KR20120099686A

KR20120099686A - 재프로그래밍된 성숙 성체 세포를 이용한 치료

Info

Publication number: KR20120099686A
Application number: KR1020127012911A
Authority: KR
Inventors: 일함 모하메드 살레 사에드 아불자데일
Original assignee: 트리스템 트레이딩 (사이프러스) 리미티드
Priority date: 2009-10-19
Filing date: 2009-10-19
Publication date: 2012-09-11
Anticipated expiration: 2029-10-19
Also published as: WO2011048350A1; CH704227B1; RU2635317C2; MA33740B1; JP2013508343A; AU2009354350B2; RU2012120713A; AU2009354350A1; CN102647989A; TN2012000157A1; UA109265C2; CA2781522A1; EP2490702A1; KR101766203B1; IL218902A; JP6073135B2; ZA201202664B; MX2012004522A; IL218902A0; CU24006B1

Abstract

역분화, 전환분화 또는 재분화 세포와 같이 재프로그래밍된 세포를 이용하여 환자의 다양한 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법. 이 방법은 환자로부터 수임 세포를 획득하고, 수임 세포를 역분화시켜 역분화 표적 세포를 획득하며, 역분화 세포를 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 양태로서, 이 방법은 환자로부터 수임 세포를 획득하고, 수임 세포를 전환분화시켜 전환분화 표적 세포를 획득하며, 전환분화 표적 세포를 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 역분화 또는 전환분화 표적 세포는 환자의 조직 또는 세포를 복원 또는 보충한다.

Description

재프로그래밍된 성숙 성체 세포를 이용한 치료{TREATMENT USING REPROGRAMMED MATURE ADULT CELLS}

참조에 의한 인용

본원에 인용 또는 참조된 모든 문서는 본원 또는 임의의 문헌에 언급된 임의의 제조사의 지침서, 설명서, 제품 명세서, 제품 설명서와 함께 본원에 참조로 삽입되고, 이들은 본 발명을 실시하는데 이용될 수 있다.

발명의 분야

줄기 세포는 세포의 유사분열을 통해 자체 재생하고 다양한 범위의 특화 세포 유형으로 분화하는 능력을 특징으로 한다. 크게 두 가지 유형의 포유동물의 줄기 세포는 배반포의 내부 세포괴로부터 분리되는 배아 줄기 세포와 성숙 조직에서 발견되는 성체 줄기 세포이다. 발달 배아에서, 줄기 세포는 모든 특화 배조직으로 분화할 수 있다. 성숙 유기체에서, 줄기 세포 및 전구 세포는 특화 세포를 보충하며, 혈액, 피부 또는 장 조직과 같은 재생 기관의 정상적인 교체를 유지해 준다.

줄기 세포는 발달이 진행함에 따라 줄기 세포의 양 감소하지만 발달 배아에 풍부하게 존재한다. 대조적으로, 성체 유기체는 특정 신체 부위에 국한되어 한정된 수량의 줄기 세포를 함유한다.

줄기 세포의 치료적 응용은 다수의 질환 또는 장애 치료를 변경할 수 있는 잠재력을 갖는다. 일부 성체 줄기 세포 치료요법(예, 골수이식)이 이미 실행되고 있는 한편, 의료 연구진들은 줄기 세포를 이용하여 무엇보다 암, 파킨슨병, 척수 손상, 근위축성 측색 경화증, 다발성 경화증 및 근육 손상을 포함한 보다 광범위한 각종 질환을 치료할 수 있을 것으로 기대한다. 이와 같은 치료요법은 질환을 치료하는데 필요한 세포 유형으로 분화하는 줄기 세포의 능력의 이점을 이용할 수 있다.

그러나, 줄기 세포를 이용하여 그와 같은 질병을 성공적으로 치료할 수 있는지의 여부는 불확실할 뿐만 아니라 줄기 세포를 획득할 수 있는 용이성에 대한 우려가 있다. 예를 들어, 전통적으로 조혈 줄기 세포는 골수, 성장 인자 가동화 말초 혈액 또는 제대혈(태반)로부터 분리 추출한다. 또한, 조혈 줄기 세포는 시험관내 수정 기술을 이용하여 획득한 배아로부터 추출되는 배아 줄기(ES) 세포로부터 제조할 수 있다. 그러나, 이들 공급원으로부터의 추출 과정은 복잡하고 때론 위험하며, 윤리적 우려에 봉착할 수 있다. 게다가, 그들 공급원으로부터 획득할 수 있는 줄기 세포의 수는 한정적이다. 또한, 줄기 세포는 질병을 치료하는데 필요한 세포로 분화하는데 곤란에 직면할 수 있다.

본 발명은 환자의 조직을 복원하거나 조직 또는 세포를 보충하기 위한 재프로그래밍된 세포의 용도에 관한 것이다. 예를 들면, 본 발명은 분화 세포 또는 수임 세포의 역분화로부터 획득된 역분화 세포를 사용하여 환자의 조직을 복원하거나 환자의 조직 또는 세포를 보충하는 것에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 분화 또는 수임 세포의 전환분화로부터 획득된 전환분화 세포를 사용하여 환자의 조직을 복원하거나 환자의 조직 또는 세포를 보충하는 것에 관한 것이다.

본원은 환자로부터 획득한 수임 세포 또는 체세포를 재프로그래밍하여 다른 계통의 세포를 생성할 수 있고 이들 재프로그래밍된 세포를 환자에게 투여하여 조직 또는 세포를 복원 또는 보충할 수 있다는 출원인의 발견에 일부 근간을 두고 있다. 재프로그래밍 과정의 예는 역분화 및 전환분화를 포함한다.

따라서, 출원인들은 수임 세포가 재프로그래밍을 겪어 다른 계통의 세포를 생성할 수 있음을 발견하였다. 예를 들면, 수임 세포가 역분화를 겪어 역분화 세포, 예를 들어 다능 줄기 세포와 같이 덜 분화된 세포를 생성할 수 있고, 이들 역분화 세포는 환자에게 투여되어 조직 또는 세포를 복원 또는 보충할 수 있다. 다른 예로서, 환자로부터 획득한 수임 세포는 전환분화를 겪어 전환분화 세포, 예를 들어 수임 세포와 다른 계통의 세포를 생성할 수 있고, 이들 전환분화 세포는 환자에게 투여되어 조직 또는 세포를 복원 또는 보충할 수 있다.

본 발명은 환자에게 재프로그래밍된 세포를 투여함으로써 해당 환자의 한 세포 계통의 조직 또는 세포를 복원 또는 보충하는 방법을 포함한다. 특히, 본 발명은 (i) 수임 세포를 획득하고, (ii) 수임 세포를 역분화시켜 역분화 표적 세포를 획득하며, (iii) 역분화 표적 세포를 환자에게 투여하는 것을 포함하고, 상기 역분화 표적 세포는 환자의 한 세포 계통의 세포로 재분화하는, 해당 환자의 그 세포 계통의 조직 또는 세포를 복원 또는 보충하는 방법을 포함한다. 이들 재분화 세포는 수임 세포와 동일한 세포 계통이거나 상이한 세포 계통일 수 있다.

또한, 본 발명은 (i) 수임 세포를 획득하고, (ii) 수임 세포를 전환분화시켜 전환분화 표적 세포를 획득하며, (iii) 전환분화 표적 세포를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 해당 환자의 한 세포 계통의 조직 또는 세포를 복원 또는 보충하는 방법을 포함한다.

일부 양태에서, 상기 환자는 이로써 한정되는 것은 아니지만 골수 부전, 혈액학적 병태, 재생불량성 빈혈, 베타-지중해 빈혈, 당뇨병, 운동 뉴런 질환, 파킨슨병, 척수 손상, 근위축증, 신장 질환, 다발성 경화증, 울혈성 심부전증, C형 간염 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 두부 외상, 척수 손상, 폐질환, 우울증, 비폐색성 무정자증, 남성 갱년기, 폐경과 불임, 회춘, 강피성 궤양, 건선, 주름, 간 경변증, 자가면역 질환, 탈모, 망막 색소 변성증, 결정 이영양증/실명, 당뇨병 및 불임을 포함한 질환, 장애, 또는 병태를 앓고 있을 수 있다. 따라서, 특정 양태에서, 재프로그래밍된 세포는 환자의 재생불량성 빈혈, 백혈병, 림프종 또는 인간 면역결핍 바이러스를 치료하는 골수 세포일 수 있다.

일부 양태에서, 재프로그래밍된 표적 세포(예, 역분화 세포, 전환분화 표적 세포 또는 재분화 세포)는 이들로 한정하는 것은 아니지만, 만능 줄기 세포, 만능 생식 세포, 조혈 줄기 세포, 뉴런 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 내배엽 및 신경외배엽 줄기 세포, 생식 세포, 배외 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 신장 세포, 폐포상피 세포, 내배엽 세포, 뉴런, 외배엽 세포, 섬세포, 선포 세포, 난모 세포, 정자, 조혈 세포, 간세포, 피부/각질 세포, 멜라닌 세포, 골/골세포, 모발/모유두 세포, 연골/연골세포, 지방세포, 골격근 세포, 내피 세포, 심근/심근세포 및 영양모세포를 포함할 수 있다.

특정 양태에서, 수임 세포는 혈액 또는 관련 조직(골수 포함)으로부터 수득된다. 수임 세포는 전혈로부터 수득될 수 있고/있거나 성분채집술을 통해 수득할 수 있다. 혈액은 가동화 또는 비가동화 혈액일 수 있다. 이와 같은 수임 세포는 이들로 한정하는 것은 아니지만 T 세포, B 세포, 호산구, 호염구, 호중구, 거핵 세포, 단핵 세포, 적혈구, 과립구, 비만 세포, 림프구, 백혈구, 혈소판 및 적혈구를 포함한다. 다른 방법으로, 수임 세포는 중추신경계 또는 말초신경계의 뉴런 조직, 근육 조직 또는 피부의 표피 및/또는 진피 조직으로부터 획득할 수 있다.

특정 양태에서, 수임 세포는 환자의 혈액 또는 조직으로부터 획득한다. 일부 양태에서, 수임 세포를 제공하는 환자와 역분화 표적 세포 또는 전환분화 표적 세포와 같은 재프로그래밍된 표적 세포를 투여받는 환자는 동일한 환자이다.

일부 양태에서, 수임 세포는 이 수임 세포를 제제와 접촉시킴으로써 역분화된다. 예를 들면, 수임 세포를 제제와 함께 배양할 수 있다. 특정 양태로서, 제제는 수임 세포의 표면에서 항원의 포획, 인식 또는 제시를 매개하는 수용체를 접목시킨다. 상기 수용체는 MHC 부류 I 항원 또는 MHC 부류 II 항원일 수 있다. 일부 양태에서, 부류 I 항원은 HLA-A 수용체, HLA-B 수용체, HLA-C 수용체, HLA-E 수용체, HLA-F 수용체 또는 HLA-G 수용체이고, 상기 부류 II 항원은 HLA-DM 수용체, HLA-DP 수용체, HLA-DQ 수용체 또는 HLA-DR 수용체이다.

특정 양태에서, 상기 제제는 수용체에 대한 항체, 예를 들어 수용체에 대한 모노클로날 항체일 수 있다. 일부 양태에서, 항체는 모노클로날 항체 CR3/43 또는 모노클로날 항체 TAL 1B5이다. 추가의 양태에서, 상기 제제는 MHC 유전자 발현, 예를 들어 MHC 부류 I⁺ 및/또는 MHC 부류 II⁺ 발현을 조절한다.

일부 양태에서, 역분화 세포는 별도의 단계에서 재분화를 겪을 수 있다. 예를 들어, 역분화 세포를 성장 인자(이들에 한정되는 것은 아니지만, 염기성 섬유모세포 성장 인자, 표피 성장 인자, 과립구 대식 세포 콜로니-자극 인자, 줄기 세포 인자, 인터류킨-1, -3, -6 및 -7, 염기성 섬유모세포 성장 인자, 표피 성장 인자, 과립구-대식 세포 콜로니 자극 인자, 과립구-콜로니 자극 인자, 에리쓰로포이에틴, 줄기 세포 인자 및 골 형성 단백질을 포함)와 접촉시켜 재분화시킬 수 있다. 그 후, 생성된 재분화 표적 세포를 환자에게 투여할 수 있다.

본 발명의 특정 양태로서, 수임 세포는 이 수임 세포를 특정 배양 조건에서 배양하여 전환분화시킬 수 있다. 예를 들어, 수임 세포를 역분화제와 배합하여 특정 유형의 배양 배지에서 배양시킬 수 있다. 이들 배양 배지의 예는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), 이스코브 변형 둘베코 배지(IMDM) 등을 포함할 수 있다. 또한, 조직 배양 배지는 비타민 및/또는 무기질 보충제, 하이드로코티손, 덱사메타손, β-머캅토에탄올 등과 같은 분화 촉진제를 포함할 수 있다. 게다가, 추가의 배양 조건은 킬레이트화제 또는 항생제의 사용, 특정 온도 또는 이산화탄소 또는 산소 수준에서의 배양 및 특정 용기에서의 배양을 포함한다. 배양 조건은 생성되는 전환분화 표적 세포의 유형을 결정할 수 있다.

이에 따라 본 발명의 한 가지 관점은 표적 세포를 수득하는 방법이다. 이 방법은 수임 세포를 획득한 다음 수임 세포를 재프로그래밍하는 것을 포함할 수 있다. 이들 과정은 본원에 기술된 바와 같다. 일부 양태에서, 본 발명의 방법은 수임 세포를 역분화시키는 것을 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 본 발명의 방법은 수임 세포를 전환분화시키는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 방법은 수임 세포를 역분화시킨 다음 역분화 세포를 재분화시키는 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 관점은 환자의 한 세포 계통의 조직 또는 세포를 복원 또는 보충하거나 질환 또는 조직 손상을 치료하기 위한 의약의 제조시에 하나 이상의 재프로그래밍된 표적 세포를 사용하는 것이다.

본 발명의 또 다른 관점은 질환 또는 조직 손상의 치료를 필요로 하는 환자의 그러한 질환 또는 조직 손상을 치료하는 방법이다. 특정 양태에서, 본 발명의 방법은 수임 세포를 획득하고, 수임 세포를 재프로그래밍하여 재프로그래밍된 표적 세포를 획득하며, 재프로그래밍된 표적 세포를 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 표적 세포는 역분화, 전환분화 및/또는 재분화를 통해 재프로그래밍될 수 있다. 특정 양태에서, 표적 세포는 역분화 표적 세포, 전환분화 표적 세포 및/또는 재분화 표적 세포이다. 수임 세포를 획득하고 수임 세포를 재프로그래밍하는 방법은 본원에 기술된 바와 같다.

일부 양태에서, 역분화 표적 세포, 전환분화 표적 세포 또는 재분화 표적 세포와 같은 재프로그래밍된 표적 세포는 주사, 이식 또는 주입을 통해 투여될 수 있다. 이들 세포는 비경구, 근육내, 정맥내, 피하, 안내, 경구, 경피 주사 또는 척수액으로의 주사에 의해 투여될 수 있다. 특정 양태에서, 역분화 표적 세포 또는 전환분화 표적 세포는 약제학적 조성물에 포함되어 투여된다. 약제학적 조성물은 역분화 표적 세포 또는 전환분화 표적 세포 및 한 가지 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다.

본 발명의 한 가지 관점은 재프로그래밍된 표적 세포(예, 역분화 표적 세포 또는 전환분화 표적 세포)를 투여하기 위한 약제학적 조성물이다. 약제학적 조성물은 표적 세포의 한 가지 이상의 유형과 한 가지 이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 임의로, 약제학적 조성물은 환자에게 투여하기에 적합한 보조제 및/또는 기타 부형제를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 관점은 (i) 수임 세포를 획득하고, (ii) 수임 세포를 재프로그래밍하여 재프로그래밍된 표적 세포를 획득하며, (iii) 임의로 재프로그래밍된 표적 세포를 한 가지 이상의 약제학적 부형제와 혼합시키는 것을 포함하는, 약제학적 조성물 또는 의약의 제조 방법이다. 일부 양태에서, 재프로그래밍된 표적 세포는 한 가지 이상의 약제학적 부형제와 혼합된다. 다른 양태에서, 재프로그래밍된 표적 세포는 한 가지 이상의 약제학적 부형제와 혼합되지 않는다. 수임 세포를 획득하고 수임 세포를 재프로그래밍하는 방법은 본원에 기술된 바와 같다.

본원의 명세서 및 특히 특허청구범위 및/또는 단락에 사용된 용어, 예를 들면 "포함하는", "포함된", "포함한" 등은 미국특허법에 따르는 의미를 가질 수 있고; 예를 들어, 이들 용어는 포함하는 것으로 언급된 대상과 이외의 것까지도 포함한다는 것을 의미한다. 또한, "필수적으로 이루어진"과 같은 용어 또한 미국특허법에 따르는 의미를 갖는다. 예를 들어, 이 용어는 명확하게 언급되지 않은 요소를 포함하지만 선행 기술에서 발견되거나 본 발명의 기본적인 특징 또는 새로운 특징에 영향을 미치는 요소는 배제한다는 것을 의미한다.

이들 양태 및 기타 양태들이 아래 상세한 설명에 기술되거나 명백히 나타나고 내포되어 있다.

