CN105176923A - 一种从经血中制备宫内膜间充质干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从经血中制备宫内膜间充质干细胞的方法，该方法包括如下步骤：(a)在女性经期将卫生栓置入阴道中，其中，所述卫生栓包括吸收栓体，所述吸收栓体具有吸水纤维芯体，且所述吸水纤维芯体上包裹有纱布吸收层，置入的时间使得所述纱布吸收层上吸附有经血和/或脱落的子宫内膜组织；(b)拉出所述拉线取出所述卫生栓，用洗脱液将所述纱布吸收层上所吸附的经血和/或脱落的子宫内膜组织洗脱下来，得到洗脱产物；(c)从所述洗脱产物中分离出有核细胞，并进行细胞培养。本发明能够方便地在临床上使用，能够为经血捐赠者接受，并且，所获得的宫内膜间充质干细胞具有更高的增殖活性。

Description

一种从经血中制备宫内膜间充质干细胞的方法

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体地，涉及一种从经血中制备宫内膜间充质干细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞(MesenchymalStemCell，MSC)是干细胞的一种，因能分化为间质组织而得名，具有自我更新能力和多向分化潜能，可用于造血支持和促进干细胞植入及免疫调控等多种功能。随女性经血脱落的子宫内膜组织中具有相当数量的间充质干细胞，被称之为宫内膜间充质干细胞。宫内膜间充质干细胞细胞数量多，是骨髓来源干细胞的30倍；体外增殖能力强：24小时扩增一倍，可增殖390次，传代高达50次；分化潜能性大：能表达Oct-4、SSEA-4和CD117等干细胞标志物，与骨髓干细胞相近；而且免疫原性低，是一类免疫缺陷细胞，异体移植无免疫排斥反应或反应较弱，因此在再生医学领域具有巨大的潜能。

经血随月经周期每月排出，从经血中可以分离出宫内膜干细胞。但经血与人体分离前易污染，收集、保存较为困难。目前，从女性经血中提取间充质干细胞，主要通过月经杯(DivaCup)来进行经血及随经血脱落组织的采集，中国专利申请CN201210116237.7和CN201410836460.8中均有涉及月经杯的使用。月经杯作为提取宫内膜干细胞使用的一次性器具，通常为医用硅胶材质，造价较高，且有大小型号之分，未使用过月经杯的多数女性很难判别应选择何种型号的杯体适合自己使用。使用型号大小不适宜的月经杯会导致体内异物感、经血渗漏及采集失败。月经杯在我国较为少用，不符合我国女性的经期用品使用习惯，且把月经杯放进阴道较为麻烦，需要使用练习时间。未婚女性担心月经杯损坏处女膜，已婚女性也担心会影响阴道结构而导致阴道松弛。个别女性因阴道结构的差异，不易放置月经杯。另外，月经杯置入体内4-5小时取出进行清洗、消毒后再放回体内，不便于职业女性在工作中使用。现有的卫生棉条虽然可以吸收经血，但是吸收在卫生棉条上的经血中的细胞无法从卫生棉条中释放出来，并且子宫内膜组织块也无法回收，因而不能用于提取宫内膜间充质干细胞。因此，目前从经血中制备宫内膜间充质干细胞的方法存在临床上使用困难且宫内膜间充质干细胞增殖活性低。

发明内容

本发明的目的是提供一种从经血中制备宫内膜间充质干细胞的方法，该方法在临床上非常容易使用，且能够取得较高的宫内膜间充质干细胞增殖活性。

为了实现上述目的，本发明提供了一种从经血中制备宫内膜间充质干细胞的方法，该方法包括如下步骤：(a)在女性经期将卫生栓置入阴道中，其中，所述卫生栓包括吸收栓体和固定在所述吸收栓体上的拉线；所述吸收栓体具有吸水纤维芯体，且所述吸水纤维芯体上包裹有纱布吸收层，所述纱布吸收层上具有开口向外的凹槽，所述凹槽中嵌入有吸水凝胶条，且所述吸水凝胶条的外接触面高于所述纱布吸收层的外接触面；置入的时间使得所述纱布吸收层上吸附有经血和/或脱落的子宫内膜组织；(b)拉出所述拉线取出所述卫生栓，拆下所述纱布吸收层，然后用洗脱液将所述纱布吸收层上所吸附的经血和/或脱落的子宫内膜组织洗脱下来，得到洗脱产物；(c)从所述洗脱产物中分离出有核细胞，并进行细胞培养。

