CN102647989A - 采用重编程序的成熟成体细胞的治疗 - Google Patents

Abstract

一种使用重编程序的细胞诸如反分化、转分化或再分化细胞治疗患者中的各种疾病、紊乱或病症的方法。该方法包括从患者获得定型细胞、反分化所述定型细胞以获得反分化靶细胞、和将所述反分化细胞施用至所述患者。在一些实施方案中，该方法包括从患者获得定型细胞、转分化所述定型细胞以获得转分化靶细胞、和将所述转分化靶细胞施用至所述患者。所述反分化或转分化靶细胞修复或补充患者中的组织或细胞。

Description

采用重编程序的成熟成体细胞的治疗

通过引用并入

所有引用文件或在本文引用的文件中参考的文件以及本文或本文通过引用并入的任何文件中提及的任何产品的任何制造商指示、说明书、产品规格和产品页都通过引用由此引入本文，并且可用于本发明的实践。

发明领域

使用重编程序的细胞(reprogrammed cells)诸如反分化、转分化或再分化细胞治疗患者中的各种疾病、紊乱或病症的方法。该方法包括从患者获得定型细胞、反分化定型细胞以获得反分化靶细胞、和将反分化细胞施用至患者。在一些实施方案中，该方法包括从患者获得定型细胞、转分化定型细胞以获得转分化靶细胞、和将转分化靶细胞施用至患者。所述反分化或转分化靶细胞修复或补充患者中的组织或细胞。

发明背景

干细胞的特征在于其通过细胞有丝分裂而自我更新以及分化成各种特化细胞类型的能力。两种广泛类型的哺乳动物干细胞是分离自胚泡内细胞团的胚胎干细胞和发现于成体组织的成体干细胞。在发育胚胎中，干细胞可分化成所有特化胚胎组织。在成年生物体中，干细胞和祖细胞补充特化细胞并维持再生器官例如血液、皮肤或肠组织的正常更新。

尽管干细胞在发育胚胎中很丰富，但干细胞量随着发育进行而下降。相比之下，成年生物体包含有限数量的限于某些机体区室的干细胞。

干细胞的治疗应用具有改变对于多种疾病或紊乱的治疗的潜能。尽管已经存在一些成体干细胞治疗诸如骨髓移植，但医学研究人员期望使用干细胞来治疗更宽种类的疾病，包括癌症、帕金森病、脊髓损伤、肌萎缩性侧索硬化、多发性硬化和肌肉损伤等。这样的治疗可以利用干细胞分化成治疗该疾病所需的细胞类型的能力。

然而，关于成功使用干细胞治疗这样的疾病存在不确定性，而且关于干细胞可获得的容易性存在疑虑。例如，传统上通过从骨髓、动员生长因子的外周血液或脐带血(胎盘)分离而提取造血干细胞。造血干细胞也可从胚胎干(ES)细胞制备，所述胚胎干(ES)细胞提取自使用体外受精技术获得的胚胎。然而，从这些来源提取是麻烦的，有时是危险的，并且可能受到伦理关切的挑战。此外，可从这些来源获得的干细胞数有限。而且，干细胞可能在分化成治疗疾病所需的细胞方面存在困难。

发明概述

本发明涉及利用重编程序的细胞来在患者中修复组织或补充组织或细胞。例如，本发明涉及利用从分化或定型细胞的反分化获得的反分化细胞来在患者中修复组织或补充组织或细胞。本发明还涉及利用从分化或定型细胞的转分化获得的转分化细胞来在患者中修复组织或补充组织或细胞。

本申请部分基于申请人的这样的发现：从患者获得的定型细胞或体细胞可以重编程序，产生不同谱系的细胞，并且这些重编程序的细胞可被施用给患者，以修复或补充组织或细胞。重编程序过程的实例包括反分化和转分化。

因此，申请人发现定型细胞可经历重编程序而产生不同谱系的细胞。例如，定型细胞可经历反分化，产生反分化细胞，例如分化程度较小的细胞，诸如多能干细胞，并且这些反分化细胞可被施用给患者以修复或补充组织或细胞。作为另一个实例，从患者获得的定型细胞可以经历转分化，产生转分化细胞，例如与该定型细胞谱系不同的细胞，而且这些转分化的细胞可被施用给患者，以修复或补充组织或细胞。

本发明包括通过施用重编程序的细胞至患者而在该患者中修复或补充一种细胞谱系的组织或细胞(tissue or cells of a cell lineage)的方法。具体而言，本发明包括在患者中修复或补充一种细胞谱系的组织或细胞的方法，包括(i)获得定型细胞，(ii)反分化该定型细胞以获得反分化靶细胞，和(iii)将该反分化靶细胞施用至患者，其中该反分化靶细胞再分化成该细胞谱系的细胞。这些再分化的细胞与该定型细胞可以是相同的细胞谱系或不同的细胞谱系。

本发明还包括在患者中修复或补充一种细胞谱系组织或细胞的方法，包括(i)获得定型细胞，(ii)转分化该定型细胞以获得转分化靶细胞，和(iii)将该转分化靶细胞施用至患者。

在一些实施方案中，患者可患有疾病、紊乱或病症，包括但不限于骨髓衰竭、血液病症、再生障碍性贫血、β地中海贫血、糖尿病、运动神经元病、帕金森病、脊髓损伤、肌营养不良、肾疾病、多发性硬化、充血性心力衰竭、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、头部创伤、脊髓损伤、肺疾病、抑郁症、非梗阻性无精子症、男性更年期(andropause)、绝经期和不育症、复壮、硬皮病性溃疡、银屑病、皱纹(wrinkles)、肝硬化、自身免疫病、脱发、色素性视网膜炎、晶状变性(crystalline dystrophy)/失明、糖尿病和不育症。因此，在一些实施方案中，重编程序的细胞可以是在患者中治疗再生障碍性贫血、白血病、淋巴瘤或人免疫缺陷病毒的骨髓细胞。

在一些实施方案中，重编程序的靶细胞诸如反分化细胞、转分化靶细胞或再分化细胞可包括但不限于多能干细胞、多能生殖细胞、造血干细胞、神经干细胞(neuronal stem cell)、上皮干细胞、间质干细胞、内胚层和和神经外胚层干细胞、生殖细胞、胚外的胚胎干细胞、肾细胞、肺泡上皮细胞、内胚层细胞、神经元、外胚层细胞、胰岛细胞、腺泡细胞、卵母细胞、精子、造血细胞、肝细胞、皮肤/角化细胞、黑素细胞、骨/骨细胞、毛发/真皮乳头细胞、软骨/软骨细胞、脂肪细胞/脂肪细胞、骨骼肌细胞、内皮细胞、心肌/心肌细胞和滋养层细胞。

在一些实施方案中，定型细胞获自血液或包括骨髓在内的有关组织。定型细胞可以从全血获得和/或可以通过单采血液成分术获得。血液可以是动员或未动员的血液。这样的定型细胞包括但不限于T细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性白细胞、巨核细胞、单核细胞、红血球、粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞、白细胞、血小板和红细胞。可选地，定型细胞可以获自来自中枢神经系统或周围神经系统的神经组织、肌肉组织或来自皮肤的表皮和/或真皮组织。

在一些实施方案中，定型细胞获自患者的血液或组织。在一些实施方案中，从其获得定型细胞的患者与向其施用重编程序的靶细胞诸如反分化靶细胞或转分化靶细胞的患者是相同的患者。

在一些实施方案中，通过将定型细胞与试剂接触而使定型细胞反分化。例如，定型细胞可以用所述试剂温育。在一些实施方案中，所述试剂接合在定型细胞表面上调节抗原的捕获、识别或呈递的受体。受体可以是MHC I类抗原或MHC II类抗原。在一些实施方案中，I类抗原是HLA-A受体、HLA-B受体、HLA-C受体、HLA-E受体、HLA-F受体或HLA-G受体，且所述II类抗原是HLA-DM受体、HLA-DP受体、HLA-DQ受体或HLA-DR受体。

在一些实施方案中，所述试剂可以是受体的抗体，诸如受体的单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体CR3/43或单克隆抗体TAL 1B5。在进一步的实施方案中，所述试剂调节MHC基因表达，诸如MHC I⁺类和/或MHC II⁺类表达。

在一些实施方案中，反分化细胞可在单独的步骤中经历再分化。例如，可通过使反分化细胞与生长因子接触而使反分化细胞再分化，所述生长因子包括但不限于碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、粒细胞巨噬细胞集落-刺激因子、干细胞因子、白细胞介素-1、-3、-6和-7、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞-集落刺激因子、促红细胞生成素、干细胞因子和骨形态发生蛋白。然后，所得到的再分化靶细胞可被施用给患者。

在本发明的实施方案中，可以通过在特定培养条件中培养定型细胞而使定型细胞转分化。例如，定型细胞可以在特定类型的培养基中与反分化试剂一起培养。这些培养基的实例可包括达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)、Iscove改良达尔伯克氏培养基(IMDM)等。组织培养基也可包含分化促进剂，诸如维生素和/或矿物质补充剂、氢化可的松、地塞米松、β-巯基乙醇等。而且，另外的培养条件包括使用螯合剂或抗生素、在某些温度或二氧化碳或氧水平下培养、以及在某些容器中培养。培养条件可决定得到的转分化靶细胞的类型。

因此，本发明的一个方面是获得靶细胞的方法。所述方法可包括获得定型细胞，然后使定型细胞重编程序。这些方法如在本申请中所描述。在一些实施方案中，所述方法可包括反分化定型细胞。在其它实施方案中，所述方法可包括转分化定型细胞。在又一些实施方案中，所述方法可包括反分化定型细胞，然后再分化所述反分化细胞。

本发明的另一个方面是一种或多种重编程序的靶细胞在制备用于在患者中修复或补充一种细胞谱系的组织或细胞或用于治疗疾病或组织损伤的药物中的用途。

此外，本发明的另一个方面是一种在需要的患者中治疗疾病或组织损伤的方法。在一些实施方案中，该方法包括获得定型细胞、使所述定型细胞重编程序以获得重编程序的靶细胞、和将所述重编程序的靶细胞施用至所述患者。在一些实施方案中，靶细胞可以通过反分化、转分化和/或再分化进行重编程序。在特定实施方案中，靶细胞是反分化靶细胞、转分化靶细胞和/或再分化靶细胞。获得定型细胞和使定型细胞重编程序的方法如本申请中所描述。

在一些实施方案中，重编程序的靶细胞诸如反分化靶细胞、转分化靶细胞或再分化靶细胞可以通过注射，植入或输注施用。这些细胞可以通过肠胃外、肌内、静脉内、皮下、眼内、经口、经皮注射或注射入脊髓液而施用。在一些实施方案中，反分化靶细胞或转分化靶细胞在药物组合物中施用。药物组合物可包含反分化靶细胞或转分化靶细胞和至少一种药学上可接受的赋形剂。

本发明的一个方面是用于施用重编程序的靶细胞诸如反分化靶细胞或转分化靶细胞的药物组合物。药物组合物可包含一种或多种类型的靶细胞和至少一种药学可接受的载体。任选地，药物组合物可包含佐剂和/或其它适于施用入患者的赋形剂。

本发明的另一个方面是一种制备药物组合物或药物的方法，其包括(i)获得定型细胞，(ii)使定型细胞重编程序，以获得重编程序的靶细胞，和(iii)任选地，组合重编程序的靶细胞与一种或多种药物赋形剂。在一些实施方案中，重编程序的靶细胞与一种或多种药物赋形剂组合。在其它实施方案中，重编程序的靶细胞不与一种或多种药物赋形剂组合。获得定型细胞和使定型细胞重编程序的方法如本申请中所描述。

应指出，在本公开内容中、尤其在权利要求和/或段落中，术语诸如“包括”等可具有在美国专利法中属于该术语的含义；例如，它们可意指“包含”等；并且术语诸如“基本由……组成”具有美国专利法中属于该术语的含义，例如，它们允许有未明确描述的要素，但排除在现有技术中发现的要素或影响本发明的基本或新的特征的要素。

这些和其它实施方案公开于下列详细描述或者从下列详细描述是显而易见的，并且由其包括。

附图简述

下列以实例给出但非旨在将本发明只限制于所描述的具体实施方案的详细说明可结合附图得到最好的理解，其中：

图1显示重编程序诱导之前(上图)和之后(下图)经单采血液成分术的单核的细胞的免疫表型分型。对于免疫球蛋白G1(IgG1)同种型对照和CD34或CD19，分别用缀合于R-藻红蛋白(RPE)Cy-5或藻红蛋白(PE)(垂直图例)的单克隆抗体标记细胞。细胞也针对缀合于异硫氰酸荧光素(FITC)的CD45、CD38、CD61、和IgG1同种型对照单克隆抗体进行染色(水平图例)。下图显示了造血干细胞的增加，如CD34和CD34CD38-细胞的相对数增加伴随白细胞成熟标记诸如CD45和CD19的减少所描述。