아래의 상세한 설명은 본 발명의 예를 제시하고 있으나 본 발명을 기술된 특정 양태로만 한정하려는 의도가 있는 것은 아니며, 본원에 첨부된 도면과 병용하여 최상의 이해를 구할 수 있다.
도 1은 재프로그래밍의 유도 전(상부 패널) 및 유도 후(하부 패널)에 채집된 단핵 세포의 면역표현형검사 결과를 보여준다. 세포는 면역글로불린 G1(IgG1) 아이소타입 대조군 및 CD34에 대한 R-피코에리쓰린(RPE) Cy-5 또는 CD19에 대한 피코에리쓰린(PE)에 접합된 모노클로날 항체로 표지되었다(수직 범례). 또한, 세포는 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)에 접합된 CD45, CD38, CD61 및 IgG1 아이소타입 대조군 모노클로날 항체에 대해 염색되었다(수평 범례). 하부 패널은 CD34 및 CD34CD38-세포의 상대적 수가 증가하면서 CD45 및 CD19와 같은 백혈구 성숙 마커는 감소하는 것으로 나타남으로써 조혈 줄기 세포의 증가를 보여준다.
도 2a는 중증의 재생불량성 빈혈 환자에게 자가 HRSC의 주입 후 (1일째, 2일째, 3일째, 6일째 및 14일째) 그 환자의 말초혈액 시료의 면역표현형 검사 결과를 순차적으로 보여준다. 세포는 CD34와 CD45(두번째 수평 패널) 및 CD34와 CD38(세번째 수평 패널)에 대한 모노클로날 항체로 표지되었다. 상부 수평 패널은 전방 산란 및 측방 산란이 자가 HRSC의 유세포 분석, 골수 도말 및 테르핀 박편임을 보여준다. 1일째 내지 14일째는 거대한 전방 및 측방 산란을 갖는 세포의 증가를 보여주며 이것은 과립구의 지표이고, 1일째 내지 3일째는 순환하는 CD34 조혈 줄기 세포의 상대적 수의 증가를 보여준다. 도 2b는 중증의 자가 사람 재프로그래밍된 줄기 세포(HRSC)의 주입 후 (1일째, 2일째, 3일째, 6일재 및 14일째) 재생불량성 빈혈 환자의 말초 혈액 시료의 면역표현형 검사 결과를 순차적으로 보여준다. 세포는 CD34와 CD61(첫번째 수평 패널), CD19와 CD3(두번째 수평 패널) 및 CD33&13과 CD7(세번째 수평 패널)에 대한 모노클로날 항체로 표지되었다. FACScan 플롯은 골수성 세포의 수적 증가를 보여주고, 이것은 전구 세포를 포함하는 CD33&13 발현 세포의 점증적 증가로 나타나며, 이러한 증가는 CD7과 함께 CD33&13을 동시-발현하는 세포의 상대적 수의 증가로 나타난다. 또한, CD19 및 CD3 림프구의 상대적 수적 증가로 나타난 바와 같이 림프구의 상대적 수가 점증적으로 증가하였다.
도 3은 자가 HRSC의 주입 전 및 후의 중증의 재생불량성 빈혈 환자의 골수 분석 결과를 보여준다. 치료 전(a) 및 후(b)의 골수 도말은 적혈구 세포의 증가를 보여주고; 치료 전(c) 및 후(d)의 테르핀 박편은 골수 세포 충실성의 증가를 보여주며; HRSC의 주입 후 골수의 클론 분석은 콜로니 형성 단위 거핵세포(e), 콜로니 형성 단핵세포(f), 콜로니 형성 과립구와 대식세포(g), 및 콜로니 형성 골수세포와 적혈구(h), 및 세포집락 형성 적혈구(i)의 증가된 성장을 보여준다.
도 4는 자가 HRSC의 주입 후 4년 경과시 중증의 재생불량성 빈혈 환자의 말초 혈액 시료의 핵형 분석 및 G-분염 결과를 보여주고, 이는 유전적 이상이 없음을 보여준다.
도 5는 자가 재프로그래밍된 세포로 치료한 후 지중해빈혈 환자의 절대 평균 태아 헤모글로빈 수준이 증가하였음을 보여준다.
도 6은 자가 재프로그래밍된 세포로 치료한 후 지중해 빈혈 환자의 적혈구 세포의 평균 크기를 나타내고 펨토리터로 표시되는 평균 적혈구 용적의 증가를 보여준다.
도 7은 자가 재프로그래밍된 세포로 치료한 후 지중해 빈혈 환자의 세포당 헤모글로빈의 중량이며 피코그램으로 표시되는 평균 세포 헤모글로빈의 증가를 보여준다.
도 8은 자가 재프로그래밍된 세포로 치료한 후 지중해 빈혈 환자의 밀리리터당 나노그램으로 표시되는 혈중 페리틴 수준의 감소를 보여준다.
도 9는 자가 재프로그래밍된 세포로 치료한 후 당뇨병 환자의 금식 후 및 혼합식 급식 후의 C-펩타이드 수준의 증가를 보여준다.
도 10은 자가 재프로그래밍된 세포로 치료한 후 당뇨병 환자의 당화 헤모글로빈(HbA1C) 수준의 감소를 보여준다.
도 11은 근육위축병 환자를 자가 재프로그래밍된 세포로 치료한 후 크레아틴 포스포키나제 (CPK) 및 락테이트 데하이드로게나제 (LDH) 농도의 감소를 보여준다.
도 12는 자가 재프로그래밍된 세포로 치료한 후 근위축증 환자의 간 효소 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 수준의 감소를 보여준다.
도 13은 자가 재프로그래밍된 세포로 치료한 후 12명의 신장 질환 환자의 뇨 중 미세알부민 수준의 감소를 보여준다.
도 14는 당뇨병으로 인한 신장 질환을 앓고 있는 12명의 환자를 자가 재프로그래밍된 세포로 치료한 후 당화 헤모글로빈(HbA1C) 수준의 감소를 보여준다.
도 15a는 자가 재프로그래밍된 세포로 치료하기 전(좌측 스캔) 및 치료한 후 3개월 경과시(우측 스캔) 다발성 경화증 환자의 뇌의 자기 공명 영상(MRI) 스캔을 보여주고, 이는 줄기 세포 치료 후 병소 증가가 감소하였음을 나타낸다. 도 15b는 자가 재프로그래밍된 세포로 치료하기 전(좌측 스캔) 및 치료한 후 3개월 경과시(우측 스캔) 환자 뇌의 다른 부분의 MIR 스캔을 보여준다. 치료전을 나타낸 스캔에서 화살표는 뇌의 병소를 가리키고, 한편, 치료 후를 나타내는 스캔에서 화살표는 병소의 호전을 가리킨다.
도 16a는 자가 재프로그래밍된 세포로 치료하기 전(상부 스캔) 및 치료한 후 6개월 경과시(하부 스캔) 다발성 경화증 환자의 뇌의 자기 공명 영상(MRI) 스캔을 보여준다. 도 16b는 자가 재프로그래밍된 세포로 치료하기 전(상부 스캔) 및 치료한 후 6개월 경과시(하부 스캔) 추가적인 MRI 스캔을 보여준다. 치료전을 나타낸 스캔에서 화살표는 뇌의 병소를 가리키고, 한편, 치료 후를 나타낸 스캔에서 화살표는 병소의 호전을 가리킨다.
도 17a는 자가 재프로그래밍된 세포로 치료하기 전(좌측 스캔) 및 치료한 후 6개월 경과시(우측 스캔) 다발성 경화증 환자의 시상면 자기 공명 영상(MRI) 스캔을 보여준다. 도 17b는 자가 재프로그래밍된 세포로 치료하기 전(좌측 스캔) 및 치료한 후 6개월 경과시(우측 스캔) 척추의 횡단면 MRI 스캔을 보여준다. 치료전d을 나타낸 스캔에서 화살표는 뇌의 병소를 가리키고, 한편, 치료 후를 나타낸 스캔에서 화살표는 병소의 호전을 가리킨다.
도 18a는 C형 간염이 감염된 환자에게 자가 재프로그래밍된 세포로 치료한 후 간 효소 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ATL) 수준의 감소를 보여주고, 도 18b는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST) 수준의 감소를 보여준다.
도 19a는 자동차 사고로 인한 두부 외상을 앓고 있는 환자 뇌의 자기 공명 영상(MRI) 스캔을 보여준다. 치료 전(상부 스캔) 뇌실은 확장되어 있고 광범위하게 혈종이 산재해 있음을 보여준다. 자가 재프로그래밍된 세포로 치료 후(하부 스캔), 뇌실은 혈종의 호전과 함께 뇌실 및 대뇌구 확장의 감소와 같은 뇌 위축 변수의 감소를 보여준다. 도 19b는 환자의 치료 전(상부 스캔) 및 후(하부 스캔)에 그 환자 뇌의 추가적인 MRI 스캔을 보여준다.
도 20은 자가 재프로그래밍된 세포로 치료하기 전(좌측 X-선) 및 치료 후(우측 X-선)에 폐질환 환자의 흉부 X-선을 보여준다. 치료 후 환자는 저밀도 영역의 감소로 나타나는 호전된 폐 용적 및 감소된 병소 크기를 보여준다.
도 21은 비폐쇄성 무정자증 환자를 자가 재프로그래밍된 세포로 치료한 후 여포-자극 호르몬(fsh), 황체 형성 호르몬(lh), 프로게스테론(pro) 및 테스토스테론(test)의 성호르몬 수준을 보여준다. 이들 농도는 초음파로 결정된 정소 크기(데이터 제시되지 않음)의 증가와 함께 유리 테스토스테론의 유의적 증가를 보여준다.
도 22는 손상된 시력을 앓고 있는 환자를 자가 재프로그래밍된 세포로 치료하기 전(상부 패널) 및 치료 후(하부 패널)에 그 환자의 망막 민감도 및 시력 손상을 보여준다. 망막 민감도 결과에서, 오렌지색 영역은 감소된 망막 민감도를 가리킨다. 시력 손상 결과에서, 백색 영역은 정상적인 시력을 가리키며, 핑크색, 오렌지색 및 검정색 영역은 증가된 시력 손상을 가리킨다. 치료전의 망막 민감도에서 오렌지색 영역이 치료후에 녹색과 백색으로 변환되었고 치료전의 시력 손상에서 검정색 영역이 치료후에 백색으로 변환되었음에 따라, 치료 후 환자는 시야가 호전되었다.

정의

본원에 사용된 "수임 세포"는 분화된 특성을 나타내는 세포이다. 이들 세포는 흔히 성숙하고 특화된 것으로 고려된다. 예로는 백혈구, 적혈구, 상피세포, 뉴런 및 연골세포가 포함된다.

본원에 사용된 "비수임 세포"는 성숙한 분화 특성을 나타내지 않는 세포이다. 이들 세포는 흔히 미성숙하고 특화되지 않은 것으로 고려된다. 비수임 세포의 일례는 자기재생(무한 분열) 및 분화(특화)를 할 수 있는 미성숙 세포인 줄기 세포이다.

본원에 사용된 "재프로그래밍"은 첫번째 세포 계통의 수임 세포가 다른 세포 유형의 세포로 변화하는 과정을 가리킨다. 이러한 다른 세포 유형은 다른 세포 계통의 것일 수 있다. 재프로그래밍은 역분화, 전환분화 또는 재분화와 같은 과정을 통해 일어날 수 있다.

본원에 사용된 "재프로그래밍된 세포"는 수임 세포의 재프로그래밍을 겪은 세포이다. 재프로그래밍된 세포는 역분화 세포, 전환분화 세포 및/또는 재분화 세포를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 "역분화"는 수임 세포, 즉 성숙한 특화 세포가 거꾸로 더 원시적인 세포 단계로 돌아가는 과정이다. "역분화 세포"는 수임 세포의 역분화에 의해 발생하는 세포이다.

본원에 사용된 "전환분화"는 첫번째 세포 계통의 수임 세포가 다른 세포 유형의 다른 세포로 변화하는 과정이다. 일부 양태에서, 전환분화는 역분화와 재분화의 조합일 수 있다. "전환분화 세포"는 수임 세포의 전환분화에 의해 발생하는 세포이다. 예를 들어, 전혈 세포와 같은 수임 세포는 뉴런으로 전환분화될 수 있다.

본원에 사용된 "재분화"는 비수임 세포 또는 역분화 세포가 보다 성숙하고 특화된 세포로 분화하는 과정을 가리킨다. "재분화 세포"는 비수임 세포 또는 역분화 세포의 재분화에 의해 발생하는 세포이다. 재분화 세포가 역분화 세포의 재분화를 통해 획득되는 경우, 재분화 세포는 역분화를 겪은 수임 세포와 동일하거나 상이한 계통일 수 있다. 예를 들면, 백혈구와 같은 수임 세포는 역분화하여 만능 줄기 세포와 같은 역분화 세포를 형성할 수 있고, 이어서 역분화 세포는 재분화하여 백혈구(수임 세포)와 동일한 계통인 림프구를 형성하거나, 재분화하여 백혈구(수임 세포)와 다른 계통인 뉴런을 형성할 수 있다.

본원에 사용된 "표적 세포"는 환자에게 투여하여 조직 또는 세포를 복원 또는 보충하기 위해 획득되는 세포이다. 예를 들면, 표적 세포는 역분화 표적 세포 또는 전환분화 표적 세포와 같은 재프로그래밍된 표적 세포일 수 있으며, 이에 따라서 역분화 또는 전환분화 표적 세포는 환자에게 투여된다.

수임 세포

상기된 바와 같이, 본 발명의 수임 세포는 분화된 특성을 나타내는 세포이다. 수임 세포는 항원 제시, 포획 또는 인식과 관련된 모든 구성원을 포함할 수 있다. 예를 들어, 수임 세포는 MHC 부류 I⁺및/또는 MHC 부류 II⁺ 세포일 수 있다.

또한, 수임 세포는 미분화 세포로부터 유도된 또는 유도가능한 임의의 세포일 수 있다. 따라서, 한 가지 양태에서, 수임 세포는 또한 미분화 세포이다. 그러므로, 예를 들면, 수임 세포는 만능 줄기 세포와 관련하여 분화되는 림프성 줄기 세포 또는 골수성 줄기 세포일 수 있다.

수임 세포는 골수 또는 제대혈을 포함한 혈액 또는 관련 조직, 중추신경계 또는 말초신경계로부터의 뉴런 조직, 근육 조직 또는 피부로부터의 표피 및/또는 진피 조직(즉, 예를 들어, 구강 스크래핑을 통해)과 같은 생물 재료로부터 유도될 수 있다. 생물 재료는 출산 후 기원의 것일 수 있다.

생물 재료는 조직 유형에 적합한 것으로 본 분야에 알려진 방법을 이용하여 획득할 수 있다. 예는 이들에 한정되는 것은 아니지만 절개, 주사기 적출, 스와빙(swabbing) 성분채집술이 포함된다.

특정 양태에서, 수임 세포는 전혈 또는 이의 가공 산물(예, 혈장 또는 연막)으로부터 유도되는데 그 이유는 이들을 대상자로부터 제거하는 것이 최소의 의료 감독하에 실시할 수 있기 때문이다. 혈액 시료는 전형적으로 헤파린 또는 시트레이트와 같은 항응고제로 처리된다. 생물학적 시료 중의 세포는 특정 세포 유형을 증식시키기 위해, 특정 세포 유형을 제거하기 위해 또는 조직괴로부터 세포를 분리하기 위해 처리될 수 있다. 세포를 정제하고 분리하는데 유용한 방법은 원심분리(예, 밀도 구배 원심분리), 유세포 분석 및 친화성 크로마토그래피(예, 세포 표면 마커 또는 패닝에의 모노클로날 항체를 포함하는 자성 비드의 사용)(참조: Vettese-Dadey, The Scientist 1999, 13:21)를 포함한다. 예로서 Ficoll-Hypaque 분리가 적혈구 및 과립구를 제거하여 림프구 및 단핵구와 같은 단핵 세포를 취득하는데 유용하다.

혈액으로부터 유도될 수 있는 수임 세포의 예로는 이들에 한정되는 것은 아니지만 CFC-T 세포, CFC-B 세포, CFC-에오신 세포, CFC-Bas 세포, CFC-Bas 세포, CFC-GM 세포, CFC-M, CFC-MEG 세포, BFC-E 세포, CFC-E 세포, T 세포, B 세포, 호산구, 호염구, 호중구, 단구, 거핵 세포 및 적혈구를 포함한다.

혈액 유도된 수임 세포는 특정 항원의 발현에 의해 동정될 수 있다. 예를 들어, B 세포는 CD19⁺, CD21⁺, CD22⁺ 및 DR⁺ 세포이다. T 세포는 CD2⁺, CD3⁺ 및 CD4⁺ 또는 CD8⁺ 세포이다. 미성숙 림프구는 CD4⁺ 및 CD8⁺ 세포이다. 활성화 T 세포는 DR⁺ 세포이다. 자연 살해 세포(NK)는 CD56⁺ 및 CD16⁺ 세포이다. T 림프구는 CD7⁺ 세포이다. 백혈구는 CD45⁺ 세포이다. 과립구는 CD13⁺ 및 CD33⁺ 세포이다. 단구 대식세포는 CD14⁺ 및 DR⁺ 세포이다.

특정 양태에서, 수임 세포는 B 림프구(활성화 또는 비활성화), T 림프구(활성화 또는 비활성화), 대식세포 단핵구 계통으로부터의 세포, 부류 I 또는 부류 II 항원을 발현할 수 있는 유핵 세포, 부류 I 또는 부류 II 항원을 발현하도록 유도될 수 있는 세포 또는 제핵 세포(즉, 적혈구 세포와 같이 핵을 함유하지 않는 세포)일 수 있다.

다른 양태에서, 수임 세포는 각각이 CD56 및/또는 CD16 세포 표면 수용체를 발현하는 대과립 림프구, 공 림프구 및 자연살해세포를 포함한 세포의 그룹 중 어느 하나로부터 선택될 수 있다.

수임 세포는 필수적으로 일차 배양물이기 때문에, 세포 군체에 생존력을 유지하는데 적합한 영양분을 보충하는 것이 필요할 수 있다. 적합한 배양 조건은 본 분야의 전문가에게 잘 알려져 있다. 그러나, 세포 군체의 처리는 환자로부터 생체 시료의 제거 후 가능한 신속하게, 전형적으로 12시간 내, 바람직하게는 2 내지 4시간 내에 개시하는 것이 바람직하다. 세포 생존력은 트립판 블루 염색 배제법 또는 프로피듐 요오다이드와 같이 잘 알려진 기술을 이용하여 점검할 수 있다.

역분화 세포

역분화는 세포의 구조 및 기능에 점차적으로 변화를 일으켜 덜 특화된 세포를 생성하는 재프로그래밍 과정의 한 유형이다. 역분화는 자연히 발생할 수 있으며, 이때 세포는 조직 손상에 반응하여 생체내에서 한정된 역분화를 겪을 수 있다. 다른 방법으로서, 역분화는 미국특허원 제08/594,164호(미국특허 제6,090,625호), 미국특허원 제09/742,520호(미국특허 제7,112,440호), 미국특허원 제10/140,978호(미국특허 제7,220,412호), 미국특허원 제10/150,789호(미국특허 제7,410,773호) 및 미국특허원 제09/853,188호에 기술된 방법을 이용하여 유도할 수 있다. 상기 특허 모두는 본원에 참고로 인용된다.

본 발명의 역분화 세포는 이들에 한정되는 것은 아니지만 만능 줄기 세포, 림프성 줄기 세포, 골수성 줄기 세포, 뉴런 줄기 세포, 골격근 부수 세포, 상피 줄기 세포, 내배엽 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포 및 배아 줄기 세포를 포함할 수 있다.

특정 양태에서, 수임 세포는 혈액으로부터 유도되고 역분화되어 조혈 세포 계통의 역분화 세포를 형성한다. 이들 역분화 세포의 예로는 이들에 한정되는 것은 아니지만 만능 줄기 세포, 림프성 줄기 세포 및 골수성 줄기 세포가 포함된다.

수임 세포는 이들 세포를 세포에 작동적으로 접목하는 제제와 접촉시켜 역분화시킬 수 있다. 이어서, 세포를 배양하여 제제에 의해 작동적으로 접목된 세포가 역분화 과정을 통해 진행하여 궁극적으로 미분화되도록 한다.

접촉 단계는 수임 세포상에서 표면 항원과 접목하는 제제를 포함할 수 있다. 제제는 수임 세포와의 직접적 접목 또는 간접적 접목으로 작용할 수 있다. 직접적 접목의 예는 수임 세포가 이의 세포 표면에 하나 이상의 세포 표면 수용체를 가질 경우로서, 예로는 B 세포에 발견될 수 있는 것과 같이 동종 영역(동일한 또는 유사한 서열을 갖는 것으로 공통적으로 발견되는 영역)을 갖는 β-쇄를 들 수 있고, 이때 제제는 세포 표면 수용체와 직접적으로 접목한다. 다른 예는 수임 세포가 이의 세포 표면에 세포 표면 수용체를 갖는 경우로서, 예로는 T 세포에서 발견될 수 있는 것과 같이 동종 영역을 갖는 α-쇄를 들 수 있고, 이때 제제는 세포 표면 수용체와 직접적으로 접목한다.

간접적 접목의 예는 수임 세포가 이의 세포 표면에 적어도 둘 이상의 세포 표면 수용체를 갖는 경우이며 수용체들 중 하나와 제제의 접목은 다른 수용체에 영향을 미치고, 이어서 수임 세포의 역분화를 유도한다.

수임 세포를 역분화시키기 위한 제제는 화학적 화합물 또는 조성물일 수 있다. 예를 들어, 제제는 수임 세포의 표면에서 세포 표면 수용체와 접목할 수 있다. 특정 양태에서, 제제는 수임 세포의 표면에 존재하는 수용체(예, 수임 세포에 의해 발현될 수 있는 수용체)와 작동적으로 접목한다.

예를 들어, 제제는 이들에 한정되는 것은 아니지만 사이클릭 아데노신 모노포스페이트(cAMP), CD4 분자, CD8 분자, T-세포 수용체의 일부 또는 전부, 리간드(고정 또는 유리), 펩타이드, T-세포 수용체(TCR), 항체, 교차반응 항체, 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체를 포함할 수 있다. 또한, 성장 인자, 예를 들어 조혈 성장 인자(예, 에리쓰로포이에틴 및 과립구-단핵구 콜로니 자극 인자(GM-CSF))가 사용될 수 있다.

제제가 항체, 교차-반응 항체, 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체인 경우, 제제는 MHC 부류 II 항원의 베타-쇄, MHC HLA-DR 항원의 β-쇄, MHC 부류 I 또는 부류 II 항원의 α-쇄, HLA-DR 항원의 α-쇄, MHC 부류 II 항원 또는 MHC 부류 I 항원의 α- 및 β-쇄 중 임의의 하나 이상에 대한 항체, 교차-반응 항체, 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체 중 임의의 하나 이상일 수 있다. 항체의 예로는 CR3/43(공급사 Dako)을 들 수 있다.

용어 "항체"는 결합 활성을 유지하는 여러가지 절편(단백질분해 절단 또는 재조합 기술에 의해 유도된 것) 및 유도체(예, Fab, F(ab')₂ 및 scFv 항체)뿐만 아니라 이의 모사체 또는 생동배체를 포함할 수 있다. 또한, 예를 들면 결합을 향상시키기 위해 아미노산 잔기의 재배열에 의해 아미노산 서열을 변형시키거나, 항체가 면역 부작용의 가능성을 줄이기 위해 본 발명의 방법에 따라 치료하는데 필요한 세포의 기원이 되는 유기체와 다른 종에서 제조된, 유전자 조작 변이체(예, 인간화 마우스 모노클로날 항체)를 포함한다.

수임 세포를 역분화 세포로 변환시키는데 사용되는 제제는 바람직하게는 수임 세포의 세포 외에서 작용할 수 있다. 예를 들면, 수임 세포는 제제에 의해 작동적으로 접목할 수 있는 수용체를 포함할 수 있으며, 제제는 작동적으로 수용체와 접목한다.

예를 들면, 수용체는 세포 표면 수용체일 수 있다. 세포 표면 수용체의 구체예는 이들에 한정되는 것은 아니지만 MHC 부류 I 및 부류 II 수용체를 포함한다. 수용체는 MHC 부류 I 및 부류 II 수용체의 경우와 같이 α-성분 및/또는 β-성분을 포함할 수 있다.