通过上述技术方案，本发明能够方便地在临床上使用，能够为经血捐赠者接受，并且所获得的宫内膜间充质干细胞具有更高的增殖活性。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是本发明的卫生栓结构示意图。

图2是本发明的卫生栓中的吸收栓体的结构示意图。

图3是本发明的卫生栓中的吸收栓体的横截面结构示意图。

图4是测试实施例1中的P0代宫内膜间充质干细胞生长状态图。

图5是测试实施例2中的生长曲线图。

图6是测试实施例3中的凝胶克隆接种实验结果图。

图7是测试实施例5中的宫内膜间充质干细胞的三系分化结果图，由左到右分别成骨(A)、成脂(B)和成软骨(C)分化结果。

附图标记说明

11包装管12吸收栓体13活塞

14拉线

21开孔22纱布吸收层

23凹槽24吸水纤维芯体

31头部32尾部

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

参考图1、图2和图3，本发明提供了一种从经血中制备宫内膜间充质干细胞的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(a)在女性经期将卫生栓置入阴道中，其中，所述卫生栓包括吸收栓体12和固定在所述吸收栓体12上的拉线14；所述吸收栓体12具有吸水纤维芯体24，且所述吸水纤维芯体24上包裹有纱布吸收层22，所述纱布吸收层22上具有开口向外的凹槽23，所述凹槽23中嵌入有吸水凝胶条，且所述吸水凝胶条的外接触面高于所述纱布吸收层22的外接触面；置入的时间使得所述纱布吸收层22上吸附有经血和/或脱落的子宫内膜组织；(b)拉出所述拉线14取出所述卫生栓，拆下所述纱布吸收层22，然后用洗脱液将所述纱布吸收层22上所吸附的经血和/或脱落的子宫内膜组织洗脱下来，得到洗脱产物；(c)从所述洗脱产物中分离出有核细胞，并进行细胞培养。

其中，该卫生栓包括吸收栓体12和固定在所述吸收栓体12上的拉线14；其中，所述吸收栓体12具有吸水纤维芯体24，且所述吸水纤维芯体24上包裹有纱布吸收层22，所述纱布吸收层22上具有开口向外的凹槽23，所述凹槽23中嵌入有吸水凝胶条，且所述吸水凝胶条的外接触面高于所述纱布吸收层22的外接触面。其中，所述吸收栓体12的作用是吸附经血中的液体部分，所述纱布吸收层22的作用是吸附经血中的细胞部分(宫内膜间充质干细胞)以及子宫内膜组织块，并且所述纱布23吸附的细胞部分和子宫内膜组织块能够在后续提取步骤中得到较高的释放产率，释放后的细胞部分和子宫内膜组织块在制备宫内膜间充质干细胞时能够得到较高的产率。其中，所述吸水凝胶条用于润滑，避免放置卫生栓时由于纱布吸收层22的摩擦带来不适感。

优选地，所述凹槽23的数量为1-10条，且所述凹槽23的走向与所述吸收栓体12的轴向平行。其中，所述凹槽23可以通过已知的压制方法，在纱布吸收层22上进行压制后获得。