图2a显示在输注自体HRSC后(输注后第1日、第2日、第3日、第6日和第14日)患有严重的再生障碍性贫血的患者的外周血液样品的顺序免疫表型分型。用抗CD34和CD45(第二排的图)和CD34和CD38(第三排的图)的单克隆抗体标记细胞。顶排的图显示前向和侧向散射是自体HRSC的流式细胞术、骨髓涂片和环钻切片(tehphin section)。第1日至第14日显示具有指示粒细胞的大的前向和侧向散射的细胞增加，且第1日至第3日显示循环CD34造血干细胞的相对数增加。图2b显示在输注自体人重编程序的干细胞(HRSC)后(输注后第1日、第2日、第3日、第6日和第14日)患有严重的再生障碍性贫血的患者的外周血液样品的顺序免疫表型分型。用抗CD34和CD61(第一排的图)、CD19和CD3(第二排的图)和CD33和13和CD7(第三排的图)的单克隆抗体标记细胞。FACScan图显示了髓样细胞数的增加，如包括祖细胞在内的表达CD33和13的细胞的逐渐增加所描述，所述表达CD33和13的细胞的逐渐增加通过共表达CD33和13与CD7的细胞相对数的增加所描述。此外，淋巴细胞的相对数也逐渐增加，如CD19和CD3淋巴细胞相对数的增加所示。

图3显示了在输注自体HRSC前后严重再生障碍性贫血患者的骨髓分析。治疗前后的骨髓涂片(a和b)显示红细胞增加；治疗前后环钻切片(terphine section)(c和d)显示骨髓细胞性增加；输注HRSC后的骨髓克隆分析显示集落形成单位巨核细胞(e)；集落形成单核细胞(f)；集落形成粒细胞和巨噬细胞(g)；和集落形成中幼粒细胞和类红细胞(h)；以及爆发形成类红细胞(I)的生长增加。

图4显示在输注自体HRSC 4年后患有严重再生障碍性贫血的患者的外周血液样品的核型分析和g显带，显示无遗传异常。

图5显示在用自体重编程序细胞治疗后在地中海贫血患者中绝对平均胎儿血红蛋白水平的增加。

图6显示在用自体重编程序的细胞治疗后在地中海贫血患者中以飞升表示的代表红细胞平均尺寸的平均红细胞体积增加。

图7显示在用自体重编程序的细胞治疗后在地中海贫血患者中以皮克表示的平均细胞血红蛋白增加，所述平均细胞血红蛋白是每个细胞中血红蛋白的重量。

图8显示在用自体重编程序的细胞治疗后在地中海贫血患者中以纳克每毫升表示的血清铁蛋白水平的减少。

图9显示在用自体重编程序的细胞治疗后在糖尿病患者中空腹和混合餐饮食摄入后C-肽水平的增加。

图10显示在用自体重编程序细胞治疗后在糖尿病患者中糖化血红蛋白(HbA1C)水平的减少。

图11显示在用自体重编程序细胞治疗后在肌营养不良患者中肌酸磷酸激酶(CPK)和乳酸脱氢酶(LDH)水平的减少。

图12显示在用自体重编程序细胞治疗后在肌营养不良患者中肝脏酶丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平的减少。

图13显示在用自体重编程序细胞治疗后在12例肾疾病患者中微量白蛋白尿素水平的减少。

图14显示在用自体重编程序细胞治疗后在12例由于糖尿病而患有肾疾病的患者中糖化血红蛋白(HbA1C)水平的减少。

图15a显示在用自体重编程序的细胞治疗之前(左扫描图)和治疗后三个月(右扫描图)多发性硬化患者脑的磁共振成像(MRI)扫描图，其显示干细胞治疗后损害增强减少。图15b显示在用自体重编程序的细胞治疗之前(左扫描图)和治疗后三个月(右扫描图)患者脑的不同部分的MRI扫描图。在表示治疗前的扫描图中，箭头指向脑中的损害，而在表示治疗后的扫描图中，箭头指向该损害的改善。

图16a显示在用自体重编程序的细胞治疗之前(上扫描图)和治疗后六个月(下扫描图)多发性硬化患者脑的磁共振成像(MRI)扫描图。图16b显示在用自体重编程序的细胞治疗之前(上扫描图)和治疗后六个月(下扫描图)患者脑的另外的MRI扫描图。在表示治疗前的扫描图中，箭头指向脑中的损害，而在表示治疗后的扫描图中，箭头指向该损害的改善，脑萎缩减少，如脑室和脑沟扩大减少所表示的。

图17a显示在用自体重编程序的细胞治疗之前(左扫描图)和治疗后六个月(右扫描图)多发性硬化患者的矢状面磁共振成像(MRI)扫描图。图17b显示在用自体重编程序的细胞治疗之前(左扫描图)和治疗后六个月(右扫描图)所述患者脊髓的横断面MRI扫描图。在显示治疗前的扫描图中，箭头指向所述脊髓上的损害，而在显示治疗后的扫描图中，箭头指向该损害的改善。

图18a显示在用自体重编程序细胞处理后在感染上丙型肝炎的患者中肝脏酶丙氨酸转氨酶(ALT)水平的减少，而图18b显示在用自体重编程序细胞处理后在感染上丙型肝炎的患者中天冬氨酸转氨酶(AST)水平的减少。

图19a显示由于机动车事故造成头部创伤的患者脑的磁共振成像(MRI)扫描图。在治疗前(上扫描图)，脑室显示扩大和移位，具有宽的矛状血肿。在用自体重编程序的细胞治疗后(下扫描图)，脑室显示脑萎缩参数下降，诸如脑室和脑沟扩张减少，及血肿改善。图19b显示在治疗之前(上扫描图)和治疗后(下扫描图)所述患者脑的另外的MRI扫描图。

图20显示在用自体重编程序的细胞治疗之前(左x-射线图)和之后(右x-射线图)肺病患者的胸部x-射线图。在治疗后，患者显示出肺容量的改善和损害尺寸的减少，如高致密区减少所示。

图21显示在用自体重编程序的细胞治疗的非梗阻性无精子症患者中促卵泡激素(fsh)、促黄体生激素(lh)、孕酮(pro)和睾酮(test)的性激素水平。所述水平显示，游离睾酮显著增加，且由超声波确定的睾丸尺寸(数据未示出)增加。

图22显示在用自体重编程序的细胞治疗之前(上图)和之后(下图)在患有受损视力的患者中的视网膜灵敏度和视觉缺损。在视网膜灵敏度结果中，橙色区域表示视网膜灵敏度下降。在视觉缺损结果中，白色区域表示正常视力，粉色、橙色和黑色区域表示视觉缺损增加。在治疗之后，患者的视野得以改善，因为治疗前视网膜灵敏度结果中的橙色区域在治疗后变成绿色和白色，且治疗前视觉缺损结果中的黑色区域在治疗后变成白色。

详述

定义

如本文所使用，“定型细胞(committed cells)”是展示分化特性的细胞。这些细胞通常被认为是成熟和特化的。实例包括白细胞、红细胞、上皮细胞、神经元和软骨细胞。

如本文所使用，“未定型细胞”是未展示成熟的分化特性的细胞。这些细胞通常被认为是不成熟的和非特化的。未定型细胞的实例是干细胞，其是能够自我更新(无限制分裂)和分化(特化)的未成熟细胞。

如本文所使用，“重编程序”是指第一细胞谱系的定型细胞变成不同细胞类型的细胞的过程。该不同的细胞类型可以是不同的细胞谱系。重编程序可通过诸如反分化、转分化或再分化的过程而发生。

如本文所使用，“重编程序的细胞”是经历定型细胞重编程序的细胞。重编程序的细胞可包括反分化细胞、转分化细胞和/或再分化细胞。

如本文所使用，“反分化”是定型细胞(即成熟的特化细胞)恢复到更原始的细胞阶段的过程。“反分化细胞”是由定型细胞反分化获得的细胞。

如本文所使用，“转分化”是第一细胞谱系的定型细胞变成不同细胞类型的另一种细胞的过程。在一些实施方案中，转分化可以是反分化和再分化的结合。“转分化细胞”是由定型细胞转分化获得的细胞。例如，定型细胞诸如全血细胞可以转分化成神经元。

如本文所使用，“再分化”是指未定型细胞或反分化细胞分化成更成熟的特化细胞的过程。“再分化细胞”是指从未定型细胞或反分化细胞再分化获得的细胞。如果再分化细胞通过反分化细胞的再分化获得，再分化细胞可以是与已经经历反分化的定型细胞相同或不同的谱系。例如，定型细胞诸如白细胞可以反分化而形成反分化细胞诸如多能干细胞，然后该反分化细胞可以再分化而形成淋巴细胞，其为与白细胞(定型细胞)相同的谱系，或再分化形成神经元，其为与白细胞(定型细胞)不同的谱系。

如本文所使用，“靶细胞”是获得用于施用至患者以修复或补充组织或细胞的细胞。例如，靶细胞可以是重编程序的靶细胞，诸如反分化靶细胞或转分化靶细胞，由此反分化或转分化靶细胞被施用至患者。

定型细胞

如上所述，本发明的定型细胞是展示分化特性的细胞。定型细胞可包含与抗原呈递、捕获或识别有关的任何成分。例如，定型细胞可以是MHC I⁺类和/或MHC II⁺类细胞。

定型细胞也可以是来源于或可来源于未分化细胞的任何细胞。因此，在一个实施方案中，定型细胞也是未分化细胞。因此，例如，定型细胞可以是淋巴干细胞或髓样干细胞，其相对于多能干细胞而言是分化的。

定型细胞可以来源于生物材料，诸如血液或相关组织(包括骨髓或脐带血)、来自中枢神经系统或外周神经系统的神经组织、肌肉组织或来自皮肤的表皮和/或真皮组织(即，例如通过口腔刮除的方式)。生物材料可以是出生后来源。

生物材料可以使用本领域已知的适于所述组织类型的方法获得。实例包括但不限于切除、针抽取、擦拭和单采血液成分术。

在具体的实施方案中，定型细胞来源于全血或其加工产物，诸如血浆或棕黄层，因为它们从受试者的移除可以以最小程度的医学监督进行。血液样品通常用抗凝剂诸如肝素或柠檬酸盐处理。生物样品中的细胞可以被处理以富集某些细胞类型、除去某些细胞类型或从组织块分离细胞。用于纯化和分离细胞的有用方法包括离心(诸如密度梯度离心)、流式细胞术和亲和色谱法(诸如利用包含抗细胞表面标记的单克隆抗体的磁珠或淘选)(见Vettese-Dadey, The Scientist 1999, 13: 21)。例如，Ficoll-Hypaque分离可用于除去红细胞和粒细胞以留下单核的细胞诸如淋巴细胞和单核细胞。

可以源自血液的定型细胞的实例包括但不限于CFC-T细胞、CFC-B细胞、CFC-Eosin细胞、CFC-Bas细胞、CFC-Bas细胞、CFC-GM细胞、CFC-M、CFC-MEG细胞、BFC-E细胞、CFC-E细胞、T细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性白细胞、单核细胞、巨核细胞和红细胞。

血液来源的定型细胞可以通过其特定抗原的表达加以鉴定。例如，B细胞是CD19⁺、CD21⁺、CD22⁺和DR⁺细胞。T细胞是CD2⁺、CD3⁺、以及CD4⁺或CD8⁺细胞。未成熟的淋巴细胞是CD4⁺和CD8⁺细胞。活化T细胞是DR⁺细胞。天然杀伤细胞(NK)是CD56⁺和CD16⁺细胞。T淋巴细胞是CD7⁺细胞。白细胞是CD45⁺细胞。粒细胞是CD13⁺和CD33⁺细胞。单核巨噬细胞是CD14⁺和DR⁺细胞。

在一些实施方案中，定型细胞可以是B淋巴细胞(活化或未活化的)、T淋巴细胞(活化或未活化的)、来自巨噬细胞单核细胞谱系的细胞、能够表达I类或II类抗原的有核细胞、可被诱导表达I类或II类抗原的细胞或无核细胞(即不包含核的细胞诸如红细胞)。

在可选的实施方案中，定型细胞可以选自包括各自表达CD56和/或CD16细胞表面受体的大颗粒淋巴细胞、裸淋巴细胞和天然杀伤细胞的细胞组的任何一种。

由于定型细胞基本上是原代培养物，因此用合适的营养素补充细胞群以维持生活力可能是必需的。合适的培养条件是本领域技术人员已知的。尽管如此，细胞群的处理优选在从患者移出生物样品之后尽快开始，通常在12小时内，优选在2至4小时内。细胞生活力可以使用众所周知的技术诸如台盼蓝排除或碘化丙啶检测。

反分化细胞

反分化是一种类型的重编程序过程，由此细胞的结构与功能逐渐地变化，产生特化程度较低的细胞。反分化可以自然地发生，其中细胞可响应于组织损伤而在体内经历有限的反向分化。可选地，可以使用在美国申请序列第08/594,164号(现美国专利第6,090,625号)、美国申请序列第09/742,520号(现美国专利第7,112,440号)、美国申请序列第10/140,978号(现美国专利第7,220,412号)、美国申请序列第10/150,789号(现美国专利第7,410,773号)和美国申请序列第09/853,188号中描述的方法诱导反分化，所述申请或专利都通过引用并入本文。