수용체는 동종 영역을 갖는 β-쇄, 예를 들면 적어도 HLA-DR의 β-쇄의 동종 영역을 포함할 수 있다.

대안으로서 또는 추가적으로, 수용체는 동종 영역을 갖는 α-쇄, 예를 들면 적어도 HLA-DR의 α-쇄의 동종 영역을 포함할 수 있다. 수용체는 주 조직 적합성 복합체(MHC)의 부류 I 또는 부류 II 항원일 수 있다. 특정 양태로서, 세포 표면 수용체는 이들에 한정되는 것은 아니지만 HLA-DR 수용체, DM 수용체, DP 수용체, DQ 수용체, HLA-A 수용체, HLA-B 수용체, HLA-C 수용체, HLA-E 수용체, HLA-F 수용체 또는 HLA-G 수용체를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 세포 표면 수용체는 HLA-DR 수용체일 수 있다.

제제는 수용체에 대한 항체, 예를 들면 수용체에 대한 모노클로날 항체일 수 있다.

제제의 예는 MHC 부류 I⁺ 및/또는 MHC 부류 II⁺ 발현과 같은 MHC 유전자 발현을 조절하는 것일 수 있다.

특정 양태에서, 제조는 생체 반응 조절물질과 병용하여 사용될 수 있다. 생체 반응 조절물질의 예는 이들에 한정되는 것은 아니지만 알킬화제, 면역조절제, 성장 인자, 사이토카인, 세포 표면 수용체, 호르몬, 핵산, 뉴클레오타이드 서열, 항원 또는 펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 알킬화제는 사이클로포스포아미드일 수 있거나 포함할 수 있다.

다른 생체 반응 조절물질은 MHC 부류 I 및/또는 부류 II 항원 발현을 상향조절할 수 있고, 일부 양태에서, MHC 수용체와 결합하는 제제가 더 효과적으로 작용하도록 할 수 있는 화합물을 포함할 수 있다.

어떠한 세포 유형도 MHC 부류 I 및/또는 부류 II 항원을 발현하도록 제조될 수 있기 때문에, 세포가 부류 I 및/또는 부류 II MHC 항원을 본질적으로 발현하거나 발현하지 않거나 관계없이 아주 다양한 세포 유형을 역분화시키는 방법이 제공될 수 있다.

수임 세포는 일반적으로 제제와 적어도 2시간, 전형적으로는 2 내지 24시간, 바람직하게는 2 내지 12시간 배양한다. 배양은 전형적으로 약 실온 또는 예를 들어 약 22℃에서 약 37℃(33℃를 포함)까지의 온도 범위에서 실시한다. 역분화 과정의 진행은 소량의 시료를 분취하고 세포를 현미경 및/또는 유세포 분석을 이용하여 검사하여 주기적으로 점검할 수 있다. 다른 방법으로서, 장비가 역분화 과정의 진행을 온라인 모니터링하는 추적 수단을 포함할 수 있다.

역분화제의 사용에 추가하여, 수임 세포는 자가 혈장 또는 혈청에서 배양하거나 태아혈청 또는 말 혈청에서 배양할 수 있다. 임의로, 수임 세포는 항응고제, 킬레이트화제 또는 항생제와 함께 배양할 수 있다. 세포 배양을 위한 온도 범위는 18 내지 40℃로 확장할 수 있고, 또한 4 내지 10% CO₂ 및/또는 10 내지 35% O₂를 포함할 수 있다. 추가로, 배양은 코팅된 또는 코팅되지 않은 혈액백, 조직배양백 또는 플라스틱 용기에서 진행할 수 있다.

특정 유형의 역분화 세포는 특정 배양 조건을 이용한 역분화에 의해 획득할 수 있다. 예를 들면, 수임 세포는 이들 수임 세포를 역분화제와 배합하여 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), 비필수 아미노산(NEAA), L-글루타민(L-glu) 및 β-머캅토에탄올(2 βME)에서 배양하여 만능 세포로 역분화시킬 수 있다. 또한, 수임 세포는 처음에 킬레이트화제에 노출시킬 수 있다.

다른 예로서, 중간엽 세포를 수득하기 위해 수임 세포를 DMEM(저 글루코스) 및 L-glu 또는 DMEM (저 글루코스), L-glu, 2 βME 및 NEAA를 이용하고 역분화제(들)와 배합하여 배양할 수 있다. 추가로, 항생제 젠타마이신이 세포 배양에 사용될 수 있다.

전환분화 세포

전환분화 세포는 수임 세포를 역분화제와 배합한 조직 배양 배지에서 배양하여 획득한다. 이에 따라 수임 세포는 전환분화를 겪으면서 다른 세포 유형의 세포로 형질전환되고; 일부 양태에서, 수임 세포는 다른 계통의 세포로 형질전환된다.

전환분화를 통해 획득된 표적 세포의 유형은 배양 조건에 의해 좌우된다. 이들 조건은 배양시 사용되는 조직 배양 배지의 유형, 다양한 분화 촉진제의 존재/부재, 상이한 혈청의 존재/부재, 배양 온도, 산소 또는 이산화탄소의 존재/부재 및 컨테이너 또는 용기의 종류에 따라 다양할 수 있다.

전환분화를 위해 사용되는 조직 배양 배지의 예는 이들로 한정되는 것은 아니지만 이스코브 변형 둘베코 배지(IMDM), 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), 이글 최소 필수(EME) 배지, 알파-최소 필수 배지(α-MEM), 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(RPMI; 배지개발처) 1640, Ham-F-12, E199, MCDB, 레이보비츠 L-15, 윌리엄스 배지 E, 또는 제형된 조직 배양 배지 시판품을 포함한다.

분화촉진제는 항응고제, 킬레이트화제 및 항생제를 포함한다. 이와 같은 제제의 예는 하기 중 하나 이상일 수 있다: 비타민 및 무기물 또는 이의 유도체 [예, A(레티놀), B₃, C(아스코베이트), 아스코베이트 2-포스페이트, D₂, D₃, K, 레티노산, 니코틴아미드, 아연 또는 아연 화합물 및 칼슘 또는 칼슘 화합물]; 천연 또는 합성 호르몬(예, 하이드로코르티손 및 덱사메타손); 아미노산 또는 이의 유도체(예, L-글루타민(L-glu), 에틸렌 글리콜 테트라세트산(EGTA), 프롤린 및 비필수 아미노산(NEAA)]; β-머캅토에탄올, 디부틸 사이클릭 아데노신 모노포스페이트(db-cAMP), 모노티오글리세롤(MTG), 퓨트레신, 디메틸 설폭사이드(DMSO), 하이포크산틴, 아데닌, 포스콜린, 실로스타미드 및 3-이소부틸-1-메틸크산틴과 같은 화합물 또는 이의 유도체; 5-아자시티딘과 같은 뉴클레오시드 및 이의 유사체; 아스코르브산, 피루베이트, 오카딘산, 리놀레산, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 항응고제 시트레이트 덱스트로스 조제 A(ACDA), 디나트륨 EDTA, 나트륨 부티레이트 및 글리세로포스페이트와 같은 산 또는 이의 염; 항생제 또는 약물(예, G418, 젠타마이신, 펜톡시필린(1-(5-옥소헥실)-3,7-디메틸크산틴) 및 인도메타신); 및 조직 플라스미노겐 활성화제 (TPA)와 같은 단백질.

이들 분화 촉진제는 특정 유형의 표적 세포를 획득하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 비타민 B₃을 사용하여 섬세포와 같은 선포 세포 또는 하이드로코르티손을 생성할 수 있고; 덱사메탄손을 사용하여 중간엽 기원 또는 상피 기원의 세포(예, 신장 상피 세포, 피부 및 관련 구조체(예, 모유두 세포))를 생성할 수 있으며; β-머캅토에탄올을 사용하여 CNS의 부세포를 포함하여 뉴런 세포와 같은 외배엽 세포를 생성할 수 있다.

배양 배지는 자가 혈장; 혈소판; 태아 채혈과 같은 혈청; 또는 말 혈청과 같은 포유동물 기원의 혈청을 함유할 수 있다. 또한, 변환 과정은 혈액백, 스캐폴드, 조직배양백 또는 플라스틱 조직배양 용기 내에서 진행될 수 있다. 조직배양 용기는 흡착성 또는 비흡착성 조직배양 용기일 수 있거나, 제조하고자 하는 조직 또는 특화 세포의 필요한 유형에 따라 흡착 또는 부상분리를 촉진하는 젤리틴, 콜라겐, 매트리겔 또는 세포외 매트릭스와 같은 제제로 코팅되거나 코팅되지 않을 수 있다.

추가의 배양 조건은 약 10 내지 약 60℃, 또는 약 18 내지 약 40℃일 수 있는 온도; 약 0 내지 약 20% 또는 약 4 내지 약 10%일 수 있는 이산화탄소(CO₂) 수준; 및 약 0 내지 약 50% 또는 약 10 내지 약 35%일 수 있는 산소(O₂)를 포함한다.

표적 세포를 획득하기 위해 역분화제를 배합 사용한 방법의 예가 표 1에 기술되어 있다.

본 발명의 방법은 역분화제와 조합하여 다양한 유형의 표적 세포를 수득한다.

표적 세포 유형	역분화제와 조합으로 사용된 배양 조건	추가의 배양 조건
만능 줄기 세포 또는 만능 전구 세포의 이종군체	ㆍDMEM, NEAA, L-glu, 2βME	ㆍ킬레이트화제 또는 항응고제에 수임된 세포의 사전 노출 ㆍ전구 세포의 경우 배양 배지만으로의 희석에 의한 역분화제의 회수
중간엽 줄기 세포	ㆍDMEM(저 글루코스), L-glu; 또는 ㆍDMEM(저 글루코스), L-glu, 2βME, NEAA	ㆍ젠타마이신
ㆍ만능 생식 세포 ㆍ난모세포 ㆍ정자	ㆍRPMI 1640, 임의로 NEAA, L-glu, 2βME(난모세포의 경우); 또는 ㆍEME 배지, 레티놀, L-glu, 나트륨 피루베이트, 나트륨 락테이트, NEAA(난모세포의 경우); 또는 ㆍDMEM, Hams F12, 비타민 C, 비타민 E, 레티노산, 레티놀, 피루베이트, 임의로 펜톡시필린(정자의 경우); 또는 ㆍ상기에 열거된 만능 줄기 세포를 위한 배양 조건 및 추가적으로 다음 세로단에 수록된 배양 조건(정자 또는 난모세포의 경우)	GAIC ㆍ약 30 내지 32℃(정자) 및 약 38 내지 39℃(난모세포)에서 배양할 수 있다. ㆍ세포는 역분화 및 재분화 이전에 EDTA 및 EGT와 같은 킬레이트화제에 노출될 수 있다. ㆍ정자의 경우, 오카딘산, DMSO 및 아연 또는 아연 화합물의 첨가를 포함할 수 있고; Gamete 100을 기본 배지로서 대신 사용할 수 있다. ㆍ난모세포의 경우, dp-cAMP, 디나트륨 DETA, 포스콜린, 실로스타미드 및 하이포크산틴의 첨가를 포함할 수 있다. ㆍ난모세포의 경우, 배지 199를 기본 배지로서 대신 사용할 수 있다.
신장	ㆍDMEM, Hams F12 및 하이드로코르티손, 임의로 비타민 K; 또는 ㆍ상기에 수록된 만능 줄기 세포를 위한 배양 조건 및 하이드로코르티손
ㆍ폐포상피 ㆍ내배엽	ㆍDMEM, NEAA, L-glu, 임의로 2 βME, 니코틴아미드; 또는 ㆍ상기에 수록된 만능 줄기 세포를 위한 배양 조건 및 니코틴아미드, 및 임의로 덱사메타손, 레티노산, db-cAMP; 또는 ㆍIMDM, L-glu, 아스코르브산, MTG	ㆍ항생제 G418 및 매트리겔 코팅된 조직배양 용기
ㆍ뉴런 ㆍ외배엽	ㆍDMEM 및 Hams F12, NEAA, 2 βME, 및 임의로 푸트레신, 레티노산, L-glu, 하이드로코르티손, 아스코베이트; 또는 ㆍ상기에 수록된 만능 줄기 세포를 위한 배양 조건 및 임의로 푸트레신, 레티노산, 하이드로코르티손, 아스코베이트
ㆍ섬 세포 ㆍ선포 세포	ㆍDMEM, Hams F12, 비타민 B₃; 또는 ㆍRPMI 1640 및 비타민 B₃; 또는 ㆍ상기에 수록된 만능 줄기 세포를 위한 배양 조건 및 비타민 B₃(니코틴아미드), 및 임의로 덱사메타손
ㆍ조혈 세포	ㆍIMDM 및 임의로 하이드로코티손; 또는 ㆍIMDM, L 글루타민 및 MTG; 또는 ㆍ상기에 수록된 만능 줄기 세포를 위한 배양 조건 및 추가로 2βME 대신 사용되는 MTG 및 임의로 비타민	ㆍ배양 온도는 33℃일 수 있다. ㆍ배양 온도는 배양물에서 거핵 세포를 증폭시키기위해 실온일 수 있다. ㆍ분화 세포가 배양물에서 적혈구 전구세포의 증폭을 위해 변환전에 킬레이트화제에 노출될 수 있다. ㆍRPMI 1640이 림프구 전구세포의 증식을 위해 기본 배지로 사용될 수 있다. ㆍ나트륨 부티레이트 및/또는 5-아자시티딘이 원시성 적혈구 분화의 촉진을 위해 배양물에 첨가될 수 있다.
간세포	ㆍDMEM 또는 IMDM 또는 α-최소 필수 배지, L-glu 및 임의로 덱사메타손, L 아스코르브산-2-포스페이트 및 니코틴아미드; 또는 ㆍ윌리엄스 배지 E, 나트륨 피루베이트, 덱사메타손; 또는 ㆍ상기에 수록된 만능 줄기 세포를 위한 배양 조건 및 덱사메타손
피부/각질세포	ㆍHams F12, DMEM (배지비율 3:1), 하이드로코티손, L-glu 및 임의로 아데닌; 또는 ㆍE199 또는 DMEM 및 L-glu, 및 임의로 하이드로코티손 및 아데닌; 또는 ㆍ상기에 수록된 만능 줄기 세포를 위한 배양 조건 및 하이드로코티손, 및 임의로 칼슘 또는 칼슘 화합물 또는 아스코베이트	ㆍ항생제로서 제타마이신을 첨가할 수 있다. ㆍ36.4℃에서 배양할 수 있다.
멜라닌 세포	ㆍMCDB 및 레이보비츠 L-15, TPA 및 임의로 3-이소부틸-1-메틸크산틴; 또는 ㆍ배지 199 및 하이드로코티손
골세포/뼈	ㆍDMEM, β-글리세로포스페이트, 덱사메타손, 아스코베이트 및 L-glu 및 임의로 비타민 D₃; 또는 ㆍ상기에 수록된 만능 줄기 세포를 위한 배양 조건 및 추가로 글리세로포스페이트, 덱사메타손 및 아스코베이트 및 임의로 비타민 D₃
모유두 세포/모발	ㆍ윌리암 E 배지, L-glu, 하이드로코티손 및/또는 비타민 D₂, 아데닌 및 리놀레산; 또는 ㆍDMEM, Hams F12(기본 배지로서), L-glu, 하이드로코티손 및/또는 비타민 D₂, 아데닌 및 리놀레산; 또는 ㆍ상기에 수록된 만능 줄기 세포를 위한 배양 조건, 하이드로코티손, 비타민 D₂, 아데닌 및 리놀레산
연골세포/연골	ㆍDMEM, 피루베이트, 아스코베이트 2-포스페이트, 덱사메타손 및 프롤린; 또는 ㆍ상기에 수록된 만능 줄기 세포를 위한 배양 조건, 아스코베이트 2-포스페이트, 덱사메타손 및 프롤린
지방 세포	ㆍDMEM, 덱사메타손 및 인도메타신; 또는 ㆍ덱사메타손 및 인도메타신
골격근	ㆍDMEM, 저 글루코스 및 임의로 하이드로코티손, 덱사메타손, L-글루타민 및 나트륨 피루베이트; 또는 ㆍDMEM 및 Ham F12 또는 F10(기본 배지로서) 또는 DMEM 및 배지 199; 또는 ㆍ상기에 수록된 만능 줄기 세포를 위한 배양 조건 및 글루코스, 젠타마이신 및 저 혈청	ㆍ항생제로서 젠타마이신를 첨가할 수 있다. ㆍ저혈청 농도를 첨가할 수 있다. ㆍ젤라틴이 코팅된 배양용기를 이용할 수 있다. ㆍ39℃로 승온시킨 온도에서 배양할 수 있다. ㆍ5-아자시티딘의 첨가를 포함할 수 있다.
혈관 (내피)	ㆍDMEM, NEAA 및 2 βME; 또는 ㆍIMDM 및 덱사메타손
심근/심근 세포	ㆍ4:1 DMEM과 M199 배지 또는 DMEM (저 글루코스) 및 추가로 아스코르브산 및/또는 DMSO; 또는 ㆍ상기에 수록된 만능 줄기 세포를 위한 배양 조건 및 추가로 항-중력 배양 또는 진동 환경	ㆍ완전한 분화를 위해 젤라틴 코팅된 배양 용기 및 자가 혈청 또는 혈소판 제거된 혈장 ㆍ완전 분화를 커버 슬립 슬라이드에서 관찰할 수 있다.
영양모세포	ㆍDMEM, L-glu, 2 βME, NEAA 및 역분화제를 제외하고 동일한 배양 배지로의 연속 희석; 또는 ㆍRPMI 1640, 2 βME, 나트륨 피루베이트 및 L-글루타민	세포를 중간엽 및 외배엽 (생식줄기 세포 및 전구세포를 포함)로 분화시키는데 필요한 자가 성장 인자 및 호르몬을 생성하기 위해 사용될 수 있다.

특히, 표 1에서 각 세포 유형을 위해 기술한 배양 조건의 경우, 상응하는 배양 배지로 배양 조건을 연속 희석하여 역분화제를 제거하는 것은 더욱 증가된 전환분화를 초래한다.

배양 동안에, 여러 가지 분화 촉진제를 임의로 함유하는 배양 배지는 역분화제가 배제된 배지를 추가로 첨가하여 희석될 수 있다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니만, 희석이 분화를 증가시키는 것으로 보이는데 그 이유는 세포가 덜 조밀하고, 증식 자극 인자가 덜 농축되기 때문이다. 따라서, 배지의 첨가는 전환분화를 추가로 증가시킬 수 있으며 세포 계통내에서 어떠한 세포 유형이 획득될 수 있는가에 영향을 미칠 것이다. 예를 들면, 표적 세포가 뉴런인 경우, 배양 배지의 첨가는 뉴런 전구세포보다 더욱 성숙한 뉴런(둘다 동일한 계통에 속한다) 쪽으로 발현 이동을 초래할 수 있다. 다른 예로서, 전향 분화 골격근 전구세포는 혈청 농도를 점진적으로 감소시킴으로 달성되는 배양 배지의 연속 희석에 의해서만 분화할 것이다.

재분화 세포

역분화 세포는 이들 역분화 세포를 표적 세포 유형으로 재수임 또는 재분화시킴으로써 표적 세포를 획득하는데 사용할 수 있다. 이것은 역분화 세포를 성장 인자와 접촉시켜 수행할 수 있다. 예를 들면, 줄기 세포를 뉴런 세포로 분화시키는데 레티노산이 사용되어 왔다. 줄기 세포를 림프구 전구체로 분화시키는데 메틸셀룰로스에 후속하여 골수 기질 세포주와 IL-7과의 공동배양이 사용되어 왔다(Nisitani et al., Int Immuno 1994, 6: 909-916). Le Page(New Scientist Dec. 16, 2000)는 줄기 세포가 폐 상피 세포로 분화될 수 있음을 교시한다. Bischoff(Dev Biol 1986, 115: 129-39)는 근육 부수 세포를 성숙 근육 섬유질로 분화시키는 방법을 교시한다. 뉴런 전구 세포는 염기성 섬유아세포 성장 인자 및 표피 성장 인자에 의해 증식될 수 있다(Nakafuku and Nakamura, J Neurosci Res 1995, 41: 153-168). 조혈 줄기 세포는 GM-CSF, 에리쓰로포이에틴, 줄기 세포 인자 및 인터류킨(IL-1, IL-3, IL-6)을 포함한 많은 성장 인자를 사용하여 증식시킬 수 있다 - 여러 가지 이들 인자를 검토하기 위해 Matcalf(Nature 1989, 339: 27-30)를 참조할 수 있다.

Potocnik 등(EMBO J 1994, 13: 5274-83)은 심지어 저 산소(5%) 조건을 사용하여 줄기 세포를 조혈 세포로 분화시키는 것을 증명하였다.