优选地，所述凹槽23的最大深度为所述纱布吸收层22的最大厚度的20-70％。所述凹槽23提供了所述吸水凝胶条的嵌入位置。

优选地，所述吸水凝胶条具有低于所述纱布吸收层14的外接触面的尾部32和高于所述纱布吸收层14的外接触面的头部31，且所述头部31沿所述纱布吸收层14的表面延伸至卡止在所述凹槽23的开口上。其中，所述吸水凝胶条的头部31在吸水后具有润滑性能，可以避免纱布吸收层22与阴道的直接摩擦。所述吸水凝胶条可以为吸水硅胶条和/或聚丙烯酰胺吸水凝胶条。

优选地，所述吸水纤维芯体24的平均长度为5-7cm，平均直径为1-10mm；所述纱布吸收层22的最大厚度为2-5mm。所述吸水纤维芯体24和所述纱布吸收层22的尺寸优选适于亚洲女性阴道尺寸特点。

优选地，所述吸收栓体12包括半球状的头段，所述吸收栓体12包括弹头状的头段，所述头段的底面上连接有圆柱状的本体段。

优选地，所述头段与所述本体段的长度比例为1:(2-8)。所述吸收栓体12的结构优选适于亚洲女性阴道结构特点。

优选地，所述拉线14的长度为150-200mm。该优选的长度适合卫生栓的使用和取出。

优选地，所述卫生栓还包括容纳所述吸收栓体12的包装管11。所述包装管11能够方便所述吸收栓体13的储存和使用。

优选地，所述包装管11的两端具有开口，所述卫生栓还包括活塞13，所述活塞13能够经过所述包装管11一端的开口进入所述包装管11并在所述包装管11中沿轴向移动直至将所述吸收栓体12从所述包装管11的另一端的开口推出。将卫生栓置入阴道中的操作包括：推动所述活塞(13)经过所述包装管11一端的开口进入所述包装管11并在所述包装管11中沿轴向移动直至将所述吸收栓体12从所述包装管11的另一端的开口推出至阴道中。

本发明的卫生栓在使用时，可以将吸收栓体12用手指推入阴道，也可以将包装管11的开口靠近阴道口或半插入阴道内，推动活塞13将所述吸收栓体12从所述包装管11推出至阴道中。内管从外管中先行抽出，再作为推杆将吸收栓体12推入阴道内，之后去除包装管11和活塞13。吸水凝胶条可以起到润滑作用。吸收栓体12在阴道中存留1-4小时的过程中，经血被所述吸水纤维芯体24吸收，经血中的细胞(包括宫内膜间充质干细胞)以及子宫内膜组织块可以吸附、滞留在纱布吸收层22中。吸收栓体12在阴道中存留1-4小时后，通过连接吸收栓体12上的拉线14的尾部拉线将吸收栓体12拉出。吸收栓体12取出后，可以分离所述纱布吸收层22和所述纱布23；所述纱布吸收层22上吸附的经血中的细胞(包括宫内膜间充质干细胞)以及子宫内膜组织块可以很容易地释放到细胞培养液中，用于后续的培养和扩增。

根据本发明特别优选的一种实施方式，所述纱布吸收层22为经过包被液预处理无菌脱脂棉纱布，所述包被液预处理的操作包括：将所述无菌脱脂棉纱布浸没于包被液中，然后捞出并挤出多余液体后进行干燥，再压制成型；其中，所述包被液为含有40-60ng/mL的多聚赖氨酸、1250-2500U/mL的肝素和5-20ng/μL的纤连蛋白且pH值为7.2-7.5的缓冲液。在该优选实施方式中，所述纱布吸收层22更有利于经血中的细胞(包括宫内膜间充质干细胞)以及子宫内膜组织块的附着并保持活力，从而可以提高宫内膜间充质干细胞的增殖活性。