本发明的反分化细胞可包括但不限于多能干细胞、淋巴干细胞、髓样干细胞、神经干细胞、骨骼肌卫星细胞、上皮干细胞、内胚层干细胞、间质干细胞和胚胎干细胞。

在具体实施方案中，定型细胞来源于血液并反分化而形成造血细胞谱系的反分化细胞。这些反分化细胞的实例包括但不限于多能干细胞、淋巴干细胞和髓样干细胞。

定型细胞可以通过将该细胞与可操作地接合该细胞的试剂接触而反分化。然后，温育所述细胞，以使得已经由所述试剂可操作接合的那些细胞通过反分化过程发展并最终变成未分化的。

接触步骤可包括所述试剂与定型细胞上的表面抗原接合。所述试剂可以与定型细胞直接接合或间接接合起作用。直接接合的实例是定型细胞在其细胞表面上具有至少一种细胞表面受体诸如具有同源区(通常发现具有相同或相似的序列的区域)的β-链(诸如可在B细胞上发现的那些)并且其中试剂直接结合所述细胞表面受体时。另一个实例是定型细胞在其细胞表面上具有细胞表面受体诸如具有同源区的α-链(诸如可在T细胞上发现的那些)并且其中所述试剂直接接合所述细胞表面受体时。

间接接合的实例是定型细胞在其细胞表面上具有至少两种细胞表面受体并且所述试剂与所述受体之一的接合影响另一个受体时，该另一个受体然后诱导定型细胞的反分化。

用于反分化定型细胞的试剂可以是化学化合物或组合物。例如，所述试剂可以能够接合定型细胞表面上的细胞表面受体。在一些实施方案中，所述试剂可操作地接合定型细胞表面上存在的受体，该受体可以由所述定型细胞表达，例如能够由定型细胞表达的受体。

例如，试剂可包括但不限于环腺苷酸(cAMP)、CD4分子、CD8分子、T细胞受体的一部分或全部、配体(固定的或游离的)、肽、T细胞受体(TCR)、抗体、交叉反应性抗体、单克隆抗体或多克隆抗体中的任何一种或多种。也可使用生长因子，诸如造血生长因子，例如促红细胞生成素和粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

如果所述试剂是抗体、交叉反应性抗体、单克隆抗体或多克隆抗体，则所述试剂可以是下列的任何一种或多种的抗体、交叉反应性抗体、单克隆抗体或多克隆抗体的任何一种或多种：MHC II类抗原的β-链、MHC HLA-DR抗原的β-链、MHC I类或II类抗原的α-链、HLA-DR抗原的α-链、MHC II类抗原或MHC I类抗原的α-链和β-链。抗体的实例是CR3/43(由Dako提供)。

术语“抗体”可包括保持结合活性的各种片段(来源于蛋白水解裂解或重组技术)和衍生物，诸如Fab、F(ab')₂和scFv抗体以及其模拟物或生物电子等排体。也包括在内的抗体是遗传改造的变体，其中一些氨基酸序列已经被修饰，例如通过氨基酸残基的置换以增强结合，或者其中抗体已经在与其细胞期望根据本发明的方法处理的生物不同的物种中进行制备，以减小不利免疫反应的可能性(其一个实例是“人源化”小鼠单克隆抗体)。

用于实现定型细胞向反分化细胞的转化的试剂优选可在定型细胞的胞外发挥作用。例如，定型细胞可包含由所述试剂可操作接合的受体，并且所述试剂可操作接合所述受体。

例如，受体可以是细胞表面受体。细胞表面受体的具体实例包括但不限于MHC I类和II类受体。受体可包含α-成分和/或β-成分，如同MHC I类和II类受体的情况一样。

受体可包含具有同源区的β-链，例如至少HLA-DR的β-链的同源区。

可选地或另外，所述受体可包含具有同源区的α-链，例如至少HLA-DR的α-链的同源区。受体可以是主要组织相容性复合体(MHC)的I类或II类抗原。在一些实施方案中，所述细胞表面受体可包括但不限于HLA-DR受体、DM受体、DP受体、DQ受体、HLA-A受体、HLA-B受体、HLA-C受体、HLA-E受体、HLA-F受体或HLA-G受体。在一些实施方案中，细胞表面受体可以是HLA-DR受体。

试剂可以是所述受体的抗体，诸如所述受体的单克隆抗体。

试剂的实例可以是调节MHC基因表达诸如MHC I⁺类和/或MHC II⁺类表达的试剂。

在一些实施方案中，所述试剂可与生物应答调节剂一起使用。生物应答调节剂的实例包括但不限于烷化剂、免疫调节剂、生长因子、细胞因子、细胞表面受体、激素、核酸、核苷酸序列、抗原或肽。例如，烷化剂可以是环磷酰胺或可包含环磷酰胺。

其它生物应答调节剂可包括能够上调MHC I类和/或II类抗原表达的化合物，其在一些实施方案中可允许结合MHC受体的试剂更有效地工作。

由于可使任何细胞类型表达MHC I类和/或II类抗原，这可提供一种用于反分化各种细胞类型的方法，无论它们是否组成型表达I类和/或II类MHC抗原。

定型细胞通常与试剂一起温育至少两个小时，典型地2-24小时，优选2-12小时。温育典型地在约室温或例如约22℃直至约37℃包括33℃下进行。反分化程序的进展可以通过移出样品的小等分试样并使用显微术和/或流式细胞术检查细胞进行定期检查。可选地，装置可以包含在线监测反分化程序进展的追踪元件。

除了利用反分化试剂之外，定型细胞可以在自体血浆或血清中或在胎血清或马血清中培养。任选地，定型细胞可以用抗凝剂、螯合剂或抗生素培养。用于温育细胞的温度可以延伸至18-40℃，并且还可包括4-10 % CO₂和/或10-35 % O₂。此外，温育可在涂层或无涂层的血液袋、组织培养袋或塑料容器中发生。

一些类型的反分化细胞可以通过使用特定培养条件进行反分化而获得。例如，通过在达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)、非必需氨基酸(NEAA)、L-谷氨酰胺(L-glu)和β-巯基乙醇(2βME)中连同反分化试剂培养定型细胞，定型细胞可以反分化成多能细胞。定型细胞也可最初暴露于螯合剂。

作为另一个实例，为获得间充质细胞，可以使用DMEM(低葡萄糖)和L-glu，或者DMEM(低葡萄糖)、L-glu、2βME和NEAA，结合反分化试剂培养定型细胞。此外，抗生素庆大霉素也可用于细胞培养。

转分化细胞

通过用组织培养基结合反分化试剂培养定型细胞，获得转分化细胞。定型细胞由此经历转分化，其中定型细胞转化成另一个细胞类型的细胞；在一些实施方案中，定型细胞转化成不同谱系的细胞。

通过转分化获得的靶细胞的类型取决于培养条件。这些条件根据组织培养基的类型、各种分化促进剂的存在/不存在、不同血清的存在/不存在、温育温度、氧或二氧化碳的存在/不存在、以及用于温育的容器或器皿的类型而不同。

用于转分化的组织培养基的实例包括但不限于Iscove改良达尔伯克氏培养基(IMDM)、达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)、伊格尔极限必需(EME)培养基、α-极限必需培养基(α-MEM)、Roswell Park Memorial Institute (RPMI；开发培养基的地点)1640、Ham-F-12、E199、MCDB、Leibovitz L-15、Williams培养基E或任何商业上配制的组织培养基。

分化促进剂包括抗凝剂、螯合剂和抗生素。此类试剂的实例可以是下列的一种或多种：维生素和矿物质或其衍生物，诸如维生素A(视黄醇)、B₃、C(抗坏血酸)、抗坏血酸2-磷酸酯、D₂、D₃、K、视黄酸、烟酰胺、锌或锌化合物、以及钙或钙化合物；天然或合成激素诸如氢化可的松和地塞米松；氨基酸或其衍生物，诸如L-谷氨酰胺(L-glu)、乙二醇四乙酸(EGTA)、脯氨酸和非必需氨基酸(NEAA)；化合物或其衍生物，诸如β-巯基乙醇、二丁基环腺苷酸(db-cAMP)、一硫代甘油(MTG)、腐胺、二甲亚砜(DMSO)、次黄嘌呤、腺嘌呤、毛喉素、西洛酰胺和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤；核苷和其类似物，诸如5-氮杂胞苷；酸或其盐，诸如抗坏血酸、丙酮酸、冈田软海绵酸(okadic acid)、亚油酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、抗凝剂柠檬酸盐右旋糖配方A(ACDA)、EDTA二钠、丁酸钠和磷酸甘油；抗生素或药物，诸如G418、庆大霉素、己酮可可豆碱(1-(5-氧代己基)-3,7-二甲基黄嘌呤)和吲哚美辛；和蛋白质诸如组织纤溶酶原激活物(TPA)。

这些分化促进剂可用来获得特定类型的靶细胞。例如，维生素B₃可用来产生腺泡细胞诸如胰岛细胞或氢化可的松、地塞米松可用来产生间质来源或上皮来源的细胞(例如，肾上皮细胞、皮肤和伴生构造诸如真皮乳头细胞)；以及β-巯基乙醇可用来产生外胚层细胞诸如神经细胞，包括CNS的辅助细胞。

培养基可包含自体血浆；血小板；血清诸如胎血样；或哺乳动物来源的血清诸如马血清。此外，转化过程可以在血液袋、支架、组织培养袋、或塑料组织培养容器内部发生。组织培养容器可以是粘附或非粘附型组织培养容器，或可以包被或未包被试剂诸如明胶、胶原、基质胶(matrigel)或胞外基质，其促进粘附或漂浮，这取决于待制备的组织或特化细胞的要求类型。

另外的培养条件包括温度，其可以是约10-约60℃、或约18-约40℃；二氧化碳水平(CO₂)，其可以是约0-约20%或约4-约10%；和氧(O₂)，其可以是约0-约50%或约10-约35 %。

获得靶细胞并结合反分化试剂使用的方法的实例在表1中论述。

表1. 结合反分化试剂获得各种类型的靶细胞的方法

值得注意的是，对于表1每一种细胞类型描述的培养条件，通过接下来用相应的培养基稀释培养条件收回反分化试剂，产生更为增强的转分化。

在培养期间，任选地含有各种分化促进剂的培养基可以通过加入更多培养基但无反分化试剂而稀释。不束缚于理论，稀释看来增加分化，原因在于细胞变得较不致密，并且增殖刺激因子的浓缩程度较低。因此，添加培养基可进一步增强转分化并将影响细胞谱系内什么类型的细胞得以获得。例如，如果靶细胞是神经元，培养基的添加可使得发育向更成熟的神经元移动，而不是神经元祖先(两者为相同谱系)。作为另一个实例，正向分化骨骼肌祖先将仅通过培养基的连续稀释分化，所述连续稀释通过逐渐降低血清浓度而实现。

再分化细胞

通过将反分化细胞再定型或再分化成靶细胞类型，反分化细胞可用于获得靶细胞。这可通过使反分化细胞与生长因子接触而进行。例如，视黄酸已经被用于将干细胞分化成神经细胞。已经使用甲基纤维素、接着与骨髓基质系和IL-7共培养来使干细胞分化成淋巴细胞前体(Nisitani等, Int Immuno 1994, 6: 909-916)。Le Page (New Scientist Dec. 16, 2000)教导干细胞可以被分化成肺上皮细胞。Bischoff(Dev BioI 1986, 115: 129-39)教导如何将肌肉卫星细胞分化为成熟肌纤维。神经前体细胞可以用碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子扩充(Nakafuku and Nakamura, J Neurosci Res 1995, 41: 153-168)。造血干细胞可以使用许多生长因子包括GM-CSF、促红细胞生成素、干细胞因子和白细胞介素(IL-l、IL-3、IL-6)扩充，这些各种因子的综述见Metcalf (Nature 1989, 339: 27-30)。

Potocnik等人(EMBO J 1994, 13: 5274-83)甚至证明了使用低氧(5%)条件使干细胞分化为造血细胞。

再分化细胞可以与反分化细胞来源的定型细胞属于相同谱系。可选地，再分化细胞可以与反分化细胞来源的定型细胞属于不同的谱系。例如，B淋巴细胞可以反分化为CD34⁺CD38^-HLA-DR^-干细胞。该干细胞接着可以沿着B细胞谱系(相同谱系)或淋巴谱系(不同谱系)再分化或再定型。

靶细胞

本发明的靶细胞是如上所述通过反分化、转分化或再分化可获得的重编程序的细胞。根据本发明，靶细胞可包括但不限于多能干细胞、淋巴干细胞、髓样干细胞、神经干细胞、骨骼肌卫星细胞、上皮干细胞、内胚层和和神经外胚层干细胞、生殖细胞、胚外和胚胎干细胞、间质干细胞、肾细胞、肺泡上皮细胞、内胚层细胞、神经元、外胚层细胞、胰岛细胞、腺泡细胞、卵母细胞、精子、造血细胞、肝细胞、皮肤/角化细胞、黑素细胞、骨/骨细胞、毛发/真皮乳头细胞、软骨/软骨细胞、脂肪细胞/脂肪细胞、骨骼肌细胞、内皮细胞、心肌/心肌细胞和滋养层细胞。