재분화 세포는 역분화 세포의 기원이 되는 수임 세포와 동일한 계통일 수 있다. 다른 방법으로서, 재분화 세포는 역분화 세포의 기원이 되는 수임 세포와 다른 계통일 수 있다. 예를 들면, B 림프구는 CD34⁺CD38^- HLA-DR^- 줄기 세포로 역분화될 수 있다. 이 줄기 세포는 순차적으로 B 세포 계통(동일한 계통) 또는 림프성 계통(상이한 계통)을 따라 재분화 또는 재수임될 수 있다.

표적 세포

본 발명의 표적 세포는 상기된 바와 같이 역분화, 전환분화 또는 재분화에 의해 획득될 수 있는 재프로그래밍된 세포이다. 본 발명에 따르면, 표적 세포는 이들에 한정되는 것은 아니지만 만능 줄기 세포, 림프성 줄기 세포, 골수성 줄기 세포, 뉴런 줄기 세포, 골격근 부수 세포, 상피 줄기 세포, 내배엽 및 신경외배엽 줄기 세포, 생식 세포, 배외 및 배아 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 신장 세포, 폐포상피 세포, 내배엽 세포, 뉴런, 외배엽 세포, 섬세포, 선포세포, 난모세포, 정자, 조혈 세포, 간세포, 피부/각질세포, 멜라닌세포, 골/골세포, 모발/모유두 세포, 연골/연골세포, 지방세포, 골격근 세포, 내피 세포, 심근/심근세포 및 영양모세포를 포함한다.

상기된 바와 같이 수임 세포 및/또는 역분화 세포는 역분화 및/또는 전환분화 및/또는 재분화를 유도하는 특정 조건에서 배양하고 표적 세포를 획득한다. 수임 세포 및/또는 역분화 세포를 배양하는 기간은 특정 시간에 의해 조절되는 것이 아니라 표적 세포가 생성되었다는 결정에 의해 조절된다.

역분화, 전환분화 또는 재분화 표적 세포의 생성 결정 또는 수적 변화 결정은 계통-연관된 마커 또는 전사 인자의 발현을 하향조절하는 수임 세포의 상대적 숫자의 변화 및/또는 표적 세포의 세포 표면 마커 특징을 갖는 세포의 상대적 숫자를 모니터링함으로써 수행할 수 있다. 다른 방법으로서 또는 추가적으로서, 표적 세포에는 없고 수임 세포에서 전형적인 세포 표면 마커를 갖는 세포의 수적 감소를 모니터링할 수 있다. 예를 들면, 표적 세포는 POU5F1 (OCT-4), TERT, KLF4, UTF1, SOX2, Nanog 또는 단계-특이적 배아 마커 3 및 4(SSEA-3 및 SSEA-4), 고분자량 당단백질 TRA-1-60 및 TRA-1-81 및 알카리성 포스파타제와 같은 많은 단계-특이적 마커에 의해 특징지어지는 배아 줄기 세포일 수 있다(Andrews et al., Hybridoma 1984, 3: 347-361; Kannagi et al., EMBO J 1983, 2: 2355-2361; Fox et al., Dev Biol 1984, 103: 263-266; Ozawa et al., Cell Differ 1985, 16: 169-173). 이들은 또한 그 존재가 분화의 지표인 SSEA-1을 발현하지 않는다. 줄기 세포의 다른 유형에 대한 다른 마커들이 알려져 있으며, 예로는 신경상피 줄기 세포에 대한 네스테인을 들 수 있다(J Neurosci 985, 5: 3310). 간엽 줄기 세포는 예를 들어 SH2, SH3, CD29, CD44, CD71, CD90, CD106, CD120a 및 CD124에 대해 양성이고, CD34, CD45 및 CD14에 대해 음성이다. 만능 줄기 세포는 CD34⁺ DR^- TdT^- 세포이다(다른 유용한 마커는 CD38^- 및 CD36⁺이다). 림프성 줄기 세포는 DR⁺, CD34⁺ 및 TdT⁺ 세포이다(또한 CD38⁺). 골수성 줄기 세포는 CD34⁺, DR⁺, CD13⁺, CD33⁺, CD7⁺ 및 TdT⁺ 세포이다.

표적 세포에 대한 추가의 세포 마커는 마이크로어레이 분석을 통해 개발될 수 있다. 이 분석은 역분화되고/되거나 전환분화되고/되거나 재분화된 표적 세포로부터 RNA를 분리하고, 분리된 RNA를 색소로 표지하며, 분리된 RNA를 마이크로어레이에 하이브리드화하는 것을 포함할 수 있다. 마이크로어레이는 완전한 게놈을 나타내는 유전자 또는 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있거나 특정 기관계, 조직계, 질환, 병리 등을 겨냥한 유전자 또는 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 세포 마커는 어느 유전자/올리고뉴클레오타이드가 높은 신호 강도를 나타내는지에 의해 동정될 수 있으며, 이에 따라 표적 세포에서 상향조절되거나 하향조절된다. 그런 다음, 이 정보는 마이크로어레이 분석에 의해 동정된 마커의 존재 또는 심지어 마커의 그룹 또는 패턴를 기준으로 표적 세포를 결정하는데 응용될 수 있다.

또한 CFC 검정과 같은 많은 시험관내 검정을 이용하여 표적 세포의 확인을 수행할 수 있다(실시예 참조). 흔히, 매우 원시적인 조혈 줄기 세포는 장기배양 개시 세포(LTC-IC) 검정을 이용하여 측정한다(Eaves et al., J Tiss Cult Meth 1991, 13: 55-62). LTC-IC는 조혈작용을 5 내지 12주간 지속한다.

중추신경계, 췌장, 간, 신장, 피부 등의 세포와 같은 다른 세포 유형의 경우, 세포 배양은 표적 세포가 본 분야에 알려진 기술인 면역조직화학법, 유세포 분석, 마이크로어레이 또는 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 성상확인이 될 때까지 계속 이루어질 수 있다. 또한, 이것은 기능상 검정, 예를 들어 본 발명에서 관찰된 바와 같이 면역결핍 숙주의 이식 또는 근본적인 임상 조건의 수정 또는 완화를 포함할 수 있다.

표적 세포는 마이크로어레이 또는 RT-PCR에 의해 동정될 수 있는데 이들 검사는 표적 세포에서 새로운 계통-특이적 전사 인자, 단백질 및 신호의 획득을 보여준다. 예를 들면, 외배엽 계통의 표적 세포로 변환된 역분화 줄기 세포는 Nestin, Criptol, isl1, LHX1 및/또는 EN1과 같은 유전자를 발현할 수 있으며, 추가로 뉴런으로 분화되는 경우 신경 미세 섬유(NF)를 발현할 것이다. 한편, 내배엽 계통의 표적 세포로 변환된 세포는 sox7, sox17, Nodal, PDX1 및/또는 FOXA2와 같은 유전자를 발현할 수 있지만, 추가로 췌장 섬세포쪽으로 분화된 표적 세포는 인슐린(INS) 및 neurog3(NGN3)과 같은 유전자를 발현할 수 있다. 특히, 목적하는 표적 세포를 향한 변환은 변환을 겪은 첫번째 출발 군체와 연관된 성숙 전사 인자의 하향조절에 의해 달성될 수 있다.

또한, 표적 세포의 생성은 표적 세포의 특정한 구조적 및/또는 형태적 특징(예, 세포 모양, 크기 등)을 식별함으로써 결정할 수 있다. 본 발명의 표적 세포와 관련하여 그러한 특징은 본 분야에 알려져 있다.

일단 목적하는 세포 유형이 상대적 숫자는 적절한 수준까지 증가하고, (예를 들면, 0.1% 이상 또는 5% 이하), 생성된 변형 세포 군체는 많은 방법에 이용할 수 있다. 형성된 표적 세포(예, 만능 줄기 세포)의 수와 관련하여, 줄기 세포의 증식능을 평가하는 것이 중요하다. 비록 일부 환경하에서, 형성된 줄기 세포 또는 다른 역분화 세포의 수가 적을 수 있지만, 연구한 바에 따르면 불과 50개의 만능 조혈 줄기 세포가 공여 마우스에서 전체 조혈계를 재구성할 수 있는 것으로 나타났다. 따라서, 치료 용도는 많은 수의 세포의 형성을 필요로 하지 않는다.

또한, 수임 세포의 역분화, 전환분화 또는 재분화 표적 세포로의 변환은 약제학적 담체 또는 희석제와 혼합된 제제를 환자에게 투여함으로써 생체내에서 수행할 수 있다. 그러나, 많은 사례에서 역분화, 전환분화 또는 재분화는 시험관내/생체외에서 실시하는 것이 바람직하다.

시험관내에서 획득된 처리된 세포 군체는 최소한의 과정을 통해 후속적으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 이들 세포는 단순히 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 배합하여 줄기 세포를 필요로 하는 환자에게 투여할 수 있다.

그러나, 역분화, 전환분화 또는 재분화 표적 세포를 위해 세포 군체를 증식시키거나 세포 군체로부터 세포를 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 많은 방법을 이용하여 간편하게 실시할 수 있다(Vattese-Dadey-The Scientist 1999, 13). 예를 들면, 크로마토그래피 및/또는 유세포 분석을 이용하여 세포 표면 마커를 기초로 하여 세포를 정제할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 세포 군체에 존재하는 다른 세포(예, 기질 세포)가 줄기 세포 생존력 및 기능을 유지할 수 있기 때문에 세포 군체로부터 역분화, 전환분화 또는 재분화 표적 세포를 광범위하게 정제하는 것은 필요하지 않거나 바람직하지 않을 수 있다.

유세포 분석은 혼합된 세포 군체내에서 세포를 성상확인하고 세포를 분류하는데 신뢰성이 있고 강력한 정착된 기술이다. 따라서, 정제 또는 분리 수단은 유세포 분석기를 포함할 수 있다. 유세포 분석은 현탁액 중에 입자의 물리적 특징을 기초로 작동하며, 입자는 광선에 감지되어 구별될 수 있다. 물론 이들 입자는 세포일 수 있다. 물리적 특징은 세포 크기 및 구조를 포함하거나, 최근 수년간 상당히 각광받아 온 것으로 형광분자에 접합된 모노클로날 항체에 의해 결합되는 세포 표면 마커를 포함한다.

Kreisseg 등(J Hematother 1994, 3: 263-89)은 "항-CD34 모노클로날 항체의 이용가능성때문에 다중변수 유세포 분석이 조혈 줄기 세포 및 전구세포의 결정을 위한 도구로 선택되어 왔다"고 진술하고 있다. 또한, Kreisseg는 유세포 분석에 의해 CD34-발현 세포의 정량 및 성상확인을 위한 일반적인 기술을 기술하고 있다. 추가로, Korbling 등(Bone Marrow Transplant 1994, 13: 649-54)은 HLA-DR 발현을 기초로 하여 면역흡착에 이은 유세포 분석에 의해 CD34⁺ 세포의 정제를 교시한다. 앞서 논의된 바와 같이, CD34⁺는 줄기 세포/전구세포와 관련하여 유용한 마커이다. 또한, 다른 물리적 특징을 기초로 하여 줄기 세포를 분류하는 유세포 분석 기술이 이용가능하다. 예를 들면, Visser 등(Blood Cells 1980, 6: 391-407)은 줄기 세포가 이들의 크기 및 구조화 정도를 기초로 하여 분리될 수 있음을 교시한다. 또한, Grogan 등(Blood Cells 1980, 6: 625-44)은 생존 줄기 세포가 단순한 조혈 조직으로부터 검증가능한 고순도로 분류될 수 있음을 교시한다.

세포 표면 마커의 존재 또는 다른 물리적 성질을 기초로 세포를 선별(양성 선별)하는 것 이외에, 음성 기준을 이용하여 세포 군체를 증식시키고 정제할 수 있다. 예를 들면, CD4, CD8, CD42 및 CD3과 같은 계통 특이적 마커를 소유한 세포는 유세포 분석 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 군체로부터 제거할 수 있다.

세포를 정제하는데 매우 유용한 기술은 자성 비드에 연결된 항체 또는 다른 친화성 리간드의 사용을 포함한다. 비드를 세포 군체와 배양하며, 친화성 리간드가 결합하는 CD34와 같은 세포 표면 마커를 갖는 세포는 포획된다. 세포를 함유한 시료 튜브를, 비드가 튜브의 측면으로 끌리게 되는 자성 시료 농축기에 넣는다. 1회 이상의 세척 단계 후 해당 세포는 다른 세포로부터 부분적으로 또는 실질적으로 완전하게 정제된다. 음성 선별 방식에서 사용되는 경우, 액상을 버림으로써 비드에 결합된 세포를 세척하는 대신에, 액상은 보존하고 결과적으로 비드에 결합된 세포가 세포 군체로부터 효과적으로 제거된다.

이들 친화성 리간드-기반 정제 방법은 적합한 마커가 이미 성상확인되어 있거나 성상확인될 수 있는 어떠한 세포 유형과도 사용할 수 있다. Urbankova 등(J Chromatogr B Biomed Appl 1996, 687: 449-52)은 중력장-유동 분획법에 의한 마우스 골수 현탁액으로부터의 조혈 줄기 세포의 미량제조를 교시한다. 또한, Urbankova 등은 마우스 골수 유래의 줄기 세포가 골수중의 다른 세포보다 더 크고 이에 따라 이들을 혼합물로부터 분리하는 것이 가능하기 때문에 이들 줄기 세포의 성상확인을 위해 상기 방법을 사용하였음을 언급하고 있다. 따라서, 세포 표면 마커 이외의 다른 물리적 변수를 사용하여 줄기 세포를 정제하고 증식시킬 수 있다.

역분화, 전환분화 또는 재분화 표적 세포와 같은 재프로그래밍된 표적 세포 및/또는 본 발명의 방법에 의해 제조된 역분화, 전환분화 또는 재분화 표적 세포와 같은 정제된 재프로그래밍된 표적 세포를 포함한 세포 군체는 공지 기술을 이용하여 시험관내에서 유지시킬 수 있다. 전형적으로, 최소 성장 배지(예, Hanks, RPMI 1640, 둘베코 최소 필수 배지(DMEM) 또는 이스코브 변형 둘베코 배지)가 포유류 혈청(예, FBS) 및 임의로 자가 혈장과 함께 보충되어 사용되어 세포에 적합한 성장 환경을 제공한다. 줄기 세포는 기질세포 층과 같은 배양보조세포 층 상에서 배양될 수 있다 (Deryugina et al., Crit Rev Immunology 1993, 13: 115-150). 기질세포는 미분화 상태에서 전구세포를 유지해 주는 인자를 분비하는 것으로 알려져 있다. 줄기 세포를 위한 장기간 배양 시스템은 Dexter et al., J Cell Physiol 1977, 91: 335 및 Dexter et al., Acta Haematol 1979, 62: 299에 기술되어 있다.

예를 들어, Lebkowski 등(Transplantation 1992, 53: 1011-9)은 폴리스티렌 표면 상에 공유적으로 고정된 모노클로날 항체의 사용을 기초로 하는 기술을 이용하여 사람 CD34⁺ 조혈세포를 정제할 수 있고 이 방법에 의해 정제된 CD34⁺ 세포는 85% 이상의 생존율로 유지될 수 있음을 교시한다. 또한, Lebkowski 등(J Hematother 1993, 2: 339-42)은 사람 CD34⁺ 세포를 분리하고 배양하는 방법을 교시한다. 또한, 여러 방법을 검토하기 위해 Haylock et al., Immunomethods 1994, 5: 217-25를 참조할 수 있다.

줄기 세포를 포함한 세포 군체 및 줄기 세포를 포함한 정제된 제제는 향후 사용을 위해 동결/냉동 보존할 수 있다. 세포를 동결하고 향후 복원하는데 적합한 기술들은 본 분야에 잘 알려져 있다.

한 가지 관점으로서, 역분화, 전환분화 또는 재분화는 버피코트 혈액 시료로부터 세포로 발생하거나 그 내부에서 발생한다. 용어 "버피 코트"는 응고되지 않은 혈액을 원심분리하거나 정치해 두었을 때 적혈구층과 혈장층 사이에 형성되는 백색의 세포층을 의미한다.

치료 방법

본 발명의 재프로그래밍된 표적 세포(예, 역분화 표적 세포, 전환분화 표적 세포 및 재분화 표적 세포)는 여러 가지 성분과 배합되어 본 발명의 조성물을 생성할 수 있다. 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 배합되어 약제학적 조성물(사람용 또는 동물용일 수 있음)을 생성할 수 있다. 적합한 담체 및 희석제는 이들에 한정되는 것은 아니지만 등장 식염액(예, 인산염 완충염수)을 포함한다. 본 발명의 조성물은 직접 주사에 의해 투여될 수 있다. 조성물은 비경구, 근육내, 정맥내, 피하, 안내, 경구, 경피 투여 또는 척수내 주사를 위해 제형화될 수 있다.

표적 세포를 포함한 조성물은 주사 또는 이식에 의해 전달될 수 있다. 세포는 현탁액으로 전달되거나 천연 및/또는 합성 생체분해성 매트릭스와 같은 지지 매트릭스에 내장될 수 있다. 천연 매트릭스는 이들에 한정되는 것은 아니지만 콜라겐 매트릭스를 포함한다. 합성 생체분해성 매트릭스는 이들에 한정되는 것은 아니지만 폴리무수물 및 폴리락트산을 포함한다. 이들 매트릭스는 생체내에서 파손되기 쉬운 세포에 지지체를 제공할 수 있다.

또한, 조성물은 본 발명의 역분화, 전환분화 또는 재분화 표적 세포 및 한 가지 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체 또는 비히클을 포함할 수 있다.

또한, 전달은 통제된 전달에 의해 이루어질 수 있고, 즉, 수분 내지 수시간 또는 수일일 수 있는 기간에 걸쳐 전달 수 있다. 전달은 전신적(예, 정맥내 주사에 의해)일 수 있거나 목적하는 특정 부위로 국한될 수 있다. 세포는 리포좀 전달을 통해 생체내로 전달될 수 있다.

표적 세포는 kg 당 1 x 10⁵ 내지 1 x 10⁷ 세포의 용량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 70 kg 환자는 조직의 재건을 위해 14 x 10⁶ CD34⁺ 세포를 투여받을 수 있다. 이 용량은 본원에 수록된 표적 세포의 어떠한 조합도 해당될 수 있다.

본 발명의 방법은 다양한 질환, 병태 또는 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 이와 같은 병태는 이들에 한정되는 것은 아니지만 골수 부전, 혈액학적 병태, 재생불량성 빈혈, 베타-지중해 빈혈, 당뇨병, 운동 뉴런 질환, 파킨슨병, 척수 손상, 근위축증, 신장 질환, 간질환, 다발성 경화증, 울혈성 심부전증, C형 간염 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 두부 외상, 폐질환, 우울증, 비폐색성 무정자증, 남성 갱년기, 폐경과 불임, 회춘, 강피성 궤양, 건선, 주름, 간 경변증, 자가면역 질환, 탈모, 망막 색 소변성증, 및 결정 이영양증/실명 또는 기타 조직 퇴행과 연관된 장애를 포함한다.

재생불량성 빈혈은 범혈구 감소증 및 저세포성 골수로 나타나는 희귀하지만 치명적인 골수 장애이다(Young et al., Blood 2006, 108: 2509-2519). 이 장애는 Th1 사이토카인, 특히 조혈 줄기 세포 분획을 표적으로 하는 γ-인터페론을 발현하는 활성화된 I형 세포독성 T 세포에 의한 면역-매개 병태생리로 인해 골수 부전이 유도되고 결국 범혈구 감소증이 초래되어 발생할 수 있다(Bacigalupo et al., Hematology 2007, 23-28). 재생불량성 빈혈 환자의 대부분은 HLA-일치 형제로부터 획득한 줄기 세포 이식으로 치료될 수 있지만(Locasciulli et al., Haematologica. 2007; 92:11-18), 이 방법을 고령 환자나 가족 공여자가 없는 환자에게까지 적용하는 것은 상당한 도전에 직면해 있다. HLA-일치 동종 줄기 세포 이식 후 합리적인 생존율에도 불구하고, 이 절차는 이식편대숙주(GVDH) 질환을 예방하는데 사용되는 면역억제 요법에 의한 일부 잠재적 위험을 안고 있다. 예를 들면, 항흉선세포 글로불린(ATG)과 함께 또는 없이 사용되는 고용량의 사이클로포스포아미드는 장기간의 면역억제를 초래하고 환자가 기회 감염에 잘 걸리게 한다. 다른 잠재적 위험은 줄기 세포 이식 후 수주 또는 수개월에 발병할 수 있는 이식 부전이다(Gottdiener et al., Arch Intern Med 1981, 141: 758-763; Sanders et al., Semin Hematol 1991, 28: 244-249). 게다가, 이식 부전의 위험은 줄기 세포 이식 이전에 받는 수혈 횟수만큼 증가한다.