其中，所述洗脱液可以为常规的各种细胞培养用的缓冲液，例如磷酸盐缓冲液或生理盐水，根据本发明的一种优选实施方式，所述洗脱液为含有50-200μg/mL青霉素、50-200μg/mL链霉素、1.5-4μg/mL两性霉素B和30-50μg/mL环丙沙星和4-8mg/mL肝素且pH值为7.2-7.5的缓冲液。在该优选实施方式中，所述纱布吸收层22上吸附的经血中的细胞(包括宫内膜间充质干细胞)以及子宫内膜组织块可以更加容易地从所述纱布吸收层22上洗脱下来，从而可以提高宫内膜间充质干细胞的增殖活性。

根据本发明的方法，其中，从所述洗脱产物中分离出有核细胞的操作可以包括：将所述洗脱产物与红细胞裂解液混合，然后(800-1200)×g离心后去除液体，得到沉淀，然后将所述沉淀剪碎为1-5mm³大小的碎块，再进行贴壁细胞培养。

根据本发明的方法，其中，进行细胞培养所用的培养基为添加了3-5mmol/L谷氨酰胺、4-6mg/mL的人血清替代物、8-12ng/mL的EGF、8-12ng/mL的PDGF-BB、50-200μg/mL青霉素和50-200μg/mL链霉素的αMEM培养基。

以下，通过实施例进一步详细说明本发明。

制备实施例1

本制备实施例用于说明本发明的卫生栓的制备过程。

将无菌脱脂棉纱布(购自广东恒健制药有限公司，货号为861587)裁剪后在卫生栓压制条件(如CN1355684A的专利中所述的压制方法)下，压制为长度为6cm，内径为8mm，厚度为3mm的筒状套体，并且在所述纱布吸收层22上压制出8条对称的开口向外的凹槽23，且所述凹槽23的走向与所述筒状套体的轴向平行；所述凹槽23的最大深度为筒状套体的最大厚度的50％，即1.5mm。将脱脂棉(购自北京奥民胜医疗器械有限公司公司，货号为001)填充于纱布吸收层22中作为吸水纤维芯体24，吸水纤维芯体24的平均长度为6cm，平均直径为8mm。将吸水硅胶条(吸水硅胶购自上海祥晨特种橡胶制品有限公司，货号为77845，预制为直径2mm的吸水硅胶条)嵌入所述凹槽23中，由于凹槽23的挤压，在横截面方向上，吸水硅胶条具有低于所述纱布吸收层14的外接触面的尾部32和高于所述纱布吸收层14的外接触面的头部31，且所述头部31沿所述纱布吸收层14的表面延伸至卡止在所述凹槽23的开口上。由此组装得到吸收栓体12，并且在吸收栓体的一端固定上拉线14。

使用医用级聚乙烯塑料，压制为包装管11和活塞13，所述活塞13能够经过所述包装管11一端的开口进入所述包装管11并在所述包装管11中沿轴向移动直至将所述吸收栓体12从所述包装管11的另一端的开口推出。将所述吸收栓体12置于所述包装管11中，具有所述拉线14朝向活塞13，形成本发明优选的一种卫生栓。

制备实施例2

按照制备实施例1的方法进行卫生栓的制备，所不同的是，在将无菌脱脂棉纱布裁剪和压制前，进行包被液预处理；具体地，将所述无菌脱脂棉纱布浸没于包被液中，然后捞出并挤出多余液体后进行干燥，其中，所述包被液为含有50ng/mL的多聚赖氨酸、1800U/mL的肝素和10ng/μL的纤连蛋白，且pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。

实施例1

本实施例用于说明本发明的卫生栓用于收集经血及脱落的子宫内膜组织的过程，以及经血捐献者的使用感受；并且还对宫内膜间充质干细胞进行培养和鉴定。

使用制备实施例1制备得到的卫生栓，募集多名经血捐献者，按照如下方法收集经血：在女性经期，推动活塞13经过包装管11一端的开口进入包装管11并在包装管11中沿轴向移动直至将所述吸收栓体12从所述包装管11的另一端的开口推出至阴道中，使得吸收栓体12在女性经期阴道中保持3小时，然后经过拉线14拉出所述吸收栓体，拆下所述纱布吸收层22，然后用洗脱液将所述纱布吸收层22上所吸附的经血和/或脱落的子宫内膜组织洗脱下来，得到洗脱产物；所述洗脱液为pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。