如上所述，定型细胞和/或反分化细胞在特定条件下培养以诱导反分化和/或转分化和/或再分化并获得靶细胞。定型细胞和/或反分化细胞的培养持续时间不通过特定的时长控制，而是通过确定靶细胞已经产生来控制。

反分化、转分化或再分化靶细胞的产生或数目变化的确定可以通过监测下调谱系相关标记或转录因子的表达的定型细胞相对数的变化和/或具有表征靶细胞的细胞表面标记的细胞相对数的变化进行。可选地或另外，可以监测具有定型细胞而非靶细胞的典型细胞表面标记的细胞数目的下降。例如，靶细胞可以是胚胎干细胞，其由许多阶段-特异性标记表征，诸如POU5F1(OCT-4)、TERT、KLF4、UTFl、SOX2、Nanog或阶段-特异性胚胎标记3和4(SSEA-3和SSEA-4)、高分子量糖蛋白TRA-1-60和TRA-1-81和碱性磷酸酶(Andrews等, Hybridoma 1984, 3: 347-361; Kannagi等, EMBO J 1983, 2: 2355-2361; Fox等, Dev Biol 1984, 103: 263-266; Ozawa等, Cell Differ 1985, 16: 169-173)。它们也不表达SSEA-l，其存在是分化的指示物。其它标记对于其它类型的干细胞是已知的，诸如对于神经上皮干细胞的Nestein (J Neurosci 985, 5: 3310)。例如，间质干细胞对于SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a和CD124是阳性的，并且对于CD34、CD45和CD14是阴性的。多能干细胞是CD34⁺ DR-TdT^-细胞(其它有用的标记是CD38^-和CD36⁺)。淋巴干细胞是DR⁺、CD34⁺和TdT⁺细胞(还是CD38⁺)。髓样干细胞是CD34⁺、DR⁺、CD13⁺、CD33⁺、CD7⁺和TdT⁺细胞。

靶细胞的另外的细胞标记可以通过微阵列分析发现。所述分析可牵涉从反分化和/或转分化和/或再分化的靶细胞分离RNA，用染料标记该分离的RNA，和使该分离的RNA与微阵列杂交。微阵列可包含代表全基因组的基因或寡核苷酸，或者可包含指向特定器官系统、组织系统、疾病、病理学等的基因或寡核苷酸。细胞标记可以由展示出高信号密度的基因/寡核苷酸鉴定，并由此在靶细胞中上调或下调。然后，该信息可用来基于通过微阵列分析鉴定的标记、或甚至标记组或标记谱的存在而确定靶细胞。

靶细胞的确认也可以使用许多体外测定诸如CFC测定(也参见实施例)进行。通常使用长期培养起始细胞(LTC-IC)测定来测量非常原始的造血干细胞(Eaves等, J Tiss Cult Meth 1991, 13: 55-62)。LTC-IC维持造血5至12周。

对于其它细胞类型诸如中枢神经系统、胰腺、肝、肾、皮肤等的细胞，细胞培养可连续进行直到靶细胞出现，如免疫组织化学、流式细胞术、微阵列或反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)(这些是本领域已知的技术)所表征。这还可包括功能测定，例如，移入免疫缺陷宿主或改正或改善潜在的临床病症，如本文所观察到的。

靶细胞可以通过微阵列或RT-PCT加以鉴定，所述微阵列或RT-PCT显示在靶细胞中新的谱系特异性转录因子、蛋白质和信号的获得。例如，转化为外胚层谱系的靶细胞的反分化干细胞可表达基因诸如Nestin、Criptol、isl1、LHXl、和/或ENl，并且如果进一步分化为神经元，则将表达神经丝(NF)。另一方面，转化为内胚层谱系的靶细胞的细胞可表达基因诸如sox7、sox17、Nodal、PDX1和/或FOXA2；但是进一步向胰岛细胞分化的靶细胞可表达基因诸如胰岛素(INS)和neurog3(NGN3)。值得注意的是，向期望的靶细胞转化可以伴随着与已经经历转化的原始起始群相关的成熟转录因子的下调。

此外，靶细胞产生的确定可以通过识别靶细胞的特定结构和/或形态特征例如细胞形状、尺寸等而进行。对于本发明的靶细胞，这些特征在本领域中是已知的。

一旦期望细胞类型的相对数已经增加到合适的水平(其例如可以低至0.1%或高至5%)，所得到的改变的细胞群可以以许多方式使用。关于所形成的靶细胞例如多能干细胞的数目，重要的是理解干细胞的增殖能力。尽管在一些环境下，所形成的干细胞或其它反分化细胞的数目可能看起来低，但是研究已经表明，仅仅50个多能造血干细胞就可以在供体小鼠中重建完整的造血系统。因此，治疗有用性并不要求形成大量细胞。

定型细胞向反分化、转分化或再分化靶细胞的转化也可通过向患者施用与药物载体或稀释剂混合的试剂而体内进行。然而，在许多情况下，优选的是反分化、转分化或再分化在体外/离体进行。

体外获得的处理的细胞群接着可以在最小程度处理的情况下使用。例如，它们可以简单地与药学可接受的载体或稀释剂组合并施用于需要干细胞的患者。

然而，对于反分化、转分化或再分化靶细胞富集细胞群或者从所述细胞群纯化细胞可以是期望的。这可以使用许多方法方便地进行(见Vattese-Dadey--The Scientist 1999, 13)。例如，可使用色谱法和/或流式细胞术，基于细胞表面标记纯化细胞。尽管如此，从细胞群大量纯化反分化、转分化或再分化靶细胞常常既不必要也不是期望的，原因在于存在于该细胞群的其它细胞(例如基质细胞)可维持干细胞生活力与功能。

流式细胞术是一种充分确立的用于表征混合群内的细胞以及用于分选细胞的可靠和强大的技术。因此，纯化或分离装置可包括流式细胞仪。流式细胞术基于在液体悬浮液中粒子的物理特征而操作，当用光束探查时，所述粒子可被区分。这样的粒子当然可以是细胞。物理特征包括细胞尺寸和结构或者近年来已经变得非常流行的由缀合于荧光分子的单克隆抗体结合的细胞表面标记。

Kreisseg等(J Hematother 1994, 3: 263-89)陈述，“由于抗CD34单克隆抗体的可用性，多参数流式细胞术已经成为确定造血干细胞和祖细胞的选择工具”。Kreisseg进一步描述了用于通过流式细胞术量化和表征CD34-表达细胞的一般技术。此外，Korbling等(Bone Marrow Transplant 1994, 13: 649-54)教导了通过免疫吸附、接着通过基于HLA-DR表达的流式细胞术纯化CD34⁺细胞。如以上所讨论，CD34⁺是与干细胞/祖细胞有关的有用标记。也可利用基于其它物理特征分选干细胞的流式细胞术技术。例如，Visser等(Blood Cells 1980, 6:391-407)教导，干细胞可基于其尺寸和结构性程度分离。Grogan等(Blood Cells 1980, 6: 625-44)也教导“有活力的干细胞可以以高和可验证的纯度从简单的造血组织分选”。

除基于细胞表面标记或其它物理性质的存在(阳性选择)选择细胞外，细胞群也可以使用阴性标准进行富集、纯化。例如，具有谱系特异性标记诸如CD4、CD8、CD42和CD3的细胞可通过流式细胞术或亲和色谱法从细胞群除去。

一种纯化细胞的非常有用的技术牵涉利用与磁珠连接的抗体或其它亲和配体。所述珠与细胞群和具有细胞表面标记诸如CD34的细胞一起温育，而亲和配体结合的细胞表面标记被捕获。包含细胞的样品管被置于磁性试样浓缩器内，在那里磁珠被吸引到管的侧面。在一个或多个洗涤阶段之后，目标细胞已经部分或基本上完全从其它细胞纯化出来。当用于阴性选择形式时，保留液相，从而与珠结合的细胞从细胞群有效地除去，而不是通过丢弃液相来洗涤与珠结合的细胞。

这些基于亲和配体的纯化法可用于合适的标记已经被表征或可以被表征的任何细胞类型。Urbankova等(J Chromatogr B Biomed Appl 1996, 687: 449-52)教导了通过重力场-流动分级分离法从小鼠骨髓悬浮液微量制备造血干细胞。Urbankova等进一步评述，该方法被用于来自小鼠骨髓的干细胞的表征，原因在于这些细胞比骨髓中其它细胞更大，并且因此将它们与混合物分离是可能的。因此，除了细胞表面标记以外的物理参数可用来纯化/富集干细胞。

包含重编程序的靶细胞诸如反分化、转分化或再分化靶细胞的细胞群和/或纯化的重编程序的靶细胞诸如通过本发明的方法产生的反分化、转分化或再分化靶细胞可以采用已知的技术体外维持。

通常，使用基本生长培养基诸如Hanks、RPMI 1640、达尔伯克氏极限必需培养基(DMEM)或Iscove改良达尔伯克氏培养基，其补充哺乳动物血清诸如FBS和任选地自体血浆，从而为细胞提供合适的生长环境。干细胞可以在滋养层诸如基质细胞层上培养(见Deryugina等，Crit Rev Immunology 1993, 13: 115-150)。基质细胞被认为分泌维持未分化状态的祖细胞的因子。干细胞的长期培养系统描述于Dexter等(J Cell Physiol 1977, 91: 335)和Dexter等 (Acta Haematol 1979, 62: 299)。

例如，Lebkowski等(Transplantation 1992, 53: 1011-9)教导，人CD34⁺造血细胞可使用基于应用共价固定于聚苯乙烯表面上的单克隆抗体的技术加以纯化，并且通过该方法纯化的CD34⁺细胞可以以大于85%的生活力维持。Lebkowsk等(J Hematother 1993, 2: 339-42)也教导了如何分离和培养人CD34⁺细胞。对于各种方法的综述，也参见Haylock等 (Immunomethods 1994, 5: 217-25)。

包含干细胞的细胞群和包含干细胞的纯化制剂可以冷冻/冷冻干燥，以备将来之用。冷冻细胞并在之后使其复苏的合适技术是本领域已知的。

在一个方面，反分化、转分化或再分化发生于来自棕黄层血样的细胞或在其中的细胞。术语“棕黄层”是指当离心未凝固血液或使其静置时在红细胞层和血浆之间形成的白细胞层。

治疗方法

本发明的重编程序的靶细胞诸如反分化靶细胞、转分化靶细胞和再分化靶细胞可以与各种成分组合，以产生本发明的组合物。所述组合物可以与一种或多种药学可接受的载体或稀释剂组合，以产生药物组合物(其可供人或动物使用)。合适的载体和稀释剂包括但不限于等渗盐水溶液例如磷酸缓冲盐水。可以通过直接注射施用本发明的组合物。所述组合物可以被配制用于肠胃外、肌内、静脉内、皮下、眼内、经口、经皮施用、或注射入脊髓液。

包含靶细胞的组合物可以通过注射或植入递送。细胞可以在悬浮液中或植入支持基质诸如天然和/或合成的生物可降解基质而递送。天然基质包括但不限于胶原基质。合成的生物可降解基质包括但不限于聚酐和聚乳酸。这些基质可在体内为脆性细胞提供支持。

组合物还可包含本发明的反分化或转分化或再分化靶细胞和至少一种药学上可接受的赋形剂、载体或媒介物。

递送还可通过控制递送进行，即在一段时间内递送，所述一段时间可从若干分钟至若干小时或若干天。递送可以是全身性的(例如通过静脉注射)或指向特定目标部位。可以使用脂质体转移，将细胞引入体内。

靶细胞可以每千克1×10⁵至1×10⁷ 个细胞的剂量施用。例如，70 kg患者可以施用14×10⁶ CD34⁺个细胞，用于组织重构。所述剂量可以是本申请列出的靶细胞的任何组合。

本发明的方法可用于治疗各种疾病、病症或紊乱。这样的病症包括但不限于骨髓衰竭、血液学病症、再生障碍性贫血、β地中海贫血、糖尿病、运动神经元病、帕金森病、脊髓损伤、肌营养不良、肾疾病、肝疾病、多发性硬化、充血性心力衰竭、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、头部创伤、肺疾病、抑郁症、非梗阻性无精子症、男性更年期、绝经期和不育症、复壮、硬皮病性溃疡、银屑病、皱纹、肝硬化、自身免疫病、脱发、色素性视网膜炎和晶状变性/失明或与组织变性有关的任何紊乱。