지중해빈혈은 헤모글로빈을 구성하는 글로빈 쇄 중 하나의 합성 비율이 감소하여 나타나는 유전성 상염색체성 열성 혈액 질환이다. 따라서, 조절 유전자의 돌연변이가 주 원인이 되어 비정상적인 헤모글로빈 분자가 형성되고 정상적인 글로빈 단백질은 생성량이 적어 결국 빈혈이 발병한다. 지중해빈혈의 다른 유형은 알파 지중해빈혈, 베타 지중해빈혈 및 델타 지중해빈혈을 포함하며, 각각 알파 글로빈, 베타 글로빈 및 델타 글로빈의 생성에 영향을 미친다. 치료법은 만성 수혈, 철 킬레이트화, 비장적출 및 동종 조혈세포이식을 포함한다. 그러나, 만성 수혈은 HLA-일치 골수 공여자가 없기 때문에 대부분의 환자에게 적용되지 않고 있는 한편, 동종 조혈 세포 이식은 감염 및 이식편대숙주 질환과 같은 많은 합병증의 가능성이 연루되어 있다.

당뇨병은 비정상적인 고혈당 수준을 유발하는 증후군(고혈당증)이다. 당뇨병은 체내의 인슐린 분비 또는 인슐린 작용에서 결함이 생겨 고혈당 수준을 초래하는 일군의 질환을 가리킨다. 당뇨병은 전형적으로 두가지 유형으로 나뉜다: 1형 당뇨병은 인슐린의 감소된 생성으로 나타나고, 2형 당뇨병은 인슐린의 효과에 대한 내성으로 나타난다. 두 유형 모두 고혈당증을 유발하며 당뇨병과 일반적으로 연관된 증세(예, 과도한 뇨생성, 결과적인 보상적갈증 및 증가된 유액흡수, 흐릿한 시력, 설명되지 않는 체중감소, 무기력 및 에너지대사의 변화)를 발생한다. 당뇨병은 난치성 만성 질환으로 고려된다. 치료 옵션은 인슐린 주사, 운동, 적당한 식이요법 또는 2형 당뇨병 환자의 경우 일부 약물(예, 췌장에 의한 인슐린 분비를 촉진하고, 간에 의해 생성되는 글루코스를 감소시키며, 인슐린에 대한 세포의 민감성을 증가시키는 약물 등)로 한정된다.

운동 뉴런 질환은 운동 뉴런에 영향을 미치는 일군의 신경학적 장애를 가리킨다. 이러한 질환은 근위축성 측색 경화증(ALS), 원발성 측색 경화증(PLS) 및 진행성 근위축증(PMA)을 포함한다. ALS는 상위 운동 뉴런 및 하위 운동 뉴런 모두의 퇴행으로 나타나며, 이러한 퇴행은 근육으로의 메시지를 중단시키고 결과적으로 근육의 약화 및 종국적으로 위축을 초래한다. PLS는 상위 운동 뉴런에만 영향을 미쳐 균형의 곤란성, 각약증, 하지강직, 경직 또는 언어장애을 유발하는 희귀한 운동 뉴런 질환이다. PMA는 하지 운동 뉴런에만 영향을 미쳐 근위축, 섬유속연축 및 근력약화를 초래하는 ALS의 아형이다. 운동 뉴런 질환을 치료하는 알려진 방법은 없다. 운동 뉴런의 손상을 감소시켜 주는 것으로 알려져 있는 릴루졸(Riluzole)이 ALS 치료 약물로 승인되었지만, 이 약물은 ALS를 호전시킨다기보다는 ALS의 진행을 늦춰주는 것이다. PLS의 치료법은 경직을 감소시킬 수 있는 바클로펜 또는 경련을 줄일 수 있는 퀴닌과 같이 증상을 관리하는데 불과하다.

파킨슨병(PD)은 흑질내 도파민 작동성 뉴런의 퇴행으로부터 기인하는 흑질선상체 경로의 유실로 나타나는 신경퇴행성 장애이다. PD의 원인은 알려져 있지 않지만 운동 장애를 포함하여 도파민작용성(티로신 하이드록실라제(TH) 양성) 중뇌 뉴런의 점진적 사멸과 연관이 있다. 따라서, PD는 특징적으로 근육 경직, 떨림, 운동완서 및 잠복적 운동불능으로 나타난다. 이에, 파킨슨병 또는 이의 증세를 만족스럽게 예방하거나 치료할 수 있는 방법은 현재 존재하지 않는다. 파킨슨병-연관된 운동 장애의 대증요법은 디하이드록시페닐알라닌(L-DOPA)의 경구 투여를 포함하며, 이 물질은 운동 기능의 실질적인 호전을 유도할 수 있으나 도파민작용성 뉴런의 퇴행이 진행되면서 그 효과가 감소된다. 다른 전략은 선조체내로 이식된 세포로부터 공급된 도파민이 유실된 흑실선상체 세포를 대체할 수 있다는 착상에 기초를 두고 있는 신경 이식 및 L-DOPA를 제공하는 효소를 도입함으로써 영향받는 선조체에서 도파민을 대체하기 위해 또는 TH-양성 신경이 사멸하지 않도록 방지하거나 손상된 흑질선상체계의 재생 및 기능 회복을 자극할 수 있는 잠재적 신경보호 분자를 도입함으로써 도파민 합성을 대체하기 위해 이용될 수 있는 유전자 요법을 포함한다.

척수 손상은 특징적으로 척수 및 특히 신경 섬유의 손상으로 인하여 손상 부위 아래의 일부 또는 모든 근육 또는 신경에 장애가 발생하는 것으로 나타난다. 이러한 손상은 척수의 외상을 통해 발생하여 하나 이상의 척추뼈에 골절, 탈구, 균열 또는 압박을 일으킬 수 있거나 관절염, 암, 염증 또는 디스크 퇴행에 의해 유발된 비외상성 손상을 통해 발생할 수 있다. 척수 손상 후 치료는 신경 세포의 손상을 줄이고 손상 부위의 염증을 감소시키는 코르티코스테로이드인 메틸프레드니솔론과 같은 약물 또는 통증 및 근위축을 조절하는 약물뿐만 아니라 척수의 고정 또는 탈출된 디스크 또는 척수에 손상을 입힐 수 있는 모든 대상물을 제거하는 수술을 포함할 수 있으나, 척수 손상을 회복시킬 수 있는 것으로 알려진 수단은 아직 없다.

근위축증(MD)은 골격근을 약화시키는 일군의 근육 유전병을 가리킨다. MD는 특징적으로 진행성 근육 약화, 근육 단백질 결손, 근육 세포 아포토시스 및 조직 위축으로 나타난다. 비록 9 가지 질환(뒤시엔느 근위축, 베커 근위축, 사지연결근육퇴행위축, 선천성 근위축, 얼굴어깨위팔근육퇴행위축, 근육긴장퇴행위축, 눈인두근육퇴행위축, 원위근영양증 및 에밀리드레퓨스 근위축)이 MD로 분류되어 있지만 MD 특징을 나타내는 질환은 100 가지도 넘는다. MD에 대한 어떠한 특정 치료 방법도 전혀 알려져 있지 않다. 물리 치료요법이 근육장도를 유지해 줄 수 있으며 수술을 이용하여 삶의 질을 개선할 수 있다. 또한, 근긴장증과 같은 증상은 약물로 치료될 수 있으나 장기간 치료요법은 없다.

신장 질환은 신장에 손상을 입히고 신장 기능(혈액으로부터 노폐물 및 과량의 물의 제거, 전해질, 혈압, 산-염기 균형의 조절 및 글루코스와 아미노산의 재흡수를 포함)을 저하시키는 병태를 가리킨다. 신장 질환의 두 가지 주된 원인은 당뇨병과 고혈압이며, 다른 원인으로는 사구체신염, 루푸스 및 신장의 기형 및 장애가 포함된다. 신장 질환의 치료법은 없으며, 이에 따라 치료는 혈당 및 고혈압을 조절하고 식이요법을 모니터링함으로써 질환의 진행을 완화시키고 질환의 원인을 치료하고; 예를 들면 체액저류, 빈혈, 골 질환을 관리하여 질환의 합병증을 치료하며; 투석 또는 이식을 통해 상실된 신장 기능을 회복시키는데 초점을 두고 있다.

다발성 경화증은 면역계가 중추신경계를 공격하여 탈수초를 유도하는 자가면역 병태이다. MS는 체내의 면역체계가 뉴런 축삭돌기를 애워싸는 마이엘린을 공격하고 손상을 입히기 때문 뇌 및 척수의 신경 세포가 서로 교신하는 능력에 영향을 미친다. 마이엘린이 손실된 경우, 축삭돌기는 더 이상 신호를 효과적으로 보낼 수가 없다. 이것은 다양한 신경학적 증상을 초래할 수 있고 이들 증상은 보통 신체적 및 인지적 장애로 발전한다. MS에 대해 알려진 치료 방법은 없고; 치료법은 공격(MS 증상의 급작스러운 발생 또는 악화) 후 기능을 회복시키고, 새로운 공격 및 장애를 예방하는 시도이다. 예를 들어, 코르티코스테로이드로의 치료는 공격을 중단시키는 역할을 할 수 있는 한편, 최초 공격시에 인터페론으로의 치료는 임상적 MS가 발생할 확률을 감소시켜 주는 것으로 밝혀져 있다.

사람 면역결핍 바이러스(HIV)는 면역체계가 작동하지 못하는 병태인 후천성 면역결핍 증후군(AIDS)을 유발할 수 있는 렌티바이러스이다. HIV는 사람 면역체계에서 살아있는 세포(예, 헬퍼 T 세포, 대식세포 및 수지상 세포)를 주로 감염시킨다. HIV 감염은 감염 세포의 직접적인 바이러스 사멸에 의한, 감염 세포의 아포토시스 비율 증가에 의한 또는 감염 세포를 인식하는 CD8 세포독성 림프구에 의해 감염된 CD4⁺ T 세포의 사멸에 의한 CD4⁺ T 세포의 낮은 수준을 초래한다. 현재, HIV 또는 AIDS에 대한 백신이나 치료법은 없다. HIV 감염의 치료는 고도로 활성인 항레트로바이러스 치료요법(HAART)으로 이루어진다. 현재 HAART 옵션은 적어도 2 가지 유형의 항레트로바이러스제들 중 3 가지 이상의 약물로 구성된 배합물(또는 "칵테일")이다. 전형적으로, 이들 부류는 2 가지의 뉴클레오사이드 동족체 역전사효소 억제제(NARTI 또는 NRTI)에 프로테아제 억제제 또는 비뉴클레오사이드 역전사효소 억제제(NNRTI)가 추가된 것이다.

울혈성 심부전은 심장이 충분한 혈액을 체내의 다른 기관으로 펌핑할 수 없는 병태를 가리킨다. 이 병태는 관상 동맥 질환, 심근경색에 의해 발생된 심장의 반흔조직, 고혈압, 심장판막증, 심장병 및 심장판막감염이 원인일 수 있다. 치료 프로그램은 전형적으로 휴식, 적절한 식이요법, 일상활동의 변화 및 약물(예, 안지오텐신-전환 효소(ACE) 억제제, 베타 차단제, 디기탈리스, 이뇨제, 혈관확장제)로 구성된다. 그러나, 치료 프로그램은 심장의 손상 또는 병태를 회복시켜 주지 못한다.

C형 간염은 C형 간염 바이러스에 의해 간에서 발생되는 감염성 질환이다. C형 간염은 상처(섬유증) 및 진전된 상처(경변증)로 진행할 수 있다. 간경변증은 간부전 및 기타 합병증(예, 간암)을 발생시킬 수 있다. 현재의 치료는 페길화 인터페론 알파와 항바이러스 약물 리바비린의 배합물을 사용한다. 성공률은 바이러스 유전형에 따라 50 내지 80%로 다양할 수 있다.

두부 외상은 뇌 손상을 일으킬 수 있거나 그렇지 않은 두부의 손상을 가리킨다. 두부 외상의 흔한 원인은 교통 사고, 가정 및 업무상 재해, 추락 및 폭행이 포함된다. 두부 외상으로부터 두개골 골절, 두피열상, 경막하혈종 (경막 아래 출혈), 경막외혈종(경막과 두개골 사이에 출혈), 뇌 좌상(뇌 타박상), 뇌진탕(외상에 의한 일시적 기능 상실), 혼수 또는 심지어 사망을 포함하는 다양한 유형의 문제가 발생될 수 있다. 두부 외상의 치료는 손상 유형에 따라 다양할 수 있다. 만일 뇌가 손상된 경우, 신속하게 뇌 손상을 치유할 방법은 없으며, 흔히 뇌 손상은 이용되고 있는 치료 방법에 의해서 원상회복될 수는 없다.

폐질환은 폐, 흉강, 기관지, 기관, 상기도 및 호흡 관장 신경 및 근육을 포함하는 호흡기계의 질환을 총칭하는 용어이다. 폐질환의 예는 기관지 협착에 의한 폐색성 폐질환; 폐탄성이 상실되어 불완전한 폐확장이 발생되고 폐의 경직성이 증가하여 초래되는 억제성 또는 섬유성 폐질환; 흔히 찬 공기 또는 폐렴에 의해 발생될 수 있는 기도 감염; 암에 의해 발생된 것과 같은 호흡기 종양; 흉강 질환; 및 폐순환에 영향을 미치는 폐혈관 질환을 포함한다. 폐질환의 치료는 질환의 유형에 따라 다양하지만 코르티코스테로이드 및 항생제와 같은 약물, 산소, 기계적 인공호흡, 방사선요법 및 수술이 포함될 수 있다.

우울증은 특징적으로 저하된 기분과 함께 낮은 자존감 및 정상적으로 유쾌한 활동에 흥미 또는 즐거움의 상실이 동반되어 나타나는 정신 장애이다. 생물학적으로, 우울증은 세로토닌의 출처가 되는 대뇌줄기의 소핵 그룹인 솔기핵; 수면/각성 사이클과 같은 생체리듬을 조절하는 시교차상핵; 다양한 스트레스에 대한 신체 반응 동안에 활성화되는 연쇄 구조체인 시상하부-뇌하수체-부신피질 축; 뇌의 "보상" 회로를 담당하는 것으로 알려진 복측피개영역; 보상, 호의, 쾌락, 탐닉 및 공포에 역할을 하는 것으로 고려되는 중경의지핵; 및 부정적인 경험에 의해 활성화되는 전두대상피질을 포함한 뇌의 많은 부분에서 변형된 활동을 동반한다. 우울증의 치료는 뇌의 세포외 세로토닌 양을 증가시키는 항우울제, 운동 및 정신치료가 포함된다. 그러나, 이들 치료의 효능은 여전히 의문이다.

비폐색성 무정자증은 남성의 정자형성에 문제가 있어 정액에 존재하는 정자가 측정할 수 없는 수준인 병태이다. 이것은 흔히 호르몬 불균형에 그 원인이 있으며 이러한 불균형을 회복하는 약물을 이용하여 치료할 수 있다.

남성 갱년기는 호르몬 테스토스테론 및 데하이드로에피안드로스테론의 생성 감소로 인하여 중년 남성이 겪는 폐경-유사 병태이다. 치료는 호르몬 대체 요법 및 운동을 포함한다.

강피증은 결합조직에 영향을 미치는 만성 자가면역 질환이다. 비록 경피증이 전신의 결합조직에 영향을 미칠 수 있으나, 이 질환에서 피부의 경화가 시각적으로 가장 두드러진 증세이다. 강피증의 직접적인 치료 방법은 알려진 것이 없다.

건선은 붉은 비늘이 피부에 나타나는 만성 자가면역 질환이다. 건선의 원인은 피부 세포의 과도한 성장과 연관이 있다. 한 가지 가설은 건선이 T-세포와 연관이 있음을 제시하는데, T-세포는 진피로 이동하여 사이토카인의 분비를 유도하고 사이토카인은 피부 세포를 급격히 생성한다는 것이다. 건선의 치료로는 T-세포를 표적화하는 약물이 포함된다.

망막 색소 변성증은 비정상적인 광 수용기 또는 망막 색소 상피로 시력을 상실하는 진행성 망막 형성 장애이다. 망막 색소 변성증의 치료는 제한적이다.

본원에 기술된 병태는 표적 세포의 특정 유형 또는 이들 유형의 조합으로 치료할 수 있다. 바람직한 양태에서, 본원에 기술된 병태는 표 2에 수록된 세포 유형의 주입에 의해 치료될 수 있다.

재프로그래밍된(즉, 역분화 또는 전환분화 또는 재분화) 표적 세포를 이용한 각종 병태의 치료요법

병태	치료 세포 유형(단종 또는 이의 조합)
재생불량성 빈혈	조혈 세포
베타-지중해 빈혈	조혈 세포
당뇨병	간엽 줄기 세포, 만능 줄기 세포 및/또는 섬세포
운동 뉴런 질환	만능 줄기 세포, 폐포 상피 세포, 외배엽 세포 및/또는 뉴런
파킨슨병	만능 줄기 세포 및/또는 뉴런
척수 손상	만능 줄기 세포 및/또는 뉴런
근위축증	만능 줄기 세포, 간엽 줄기 세포 및/또는 골격근 세포
신장 질환	신장 세포, 간엽줄기 세포 및/또는 만능 줄기 세포
다발성 경화증	만능 줄기 세포, 간엽 줄기 세포 및/또는 뉴런
울혈성 심부전증	심근 세포, 간엽 줄기 세포, 만능 줄기 세포 및/또는 내피세포
C형 간염 바이러스	조혈 세포, 만능 줄기 세포, 간엽 줄기 세포 및/또는 간세포
인간 면역결핍 바이러스	조혈 세포
두부 외상	만능 줄기 세포 및/또는 뉴런
폐질환	만능 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 폐포 상피 세포 및/또는 내피 세포
우울증	만능 줄기 세포 및/또는 뉴런
비폐색성 무정자증 또는 남성 갱년기	만능 줄기 세포, 만능 생식 세포 및/또는 정자
폐경과 불임	만능 줄기 세포, 난모세포, 만능 생식 세포
회춘	만능생식세포, 만능 줄기 세포, 각질 세포, 모유두세포, 뉴런, 정자, 난모세포, 연골 세포, 심근 세포, 골격근 세포, 뉴런, 내피 세포 및/또는 멜라닌 세포
강피성 궤양	만능 줄기 세포, 내피 세포, 각질세포 및/또는 간엽 줄기 세포
건선	간엽 줄기 세포 또는 만능 줄기 세포
주름	간엽 줄기 세포, 각질 세포 및/또는 만능 줄기 세포
간 경변증	간세포, 간엽 줄기 세포, 내배엽 세포, 만능 줄기 세포
자가면역 질환	간엽 줄기 세포 및/또는 만능 줄기 세포
탈모	모유두세포 및/또는 멜라닌 세포
망막 색소 변성증 또는 결정 이영양증/실명	뉴런 및/또는 만능 줄기 세포

예로서, 상기 병태의 환자는 아래의 단계를 통해 치료할 수 있다:

1) 피스툴라-캐뉼라(Fistula-cannula)를 환자의 팔에 삽입한다;

2) COBE^® 스펙트라 장치(Gambro PCT)와 같은 자동화 시스템을 이용하여 성분채집술로 백혈구를 수집한다;

3) 환자의 백혈구로부터 자가 역분화 줄기 세포를 생성한다;

4) 자가 역분화 줄기 세포를 세척한 다음 환자에게 정맥내 주입한다;

5) 혈액시험 및 상처부위 평가를 포함하여 환자의 진행을 모니터링한다.

본 발명은 본 발명을 추가로 설명하는 하기 비제한적 실시예에 의해 보다 자세히 설명되지만, 이들 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 의도되거나 해석해서는 안된다.

실시예

실시예 1

재료 및 방법

본 임상연구는 조혈 유도 배양 조건을 재생불량성빈혈 환자 4명에게 노출한 후 자가 3시간 재프로그래밍된 세포의 일회 용량 주입에 대한 안전성을 평가하였다.

본 임상연구는 킹 에드워드 메모리얼(KEM) 병원의 윤리 위원회에 의해 승인되었으며 인스티튜트 오브 이뮤노헤마톨로지(IIH)와 공동 연구로 수행되었다. 환자는 표 3에 수록된 기준을 절대적으로 충족하였다. 결과적으로, 중증 빈혈환자 (남성 3명)와 저형성성 빈혈환자(여성 1명)의 4명의 환자가 본 연구에 참여하였다. 이들 4명의 환자는 IIH/KEM 스태프에 의해 선발되고 모니터링되었다. 환자의 임상 및 치료 전력은 표 4에 기술되어 있으며, 이들의 CD34⁺ 세포 주입 용량은 표 5에 수록되어 있다.

