C，图13)。
用ARDS患者血浆刺激人间充质干细胞24小时对表面标记物没有显著影响，但5天时CD105和CD90下降，与用健康志愿者血浆刺激的间充质干细胞 (图14)相比，表面标记物表型改变。说明在暴露于ARDS患者血浆五天后， MSC的细胞特性和其正常功能会有所改变，故会丧失其原本修复损伤组织的作用。
刺激SAEC和人间充质干细胞与ARDS患者血浆在跨孔系统中共培养24小时，导致IL-6进一步增加，N-Cadherin在mRNA和蛋白质水平上表达增加(图 12C，图13)。
抑制混合物(IFO)可降低IL-6、FN水平，增强TAC，减低细胞毒性，抑制N-Cadherin在基因和蛋白质水平上的表达，且这种影响是依赖于刺激SAEC 和MSC的人ARDS血浆的剂量的。
在用人ARDS血浆刺激后，抑制性混合物的应用维持了人MSC表面标记物表型(图12C，13&14)。
本研究证实，ARDS病人血浆中的IL-6、FN和TAC是导致影响MSC正常细胞功能的关键因素。阻断血液中IL-6、FN蛋白和增强TAC，可以保持MSC 正常特性与其修复组织损伤之功能。

Claims (8)

1.一种重组载体在治疗ARDS或制备治疗ARDS药物中的应用，其特征在于，所述重组载体携带有人HGF基因。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述重组载体为重组慢病毒载体。
3.一种重组慢病毒在治疗ARDS或制备治疗ARDS药物中的应用，其特征在于，所述重组慢病毒携带有人HGF基因。
4.一种重组MSC在治疗ARDS或制备治疗ARDS药物中的应用，其特征在于，所述重组MSC为被包含慢病毒载体携带有人HGF基因转染后的MSC。
5.一种重组MSC在治疗ARDS或制备治疗ARDS药物中的应用，其特征在于，所述重组MSC过表达人HGF基因或/和蛋白。
6. 一种治疗ARDS的方法，其特征在于，当ARDS患者的肺内微环境中，TAC在200～250 µmol/ml，IL-6在10～30 ng/ml，且FN在500～900 ng/ml时，用权利要求5中所述重组MSC对ARDS患者进行治疗给药。
7.人HGF基因或/和蛋白或/和其激活剂在MSC治疗ARDS或制备治疗ARDS药物中的应用。
8.一种治疗ARDS药物的药物，其特征在于，含有权利要求1中所述重组载体、权利要求3中所述重组MSC、权利要求4中所述重组慢病毒、权利要求5中所述重组MSC或权利要求7中所述人HGF基因或/和蛋白或/和其激活剂的一种或几种。
CN201811262291.6A 2018-10-27 2018-10-27 一种利用hgf转基因的干细胞治疗ards的方法 Pending CN110101874A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811262291.6A CN110101874A (zh) 2018-10-27 2018-10-27 一种利用hgf转基因的干细胞治疗ards的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811262291.6A CN110101874A (zh) 2018-10-27 2018-10-27 一种利用hgf转基因的干细胞治疗ards的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110101874A true CN110101874A (zh) 2019-08-09

Family

ID=67483341

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811262291.6A Pending CN110101874A (zh) 2018-10-27 2018-10-27 一种利用hgf转基因的干细胞治疗ards的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110101874A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3957364A1 (en) * 2020-08-20 2022-02-23 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. A binding molecule specifically binding to human cd4 for use in the treatment of pulmonary diseases

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008144820A1 (en) * 2007-05-28 2008-12-04 Monash University Treatment of chronic lung disease
CN104666347A (zh) * 2015-02-28 2015-06-03 广州医科大学附属第一医院 脐带间充质干细胞在制备治疗肺间质纤维化的药物制剂中的应用
CL2017002357A1 (es) * 2017-09-16 2018-04-20 Cells For Cells S A Método de obtención de una composición que contiene una población específica de células mesenquimales de cordón umbilical y sus usos