再生障碍性贫血是一种罕见但致命的骨髓紊乱，其标志在于各类血细胞减少和细胞减少的骨髓(Young等，Blood 2006, 108: 2509-2519)。所述紊乱可以由免疫介导的病理生理学所引起，具有表达Thl细胞因子、尤其是靶向造血干细胞区室的γ-干扰素的活化I型细胞毒性T细胞，引起骨髓衰竭并由此引起造血机能不足(Bacigalupo等，Hematology 2007, 23-28)。大多数再生障碍性贫血患者可以用从HLA-匹配同胞获得的干细胞移植进行治疗(Locasciulli等，Haematologica. 2007; 92: 11-18.)，然而，将这个方法延伸至年长患者或缺乏家族供体的患者则仍然是一个大的挑战。尽管在HLA-匹配的同种异体干细胞移植之后具有适当的存活，该方法带来一些潜在危险，原因在于用于预防移植物抗宿主病(GVDH)的免疫抑制方案。例如，含有或不含有抗胸腺细胞球蛋白(ATG)的高剂量环磷酰胺引起免疫抑制期延长并且使患者易于罹患机会性感染。其它潜在危险是在干细胞移植后数周或数月可能继之发生的移植失败(Gottdiener等, Arch Intern Med 1981, 141: 758–763; Sanders等Semin Hematol 1991, 28: 244-249)。而且，移植失败的风险随着在干细胞移植前接受的输血次数而增加。

地中海贫血是一种遗传性常染色体隐性血液病，其标志在于组成血红蛋白的球蛋白链之一的合成速率降低。因此，正常球蛋白生产不足，这通常由于调节基因突变，其导致异常血红蛋白分子的形成，引起贫血。不同类型的地中海贫血包括α地中海贫血、β地中海贫血和δ地中海贫血，其分别影响α球蛋白、β球蛋白和δ球蛋白的产生。治疗包括长期输血、铁螯合、脾切除术和异源造血移植。然而，由于缺乏HLA-匹配骨髓供体，长期输血对于大多数的患者而言是不可行的，而异源造血移植与许多可能的并发症诸如感染和移植物抗宿主病有关。

糖尿病是一种导致异常高血糖水平(高血糖)的综合征。糖尿病是指由于机体内胰岛素分泌或胰岛素作用缺陷而引起高血糖水平的一组疾病。糖尿病一般被分成两个类型：1型糖尿病，其标志在于胰岛素的产生减少；或2型糖尿病，其标志在于胰岛素作用的抵抗。两个类型都引起高血糖，其主要引起通常与糖尿病有关的症状，例如过多的尿产生、导致代偿性口渴和增加的液体摄取、视力模糊、无法解释的体重减轻、昏睡和能量代谢变化。糖尿病被认为是一种无法治愈的慢性病。治疗选择限于胰岛素注射、锻炼、适当的饮食，或者对于2型糖尿病患者，一些药物治疗例如促进胰腺分泌胰岛素、减小肝产生葡萄糖、增加细胞对胰岛素的敏感度等的药物。

运动神经元病是指一组影响运动神经元的神经性障碍。这样的疾病包括肌萎缩侧索硬化(ALS)、原发性侧索硬化(PLS)和进行性肌萎缩(PMA)。ALS的标志在于上运动神经元和下运动神经元均退化，其中止至肌肉的信息并导致肌肉削弱并最终萎缩。PLS是一种罕见的仅影响上运动神经元的运动神经元病，其引起平衡困难、腿部虚弱和僵硬、痉挛状态和言语问题。PMA是一种仅影响下运动神经元的ALS亚类，其可以引起肌萎缩、肌束震颤和虚弱。尚无已知的运动神经元疾病疗法。被认为减少运动神经元损害的利鲁唑已经被批准为用于ALS的药物，尽管它减慢ALS的进展而不是改善它的影响。对于PLS，治疗仅仅针对症状，例如可以减少痉挛状态的巴氯芬或可减小抽筋的奎宁。

帕金森病(PD)是一种神经变性紊乱，其标志在于由黑质内多巴胺能神经元退化导致的黑质纹状体通路损失。PD的原因尚未知，但与引起运动损伤的多巴胺能(酪氨酸羟化酶(TH)阳性)中脑神经元的渐进性死亡有关。因此，PD的特征在于肌僵硬、颤动、运动徐缓和潜在运动不能。因此，目前尚无帕金森病的满意疗法或预防或治疗帕金森病或它的症状的治疗。疾病-相关运动损伤的症状疗法牵涉口服二羟苯丙氨酸(L-DOPA)，其可以引起运动机能的实质性改善，但它的效应随着多巴胺能神经元退化进展而下降。替代策略包括神经移植，其基于来自于植入纹状体的细胞的多巴胺可以代替丧失的黑质纹状体细胞这一想法；以及基因治疗，其可用于通过引入负责L-DOPA或多巴胺合成的酶(例如通过引入可预防TH-阳性神经元死亡或刺激损伤黑质纹状体系统再生和机能恢复的潜在神经保护性分子)替换受累纹状体中的多巴胺。

脊髓损伤的特征在于脊髓受损，尤其是神经纤维受损，导致损伤部位下方的部分或全部肌肉或神经损伤。这样的损伤可由于一个或多个椎骨骨折、脱臼、压碎或压缩而导致的脊柱创伤或由于关节炎、癌、炎症或椎间盘退化所引起的非创伤性损伤而发生。虽然脊髓损伤后的治疗可牵涉药物例如甲泼尼松龙(其是减少神经细胞损伤和降低受损区域中的炎症的皮质类固醇)、或控制疼痛和肌肉痉挛状态的药物、以及脊柱固定或除去突出椎间盘或可能损伤脊柱的任意对象的外科手术，但并无逆转脊髓损伤的已知方法。

肌营养不良(MD)是指一组削弱骨骼肌的遗传性肌肉疾病。MD可由渐进性肌肉虚弱、肌肉蛋白缺乏、肌细胞凋亡和组织萎缩表征。存在展示MD特征的超过100种的疾病，尽管具体地九种疾病(杜氏、贝克、肢带、先天性、面肩胛臂、肌强直、眼咽、末梢和Emery-Dreifuss)被归类为MD。没有已知的MD治愈法，也没有任何特异疗法。物理疗法可维持肌张力，而外科手术可用来改善生活品质。此外，症状例如肌强直可以用药物治疗，但是不存在长期治疗。

肾疾病是指损伤肾和降低其发挥作用能力的病症，所述能力包括从血液去除废物和过量水分、调节电解质、血压、酸碱平衡、以及葡萄糖和氨基酸的重吸收。肾疾病的两个主要原因是糖尿病和高血压，尽管其它原因包括肾小球肾炎、狼疮以及肾畸形和阻塞。尚无肾疾病的治愈法，由此治疗集中在减缓疾病进展和治疗疾病病因，例如通过控制血糖和高血压以及监测饮食；治疗疾病并发症，例如通过针对液体潴留、贫血、骨疾病；和替代丧失的肾功能，例如通过透析或移植。

多发性硬化是一种自身免疫病症，其中免疫系统攻击中枢神经系统，引起脱髓鞘。MS影响脑和脊髓中神经细胞彼此通讯的能力，因为机体自身的免疫系统攻击和损伤包裹神经元轴突的髓磷脂。当髓磷脂损耗时，轴突不再能有效地传导信号。这可以引起各种神经学症状，其通常发展成身体残疾和认知障碍。不存在MS的治愈法；治疗旨在攻击(MS症状的突然发作或恶化)后恢复功能、预防新的攻击和预防残疾。例如，用皮质类固醇治疗可帮助结束所述攻击，而在初期攻击期间用干扰素治疗已经显示降低了临床MS发展的机会。

人免疫缺陷病毒(HIV)是一种可引起获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的慢病毒，获得性免疫缺陷综合症是一种其中免疫系统开始失效的病症。HIV主要感染人免疫系统中的重要细胞，例如辅助性T细胞、巨噬细胞和树突细胞。通过受感染细胞的直接病毒杀死、通过受感染细胞的凋亡率增加、或通过由识别受感染细胞的CD8细胞毒性淋巴细胞杀死感染的CD4⁺ T细胞，HIV感染引起低水平的CD4⁺ T细胞。目前，尚不存在HIV或AIDS的疫苗或治愈法。HIV感染的治疗由高活性的抗逆转录病毒治疗或HAART组成。目前的HAART选择是由至少两个类型的抗逆转录病毒试剂的至少三种药物组成的联合(或“混合物”)。典型地，这些类型是两种核苷类似物逆转录酶抑制剂(NARTI或NRTI)加蛋白酶抑制剂或非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)。

充血性心力衰竭是指其中心脏不能泵送足够的血液至机体其它器官的病症。该病症可以来源于冠状动脉病、由心肌梗塞造成的心脏瘢痕组织、高血压、心脏瓣膜疾病、心脏缺损和心脏瓣膜感染。治疗程序典型地由休息、适当的饮食、改进的日常活动和药物例如血管紧张素-转化酶(ACE)抑制剂、β阻断剂、毛地黄、利尿药、血管扩张剂组成。然而，所述治疗程序不会逆转心脏的损伤或病症。

丙型肝炎是一种由丙型肝炎病毒所引起的肝传染病。丙型肝炎可发展成瘢痕形成(纤维化)和晚期瘢痕形成(硬化)。硬化可引起肝功能衰竭及其他并发症例如肝癌。目前的治疗包括使用聚乙二醇干扰素α和抗病毒药物利巴韦林的联合。取决于病毒基因型，成功率可在50-80%之间变化。

头部创伤是指可能引起或不引起脑损伤的头部损伤。头部创伤的常见原因包括交通事故、家庭和职业事故、跌落和袭击。各种类型的问题可源自头部创伤，包括头颅骨折、头皮撕裂伤、硬膜下血肿(硬膜下出血)、硬脑膜外血肿(在硬膜和颅骨之间出血)、脑挫伤(脑擦伤)、脑震荡(由于创伤导致功能暂时丧失)、昏迷乃至死亡。头部创伤的治疗将随着损伤类型而变化。如果脑受损，则不存在处理其的快捷方式，并且通常损伤可能是通过可得治疗方法不可逆的。

肺疾病是针对呼吸系统疾病的广义术语，其包括肺、胸膜腔、支气管、气管、上呼吸道和用于呼吸的神经和肌肉。肺疾病的实例包括梗阻性肺疾病，其中支气管变窄；限制性或纤维化肺疾病。其中肺丧失顺应性并导致不足的肺扩张和增加的肺僵硬；呼吸道感染，其可以由感冒或肺炎所引起；呼吸器官肿瘤，例如由癌引起的肿瘤；胸膜腔疾病；和肺血管疾病，其影响肺循环。肺疾病的治疗根据疾病类型而变化，但可包括药物治疗例如皮质类固醇和抗生素、氧、机械通风、放射疗法和外科手术。

抑郁症是一种以低落情绪伴随低自尊和在正常令人愉快的活动中兴趣或乐趣丧失为特征的精神障碍。生物学上，抑郁症伴随多个脑部分的活动改变，包括中缝核，其是在血清素来源的上脑干中的一组小核；视交叉上核，其控制生物节律例如睡眠/觉醒周期；下丘脑-垂体肾上腺轴，其是在机体应答于各种应激因子期间活化的一系列结构；腹侧被盖区，其被认为负责脑的“奖励(reward)”线路；伏核，其被认为在奖励、笑、乐趣、成瘾和恐惧中起作用；和前扣带皮质，其通过负性经历活化。抑郁症的治疗包括增加脑中胞外血清素数量的抗抑郁药、锻炼和心理疗法。然而，这些治疗的效力持续受到质疑。

非梗阻性无精子症是一种男性由于精子发生的问题而在其精液中不具有任何可测量水平的精子的医学病症。这通常由激素不平衡所引起并可以使用恢复所述不平衡的药物进行治疗。

男性更年期是一种在中年男性中经历的类似于更年期的病症，其牵涉激素睾酮和脱氢表雄酮的产生减少。治疗包括激素替代疗法和锻炼。

硬皮病是一种影响结缔组织的慢性自身免疫病。皮肤硬化是所述疾病的最显著表现，尽管它可以影响整个机体的结缔组织。尚无已知的硬皮病直接治愈法。

银屑病是一种引起在皮肤上出现红色鳞状斑的慢性自身免疫病。银屑病的病因与皮肤细胞过度生长有关。一个假设认为，其与迁移到真皮并引发诱导皮肤细胞快速产生的细胞因子释放的T细胞有关。银屑病的治疗包括靶向T细胞的药物。

色素性视网膜炎是一种渐进性视网膜营养不良，其中光感受器或视网膜色素上皮异常并引起视觉丧失。治疗色素性视网膜炎的疗法是有限的。

本文描述的病症可以用特定类型的靶细胞或靶细胞类型的组合进行治疗。在优选的实施方案中，本文描述的病症可以通过输注表2概述的细胞类型进行治疗。

表2. 使用重编程序(即反分化或转分化或再分化)的靶细胞的各种病症的治疗方案

举例而言，患者可以通过以下步骤治疗如上所述的病症：

1) 将Fistula插管插入患者手臂；

2) 使用自动化系统例如COBE^? Spectra Device (Gambro PCT)，通过单采血液成分术收获白细胞;