포함 기준

각각의 기준이 요구됨	1 - 절대 호중구 수<0.5x10⁹/L
	2 - 혈소판 수<20x10⁹/L
	3 - 1% 미만의 교정 망상적혈구에 의한 빈혈
이들 기준 중 한 가지 기준만이 요구됨	4 - 25% 미만의 골수 세포 충실성
	5 - 30% 미만의 조혈세포와 50% 미만의 골수 세포 충실성
	6 - 진단 후 3개월내에 환자 평가
	7 - 사전 면역억제 치료요법을 받지 않은 환자

2 단위의 조사된 적혈구 팩 및 4 단위의 혈소판을 환자에 수혈하여 헤모글로빈 수준을 8 g/dl 이상으로, 혈소판수를 50,000 이상으로 유지하였다. Cobe Spectra 성분채집 기기 및 백혈구 분리 키트(둘 다 Gambro BCT로부터 구입)를 이용하여 환자의 혈액 총량을 2 내지 3회 처리하여 성분채집하였다. 성분채집은 경정맥 및 주피정맥에 내강이 한개인 카테터를 주입하여 실시되었다.

150 내지 200 ml의 버피 코트를 수집한 후 CD34 분석을 위해 세포 분획을 무균적으로 수거하였다. 이후, 버피 코트를 조혈 유도 배양 조건하에 재프로그래밍하였다. 요약하면, 재프로그래밍 절차는 무균적으로 백혈구 백내로 이스코브 변형 배지 30 ml에 희석된 정제된 CR3/43 1000 ㎍(DakoCytomation for TriStem Corp.에 의해 특별히 제조됨)을 첨가하는 것을 포함한다. 이어서, 백을 37℃ 및 5% CO₂로 설정된 멸균 조직 배양기에서 3시간 동안 배양하였다. 재프로그래밍 과정의 종료 후, 변환된 세포를 CD34⁺ 세포 함량에 대해 분석하였다. 그런 후, COBE 세포 프로세서 2991을 사용하여 세포를 식염수로 2회 세척하였다. 식염수에서 진탕 및 재현탁한 후, 세포 현탁액을 주입 세트를 이용하여 중력하에 경정맥을 통해 환자에 주입하였다. 자가 재프로그래밍된 세포의 주입 전 및 주입 후에 환자의 CBC 수를 포함한 활력징후를 계속적으로 모니터링하였다.

자가 사람 재프로그래밍된 줄기 세포(HRSC) 주입까지의 재생불량성 빈혈 환자의 임상 및 치료 전력

환자	HRSC 주입까지의 임상 전력	HRSC 주입까지의 치료
환자 A 25세 남성 중증의 재생불량성 빈혈	ㆍ2002년에 SAA로 진단 ㆍ쇠약 증세 및 호흡 곤란 증세를 보임 ㆍ직장 및 잇몸 출혈 및 구토의 빈번한 발생 ㆍ매달 4 단위의 혈액 및 2 단위의 혈소판을 수혈받음 ㆍ중증의 안구 충혈과 함께 황달 증상을 보임	ㆍ단백동화 스테로이드 (TabMenabol을 8개월 투약받았으나 유의적으로 전혀 호전되지 않음
환자 B 26세 여성 저형성성빈혈	ㆍ2004년 1월에 저형성성빈혈로 진단 ㆍ6개월 내내 빈발월경의 출현 ㆍ4 단위의 적혈구 팩 및 6 단위의 혈소판이 수혈된 단독 사전 RSC 주입 환자	ㆍRSC 주입 이전에 3개월간 Haematics 투약받았으나 전혀 반응이 없음
환자 C 19세 남성 최중증의 재생불량성 빈혈	ㆍ2003년 최중증 재생불량성 빈혈로 진단 ㆍ빈혈, 쇠약증, 운동시 호흡곤란을 보임 ㆍ중증의 호중성백혈구감소증으로 인하여 10 내지 15일간 지속적인 발열과 오한 ㆍ감염, 구토 및 자반의 다수 발생 둔부 농양 ㆍ뇌출혈로 인한 2회 기절 ㆍ매2주마다 5 단위의 혈액과 2 단위의 혈소판을 수혈받음	ㆍ2003년 3월을 마지막으로 6개월간 사이클로스포린 치료요법을 받았으나 효과가 전혀 없었음
환자 D 35세 남성 최중증의 재생불량성 빈혈	ㆍ빈혈, 쇠약증, 호흡곤란 ㆍ중증의 호중성백혈구감소증인한 발열과 함께 오한 및 다수의 감염과 출혈 발생 ㆍ3년전 진단 ㆍ매월 4 단위의 혈액과 2 단위의 혈소판을 수혈받음	ㆍ사이클로스포린 및 항-결핵 치료요법을 받음 6개월의 면역 억제에 반응이 없었음

모든 임상 모니터링은 IIH/KEM 스태프에 의해 실시되었다. 수혈 요건은 어떠한 단위의 혈액 제제를 수혈받은 후 얻은 수혈 기록으로부터 수혈 전후에 결정되었다. 수혈 단위는 환자 및 증인으로서 직계가족의 동의를 얻은 후에만 이용된다. 환자에게 수혈하기 전에 모든 혈액 제제는 타타 메모리얼 병원에서 조사되었다. 또한, 환자는 재프로그래밍 세포의 주입 전 및 후에 행복에 관하여 설문을 받았다. 모든 환자는 자신의 병태 및 모든 실험적 및 임상적 추적 관찰에 대한 원복 기록 또는 사본을 받았다. 이들 환자의 모니터링 기간은 처음에 2년으로 정하였으나 연장되었다. 수혈 후 첫 달동안 환자들은 병원의 무균양압실에 입원하였다.

환자, 주입 날짜, 체중 및 신장, 수집된 단핵 세포 및 주입된 CD34⁺ 세포

환자 ID 및 주입 날짜	체중	신장	채집된 단핵세포	주입된 CD34⁺/kg
환자 A 7/6/2004	48	152	1x10⁹	11.7x10⁶
환자 B 7/14/2004	38	153	3.6x10⁹	20x10⁶
환자 C 7/27/2004	52	166	3.9x10⁹	25x10⁶
환자 D 8/17/2004	52.5	160	4.3x10⁹	23x10⁶

아래와 같은 패널의 모노클로날 항체를 이용하여 백만개의 세포를 제조사의 지침에 따라 염색하였다(모든 항체는 DakoCytomation 제품이다):

패널 1 - 아이소타입 음성 대조군 IgG1-FITC, IgG1-PE-Cy5 및 IgG1-RPE 접합체로 구성됨

패널 2 - 항-인간 CD45-FITC 및 CD34-RPE-Cy5로 구성됨

패널 3 - 항-인간 CD38-FITC 및 CD34-RPE-Cy5로 구성됨

패널 4 - CD61-FITC 및 CD34-RPE-Cy5로 구성됨

패널 5 - CD33/13 RPE 및 CD7-FITC로 구성됨

패널 6 - CD45 및 글리코포린-A-RPE로 구성됨

패널 7 - CD3-FITC 및 CD19-RPE로 구성됨.

세포 분석은 BD cell Quest 소프트웨어를 이용한 FACSCalibur 시스템(BD bioscience)으로 수행하였다.

클론 검정을 위해, 재프로그래밍된 세포의 주입 전 및 후에 환자의 골수 단핵 세포(MNC)를 제조사의 지침에 따라 (Stem Cell Technologies) 재조합 성장 인자가 보충된 Methocult GFH4434에 접종하였다. 위상차 도립현미경을 이용하여 조혈 세포 콜로니로의 분화를 경과시간에 따라 점수로 평가하였다.

환자의 CBC, 간효소 및 헤모글로빈 변이체를 절차 전 및 후에 연속적으로 모니터링하였다. 환자의 퇴원 후 재검증 목적으로 독립 연구소에서 CBC, 간효소, 헤모글로빈 변이체 및 말초혈액 핵형 및 G-분염을 모니터링하였다. 이들 시험은 자가 재프로그래밍된 세포의 주입 후 빈번히 실시하였다.

자가 재프로그래밍된 세포의 주입 전 및 후에 말초혈액 시료 및 골수 세포를 분석하였다. 이 시험은 최초 1년 동안 6개월 간격으로 그리고 자가 재프로그래밍된 줄기 세포 치료요법의 개시 후 2년 경과시 매년 반복하였다. 또한, 세포의 안정성을 파악하기 위해 재프로그래밍된 세포를 주입 전에 분석하였고, 추가로 3시간 변환 단계 후뿐만 아니라 변환 세포의 최대 1개월간의 배양 후에도 실시하였다. 핵형 및 G-분염은 제3의 독립 연구소에서 모니터링하였다.

자가 재프로그래밍된 세포의 주입 전 및 후에 골수 도말 및 천공 절단을 실시하였다. 이 시험은 자가 재프로그래밍된 세포의 주입 후 14 내지 20일 경과한 후 실시하고, 그 후 매년 실시하였다.

재프로그래밍된 줄기 세포의 주입 전 및 후에 캠코더에 걸어둔 현미경을 이용하여 모든 도말 및 천공 절편을 스캐닝하여 생착 기록을 평가 및 보존하였다.

결과

모든 환자는 부작용없이 성분채집 및 단일 재프로그래밍된 줄기 세포 주입 절차를 소화하였다. 환자 A 및 환자 D는 재프로그래밍된 조혈 줄기 세포(RHSC)의 단일 주입 후 수혈이 필요없게 되었다(참조: 표 6 및 표 7). 혈소판, 호중구 및 적혈구 생착은 환자 A 및 환자 D에 주입 후 각각 3일 및 6일이 소요되었다. 환자 A 및 환자 D에서 태아성 헤모글로빈 교체가 나타났지만(참조: 표 4 및 표 5), 환자 B 및 환자 C에서는 나타나지 않았다(데이터 제시되지 않음). 주입 전에, HCV에 대해 음성으로 판명되었지만(ELISA에서 측정된 바와 같음) 환자 A 및 환자 D에서 간 효소는 상승하였다. 간효소는 RHSC의 주입 후 정상화하기 시작하였고 RHSC의 주입 후 4년이 경과하여 정상 수준에 도달하였다. 환자 B 및 환자 C는 각각 주입 후 2년 및 6개월 경과하여 사망하였다. 환자 001 및 004에서 태아성 헤모글로빈 교체가 나타났다(참조: 표 6 및 표 7). 이들 두 환자는 자가 HRSC의 일회 주입 후 장기간 생착을 나타냈다.

자가 HRSC의 주입 전 및 후에 중증의 재생불량성 빈혈 환자 A의 전혈구 수, 헤모글로빈 변이체 및 간 효소

혈액 검사	주입 전	07/19/2004 주입 후	05/26/2005 주입 후	03/07/2006 주입 후	01/05/2008 주입 후
WBC [10³/μL]	1.3	3.4	3.1	3.7	5.4
HB [g/dL]	2.6	7.1	9	12	14
RBC [10⁶/μL]	0.9	2	2.3	2.9	3.86
RETIC [%]	1		4		1.7
MCV [fL]	101.5	101.5	121.74	100	101.4
MCH [Pg]	33.6	35.5	39.13	30.8	36.3
MCHC [g/dL]	33.8	35	32.14	30.8	35.8
혈소판 [10³/μL]	18	26	37	58	189
호중구 [10³/μL]	0.32	1.000	1.054	1.184	1.994
ESO [10³/μL]			0.62	0.74	0.65
BASO [10³/μL]			0	0	0.054
LYMPH [10³/μL]		1.500	1.922	2.220	2.214
MONO [10³/μL]		0.500	0.062	0.222	0.324
HB A [g/dl]		5.1	6.7	9.2	12
HBA2 [g/dl]		0.13	0.14	0.24	0.39
HBF [g/dl]	ND	1.2	2.4	2.6	1.82
SGOT [U/L]	150	127	74	32	30
SGPT [U/L]	145	181	49	37	44

WBC=백혈구; HB=헤모글로빈; RBC=적혈구; RETIC=망상 적혈구; MCV=평균 적혈구용적; MCH=평균 적혈구 헤모글로빈; MCHC=평균 적혈구 헤모글로빈 농도; ESO=호산구; BASO=호염구; LYMPH=림프구; MONO=단핵구; HB A=헤모글로빈 A; HBA2=헤모글로빈 A2; HBF=태아성 헤모글로빈; SGOT=혈청 글루탐산 옥살로아세트산 트랜스아미나제; SGPT=혈청 글루탐산 피루브산 트랜스아미나제.

자가 HRSC의 주입 전 및 후에 중증의 재생불량성 빈혈 환자 D의 일반 혈액 검사, 헤모글로빈 변이체 및 간 효소

혈액 검사	주입 전	09/28/2004 주입 후	05/30/2005 주입 후	03/07/2006 주입 후	01/05/2008 주입 후
WBC [10³/μL]	1.7	3	2.2	2.7	4
HB	3	11.1	7.7	11.5	13
RBC		3.6	2.4	3.2	3.45
RETIC [%]		2.4	3.4		1.7
MCV		90.3	108.33	113	110.3
MCH		30.9	32	35.9	37.8
MCHC		34.2	29.62	31.9	34.2
혈소판 [10³/μL]	5	30	20	25	68
호중구 [10³/μL]	0.1	0.72	0.50	1.0	1.24
ESO [10³/μL]		0.90	0.22	0.54	0.64
BASO [10³/μL]		0	0	0	0
LYMPH [10³/μL]		2.01	1.67	1.59	1.88
MONO [10³/μL]		0.18	0.44	0.54	0.12
HB A		10.6	7.13	10.33	12.1
HBA2		0.33	0.19	0.28	0.36
HBF	0.11	0.2	0.38	0.9	0.42
SGOT	160	46	46	69	34
SGPT	150	57	32	60	46

조혈 재프로그래밍의 유도 전 및 후 3시간 경과하여 성분채집된 단핵 세포의 유세포 분석이 도 1에 나타나 있다. 조혈 프로그래밍 후 발생된 CD34 양성 세포의 수가 표 4에 수록되어 있다. 조혈 재프로그래밍 전 및 후에 성분채집된 단핵 세포의 대표적인 유세포 분석은 CD45, CD38 및 CD7의 발현과 함께 및 발현 없이 CD34 양성 세포의 유의적인 수적 증가를 보여준다(도 1). 주입시 CD34 세포는 말초 혈액을 3 내지 6일간 순환하였고, 그 후 높은 전방 및 측방 산란을 갖는 CD7과 함께 및 CD7 없이 CD33&13 발현 세포의 유의적 증가로 나타난 바와 같이 CD34 세포는 지속가능한 수준으로 골수세포로 분화하였다(도 2). 재프로그래밍의 이와 같은 패턴은 모든 환자에게서 관찰되었다.

메틸셀룰로스 세포 배양물에의 접종에 이은 자가 HRSC의 주입 전 환자의 골수 흡입물로부터 어떠한 콜로니도 형성되지 않았다(도 3). 클론 검정에서 저형성성 빈혈을 앓고 있는 환자 B에서만 저하된 조혈기능을 보였다. 그러나, 주입 후 14일 내지 20일 경과하여, 환자들로부터 획득한 모든 골수 흡입물은 적아구군 형성 단위-적혈구의 미미한 수적 증가와 함께 정상적인 범위의 다양한 조혈 콜로니를 형성하였다. 자가 HRSC의 주입 후 14 내지 20일 경과하여 골수 도말 및 천공 절편(도 3)은 기준치와 비교하였을 때 모든 환자에게서 성숙 및 미성숙 거핵세포와 함께 분화의 여러 단계에서 골수세포의 유의적인 수적 증가를 보였다. 또한, 모든 시료에서 분화의 여러 단계에서 적혈구계 과다증식이 나타났다.

모든 환자에서 자가 HRSC의 주입 전 및 후에 (4년 이상까지 환자 A 및 환자 D에서) 말초 혈액 또는 골수 시료의 핵형 및 G 분염 패턴은 변화가 없는 것으로 나타났다(도 4 참조).

재생불량성 빈혈 환자에게 자가 HRSC의 주입 후 원시(CD38 음성) 및 수임 (CD38 양성) CD34 세포는 골수 세포 내로 재프로그래밍되기 전에 말초혈액을 3일간 순환하였다(도 2). 환자 A, 환자 B 및 환자 D에서 HRSC의 주입 후 골수 생착은 3일 소요되었다. 한편, 환자 003의 경우 유세포 분석으로 검사하였을 때 골수 생착이 20일째에 이루어졌다. 어떠한 전처리 요법을 사용하지 않은 HRSC의 단일 주입은 4명의 재생불량성 빈혈 환자 중 2명에게서 장기간의 생착을 유도한다. 환자 A 및 환자 B는 HRSC 주입 후 어떠한 수혈도 없이 장기간 생착을 나타내었다. 이러한 환자에게 호중구, 적혈구 및 혈소판의 생착은 Hb F 헤모글로빈 수준의 전환 또는 증가를 동반한다(표 6 및 표 7). 이것은 사망한 다른 2명의 환자에게 나타나지 않았다. 이들 두 환자의 Hb F 전환은 제대혈 줄기 세포 이식에서 관찰되는 바와 같이 연소성 Hb 표현형을 향한 주입된 HRSC의 재프로그래밍 능력 및 그 결과로 인한 생착 및 재구성을 입증한다(Elhasid et al., Leukemia 2000, 14: 931-934; Locatelli et al., Bone Marrow Transplant 1996, 18: 1095-101).

염색체수 및 염색체분염의 보존과 함께 장기간 생착은 통상의 치료요법에서 클론 진화가 드물게 발생하는 것은 아닌 혈액상태에 HRSC를 주입하는 것이 명백히 안전하다는 것을 반영한다.

중요한 것은 동계 줄기 세포에서 본 것과 마찬가지로 어떠한 면역억제 요법을 사용하지 않더라도 자가 HRSC가 중증의 불량재생성 빈혈 환자에게서 장기간 생착과 생존률을 유도할 수 있었다는 점이다.

요약하면, 주입 후 14일 경과시, 주입된 환자의 골수 분석은 중증의 재생불량성 빈혈 골수의 우점종인 지방세포 및 기질세포가 감소하면서 분화의 여러 단계에서 골수 세포 충실성 및 골수구계, 적혈구계 및 거대핵계의 증가를 보여주었다. 헤모글로빈 수준뿐만 아니라 망상적혈구 수의 상응하는 증가와 함께 골수의 적혈구 용적에서 유의적인 증가가 있었다. 또한, 주입 후 태아성 헤모글로빈(겸상적혈구 빈혈 및 베타 지중해성 빈혈이 완화할때 나타나는 중요한 성분) 및 태아성 헤모글로빈 발현 적혈구의 지속적인 증가가 있었다. 게다가, 적혈구 세포크기, 헤모글로빈 함량 및 농도에 의해 결정되는 적혈구 지수에서 유의적인 호전이 있었다. 재프로그래밍된 세포는 주입 후 정상적인 핵형 및 유전자 안정성을 나타냈다. 마지막으로, 재생불량성 빈혈을 앓고 있는 3명 이상의 환자에게서 생착 및 장기간 재증식이 관찰되었다.

실시예 2

재료 및 방법

베타지중해 빈혈 환자 21명을 대상으로 자가 재프로그래밍된 조혈세포(표적 세포)를 시험하였다. 19명은 베타지중해 빈혈 중증 환자이고 2명은 베타지중해 빈혈 중간기 환자이다. 베타지중해 빈혈 중간기 환자 중 1명은 지중해빈혈증/Hb E 변형 빈혈증(극동 및 인도 출신의 환자에게서 공통적으로 발생)이고 다른 1명은 지중해빈혈증/겸상적혈구 빈혈증이었다.

환자 개개인의 전체 혈액을 2 내지 3회 처리하여 성분채집하였다. 표적 세포가 상기된 바와 같은 특징을 나타내어 획득할 수 있을 때까지 백혈구를 재프로그래밍하여 자가 재프로그래밍된 세포를 생성하였다. 환자의 팔 또는 대퇴부의 경정맥을 통해 자가 재프로그래밍된 세포를 정맥내 주입하였다.

결과

베타지중해 빈혈 환자에게 재프로그래밍된 세포를 주입한 후 생체신호 모니터링, 심초음파, 골밀도, 간 및 신장 효소, 핵형 및 G 분염으로 측정하고 기준치와 비교한 결과로서 독성이나 부작용은 전혀 관찰되지 않았다. 베타지중해 빈혈 중증 환자의 경우 재프로그래밍된 세포의 주입 후 9개월 경과한 시점에서 수혈 요구량을 기준치와 비교했을 때 통계적으로 유의적인 평균 감소율(50%)을 보였다. 베타지중해 빈혈 중간기 환자 2명(한명은 지중해빈혈증/HB E이고 다른 한명은 지중해빈혈/겸상적혈구 빈혈증이었다)은 재프로그래밍된 세포의 주입 후 9개월이 경과한 현재 수혈을 받지 않아도 되는 상태에 있다.