按照如下表1对经血捐献者进行使用感受打分评价：

表1

在收集经血结束后的48小时内，将所述洗脱产物与红细胞裂解液(购自南京恩晶生物科技有限公司，货号ETF3702)混合，然后1000×g离心后去除液体，得到沉淀，然后将所述沉淀剪碎为2mm³大小的碎块，再进行贴壁细胞培养。进行细胞培养所用的培养基为添加了4mmol/L谷氨酰胺、5mg/mL的人血清替代物(购自武汉维诺赛生物科技有限公司，货号R007)、10ng/mL的EGF、10ng/mL的PDGF-BB、100μg/mL青霉素和100μg/mL链霉素的αMEM培养基。进行连续5次传代后，进行如下检测：

按如下操作进行经血间充质干细胞的双层软琼脂集落形成检测：配制双层半固体琼脂培养基，于12孔培养板计入底层琼脂和上层琼脂(上层琼脂浓度为0.7重量％，含宫内膜干细胞200个/mL)37℃培养14天，观察克隆总数。

按如下操作进行经血间充质干细胞生长曲线检测：将宫内膜干细胞培养至第5代，0.25％胰酶消化细胞，用适当体积培养基重悬细胞，取100μl单细胞悬液(1×10³)接种于96孔板。在37℃、5％CO₂培养中培养10天，每天作为一个时间点并分别设置6个复孔；将CCK-8溶液10μl加入96孔板中，吹打混匀，继续37℃、5％CO₂培养箱中培养2-4小时；然后用酶标仪检测各孔的OD值(检测波长为490nm)，记录结果。绘制生长曲线。

按如下操作进行经血间充质干细胞的表型分析(流式细胞术)：细胞传至5代时收集细胞，0.25％胰酶消化细胞，制成细胞悬液，细胞浓度为1×10⁷/mL；分别取所需数量的0.5mLEP管，分别加入50μl的细胞样本，然后加入抗体(CD117、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、CD29、HLA-DR以及同型对照)，避光4℃孵育20min，300g离心5min，弃上清，加入1mL对应的缓冲液，充分混匀，300g离心5min，弃上清，加入0.5mL缓冲液，上流式细胞仪进行分析。

按如下操作进行经血间充质干细胞的成骨分化检测：经血间充质干细胞以3×10³cells/cm²铺于6孔板，待细胞生长24h后，换新鲜成骨诱导液，每隔3天全量换液，直到诱导培养21天结束诱导，弃去诱导液，加入4％多聚甲醛固定30分钟。固定完后，弃去固定液，加入PBS漂洗2次，加入1mL茜素红染色工作液染色3-5min，然后PBS漂洗3次，显微镜下观察拍照。

按如下操作进行经血间充质干细胞的脂肪分化检测：经血间充质干细胞以2×10⁴cells/cm²铺于6孔板，正常培养基培养细胞直至100％汇合度，弃去培养基，加入成脂诱导液A培养3天后，换成脂诱导液B诱导24h,再换成脂诱导液B诱导。如此交替培养3个循环，最后在成脂诱导液B中培养7天(每3天换液)。诱导结束，用4％多聚甲醛室温固定30min，PBS漂洗2次，然后在室温条件下用1mL油红染色30min，PBS漂洗3次后，显微镜下观察拍照。

按如下操作进行经血间充质干细胞的成软骨分化检测：经血间充质干细胞以2.5×10⁵cells/cm²铺于6孔板，正常培养基培养细胞至95％-100％汇合度，换软骨诱导液，每隔2天换液，诱导培养14-28天，去诱导液，加入4％多聚甲醛固定30分钟，弃去固定液，加入PBS漂洗2次，加入1mL阿辛蓝染色工作液染色30min，PBS漂洗3次，显微镜下观察拍照。