3) 从患者的白细胞产生自体反分化干细胞；

4) 洗涤所述自体反分化干细胞，然后将其静脉输注入患者；

5) 监测患者的进展，包括进行血液测试和评价损伤区域。

本发明现通过以下非限制性实施例进行进一步描述，所述实施例进一步举例说明本发明并且不旨在也不应该将其解释为限制本发明的范围。

实施例

实施例1

材料和方法

本临床研究评价将单剂量的暴露于造血诱导培养条件后3小时的自体重编程序的细胞输注入四个再生障碍性贫血患者的安全性。

该临床研究由King Edward Memorial(KEM)医院的伦理委员会批准，并与Institute of Immunohematology(IIH)合作进行。要求患者满足表3中概述的标准。结果，患有严重的(3例男性)和再生不良性(1例女性)贫血症的四例患者注册进入该研究。由IIH/KEM工作人员选择并监测这4个患者。患者的临床和治疗历史描述于表4，而其CD34⁺细胞输注剂量示于表5。

表3：纳入标准

用2单位的辐照的浓缩红细胞和4单位的血小板输注患者，以维持它们的血红蛋白水平在8 g/dl之上和血小板计数在50,000之上。通过使用Cobe Spectra单采血液成分机器和白细胞分离试剂盒(均来自Gambro BCT)处理其血液总量的2-3倍，从患者单采血液成分。单采血液成分术牵涉采用用于静脉进入的单腔导管进行的颈静脉和肘前静脉导管插入术。

在收集150-200 ml棕黄层后，无菌收集细胞试样，用于CD34分析。其后，使棕黄层在造血诱导培养条件下进行重编程序。简言之，重编程序过程牵涉将于30ml Iscove改良培养基中稀释的1000μg的纯化CR3/43(由TriStem公司的DakoCytomation具体制备)无菌添加入白细胞袋。然后，该袋在维持于37℃和5% CO₂的无菌组织培养培养箱中温育三小时。在重编程序过程完成之后，分析转化的细胞中CD34⁺细胞含量。其后，使用cobe细胞处理器2991，用盐水溶液洗涤细胞两次。在盐水溶液中搅拌和再悬浮后，将细胞悬液通过颈静脉使用输注装置在重力下输注入患者。在输注自体重编程序的细胞之前和之后，连续监测患者的生命体征，包括CBC计数。

表4：再生障碍性贫血患者直至自体人重编程序的干细胞(HRSC)输注时的临床和治疗历史。

全部临床监测由IIH/KEM工作人员进行。在输注前后根据在接受任何单位的血液产品后获得的输注记录确定输注要求。在获得患者同意和直系亲属作为见证人后，仅输注单位被利用。在输注入患者之前，全部血液产品在Tata Memorial医院进行辐照。在输注重编程序的细胞前后，还询问患者关于其健康状况的问题。全部患者携带他们的病症和全部实验室和临床随访的副本或原始记录。监测这些患者的持续时间最初设定为2年，但被延长。在输注后第一个月，患者留在医院的无菌正压室。

表5：患者、输注日期、体重和身高、单核的细胞的收集和输注的CD34⁺细胞

采用下列组的单克隆抗体(全部来自DakoCytomation)，根据制造商说明，对一百万个细胞进行染色：

第1组由同种型阴性对照IgG1-FITC、IgG1-PE-Cy5和IgG1-RPE缀合物组成

第2组由抗人CD45-FITC和CD34-RPE-Cy5组成

第3组由抗人CD38-FITC和CD34-RPE-Cy5组成

第4组由CD61-FITC和CD34-RPE-Cy5组成

第5组由CD33/13 RPE和CD7-FITC组成

第6组由CD45和血型糖蛋白-A-RPE组成

第7组由CD3-FITC和CD19-RPE组成。

使用BD细胞Quest软件，利用FACSCalibur系统(BD bioscience)进行细胞分析。

对于克隆测定，在输注重编程序的细胞前后，将患者的骨髓单核的细胞(MNC)根据生产商说明(Stem Cell Technologies)在补充重组生长因子的methocult GFH4434中接种。使用相差倒置显微镜，随时间对分化成造血细胞集落进行评价和评分。

在程序前后，连续监测患者CBC、肝酶和血红蛋白变体。在出院后，通过独立的实验室监测患者CBC、肝酶、血红蛋白变体和外周血液核型分析和G显带，用于再确认目的。在输注自体重编程序的细胞后，频繁进行这些测试。

在输注自体重编程序的细胞之前和之后，分析外周血液样品和骨髓细胞。在自体重编程序的干细胞治疗开始后的第一年以六个月间隔并且在2年后每年一次重复该测试。此外，在输注前分析重编程序的细胞，以观察细胞的稳定性，其也在3h转化步骤后以及在转化细胞的最长1个月长期培养建立后进行。通过第三方独立实验室，监测核型分析和G显带。

在输注自体重编程序的细胞之前和之后，进行骨髓涂片和环钻切片(trephine section)。在输注自体重编程序的细胞后14-20天进行该测试，之后每年进行一次。

在输注重编程序的干细胞前后，使用连接于录像机的显微镜扫描全部涂片和环钻切片，以评价和保存植入的记录。

结果

全部患者耐受单采血液成分术以及单一重编程序的干细胞输注程序而无不利事件。在单一输注重编程序的造血干细胞(RHSC)后，患者A和患者D变为输注不依赖的(见表6和7)。分别在患者A和患者D中输注后3和6天，接着发生血小板、嗜中性粒细胞和红细胞植入。在患者A和患者D(见表4和5)中观察到胎儿血红蛋白变化，而在患者B和患者C(数据未显示)中则没有观察到。在输注前，肝酶在患者A和患者D中升高，尽管是HCV阴性的(如ELISA所测量的)。在输注RHSC后肝酶开始正常化并在输注RHSC后4年达到正常水平。患者B和患者C分别在输注后2年和六个月死亡。在患者001和004中观察到胎儿Hb变化(见表6和7)。这两个患者在单一输注自体HRSC后展示出长期的植入。

表6. 自体HRSC输注前后严重的再生障碍性贫血患者患者A的全血细胞计数、血红蛋白变体和肝酶。 

WBC = 白细胞；HB = 血红蛋白；RBC = 红细胞；RETIC = 网织红细胞；MCV = 平均红细胞体积；MCH = 平均红细胞血红蛋白量；MCHC = 平均红细胞血红蛋白浓度；ESO = 嗜酸性粒细胞；BASO = 嗜碱性粒细胞；LYMPH = 淋巴细胞；MONO = 单核细胞；HB A = 血红蛋白A；HBA2 = 血红蛋白A2；HBF = 胎儿血红蛋白；SGOT =血清谷草转氨酶；SGPT = 血清谷丙转氨酶。

表7. 自体HRSC输注前后严重的再生障碍性贫血患者患者D的全血细胞计数、血红蛋白变体和肝酶。  

WBC =白细胞；HB =血红蛋白；RBC =红细胞；RETIC =网织红细胞；MCV =平均红细胞体积；MCH =平均红细胞血红蛋白量；MCHC =平均红细胞血红蛋白浓度；ESO =嗜酸性粒细胞；BASO =嗜碱性粒细胞；LYMPH =淋巴细胞；MONO =单核细胞；HB A血红蛋白A；HBA2 =血红蛋白A2；HBF =胎儿血红蛋白；SGOT =血清谷草转氨酶；SGPT =血清谷丙转氨酶。

在造血重编程序诱导之前和之后3小时，单采血液成分的单核的细胞的流式细胞术示于图1。造血重编程序后产生的CD34阳性细胞的数目列于表4中。在造血重编程序前后单采血液成分的单核细胞的典型流式细胞术显示表达和不表达CD45、CD38和CD7的CD34阳性细胞数目的显著增加(图1)。输注后，CD34细胞在外周血液循环3-6天，之后以可持续的水平分化成中幼粒细胞，如表达CD33和13的细胞的显著增加所述，其具有和不具有CD7，具有高前向和侧向散射(见图2)。在全部患者中观察到该重编程序模式。

在植入甲基纤维素细胞培养物之后，在输注自体HRSC之前，几乎无任何集落从患者骨髓抽出物形成(见图3)。仅在患有再生不良性贫血的患者B中的克隆测定显示出降低的造血。然而，在输注从患者获得的全部骨髓抽出物后14天至20天，得到正常范围的各种造血集落，其中爆发形成单位-类红细胞(BFU-类红细胞)的数目稍有升高。输注自体HRSC后14-20天的骨髓涂片和环钻切片(见图3)显示，在全部患者中，与基线相比时，在具有成熟和不成熟的巨核细胞的各个分化阶段中幼粒细胞数目的显著增加。在全部样品中还注意到在各个分化阶段的类红细胞增生。

在所有患者中，在输注自体HRSC之前和之后(在患者A和患者D中，直至超过4年)获得的外周血液或骨髓样品中核型分析和G显带图无变化(见图4)。

在将自体HRSC输注入再生障碍性贫血患者后，原始(CD38阴性)和定型(CD38阳性)CD34细胞在重编程序为中幼粒细胞之前在外周循环中循环三天(图2)。在患者A、患者B和患者D中输注HRSC后3和6天，接着发生骨髓植入。另一方面，当通过流式细胞术分析时，对于患者003，在第20天接着发生骨髓植入。在不使用任何预先调节方案的情况下，HRSC的单一输注在4例再生障碍性贫血患者中的两例中引起长期植入。在输注HRSC后没有任何输注的情况下，患者A和患者B显示出长期植入。在这些患者中嗜中性白细胞、红细胞和血小板的植入伴随着Hb F血红蛋白水平的变化或增加(表6和7)。这在死亡的另2个患者中并没有观察到。在这两个患者中Hb F变化证实了输注的HRSC向幼稚Hb表型重编程序的能力以及因此如用脐带血干细胞移植观察到的植入和重构(Elhasid 等, Leukemia 2000, 14: 931–934; Locatelli 等, Bone Marrow Transplant 1996, 18: 1095-101)。

染色体数和染色体带得以保持的该长期植入清楚地反映了在其中克隆进化在采用常规治疗的情况下不是罕见事件的血液学病症中输注HRSC的安全性。

重要地，自体HRSC能够在不使用任何免疫抑制方案的情况下在严重再生障碍性贫血患者亚组中获得长期植入和存活率，正如采用同源干细胞所观察到的一样。

总之，在输注后14天，输注患者的骨髓分析显示出在各个分化阶段骨髓细胞性、以及髓样、类红细胞和巨核细胞谱系增加，伴随着脂肪细胞和基质细胞(严重再生障碍性贫血骨髓的主要占据物)下降。骨髓中红细胞量显著增加，且血红蛋白水平以及网状细胞计数相应增加。在输注后，还存在胎儿血红蛋白(一种在改善镰刀细胞性贫血和β地中海贫血中重要的成分)和表达胎儿血红蛋白的红细胞的稳定增加。此外，红细胞指数显著改善，如红细胞尺寸、血红蛋白含量和浓度所测定。在输注后，重编程序的细胞已经展示出正常的核型和遗传稳定性。最后，在患有再生障碍性贫血的另外3个患者中，观察到植入和长期再恢复。

实施例2

材料和方法

在21例β地中海贫血患者中测试自体重编程序的造血细胞(靶细胞)。19例患者患有重型β地中海贫血，而2例患者患有中间型地中海贫血。中间型β地中海贫血患者之一是地中海贫血/Hb E变体(常见于远东和印度来源的患者)，而另一例患有地中海贫血/镰刀细胞性贫血。

通过处理2-3倍的患者血液总量，对患者进行单采血液成分术。通过重编程序白细胞直到如上文所述的其区别特征所示获得靶细胞，产生自体重编程序的细胞。通过静脉输注入颈静脉或手臂或大腿中的静脉，将自体重编程序的细胞施用给患者。

结果

在输注重编程序的细胞后，在β地中海贫血患者中没有观察到毒性或不良副作用，如通过与基线相比时生命指征监测、超声心动图、骨密度、肝和肾酶包括核型分析和G显带所测量的。与基线相比时，输注重编程序的细胞后近9个月，现在在重型β地中海贫血患者中存在统计学上显著的平均输血要求减少(50%)。在输注重编程序的细胞后近9个月，现在两例中间型β地中海贫血的地中海贫血患者(一例是地中海贫血/HB E，另一例是地中海贫血/镰刀细胞性贫血)不依赖于输注。

与基线相比时，在输注重编程序的细胞后的平均重量和高度显著更大，而在具有脾肿大和/或肝肿大的地中海贫血患者中器官大小正常化。与基线相比时，在输注重编程序的细胞后，在重型地中海贫血和中间型地中海贫血患者中绝对平均胎儿血红蛋白浓度显著增加(图5)。此外，由红细胞尺寸、血红蛋白含量(图6)和浓度(图7)的改善所反映的平均红细胞指数相比于基线也显著改善。

最后，在输注重编程序的细胞后，在地中海贫血患者中平均血清铁蛋白(铁过载的生物标志物)显著地减少(图8)。铁过载是患有地中海贫血、镰刀细胞性贫血和任何输血性铁过载诱导的紊乱的患者死亡和发病的主要原因。