재프로그래밍된 세포의 주입 후 평균 중량 및 신장은 기준치와 비교했을 때 유의적으로 증가하였고, 비장 및/또는 간이 확장된 지중해빈혈 환자의 기관 크기는 정상화되었다. 태아성 헤모글로빈의 절대 평균 농도는 지중해성 중증 및 중간기 환자 모두에서 재프로그래밍된 세포의 주입 후 기준치와 비교했을 때 유의적으로 증가하였다(도 5). 또한, 적혈구 세포 크기별 헤모글로빈 함량(도 6) 및 농도(도 7)로 반영되는 적혈구 평균 지수는 기준치와 비교했을때 유의적으로 개선되었다.

마지막으로, 평균 혈청 페리틴(철분 과다에 대한 바이오마커)은 재프로그래밍된 세포의 주입 후 지중해성 빈혈 환자에게서 유의적으로 감소하였다(도 8). 철분과다는 지중해성 빈혈 환자, 겸상적혈구 빈혈 환자 및 수혈 후 철분 과다-유도된 장애의 사망률 및 이환율에서 주요 원인이 된다.

실시예 3

재료 및 방법

당뇨병 환자 2명의 전체 혈액을 2 내지 3회 처리하여 성분채집하였다. 상기된 바와 같은 특징으로 나타나는 표적 세포가 발생될 때까지 채집된 백혈구 세포를 재프로그래밍하여 자가 재프로그래밍된 간엽 줄기 세포, 만능 줄기 세포 및 섬세포(표적 세포)를 획득하였다. 환자의 팔 또는 대퇴부의 경정맥을 통해 자가 재프로그래밍된 세포를 정맥내 투여하였다.

결과

자가 재프로그래밍된 세포의 주입 후, 환자는 금식 및 90분 급식 자극된 c-펩타이드의 측정 결과, 정상 수준의 인슐린을 합성하였다. 이와 같은 정상 수준의 c-펩타이드는 재프로그래밍된 세포의 주입 후 3개월까지 유지되었다(도 9). 추가로, 혈당 조절을 가리키는 Hb A1C 수준은 재프로그래밍된 세포의 주입 후 정상화되었다(도 10). 예를 들면, 주입 전에 10% 이상인 Hb A1C를 갖는 환자는 재프로그래밍된 세포의 주입 받은 후 현재 5.8%의 Hb A1C를 갖는 것으로 나타났다. 게다가, 이들 환자의 혈당 수준은 기준치와 비교했을 때 주입 후 정상 수준에 도달하는 것으로 나타났다. 또한, 재프로그래밍된 세포의 주입 후 당뇨 환자의 인슐린 섭취/주사를 현저히 감소시킨 것으로 나타났다.

실시예 4

재료 및 방법

근위축성 측색 경화증(ALS) 환자 4명에게 자가 재프로그래밍된 세포를 주입하였다. 이 질환의 진단은 특정 바이오마커와 관련이 없다. 이 질환은 다른 유사한 장애의 임상 제외에 의해 진단된다.

환자의 전체 혈액을 2 내지 3회 처리하여 성분채집하였다. 상기된 바와 같은 특징으로 나타나는 표적 세포가 발현될 때까지 채집된 백혈구 세포를 재프로그래밍하여 자가 재프로그래밍된 만능 줄기 세포, 폐포상피세포 및 뉴런(표적 세포)을 획득하였다. 환자의 팔 또는 대퇴부의 경정맥을 통해 자가 재프로그래밍된 세포를 정맥내 주입하였다.

결과

ALS를 앓고 있으면서 자가 재프로그래밍된 세포로 치료 받은 환자에게, 폐기능 검사(PFT)에서 유의적 호전이 있었다. 이러한 폐기능 검사에서의 장애가 조기 사망을 초래하는 원인 중 하나이다. 대부분의 환자는 팔다리 및 목에서 경직감이 줄어든 것으로 나타났고 일부 환자는 언어 능력도 호전되었음을 보고하였다. 다른 환자들은 구보 능력뿐만 아니라 머리를 올릴 정도의 호전을 보였다.

실시예 5

재료 및 방법

파킨슨병 환자 4명의 전체 혈액을 2 내지 3회 처리하여 성분채집하였다. 상기된 바와 같은 특징으로 나타나는 표적 세포가 발생될 때까지 채집된 백혈구 세포를 재프로그래밍하여 자가 재프로그래밍된 만능 줄기 세포 및 뉴런(표적 세포)을 획득하였다. 환자의 팔 또는 대퇴부의 경정맥을 통해 자가 재프로그래밍된 세포를 정맥내 주입하였다.

결과

파킨슨병으로 인해 뚜렷한 떨림 증세를 보인 환자들은 떨림이 유의적으로 감소되었고 이 질병을 관리하기 위해 사용된 통상적인 약물 투입도 줄일 수 있었다. 첫번째 환자는 매일 시네메트(도파민 조절제)를 4정 투약받았고, 수혈 후 4개월 경과시 매일 1정만 투약받고 있다.

실시예 6

재료 및 방법

척수 손상 환자 2명의 전체 혈액을 2 내지 3회 처리하여 성분채집하였다. 상기된 바와 같은 특징으로 나타나는 표적 세포가 발생될 때까지 채집된 백혈구 세포를 재프로그래밍하여 자가 역분화된 만능 줄기 세포 및 뉴런(표적 세포)을 획득하였다. 환자의 팔 또는 대퇴부의 경정맥을 통해 자가 재프로그래밍된 세포를 정맥내 주입하였다.

결과

환자 1명은 후속 조치를 받지 않았다. 다른 1명의 환자는 C5-C6 척수 손상을 입은 사지마비 환자였다. 이 환자는 앉거나 침상에서 몸을 옆으로 돌릴 수 없었다. 치료 후 환자는 매우 장시간 동안 똑바로 앉을 수 있었고 침상에서 몸체를 돌릴 수도 있었다. 또한, 환자는 벽에 몸을 기대어 홀로 설 수도 있었다. 게다가, 환자는 발가락을 움직일 수 있었고 방광의 감각을 보고하고 있다.

재프로그래밍된 세포의 주입 전 및 후 MRI 분석은 재프로그래밍된 세포의 주입 후 병소 크기가 약간 줄어들었음을 보여주었다. 환자는 물리 치료요법을 활발하게 받기시작하였고 이전보다 훨씬 더 기분이 양호하였다.

실시예 7

재료 및 방법

상기된 바와 같은 특징으로 나타나는 표적 세포가 발현될 때까지 채집된 백혈구 세포를 재프로그래밍하여 자가 재프로그래밍된 만능 줄기 세포, 간엽 줄기 세포 및 골격근 세포(표적 세포)를 획득하고 이들 세포로 2명의 근위축증(MD) 환자를 치료하였다. 첫번째 환자는 지대 MD을 앓고 있었고, 이 환자의 병은 가장 심하게 영향을 받는 근육이 일반적으로 엉덩이와 어깨인 MD의 한 부류이며, 두번째 환자는 네말린성 MD을 앓고 있었다.

환자의 전체 혈액을 2 내지 3회 처리하여 성분채집하였다. 본 발명에 따른 재프로그래밍을 통해 자가 재프로그래밍된 세포를 생성하였다. 환자의 팔 또는 대퇴부의 경정맥을 통해 자가 재프로그래밍된 세포를 정맥내 주입하였다.

결과

근육 효소 크레아틴 포스포키나제(CPK)의 수준을 모니터링하여 MD 연관된 근위축을 측정할 수 있다. 이 효소는 역분화 줄기 세포의 주입에 반응하여 감소하였다(도 11). 또한, 조직손상시 상승하는 효소인 락테이트 데하이드로게나제도 감소하였다(도 11). 또한, 환자에게서 간세포와 골근 세포의 염증 및 손상과 연관이 있는 간효소 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST)가 감소되었다.

게다가, 환자들은 재프로그래밍된 세포의 주입 전 및 후에 캠으로 촬영한 결과 운동성이 개선되었고, 재프로그래밍된 세포의 주입 후 폐기능검사에서 기준치와 비교했을 때 향상된 것으로 나타났다.

실시예 8

재료 및 방법

상기된 바와 같은 특징으로 나타나는 표적 세포가 발생될 때까지 채집된 백혈구 세포를 재프로그래밍하여 자가 재프로그래밍된 만능 줄기 세포, 간엽 줄기 세포 및 신장 세포(표적 세포)를 획득하고 이들 세포로 신장 질환 환자들을 치료하였다. 환자의 전체 혈액을 2 내지 3회 처리하여 성분채집하였다. 본 발명에 따른 재프로그래밍을 통해 자가 재프로그래밍된 세포를 생성하였다. 환자의 팔 또는 대퇴부의 경정맥을 통해 자가 재프로그래밍된 세포를 정맥내 주입하였다.

결과

자가 재프로그래밍된 세포가 주입된 환자들은 건강한 신장 기능의 지표인 여러 가지 체액 마커 수준(예, 뇨 배설량, 혈청 크레아티닌 및 BUN 또는 UREA)이 호전되었다. 예를 들어, 당뇨병을 앓고 있는 75세 남성 환자는 자가 재프로그래밍된 세포로 치료받은 후 24개월 경과시 호전된 신장 기능을 보였다(표 8 참조). 이 환자는 산소를 운반하는 적혈구내의 단백질 분자인 헤모글로빈 및 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-1)의 증가된 수준을 보였다. 또한, 환자는 유기 화합물인 요소, 근육에서 크레아틴 포스페이트의 분해 산물인 크레아티닌, 뇨에서 분비된 유기화합물인 요산 및 뼈에서 발견된 무기물인 인의 감소를 나타냈고; 이들 마커의 높은 양은 불량한 신장 기능의 지표이다. 게다가 환자는 헤모글로빈의 한 가지 형태이며 당뇨병을 앓고 있는 사람의 혈장 글루코스 농도의 지표로 흔히 사용되는 당화 헤모글로빈(HbA1C)의 감소를 보였다.

유사하게, 51세 당뇨병 남성은 치료 후 12일 경과시 비슷한 호전을 나타냈다(표 8). 이 환자는 헤모글로빈의 증가된 수준 및 크레아티닌, HbA1C 및 혈중요소질소(BUN)(요소의 형태로 혈 중의 질소의 양을 측정한다)의 감소된 수준을 보였다.

2명의 당뇨병 남성 환자의 신장 기능 마커 수준

	75세 당뇨병 남성		51세 당뇨병 남성
	기준치	치료 후 24개월	기준치	치료 후 12개월
헤모글로빈 [g/dl]	8	12.9	12	14.5
요소 [g/dl]	190	38	n/a	n/a
크레아티닌 [mg/dl]	12	1.9	15	4.5
요산 [mg/dl]	8.5	4	n/a	n/a
인 [mg/dl]	6.1	3.8	n/a	n/a
HbA1C [%]	14.4	6.1	12	6
IGF-1 [ng/dl]	45	112	n/a	n/a
BUN [mg/dl]	n/a	n/a	79	19

HbA1C=당화 헤모글로빈; IGF-1=인슐린-유사 성장 인자 1; BUN=혈 중 요소 질소

II형 당뇨병 환자 12명을 자가 재프로그래밍된 세포로 치료한 후 분석한 결과 미세알부민의 수준이 감소한 것으로 나타났고(도 13), 이것은 뇨로 알부민이 배출되는 것과 연관이 있으며 신장 질환뿐만 아니라 혈관내피세포 기능장애 및 심혈관 질환의 지표이다. 또한, 12명의 환자는 HbA1C의 감소된 수준을 나타냈다 (도 14).

추가로, 자가면역 사구체신염을 앓고 있는 45세 여성은 자가 재프로그래밍된 세포로 치료 받은 후 18개월 내에 신장 기능이 호전된 것으로 나타났다(표 9).

자가면역 사구체신염을 앓고 있는 45세 여성 환자의 신장 기능 마커 수준

	기준치	치료 후 18개월
헤모글로빈 [g/dl]	9	11.5
크레아티닌 [mg/dl]	9.3	2.1
BUN [mg/dl]	89	15

BUN=혈 중 요소 질소

게다가, 말기 신장 질환을 앓고 있는 59세 여성 환자는 재프로그래밍된 세포로의 치료에 따라 크레아티닌 수준, 요소, 헤모글로빈 수준 및 부갑상선호르몬(PTH)이 향상된 것으로 나타났다(표 10). 자가면역을 앓고 있는 45세 여성 환자의 신장 기능 마커 수준. 또한, 환자는 이전에 혈액투석을 한달에 12회 받았으나 치료 후 약 8회로 감소되었다.

말기 신장 질환을 앓고 있는 59세 여성 환자를 재프로그래밍된 세포로 치료하기 전 및 후의 신장 기능 마커 수준.

신장 기능 마커	치료전	치료후
신장 기능 마커	03/02/2009	04/29/2009	05/23/2009	08/05/2009	08/11/2009
헤모글로빈 [g/dl]	9.8	9.2	11.5
TLC/WBC (㎕당)	3800	6800	5100
PLT (㎕당)	361000	273000	348000
HbA1C [%]	5.6
AST [U/l]	25	16	14
ALT [U/l]	49	11	12
요소 [mg/dl]	90	70			22.13
크레아티닌 [mg/dl]	14.5	11.2	11.86	8.86	9.58
혈청 알부민[g/dl]	3	3.4	3.3		3
PT [초]	31.2
INR	2.71
칼슘 [mg/dl]	8.4	9.5	9.4	8.7	9.5
인 [mg/dl]	8	9.2	5.9
칼륨 [mmol/dl]	5.9		5.2	6.9	4.1
나트륨 [mmol/dl]	133			136
요산 [mg/dl]	7.9	6.1	7.5		4.8
PTH [pg/ml]			195.6		108.2

TLC=총 백혈구 수; WBC=백혈구; PLT=혈소판; HbA1C=당화 헤모글로빈; AST=아스파테이트 아미노트랜스퍼라제; ALT=알라닌 아미노트랜스퍼라제; PT=프로트롬빈 시간; INR=국제 정규화 비율(혈액 응고); PTH=부갑상선 호르몬

또한, 당뇨병으로 인해 만성 신부전을 앓고 있는 46세 환자는 재프로그래밍된 세포로 치료 받은 후 크레아티닌 수준, 요소 및 헤로글로빈 수준이 호전된 것으로 나타났다(표 11). 환자는 매달 12회 혈액투석을 받았으나 치료 후 약 5회만 받게 되었고, 에포에틴 알파(EPREX^®)를 주 2회 4000 단위씩 피하 투여 받던 것을 2주 1회 4000 단위로 낮춰 투여 받을 수 있게 되었다.

만성 신부전을 앓고 있는 46세 환자를 재프로그래밍된 세포로 치료하기 전 및 후의 신장 기능 마커 수준

신장 기능 마커	치료전	치료후
신장 기능 마커	09/21/2008	02/24/2009	04/20/2009
헤모글로빈 [g/dl]	6.5	10.3	9.4
TLC/WBC (㎕당)	5500	8200	10100
PLT (㎕당)	159000	246000	300000
FBS [mg/dl]	133	120	121
2시간 PP [mg/dl]	170	172	169
AST [U/L]	9	34	32
ALT [U/L]	5	22	15
요소 [mg/dl]	109	51	65
크레아티닌 [mg/dl]	7.5	4.9	4
혈청 알부민 [g/dl]	3.5	3.7	4
PT [초]	12.7	12	11
INR	1	1	1
칼슘 [mg/dl]	10	9.9	11
인 [mg/dl]	6	5.3	5
칼륨 [mmol/L]	6.2	5.1	4.7
마그네슘 [mg/dl]	2.3	2.4	2.8

TLC=총 백혈구 수; WBC=백혈구; PP=식후; PLT=혈소판; FBS=공복시혈당; AST=아스파테이트 아미노트랜스퍼라제; ALT=알라닌 아미노트랜스퍼라제; PT=프로트롬빈 시간; INR=국제 정규화 비율(혈액 응고); PTH=부갑상선 호르몬

실시예 9

재료 및 방법

다발성 경화증 환자를 자가 재프로그래밍된 만능 줄기 세포, 간엽 줄기 세포 및 뉴런(표적 세포)으로 치료하였다. 상기된 바와 같은 특징으로 나타나는 표적 세포가 발생될 때까지 채집된 백혈구 세포를 재프로그래밍하여 표적 세포를 획득하였다. 환자의 전체 혈액을 2 내지 3회 처리하여 성분채집하였다. 본 발명에 따른 재프로그래밍을 통해 자가 재프로그래밍된 세포를 생성하였다. 환자의 팔 또는 대퇴부의 경정맥을 통해 자가 재프로그래밍된 세포를 정맥내 주입하였다.

결과

자가 재프로그래밍된 세포로 치료 받은 환자들은 뇌 및 척수의 병소가 줄어든 것으로 나타났다. 병소의 축소는 치료를 받은 후 3개월 내에 일어났다 (도 15a-b). 뇌조직의 손상이 축소된 것은 6개월내에 일어났다(도 16a-b).

또한, 자가 재프로그래밍된 세포로 치료 받은 환자들은 척수 병소가 제거된 것으로 나타났다(도 17a-b). 게다가, 이들 환자는 Kurtzke 종합 장애 척도(EDSS) 점수가 향상된 것으로 나타났으며, 병이 완화되었고, 단일 주입 후 4년 내내 통상적인 치료요법을 받지 않았다.

실시예 10

재료 및 방법

HIV 여성 환자를 자가 재프로그래밍된 조혈 줄기 세포로 치료하였다. 환자의 전체 혈액을 2 내지 3회 처리하여 성분채집하였다. 상기된 바와 같은 특징으로 나타나는 표적 세포가 발생될 때까지 채집된 백혈구 세포를 재프로그래밍하여 표적 세포를 획득하였다. 환자의 팔 또는 대퇴부의 경정맥을 통해 자가 재프로그래밍된 세포를 정맥내 주입하였다.

결과

치료전에 HIV-1 및 HIV-2 항체에 대한 스크리닝 검사는 3.68의 검사치를 보여주었다. 1.0 이상의 검사치는 양성으로 판명한다.

자가 재프로그래밍된 세포의 치료 후 2개월 경과시, HIV-1 및 HIV-2 항체 스크리닝의 검사치는 0.46이었고, 이 수치는 환자가 HIV-1 및 HIV-2에 대한 양성 결과를 보이지 않았음을 가리킨다. 치료 후 6개월 경과시, HIV-1 및 HIV-2 스크리닝에 대한 검사치는 0.48이었고, 이 또한 환자가 HIV에 대해 양성 결과를 보이지 않고 있음을 증명한다.

실시예 11

자가 재프로그래밍된 세포의 치료 효과는 다른 병태 및 질환을 앓고 있는 환자들에게도 입증되었다. 본원에 수록된 표적 세포들은 상기된 바와 같은 특징으로 나타나는 표적 세포가 발현될 때까지 채집된 백혈구 세포를 재프로그래밍하여 표적 세포를 획득하였다.

울혈성 심부전

울혈성 심부전을 앓고 있는 61세 남성 환자에게 자가 재프로그래밍된 심근세포, 만능 줄기 세포, 간엽줄기 세포 및 내피세포를 주입하였다. 이 치료는 박출계수(EF); 관상동맥질환과 연관된 예측 인자인 뇌 나트륨이뇨 펩타이드 전구체 수준 (Pro BNP); 공복시혈당수준; 및 HbA1C 수준의 호전을 유도하였다(표 12 참조). 게다가, 이전에 확장된 심장은 심장초음파 검사 결과인 이완기말 좌심실내경(LVID/D), 수축기말 좌심실내경(LVID/S) 및 이완기말 좌심실중격두께(IVSD)의 감소에 의해 표 12에서 증명되는 바와 같이 정상적인 크기로 회복되었다.

울혈성 심부전을 앓고 있는 61세 환자를 재프로그래밍된 세포로 치료 하기 전 및 후의 관상 동맥 질환 마커

관상 동맥 질환 마커	치료 전 1개월	치료 후 1개월	치료 후 2개월	치료 후 4개월	치료 후 6개월	치료 후 10개월
LVID/D [cm]	6.5	6.3	5.9	6.9	6.5	5.7
LVID/S [cm]	6.1	5.6	5.4	5.9	5.7	4.9
EF	15	18	22	29	33	45
IVSD [cm]	1.3	1.3	1.2	1.2	0.6	1.0
LVPWD [cm]	0.7	0.6	0.6	0.8	0.6	1.0
좌심실 질량 지수 [gm/m]	283 141.5	251 133.5	209.5 111.4	167 88.8	151.5 81
Pro BNP [pg/ml]	2969	800	600	600	600	497
혈당 (금식) [mg/dl]	244	118	145	87	95	80
HbA1C [%]	9.2	nd	nd	7.2	6.5	6

LVID/D=이완기말 좌심실내경; LVID/S=수축기말 좌심실내경; EF=박출계수; IVSD=이완기말 좌심실중격두께; LVPWD=이완기말 좌심실후벽두께; Pro-BNP=뇌 나트륨이뇨 펩타이드 전구체; HbA1C=당화헤모글로빈

C형 간염

C형 간염 바이러스(HCV)로 감염되었고 베타지중해 빈혈증을 앓고 있는 13명의 환자에게 자가 재프로그래밍된 조혈세포, 만능 줄기 세포, 간엽줄기 세포 및 간세포를 주입하였다. 치료 효과는 HCV 양이 감소하였거나 제거된 것으로 나타났을 뿐만 아니라(표 13) 간 효소, 빌리루빈, 알부민, 프로트롬빈 시간 및 국제 정규화 비율(혈액 응고)과 같은 혈액 마커가 개선된 것으로 나타났다(표 14 참조). 특히, 환자들은 간세포의 염증 및 손상 모두와 연관된 간효소 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제(AST)가 정상화되었다(도 18a-b).