实施例2

按照实施例1的方法进行，所不同的是，使用制备实施例2制备得到的卫生栓，并且洗脱液为含有100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素、2.5mg/mL两性霉素B和40μg/mL环丙沙星、6.67mg/mL肝素且pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。

对比例1

按照实施例1的方法进行，所不同的是，收集经血采用购自杭州木子居电子商务公司的木阿阿月事杯。

对比例2

按照实施例1的方法进行，所不同的是，收集经血采用购自超市的ob内置式卫生棉条(普通型)。

测试实施例1

本测试实施例汇总实施例1和实施例2以及对比例1和2的结果。

在P0代细胞于培养皿贴壁生长2天后，对用不同方法提取的宫内膜间充质干细胞生长状态进行检测(图4)。实施例1和实施例2提取的细胞数目明显多于用月事杯和ob棉条提取的细胞，其中实施例2提取的细胞数目多于实施例1。从细胞形态学上看，使用实施例1和实施例2方法提取的细胞均一度优于对比例。

测试实施例2

生长曲线如图5所示，由生长曲线可知：按照实施例1和实施例2方法收集的宫内膜间充质干细胞的增殖速率明显高于对比例中由月事杯和ob棉条收集的宫内膜干细胞，且细胞生长平台期出现较晚。并且，与不含包被液的实施例1的方法相比，含包被液的实施例2的方法得到细胞的生长曲线显示出更加良好的生长情况。

测试实施例3

运用流式细胞仪对宫内膜间充质干细胞表面标志物进行检测，检测结果如表2所示，实施例提取的宫内膜间充质干细胞阳性标志物表达高于95％，阴性标准物表达低于2％，优于对比例数据。

表2

阳性率(％)	CD29	CD73	CD90	CD105	CD34	CD45	CD117	HLA-DR
									对比例1(月事杯)	97.6	91.5	93.8	95.8	0.2	0.3	0.4	0.1
对比例2(ob棉条)	97.3	90.5	92.7	95.3	0.6	1.1	0.5	0.1
									实施例1(不含包被液)	98.0	95.7	95.7	96.4	0.6	1.0	0.4	0.3
实施例2(包被液)	99.5	99.8	99.5	100.0	0.2	0.3	1.6	0.1

测试实施例4

将P3代、P9代和P17代宫内膜间充质干细胞稀释到1000个细胞数目进行凝胶克隆接种实验，结果如图6和表3所示，检测结果发现不同代数的宫内膜间充质干细胞均无克隆形成，安全性高。

表3

集落数	P3代	P9代	P17代
				常规压制(不含包被液)	0	0	0
常规压制(含包被液)	0	0	0

测试实施例5

实施例2提取出的宫内膜间充质干细胞的分化结果如图7所示，证明实施例提取出的宫内膜间充质干细胞具有较强的三系分化能力，图7中由左到右分别成骨(A)、成脂(B)和成软骨(C)分化结果。实施例1的三系分化结果与实施例2相同。

测试实施例6

对多例样本进行宫内膜间充质干细胞提取，对发生的污染率进行统计，结果如表4所示，可见使用实施例方法的污染率较低。

表4

方法	实施例1	实施例2	对比例1	对比例2
					培养总例数	10	10	10	10
污染例数	0	0	2	1
					污染率(％)	0	0	20	10

测试实施例7

按照实施例1中表1所列的标准对实施例1和2以及对比例1和2的受试者进行打分，结果如表5所示。可见本发明能够方便地在临床上使用，能够为经血捐赠者接受。

表5

方法	实施例1	实施例2	对比例1	对比例2
					置入卫生栓时感受	5	5	2	5
卫生栓在体内时感受	4	4	3	4
					取出卫生栓时感受	4	4	1	4
取出卫生栓后再次使用的感受	5	5	1	4