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008144820A1 (en) * 2007-05-28 2008-12-04 Monash University Treatment of chronic lung disease
CN104666347A (zh) * 2015-02-28 2015-06-03 广州医科大学附属第一医院 脐带间充质干细胞在制备治疗肺间质纤维化的药物制剂中的应用
CL2017002357A1 (es) * 2017-09-16 2018-04-20 Cells For Cells S A Método de obtención de una composición que contiene una población específica de células mesenquimales de cordón umbilical y sus usos

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DIANA ISLAM: "Lung Microenvironment Plays a Key Role on the Protective vs. Detrimental Effects of Mesenchymal Stromal Cell Therapy in Acute Lung Injury", 《HTTPS://WWW.PROQUEST.COM/OPENVIEW/84C689548CB1F09785A6C30F6650BCBD/1?PQ-ORIGSITE=GSCHOLAR&CBL=18750》 *
SHULING HU等: "The hepatocyte growth factor-expressing character is required for mesenchymal stem cells to protect the lung injured by lipopolysaccharide in vivo", 《STEM CELL RESEARCH & THERAPY》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3957364A1 (en) * 2020-08-20 2022-02-23 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. A binding molecule specifically binding to human cd4 for use in the treatment of pulmonary diseases

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Chu et al. Reversal of bleomycin-induced rat pulmonary fibrosis by a xenograft of human umbilical mesenchymal stem cells from Wharton's jelly
Zhao et al. Gallic acid reduces cell viability, proliferation, invasion and angiogenesis in human cervical cancer cells
WO2016029833A1 (zh) 甲病毒在制备抗肿瘤药物方面的应用
WO2008141438A1 (en) Gabaergic modulators for treating airway conditions
Malaquias et al. Effects of mesenchymal stromal cells play a role the oxidant/antioxidant balance in a murine model of asthma
Li et al. Lactoferrin protects against lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice
CN112121063A (zh) 外泌体在制备治疗间质性肺损伤和/或肺纤维化的药物中的应用
WO2023165167A1 (zh) 灵芝tRFs在哮喘治疗中的制药用途
CN110101873A (zh) 一种利用il-10转基因的干细胞治疗ards的方法
CN110108883A (zh) 用于筛选与靶治疗ards患者的msc精准医学的标志物组合
US11622964B2 (en) Method for destroying cellular mechanical homeostasis and promoting regeneration and repair of tissues and organs, and use thereof
Zhang et al. Dynamic variation of RAS on silicotic fibrosis pathogenesis in rats
Zhou et al. Exosomes derived from dental pulp stem cells accelerate cutaneous wound healing by enhancing angiogenesis via the Cdc42/p38 MAPK pathway
Hu et al. Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells alleviate acute lung injury caused by severe burn via secreting TSG-6 and inhibiting inflammatory response
CN110101874A (zh) 一种利用hgf转基因的干细胞治疗ards的方法
CN110141667A (zh) 一种利用gpx-1纠正内环境以增强干细胞对ards疗效的方法
Dong et al. Lats2-underexpressing bone marrow-derived mesenchymal stem cells ameliorate LPS-induced acute lung injury in mice
Xie et al. Adiponectin alleviates intestinal fibrosis by enhancing AMP-activated protein kinase phosphorylation
Chang et al. From Hair to Colon: Hair Follicle-Derived MSCs Alleviate Pyroptosis in DSS-Induced Ulcerative Colitis by Releasing Exosomes in a Paracrine Manner
CN109364249B (zh) 以manf为靶点的物质在制备治疗肝内胆管癌产品中的应用
Qiao et al. CD151, a laminin receptor showing increased expression in asthmatic patients, contributes to airway hyperresponsiveness through calcium signaling
Shen et al. Therapeutic benefits of CD 90‐negative cardiac stromal cells in rats with a 30‐day chronic infarct
Hiraishi et al. Substantial involvement of TRPM7 inhibition in the therapeutic effect of Ophiocordyceps sinensis on pulmonary hypertension
CN105521482B (zh) 联合应用HNF1α、HNF4α、FOXA3诱导分化治疗肝细胞癌
US11026945B2 (en) Protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase (PERK) inhibitors for prevention and/or treatment of lung injury and/or inflammation

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190809