C형 간염 바이러스로 감염된 12명의 환자를 자가 재프로그래밍된 줄기 세포로 치료한 후의 바이러스 양

환자 ID	기준치 바이러스 양 x 1000	주입 후 3개월 바이러스 양 x 1000
1	0	0
2	164	82
3	3	0
4	123	16
5	16	0
6	2	0
7	0	0
8	7.7백만	7.7백만
9	152	106
10	63	27
11	387	97
12	0	0
13	17	0

C형 간염 바이러스로 감염되었고 간 경변증을 앓고 있는 환자들의 혈액 마커의 기준치 및 재프로그래밍된 세포로의 치료 후 검사치

혈액 마커	기준치	주입 후 3개월
헤모글로빈 [g/dl]	9.8	12.9
혈소판(㎕당)	65000	120000
WBC (㎕당)	4300	7200
혈당 (금식) [mg/dl]	210	110
혈당 (식후 2시간) [mg/dl]	190	134
ALT [U/L]	50	24
AST [U/L]	32	31
빌리루빈 (전체) [mg/dl]	6.9	3.2
빌리루빈 (직접) [Mg/dm]	3.1	1.8
혈청 알부민 [g/l]	1.9	3.1
요소 [mg/dl]	60	36
크레아티닌 [mg/dl]	1.6	1.1
INR	1.8	1.0
PT [초]	18	12.8

WBC=백혈구; PP=식후; ALT=알라닌 아미노트랜스퍼라제; AST=아스파테이트 아미노트랜스퍼라제; INR=국제 정상화 비율 (혈액 응고); PT=프로트롬빈 시간

예를 들어, C형 바이러스 감염으로 인한 간 경변증을 앓고 있는 44세 남성 환자는 간효소 알라닌 아미노트랜스퍼라제 및 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제, 국제 정규화 비율(혈액 응고), 빌리루빈 및 알부민뿐만 아니라 임의 혈당에서 호전된 것으로 나타났다(표 15 참조). 사실, 이 환자는 재프로그래밍된 세포로 치료받기 전에 알부민 치료중에 있어으나 재프로그래밍된 세포로 치료 후에는 알부민 치료를 받지 않았다.

C형 간염 바이러스 감염으로 인한 간 경변증을 앓고 있는 44세 남성 환자의 혈액 마커의 기준치 및 재프로그래밍된 세포로의 치료 후 검사치

혈액 마커	기준치	치료후
혈액 마커	03/30/2009	04/04/2009	04/23/2009	05/06/2009	06/22/2009
헤모글로빈 [g/dl]	10.9	10.4	11.6	13.4	10.2
TLC (㎕당)	2500	2700	6100	4700	2800
PLT (㎕당)	20000	17000	43000	50000	27000
AST [U/L]	212	170	131	141	120
ALT [U/L]	62	59	48	51	53
알카리성 포스파타제 [U/L]	196		147		58
GGT [U/L]	49		70	63	35
빌리루빈 T [mg/L]	12.7	10.9	11.2	8.1	8.8
빌리루빈 D [mg/Dl]	6.8	5.4	4.71	4.9	4
요소 [mg/dl]	13	18	20	16	25
크레아티닌 [mg/dl]	0.7	0.7	0.8	0.7	0.7
혈청 알부민 [g/L]	2.8	2.5	2.9	2.4	1.9
RBS [mg/dl]	212	154	158	188	174
INR	1.9	1.8	1.72	1.69	1.72
칼륨 [mmol/L]		3.2	3.8	4.4
나트륨[mmol/L]		134	141	137
요산[Mg/dl]		3.5		2.4	3
알파 페토프로테인		정상
크리오글로불린		음성

TLC=총 백혈구 수; PLT=혈소판; AST=아스파테이트 아미노트랜스퍼라제; ALT=알라닌 아미노트랜스퍼라제; GGT=감마-글루타밀 트랜스퍼라제; RBS=임의 혈당; INR=국제 정규화 비율(혈액 응고)

두부 외상

자동차 사고로 인한 두부 외상 환자를 자가 재프로그래밍된 만능 줄기 세포를 주입하여 치료하였다. 이 치료는 손상된 뇌조직의 재생을 유도하였고(도 19a-b), 박출계수(EF), 관상동맥질환과 연관된 예측인자인 뇌 나트륨이뇨 펩타이드 전구체 수준(Pro BNP); 공복시혈당수준; 및 HbA1C 수준의 호전을 유도하였다(표 10 참조).

폐 질환

운동 뉴런 질환과 연관된 억제성 폐질환을 앓고 있는 환자를 자가 재프로그래밍된 만능 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 폐포상피세포 및 내피세포를 주입하여 치료하였다. 치료 후 6개월 경과시, 최대로 숨을 들이마신 후 힘껏 밖으로 내뱉은 공기의 양인 노력성 폐활량(FVC)이 50%에서 71%로 증가한 한편 1초안에 힘께 밖으로 내뱉을 수 있는 공기의 양인 1초간 노력성 호기량(FEV₁)이 64%에서 68%로 증가하였다. 건강한 성인의 경우 약 75-80%인 FEV₁ 대 FVC의 비율은 100%에서 82%로 감소하였다. 폐의 X-선 스캔 결과, 치료 후 폐강의 불투명성이 줄어든 것으로 나타났다(도 20).

폐경

51세 폐경 환자에게 자가 재프로그래밍된 만능 줄기 세포, 만능생식세포 및 난모세포를 투여하였다. 치료 후 환자는 인슐린-유사 성장 인자(IGF-1), 에스터디아올 및 저밀도 지질단백질(LDL)을 포함한 여러 가지 호르몬 및 단백질 수준이 증가한 것으로 나타났다(표 16 참조).

폐경 환자에게 자가 재프로그래밍된 줄기 세포를 투여한 효과

혈액 마커	치료 전	치료 후
혈액 마커	11/23/2006	12/09/2006	01/01/2007	02/17/2009
IGF-1 [ng/ml]	91	53	100	143
IGF-1-결합 [mg/L]	5.3	4	4.5	5.9
GH [㎍/L]	2.4	3.5	3.5	1.5
프로게스테론 [ng/ml]	1.2	1.5	17.5	2.25
에스테르디아올 [pg/ml]	26	82	162	168.82
코르티졸 [㎍/dl]	17.8	24	4.3	24.5
DHEA-S[Nmol/l]	2.2	3.6	0.4	5.3
Adrenocort [pmol/l]	21.1	10	10
티로글로불린 [ng/ml]	47	18	31	1.4
칼시토닌 [ng/ml]	28	40	50
FSH [IU/l]		41.2	5.4	3.88
LH [IU/l]		15.1	1.8	6.76
프로락틴 [㎍/l]	16.2	11.1	10.5	0.6
유리 시험 [pmol/l]	8	6.4	7.5
콜레스테롤 [mg/dl]	242	258	280	268
HDL [mg/dl]	70	76	83	63.22
LDL [mg/dl]	22	162	173	179.9
Triglycer [mg/dl]	111	102	122	125
Hba1C [%]	6.5	5.3	5.5	5.4
Fbs [Mg/dl]	94	90	102	103
Inhibin [U]	40		30
Osteocalcin [ng/mL]				6.9
TSH[nU/ml]	0.84		0.7	0.5
FT3 [pg/ml]	3.1	2.7	2.7	1.54
칼시토닌 [ng/l]	28	40	50
FT4 [pg/ml]	1.4	0.94	0.71	0.82

IGF-1=인슐린-유사 성장 인자 1; IGF-1-bind=인슐린-유사 성장 인자 결합; GH=성장호르몬; DHEA-S=데하이드로에피안드로스테론 설페이트 에스테르; adrenocort=부신피질호르몬; FSH=여포자극호르몬; LH=황체형성호르몬; HDL=고밀도 지질단백질; LDL=저밀도 지질단백질; triglycer=트리글리세라이드; HBA1C=당화 헤모글로빈; FBS=태아 채혈; TSH=갑상선자극호르몬; FT3=유리 트리요오드타이로닌; FT4=유리 타이록신

우울증

우울증을 앓고 있는 환자에게 자가 재프로그래밍된 만능 줄기 세포 및 신경을 주입하여 치료하였다 치료 후 환자는 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-1), 코르티솔 및 테스토스테론을 포함한 여러 가지 호르몬 및 단백질 수준이 증가한 것으로 나타났다(표 17 참조).

폐경 환자에게 자가 재프로그래밍된 세포를 투여한 효과

혈액 마커	치료전	치료후
혈액 마커	06/11/2007	07/23/2007
GH [㎍/l]	<0.05	0.06
IGF-1 [ng/ml]	93.4	140
IGF-bp [mg/ml]	4.4	5.6
코르티졸 [㎍/dl]	4	20.9
Adrenocort [pg/ml]	<10	17.1
Shbg [nmol/l]	37.9	39.8
FSH [IU/L]	4.94	4.98
LH [IU/L]	10.1	3.72
e2 [pg/ml]	29	<28
테스토스테론 [pmol/l]	28.4	57.8
프로락틴 [㎍/l]	15.7	1.6
DHEA-S [μmol/l]	2.3	2.9
TSH [μU/ml]	1.707	3.318
FT3 [pg/ml]	1.69	1.87
FT4 [ng/dl]	0.81	0.89

GH=성장 호르몬; IGF-1=인슐린-유사 성장 인자 1; IGF-bp=인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질; Adrenocort=부신피질호르몬; Sh-bg=성호르몬-결합 글로불린; FSH=여포자극호르몬; LH=황체형성호르몬; e2=에스트라디올; DHEA-S=데하이드로에피안드로스테론 설페이트 에스테르; TSH=갑상선자극호르몬; FT3=유리 트리요오드타이로닌; FT4=유리 타이록신

비폐색성 무정자증

비폐색성 무정자증을 앓고 있는 환자에게 자가 재프로그래밍된 만능 줄기 세포, 만능생식세포 및 정자를 주입하여 치료하였다. 치료 후 환자는 8개월 내내 테스토스테론이 증가한 것으로 나타났다(도 21).

시각 장애

과거에 제거된 양성 종양으로 시력을 잃은 환자에게 자가 재프로그래밍된 만능 줄기 세포 및 뉴런을 주입하여 치료하였다. 치료 후 환자는 망막 민감도가 증가하고 시력이 호전된 것으로 나타났다(도 22).

본원 명세서는 본 발명의 바람직한 양태를 상세히 기술하여 이와 같은 특정적인 양태는 본원에 정의된 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니며 많은 명백한 본 발명의 변형들이 본 발명의 정신 또는 범위내에서 가능할 수 있음은 이해하여야 한다.

Claims

(i) 퍼스트 세포 계통(first cell lineage)의 수임 세포(committed cell)를 획득하고, (ii) 상기 수임 세포를 재프로그래밍시켜 재프로그래밍된 세포를 획득하며, (iii) 상기 재프로그래밍된 세포를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 환자의 한 세포 계통의 조직 또는 세포를 보충하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 환자가 골수 부전, 혈액학적 병태, 재생불량성 빈혈, 베타-지중해 빈혈, 운동 뉴런 질환, 파킨슨병, 척수 손상, 근위축증, 신장 질환, 다발성 경화증, 울혈성 심부전증, C형 간염 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 두부 외상, 척수 손상, 폐질환, 우울증, 비폐색성 무정자증, 남성 갱년기, 폐경과 불임, 회춘, 강피성 궤양, 건선, 주름, 간 경변증, 자가면역 질환, 탈모, 망막 색소 변성증, 결정 이영양증/실명, 당뇨병, 간 경변증 및 불임으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 질환 또는 장애를 앓고 있는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 재프로그래밍된 세포가 만능 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 간엽 줄기 세포, 내배엽 및 신경외배엽 줄기 세포, 생식세포, 배외 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 신장 세포, 폐포 상피 세포, 내배엽 세포, 뉴런, 외배엽 세포, 섬세포, 선포 세포, 난모 세포, 정자, 조혈 세포, 간세포, 각질 세포, 멜라닌 세포, 골세포, 모유두 세포, 연골 세포, 지방 세포, 내피 세포, 심근 세포 및 영양모 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 수임 세포가 전혈, 골수, 뉴런 조직, 근육 조직, 표피 또는 진피 중에서 획득되는, 방법.
제4항에 있어서, 상기 수임 세포가 전혈로부터 획득되는, 방법.
제5항에 있어서, 상기 수임 세포가 성분채집을 통해 획득되는, 방법.
제5항에 있어서, 상기 수임 세포가 가동화 또는 비가동화 혈액으로부터 획득되는, 방법.
제5항에 있어서, 상기 수임 세포가 T 세포, B 세포, 호산구, 호염구, 호중구, 거핵 세포, 단핵 세포, 적혈구, 과립구, 비만 세포, 림프구, 백혈구, 혈소판 및 적혈구로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 재프로그래밍이 상기 수임 세포의 역분화, 전환분화, 재분화 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
제9항에 있어서, 상기 재프로그래밍이 상기 수임 세포를 역분화시켜 역분화된 세포를 획득하는 것을 포함하는, 방법.
제10항에 있어서, 상기 수임 세포가 상기 수임 세포를 제제와 접촉시킴으로써 역분화되는, 방법.
제11항에 있어서, 상기 수임 세포가 상기 제제와 배양되는, 방법.
제12항에 있어서, 상기 제제가 상기 수임 세포의 표면에서 항원의 포획, 인식 또는 제시를 매개하는 수용체와 접목하는, 방법.
제11항에 있어서, 상기 수용체가 MHC 부류 I 항원 또는 MHC 부류 II 항원인, 방법.
제11항에 있어서, 상기 제제가 수용체에 대한 항체인, 방법.
제13항에 있어서, 상기 제제가 수용체에 대한 모노클로날 항체인, 방법.
제16항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체 CR3/43 및 모노클로날 항체 TAL 1B5로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 역분화 세포가 주사 또는 이식을 통해 투여되는, 방법.
제18항에 있어서, 상기 역분화 세포가 비경구, 근육내, 정맥내, 피하, 안내, 경구, 경피 주사 또는 척수액으로의 주사에 의해 투여되는, 방법.
제9항에 있어서, 상기 재프로그래밍이 상기 수임 세포를 전환분화시켜 전환분화된 세포를 획득하는 것을 포함하는, 방법.
제20항에 있어서, 상기 수임 세포가, 수임 세포를 한 가지 이상의 역분화제 및 한 가지 이상의 분화 촉진제를 포함하는 조직 배양 배지에서 배양시킴으로써 전환분화되는, 방법.
제21항에 있어서, 상기 조직 배양 배지가 이스코브 변형 둘베코 배지(IMDM), 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), 이글 최소 필수(EME) 배지, 알파-최소 필수 배지(α-MEM), 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(RPMI; 배지 개발처) 1640, Ham-F-12, E199, MCDB, 레이보비츠 L-15, 및 윌리엄스 배지 E 또는 임의의 시판 조직 배양 배지로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 방법.
제21항에 있어서, 상기 분화 촉진제가 항응고제, 킬레이트화제 또는 항생제인, 방법.
제21항에 있어서, 상기 분화 촉진제가 비타민, 무기물 또는 이의 유도체인, 방법.
제24항에 있어서, 상기 비타민, 무기물 또는 이의 유도체가 비타민 A, 비타민 B₃, 비타민 C, 비타민 D₃, 비타민 K, 레티노산, 니코틴아미드, 아연 또는 아연 화합물 및 칼슘 또는 칼슘 화합물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 방법.
제21항에 있어서, 상기 분화 촉진제가 천연 또는 합성 호르몬인, 방법.
제26항에 있어서, 상기 천연 또는 합성 호르몬이 하이드로코르티손 또는 덱사메타손인, 방법.
제21항에 있어서, 상기 분화 촉진제가 아미노산 또는 이의 유도체인, 방법.
제28항에 있어서, 상기 아미노산 또는 이의 유도체가 L-글루타민(L-glu), 에르고티오네인(EGT), 프롤린 및 비필수 아미노산(NEAA)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 방법.
제21항에 있어서, 상기 분화 촉진제가 화학적 화합물 또는 이의 유도체인, 방법.
제30항에 있어서, 상기 화학적 화합물 또는 이의 유도체가 β-머캅토에탄올, 디부틸 사이클릭 아데노신 모노포스페이트(db-cAMP), 모노티오글리세롤(MTG), 퓨트레신, 디메틸 설폭사이드(DMSO), 하이포크산틴, 아데닌, 포스콜린, 실로스타미드 및 3-이소부틸-1-메틸크산틴으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 방법.
제21항에 있어서, 상기 분화 촉진제가 뉴클레오사이드 또는 이의 동족체인, 방법.
제32항에 있어서, 상기 뉴클레오사이드 또는 이의 동족체가 5-아자시티딘인, 방법.
제21항에 있어서, 상기 분화 촉진제가 산 또는 이의 염인, 방법.
제34항에 있어서, 상기 산 또는 이의 염이 아스코르브산, 피루베이트, 오카딘산, 리놀레산, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 디나트륨 EDTA, 에틸렌글리콜테트라아세트산(EGTA), 항응고제 시트레이트 덱스트로스 조제 A(ACDA), 나트륨 부티레이트 및 글리세로포스페이트로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 방법.
제21항에 있어서, 상기 분화 촉진제가 항생제 또는 약물인, 방법.
제36항에 있어서, 상기 항생제 또는 약물이 G418, 젠타마이신, 펜톡시필린 (1-(5-옥소헥실)-3,7-디메틸크산틴) 및 인도메타신으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 방법.
제21항에 있어서, 상기 분화 촉진제가 단백질인, 방법.
제38항에 있어서, 상기 단백질이 조직 플라스미노겐 활성화제(TPA)인, 방법.
제21항에 있어서, 상기 조직 배양 배지가 자가 혈장; 혈소판; 혈청; 또는 포유류 기원의 혈청을 함유하는, 방법.
제21항에 있어서, 상기 세포가 혈액백, 스캐폴드, 조직 배양백 또는 플라스틱 조직 배양 용기에서 배양되는, 방법.
제41항에 있어서, 상기 조직 배양 용기가 흡착성 또는 비흡착성 조직 배양 용기인, 방법.
제41항에 있어서, 상기 조직 배양 용기가 코팅 또는 비코팅되는, 방법.
제43항에 있어서, 상기 조직 배양 용기가 젤라틴, 콜라겐, 마트리겔 또는 세포외 매트릭스로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 제제로 코팅되는, 방법.
제21항에 있어서, 상기 세포가 약 18 내지 약 40℃의 온도에서 배양되는, 방법.
제21항에 있어서, 상기 세포가 약 4% 내지 약 10%의 이산화탄소 수준에서 배양되는, 방법.
제21항에 있어서, 상기 세포가 약 10% 내지 약 35%의 산소 수준에서 배양되는, 방법.
(i) 수임 세포를 획득하고, (ii) 수임 세포를 재프로그래밍시켜 재프로그래밍된 표적 세포를 획득하며, (iii) 재프로그래밍된 표적 세포를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자의 질환 또는 조직 손상을 치료하는 방법.
제1항 내지 48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 세포가 약제학적 조성물로 투여되는, 방법.
제49항의 약제학적 조성물.
환자의 한 가지 세포 계통의 조직 또는 세포를 복원 또는 보충하기 위한 또는 질환 또는 조직 손상을 치료하기 위한 약물 또는 약제학적 조성물의 제조시 하나 이상의 재프로그래밍된 표적 세포의 용도.
(i) 퍼스트 세포 계통의 수임 세포를 획득하고, (ii) 상기 수임 세포를 재프로그래밍하여 재프로그래밍된 표적 세포를 획득하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하기 위한 재프로그래밍된 표적 세포를 획득하는 방법.
제52항의 방법에 의해 획득된 재프로그래밍된 표적 세포 및 한 가지 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
(i) 우선 세포 계통의 수임 세포를 획득하고, (ii) 상기 수임 세포를 재프로그래밍하여 재프로그래밍된 표적 세포를 획득하며, (iii) 임의로, 상기 재프로그래밍된 표적 세포를 한 가지 이상의 약제학적 부형제와 혼합시키는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하기 위한 의약 또는 약제학적 조성물을 제조하는 방법.
제54항의 방법에 의해 제조된 약제학적 조성물.