以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种从经血中制备宫内膜间充质干细胞的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(a)在女性经期将卫生栓置入阴道中，其中，所述卫生栓包括吸收栓体(12)和固定在所述吸收栓体(12)上的拉线(14)；所述吸收栓体(12)具有吸水纤维芯体(24)，且所述吸水纤维芯体(24)上包裹有纱布吸收层(22)，所述纱布吸收层(22)上具有开口向外的凹槽(23)，所述凹槽(23)中嵌入有吸水凝胶条，且所述吸水凝胶条的外接触面高于所述纱布吸收层(22)的外接触面；置入的时间使得所述纱布吸收层(22)上吸附有经血和/或脱落的子宫内膜组织；

(b)拉出所述拉线(14)取出所述卫生栓，拆下所述纱布吸收层(22)，然后用洗脱液将所述纱布吸收层(22)上所吸附的经血和/或脱落的子宫内膜组织洗脱下来，得到洗脱产物；

(c)从所述洗脱产物中分离出有核细胞，并进行细胞培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述凹槽(23)的数量为1-10条，且所述凹槽(23)的走向与所述吸收栓体(12)的轴向平行；所述凹槽(23)的最大深度为所述纱布吸收层(22)的最大厚度的20-70％。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述吸水凝胶条具有低于所述纱布吸收层(14)的外接触面的尾部(32)和高于所述纱布吸收层(14)的外接触面的头部(31)，且所述头部(31)沿所述纱布吸收层(14)的表面延伸至卡止在所述凹槽(23)的开口上。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述吸水纤维芯体(24)的平均长度为5-7cm，平均直径为1-10mm；所述纱布吸收层(22)的最大厚度为2-5mm。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述卫生栓还包括容纳所述吸收栓体(12)的包装管(11)；所述包装管(11)的两端具有开口，所述卫生栓还包括活塞(13)；

将卫生栓置入阴道中的操作包括：推动所述活塞(13)经过所述包装管(11)一端的开口进入所述包装管(11)并在所述包装管(11)中沿轴向移动直至将所述吸收栓体(12)从所述包装管(11)的另一端的开口推出至阴道中。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述纱布吸收层(22)的材质为无菌脱脂棉纱布；所述吸水纤维芯体(24)的材质为人造丝、棉、粉碎木材浆纸、羊毛、绢、进行化学修饰或者交联的纤维素纤维、合成纤维和泥炭苔绒中的至少一种；所述吸水凝胶条为吸水硅胶条和/或聚丙烯酰胺吸水凝胶条。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述纱布吸收层(22)为经过包被液预处理无菌脱脂棉纱布，所述包被液预处理的操作包括：将所述无菌脱脂棉纱布浸没于包被液中，然后捞出并挤出多余液体后进行干燥，再压制成型；其中，所述包被液为含有40-60ng/mL的多聚赖氨酸、1250-2500U/mL的肝素和5-20ng/μL的纤连蛋白且pH值为7.2-7.5的缓冲液。

8.根据权利要求1或7所述的方法，其中，所述洗脱液为含有50-200μg/mL青霉素、50-200μg/mL链霉素、1.5-4μg/mL两性霉素B和30-50μg/mL环丙沙星和4-8mg/mL肝素且pH值为7.2-7.5的缓冲液。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，从所述洗脱产物中分离出有核细胞的操作包括：将所述洗脱产物与红细胞裂解液混合，然后(800-1200)×g离心后去除液体，得到沉淀，然后将所述沉淀剪碎为1-5mm³大小的碎块，再进行贴壁细胞培养。

10.根据权利要求1或9所述的方法，其中，进行细胞培养所用的培养基为添加了3-5mmol/L谷氨酰胺、4-6mg/mL的人血清替代物、8-12ng/mL的EGF、8-12ng/mL的PDGF-BB、50-200μg/mL青霉素和50-200μg/mL链霉素链霉素的αMEM培养基。