实施例3

材料和方法

通过处理2-3倍的患者血液总量，对两例糖尿病患者进行单采血液成分术。通过对单采血液成分的白细胞进行重编程序直到靶细胞如上文所述的其区别特征所示发展，获得自体的重编程序间质干细胞、多能干细胞和胰岛细胞(靶细胞)。通过静脉输注入颈静脉或手臂或大腿中的静脉，将自体重编程序的细胞施用给患者。

结果

在输注自体重编程序的细胞后，患者合成正常水平的胰岛素，如通过空腹和90分钟食物摄入刺激的c-肽所测量的。该正常水平的c-肽得以维持直至在输注重编程序的细胞后3个月(图9)。此外，Hb A1C水平(其指示血糖控制)在输注重编程序的细胞后已经正常化(图10)。例如，在输注前Hb A1C高于10%的患者在接受重编程序的细胞后现具有5.8%的Hb A1C。此外，与基线相比时，这些患者的血糖水平在输注后看起来达到正常水平。此外，在输注重编程序的细胞后，观察到糖尿病患者的胰岛素摄取/注射大幅度减少。

实施例4

材料和方法

四例肌萎缩侧索硬化(ALS)患者接受自体重编程序的细胞。该疾病的诊断不牵涉特异性生物标志物。该疾病通过临床排除其它相似的紊乱加以诊断。

通过处理2-3倍的患者血液总量，对患者进行单采血液成分术。通过对单采血液成分的白细胞进行重编程序直到靶细胞如上文所述的其区别特征所示发展，获得自体的重编程序的多能干细胞、肺泡上皮细胞和神经元(靶细胞)。通过静脉输注入颈静脉或手臂或大腿中的静脉，将自体重编程序的细胞施用给患者。

结果

在患有ALS并用自体重编程序的细胞治疗的患者中，在肺功能试验(PFT)中存在显著的改善。在该肺功能测试中的损伤是导致早期死亡的原因之一。大多数的患者经历较少的四肢和颈部僵硬，而一些患者报告言语改善。其他患者显示行走能力以及头部抬起改善。

实施例5

材料和方法

通过处理2-3倍的患者血液总量，对四例帕金森病患者进行单采血液成分术。通过对单采血液成分的白细胞进行重编程序直到靶细胞如上文所述的其区别特征所示发展，获得自体的重编程序的多能干细胞和神经元(靶细胞)。通过静脉输注入颈静脉或手臂或大腿中的静脉，将自体重编程序的细胞施用给患者。

结果

其中疾病的战栗影响显著的患者经历摇动和用于控制该紊乱的常规药物摄入的显著减少。第一例患者每日服用4片的信尼麦(Sinemet，多巴胺调节剂)，在输注后4个月每日仅摄入1片。

实施例6

材料和方法

通过处理2-3倍的患者血液总量，对两例脊髓损伤患者进行单采血液成分术。通过对单采血液成分的白细胞进行重编程序直到靶细胞如上文所述的其区别特征所示发展，获得自体的反分化多能干细胞和神经元(靶细胞)。通过静脉输注入颈静脉或手臂或大腿中的静脉，将自体重编程序的细胞施用给患者。

结果

一例患者失去随访。另一例患者是患有C5-C6脊髓损伤的四肢瘫痪者。该患者不能端坐或在床上转动其躯干。在治疗后，他能够非常长时间地坐直，并能在床上转动其身体。在靠着墙支撑其身体后，他还能够单独站立。此外，他能够摆动其脚趾并报告膀胱知觉。

在输注重编程序的细胞前后的MRI分析显示在输注重编程序的细胞后损害大小轻微减少。他开始积极地进行物理疗法，并总体感觉比以前好得多。

实施例7

材料和方法

两例肌营养不良(MD)患者用自体重编程序的多能干细胞、间质干细胞和骨骼肌细胞(靶细胞)治疗，所述自体重编程序的多能干细胞、间质干细胞和骨骼肌细胞(靶细胞)通过对单采血液成分的白细胞进行重编程序直到靶细胞如上文所述的其区别特征所示发展而获得。第一例患者遭受肢带型MD，其是指其中受影响最严重的肌肉通常是髋部和肩部的肌肉的一类MD，而第二例患者遭受nemelin MD。

通过处理2-3倍的患者血液总量，对患者进行单采血液成分术。通过根据本发明的重编程序，产生自体重编程序的细胞。通过静脉输注入颈静脉或手臂或大腿中的静脉，将自体重编程序的细胞施用给患者。

结果

与MD有关的肌肉萎缩可以通过监测肌肉酶肌酸磷酸激酶(CPK)的水平加以测量。该酶响应于反分化干细胞的输注而减少(图11)。乳酸脱氢酶(一种在组织损坏期间升高的酶)也降低(图11)。患者也经历肝酶丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的减少，其均与肝细胞以及骨骼肌的炎症和损伤有关。

而且，与基线相比时，在输注重编程序的细胞后，患者显示如在输注重编程序的细胞前后患者的摄像录像所确定的患者移动性的改善以及肺功能试验的改善。

实施例8

材料和方法

患有肾疾病的患者用自体重编程序的多能干细胞、间质干细胞和肾细胞(靶细胞)治疗，所述自体重编程序的多能干细胞、间质干细胞和肾细胞(靶细胞)通过对单采血液成分的白细胞进行重编程序直到靶细胞如上文所述的其区别特征所示发展而获得。通过处理2-3倍的患者血液总量，对患者进行单采血液成分术。通过根据本发明的重编程序，产生自体重编程序的细胞。通过静脉输注入颈静脉或手臂或大腿中的静脉，将自体重编程序的细胞施用给患者。

结果

接受自体重编程序的细胞输注的患者经历指示更为健康的肾功能的各种流体标记水平诸如尿排出量、血清肌酸酐和BUN或UREA的改善。例如，75岁糖尿病男性患者在用自体重编程序的细胞治疗后24个月显示出改善的肾功能(见表8)。所述患者展示出血红蛋白(其是红细胞中携带氧的蛋白质分子)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1，一种生长因子)的水平增加。所述患者也显示出尿素(其是有机化合物)、肌酸酐(其是肌肉中磷酸肌酸的分解产物)、尿酸(其是尿中排泄的有机化合物)和磷(其是在骨中发现的矿物质)的降低；高含量的这些标记指示不良的肾功能。此外，所述患者显示出糖化血红蛋白(HbA1C)下降，糖化血红蛋白是血红蛋白的一种形式并且通常用作遭受糖尿病的人的血浆葡萄糖浓度的指示物。

类似地，51岁的糖尿病男性在治疗后12个月展示出相似的改善(见表8)。该患者显示出增加水平的血红蛋白和降低水平的肌酸酐、HbA1C和血尿素氮(BUN)，血尿素氮是血液中尿素形式的氮量的度量。

表8：两例糖尿病男性患者中的肾功能标记水平。  

HbA1C = 糖化血红蛋白；IGF-1 = 胰岛素样生长因子1；BUN = 血尿素氮。

患有II型糖尿病并用自体重编程序的细胞治疗的12例患者的分析显示出降低水平的微量白蛋白(图13)，其与白蛋白渗漏入尿有关并且是肾疾病以及血管内皮机能障碍和心血管疾病的指示物。所述12例患者也经历降低水平的HbA1C (图14)。

此外，遭受自身免疫性肾小球肾炎的45岁女性在用自体重编程序的细胞治疗后18个月内展示出肾功能的改善(见表9)。

表9：遭受自身免疫性肾小球肾炎的45岁女性患者中的肾功能标记水平。  

BUN = 血尿素氮。

此外，遭受末期肾疾病的59岁女性患者在用重编程序的细胞治疗后显示出肌酸酐水平、尿素、血红蛋白水平和甲状旁腺激素(PTH)的改善(见表10)。遭受自身免疫的45岁女性患者中的肾功能标记水平。所述患者在每月参加的血液透析的时期数方面也下降，从12个时期到约8个时期。

表10：在用重编程序的细胞治疗前后遭受末期肾疾病的59岁女性患者中的肾功能标记水平。  

TLC = 总白细胞计数；WBC = 白细胞；PLT = 血小板；HbA1C = 糖化血红蛋白；AST = 天冬氨酸转氨酶；ALT = 丙氨酸转氨酶；PT = 凝血酶原时间；INR = 国际标准化比值(对于血液凝固)；PTH = 甲状旁腺激素。

由于糖尿病遭受慢性肾衰竭的46岁患者在用重编程序的细胞治疗后也显示出肌酸酐水平、尿素、和血红蛋白水平的改善(见表11)。所述患者在他每月参加的血液透析的时期数方面下降，从12个时期到约5个时期，并且在采用皮下递送阿法依伯汀 (EPREX^?)的治疗方面下降，从每周两次4000单位到每两周一次4000单位。

表11：在用重编程序的细胞治疗前后遭受慢性肾衰竭的46岁患者中的肾功能标记水平。  

TLC = 总白细胞计数；WBC = 白细胞；PP = 膳食后；PLT = 血小板；FBS = 空腹血糖；AST = 天冬氨酸转氨酶；ALT = 丙氨酸转氨酶；PT = 凝血酶原时间；INR = 国际标准化比值(对于血液凝固)。

实施例9

材料和方法

多发性硬化患者用自体重编程序的多能干细胞、间质干细胞和神经元(靶细胞)治疗。通过对单采血液成分的白细胞进行重编程序直到靶细胞如上文所述的其区别特征所示发展，获得靶细胞。通过处理2-3倍的患者血液总量，对患者进行单采血液成分术。通过根据本发明的重编程序，产生自体重编程序的细胞。通过静脉输注入颈静脉或手臂或大腿中的静脉，将自体重编程序的细胞施用给患者。

结果

用自体重编程序的细胞治疗的患者显示出脑中和脊髓中损害减少。损害减少可以发生在接受所述治疗的三个月内(图15a-b)。脑组织损害减少发生在六个月内(图16a-b)。

用自体重编程序的细胞治疗的患者还显示出脊髓病灶的去除(图17a-b)。此外，这些患者展示出Kurtzke扩展致残量表(EDSS)得分的改善、显示缓解、并且自从接受单一输注后高达四年未参与常规治疗。

实施例10

材料和方法

女性HIV患者用自体重编程序的造血干细胞治疗。通过处理2-3倍的患者血液总量，对患者进行单采血液成分术。通过对单采血液成分的白细胞进行重编程序直到靶细胞如上文所述的其区别特征所示发展，获得靶细胞。通过静脉输注入颈静脉或手臂或大腿中的静脉，将自体重编程序的细胞施用给所述患者。

结果

在治疗前，对于HIV-1和HIV-2抗体的筛选试验显示3.68的测试值。1.0或更大的值被认为是阳性的。

在用自体重编程序的细胞治疗后2个月，对于HIV-1和HIV-2抗体筛选的测试值是0.46，其表示患者不显示HIV-1和HIV-2的阳性结果。在治疗后六个月，对于HIV-1和HIV-2筛选的测试值是0.48，其进一步证明，所述患者不显示HIV阳性结果。

实施例11

用自体重编程序的细胞治疗的效应在遭受其它病症和疾病的患者中得以证明。通过对单采血液成分的白细胞进行重编程序直到靶细胞如上文所述的其区别特征所示发展，获得本文列出的靶细胞。

充血性心力衰竭

对遭受充血性心力衰竭的61岁男性患者输注自体重编程序的心肌细胞、多能干细胞、间质干细胞和内皮细胞。所述治疗引起射血分数(EF)；脑利尿钠肽前体水平(Pro BNP)，其是与冠状动脉病有关的预报因子；空腹血糖水平；和HbA1C水平的改善(见表12)。此外，先前扩大的心脏恢复到正常大小，如表12中通过由超声心动图测量的舒张末期左心室内部尺寸(LVID/D)、舒张末期左心室内部尺寸(LVID/S)和舒张末期心室内中隔厚度(IVSD)所证明。

表12：在用重编程序的细胞治疗前后遭受充血性心力衰竭的61岁患者中的冠状动脉病标记。  

LVID/D = 舒张末期左心室内部尺寸；LVID/S = 收缩末期左心室内部尺寸；EF = 射血分数；IVSD = 舒张末期心室内中隔厚度；LVPWD = 舒张末期左心室后壁厚度；Pro-BNP = 脑利尿钠肽前体；HbA1C = 糖化血红蛋白。

丙型肝炎

用自体重编程序的造血细胞、多能干细胞、间质干细胞和肝细胞输注感染丙型肝炎病毒(HCV)和患有β地中海贫血的13例患者。所述治疗的效应显示HCV负载较低或清除(见表13)，以及改善的血液标记(见表14)，例如肝酶、胆红素、白蛋白、凝血酶原时间和国际标准化比值(对于血液凝固)。具体而言，患者经历肝酶丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的正常化，所述酶均与肝细胞的炎症和损伤有关(图18a-b)。

表13. 感染丙型肝炎病毒并用自体重编程序的干细胞治疗的12例患者中的病毒负荷

表14. 感染丙型肝炎病毒并遭受肝硬化的患者中在基线和在用重编程序的细胞治疗之后的血液标记

WBC = 白细胞；PP = 膳食后；ALT = 丙氨酸转氨酶；AST = 天冬氨酸转氨酶；INR = 国际标准化比值(对于血液凝固)；PT = 凝血酶原时间。

例如，由于丙型肝炎病毒感染而遭受肝硬化的44岁男性患者也显示出肝酶丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶、国际标准化比值(对于血液凝固)、胆红素和白蛋白以及随机血糖的改善(见表15)。事实上，该患者在用重编程序的细胞治疗之前进行白蛋白治疗，但是在治疗之后未接受白蛋白。

表15：在由于丙型肝炎病毒感染而遭受肝硬化的44岁男性患者中在基线和在用重编程序的细胞治疗之后的血液标记。  

TLC = 总白细胞计数；PLT = 血小板；AST = 天冬氨酸转氨酶；ALT = 丙氨酸转氨酶；GGT = γ-谷氨酰转移酶；RBS = 随机血糖；INR = 国际标准化比值(对于血液凝固)。

头部创伤

由于机动车事故中遭受头部创伤的患者通过输注自体重编程序的多能干细胞和神经元治疗。所述治疗引起损伤脑组织的修复(图19a-b)；射血分数(EF)、脑利尿钠肽前体水平(Pro BNP)——其是与冠状动脉病有关的预报因子、空腹血糖水平和HbA1C水平的改善(见表10)。

肺疾病

遭受与运动神经元病有关的限制性肺疾病的患者通过输注自体重编程序的多能干细胞、间质干细胞、肺泡上皮细胞和内皮细胞进行治疗。在治疗后六个月，用力肺活量(FVC)(其是在吸满气之后可用力吹出的空气体积)从50%增加至71%；而1秒内的用力呼气量(FEV₁)(其是在一秒内可用力吹出的空气体积)从64%增加到68%。此外，FEV₁与FVC的比值(其在健康成人中约为75-80%)从100%降低至82%。肺部x射线扫描显示治疗后肺腔不透明度较低(图20)。

绝经期

51岁绝经期患者给予自体重编程序的多能干细胞、多能生殖细胞和卵母细胞输注。在治疗之后，所述患者经历各种激素和蛋白水平的增加，包括胰岛素样生长因子(IGF-1)、雌二醇(esterdiaol)和低密度脂蛋白(LDL)(见表16)。

表16. 用自体重编程序的干细胞给予绝经期患者的效应。  

IGF-1 = 胰岛素样生长因子1；IGF-1-结合 = 胰岛素样生长因子结合；GH = 生长激素；DHEA-S = 脱氢表雄酮硫酸酯；Adrenocort = 肾上腺皮质激素；FSH = 促卵泡激素；LH = 促黄体生成激素；HDL = 高密度脂蛋白；LDL = 低密度脂蛋白；triglycer = 甘油三酯；HBA1C = 糖化血红蛋白；FBS = 胎儿采血；TSH = 促甲状腺激素；FT3 = 游离三碘甲状腺原氨酸；FT4 = 游离甲状腺素。

抑郁症

遭受抑郁症的患者通过输注自体重编程序的多能干细胞和神经元治疗。在治疗之后，所述患者经历各种激素和蛋白水平的增加，包括胰岛素样生长因子(IGF-1)、氢化可的松和睾酮(见表17)。

表17. 用自体重编程序的细胞给予绝经期患者的效应。  

GH =生长激素；IGF-1 = 胰岛素样生长因子1；IGF-bp = 胰岛素样生长因子结合蛋白；Adrenocort = 肾上腺皮质激素；Sh-bg = 性激素结合球蛋白；FSH = 促卵泡激素；LH = 促黄体生成激素；e2 = 雌二醇；DHEA-S = 脱氢表雄酮硫酸酯；TSH = 促甲状腺激素；FT3 = 游离三碘甲状腺原氨酸；FT4 = 游离甲状腺素。

非梗阻性无精子症

遭受非梗阻性无精子症的患者通过输注自体重编程序的多能干细胞、多能生殖细胞和精子加以治疗。在治疗后，所述患者在八个月的时期内经历睾酮增加(图21)。

视力减损

由于已经被去除的良性肿瘤而遭受视力损失的患者通过输注自体重编程序的多能干细胞和神经元治疗。在治疗后，所述患者经历视网膜灵敏度的增加和视力改善(图22)。

因此，已经详细描述了本发明的优选实施方案，将理解的是，上述段落定义的发明不意图限于上文描述中列出的特定细节，因为其许多明显变化是可能的，而不背离本发明的精神或范围。

Claims (55)

1.一种在患者中补充一种细胞谱系的组织或细胞的方法，包括（i）获得第一细胞谱系的定型细胞；(ii)使所述定型细胞重编程序以获得重编程序的细胞，和（iii）将所述重编程序的细胞施用至所述患者。

2.权利要求1所述的方法，其中所述患者遭受选自下列的疾病或紊乱：骨髓衰竭、血液学病症、再生障碍性贫血、β地中海贫血、运动神经元病、帕金森病、脊髓损伤、肌营养不良、肾疾病、多发性硬化、充血性心力衰竭、丙型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒、头部创伤、脊髓损伤、肺疾病、抑郁症、非梗阻性无精子症、男性更年期、绝经期和不育症、复壮、硬皮病性溃疡、银屑病、皱纹、肝硬化、自身免疫病、脱发、色素性视网膜炎、晶状变性/失明、糖尿病、肝硬化和不育症。

3.权利要求1所述的方法，其中所述重编程序的细胞选自多能干细胞、造血干细胞、神经干细胞、上皮干细胞、间质干细胞、内胚层和神经外胚层干细胞、生殖细胞、胚外的胚胎干细胞、肾细胞、肺泡上皮细胞、肺泡内胚层细胞、神经元、外胚层细胞、胰岛细胞、腺泡细胞、卵母细胞、精子、肝细胞、角化细胞、黑素细胞、骨细胞、真皮乳头细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、心肌细胞和滋养层细胞。

4.权利要求1所述的方法，其中所述定型细胞从全血、骨髓、神经组织、肌肉组织、表皮或真皮获得。

5.权利要求4所述的方法，其中所述定型细胞从全血获得。

6.权利要求5所述的方法，其中所述定型细胞通过单采血液成分术获得。

7.权利要求5所述的方法，其中所述定型细胞从动员或未动员的血液获得。

8.权利要求5所述的方法，其中所述定型细胞选自T细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性白细胞、巨核细胞、单核细胞、红血球、粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞、白细胞、血小板和红细胞。

9.权利要求1所述的方法，其中重编程序包括所述定型细胞的反分化、转分化、再分化或其组合。

10.权利要求9所述的方法，其中所述重编程序包括所述定型细胞的反分化以获得反分化细胞。

11.权利要求10所述的方法，其中通过将所述定型细胞与试剂接触而使所述定型细胞反分化。

12.权利要求11所述的方法，其中所述定型细胞用所述试剂温育。

13.权利要求12所述的方法，其中所述试剂与受体接合，所述受体在所述定型细胞的表面上调节抗原的捕获、识别或呈递。

14.权利要求11所述的方法，其中所述受体是MHC I类抗原或MHC II类抗原。

15.权利要求11所述的方法，其中所述试剂是所述受体的抗体。

16.权利要求13所述的方法，其中所述试剂是所述受体的单克隆抗体。

17.权利要求16所述的方法，其中所述抗体选自单克隆抗体CR3/43和单克隆抗体TAL 1B5。

18.权利要求1所述的方法，其中所述反分化细胞通过注射或植入而施用。

19.权利要求18所述的方法，其中所述反分化细胞通过肠胃外、肌内、静脉内、皮下、眼内、经口、经皮注射或注射入脊髓液而施用。

20.权利要求9所述的方法，其中所述重编程序包括所述定型细胞的转分化以获得转分化细胞。

21.权利要求20所述的方法，其中通过将所述定型细胞在包含一种或多种反分化试剂和一种或多种分化促进剂的组织培养基中培养而使所述定型细胞转分化。

22.权利要求21所述的方法，其中所述组织培养基选自Iscove改良达尔伯克氏培养基(IMDM)、达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)、伊格尔极限必需(EME)培养基、α-极限必需培养基(α-MEM)、Roswell Park Memorial Institute (RPMI；开发培养基的地点)1640、Ham-F-12、E199、MCDB、Leibovitz L-15、和Williams培养基E或任何商业上可得的培养基。

23.权利要求21所述的方法，其中所述分化促进剂是抗凝剂、螯合剂或抗生素。

24.权利要求21所述的方法，其中所述分化促进剂是维生素、矿物质或其衍生物。

25.权利要求24所述的方法，其中所述维生素、矿物质或其衍生物选自维生素A、维生素B₃、维生素C、维生素D₃、维生素K、视黄酸、烟酰胺、锌或锌化合物、和钙或钙化合物。

26.权利要求21所述的方法，其中所述分化促进剂是天然或合成激素。

27.权利要求26所述的方法，其中所述天然或合成激素是氢化可的松或地塞米松。

28.权利要求21所述的方法，其中所述分化促进剂是氨基酸或其衍生物。

29.权利要求28所述的方法，其中所述氨基酸或其衍生物选自L-谷氨酰胺(L-glu)、麦角硫因(EGT)、脯氨酸和非必需氨基酸(NEAA)。

30.权利要求21所述的方法，其中所述分化促进剂是化学化合物或其衍生物。

31.权利要求30所述的方法，其中所述化学化合物或其衍生物选自β-巯基乙醇、二丁基环腺苷酸(db-cAMP)、一硫代甘油(MTG)、腐胺、二甲亚砜（DMSO）、次黄嘌呤、腺嘌呤、毛喉素、西洛酰胺和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤。

32.权利要求21所述的方法，其中所述分化促进剂是核苷或其类似物。

33.权利要求32所述的方法，其中所述核苷或其类似物是5-氮杂胞苷。

34.权利要求21所述的方法，其中所述分化促进剂是酸或其盐。

35.权利要求34所述的方法，其中所述酸或其盐选自抗坏血酸、丙酮酸、冈田软海绵酸、亚油酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、 EDTA二钠、乙二醇四乙酸(EGTA)、抗凝剂柠檬酸盐右旋糖配方A (ACDA)、丁酸钠和磷酸甘油。

36.权利要求21所述的方法，其中所述分化促进剂是抗生素或药物。

37.权利要求36所述的方法，其中所述抗生素或药物选自G418、庆大霉素、己酮可可豆碱(1-(5-氧代己基)-3,7-二甲基黄嘌呤)和吲哚美辛。

38.权利要求21所述的方法，其中所述分化促进剂是蛋白质。

39.权利要求38所述的方法，其中所述蛋白质是组织纤溶酶原激活物(TPA)。

40.权利要求21所述的方法，其中所述组织培养基包含自体血浆；血小板；血清；或哺乳动物来源的血清。

41.权利要求21所述的方法，其中所述细胞在血液袋、支架、组织培养袋、或塑料组织培养容器内培养。

42.权利要求41所述的方法，其中所述组织培养容器是粘附型或非粘附型组织培养容器。

43.权利要求41所述的方法，其中所述组织培养容器是包被或未包被的。

44.权利要求43所述的方法，其中所述组织培养容器用选自明胶、胶原、基质胶或胞外基质的试剂包被。

45.权利要求21所述的方法，其中所述细胞在约18-约40℃的温度培养。

46.权利要求21所述的方法，其中所述细胞在约4%-约10%的二氧化碳水平培养。

47.权利要求21所述的方法，其中所述细胞在约10%-约35%的氧水平培养。

48.一种在需要的患者中治疗疾病或组织损伤的方法，包括（i）获得定型细胞；(ii)使所述定型细胞重编程序以获得重编程序的靶细胞，和（iii）将所述重编程序的靶细胞施用至所述患者。

49.权利要求1-48任一项所述的方法，其中所述靶细胞以药物组合物施用。

50.权利要求49的药物组合物。

51.一种或多种重编程序的靶细胞在制备用于在患者中修复或补充一种细胞谱系的组织或细胞或用于治疗疾病或组织损伤的药物或药物组合物中的用途。

52.一种获得用于施用至需要的患者的重编程序的靶细胞的方法，其中所述方法包括（i）获得第一细胞谱系的定型细胞；和(ii)使所述定型细胞重编程序以获得重编程序的靶细胞。

53.一种药物组合物，其包含通过权利要求52所述的方法获得的重编程序的靶细胞和至少一种药学上可接受的赋形剂。

54.一种制备用于施用至需要的患者的药物或药物组合物的方法，其中所述方法包括：（i）获得第一细胞谱系的定型细胞；（ii）使所述定型细胞重编程序以获得重编程序的靶细胞；和（iii）任选地，组合所述重编程序的靶细胞与一种或多种药物赋形剂。

55.一种通过权利要求54所述的方法制备的药物组合物。

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