CN105132500A - 一种svf的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种SVF的制备方法，在抽吸的人体脂肪加入胶原酶溶液和生理盐水，在37℃温度下消化30-90分钟，离心去上清，在下层中加入10ml生理盐水重悬，并通过100μm单细胞滤网过滤，去除滤液，留滤渣，并离心洗涤两次即得所述SVF。本发明方法胶原酶用量较低，制备得到的SVF中胶原酶含量非常低，基本可以忽略不计，同时本发明方法制备得到的SVF在细胞活性和增殖活性上也较常规方法制得的SVF要更高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种SVF的制备方法。
背景技术
目前，脂肪组织因其在能量调控、炎症反应和免疫应答方面的作用已被认为是一个内分泌器官。此外，它还是具有多向分化潜能的多功能细胞的来源之一，而这种多功能细胞就存在于脂肪组织的血管基质部分中。脂肪组织中的血管基质部分(SVF)是脂肪组织经胶原酶消化、过滤、离心除去成熟脂肪细胞后得到的。正因为SVF易于从脂肪组织中提取并含有丰富的、可塑性极强的脂肪组织来源的间充质干细胞(Adiposetissue-derivedmesenchymalstemcells，ASC),所以对SVF的提取和制备是有必要进行研究的。间充质干细胞(如骨髓基质干细胞、脂肪组织来源干细胞)在临床多个领域都有巨大的潜在应用空间，国内外均有大量相关的基础及临床实验研究，目前干细胞治疗在整形外科、心脏科、血管外科、烧伤科、消化科、血液科、风湿免疫科等领域都有相关临床应用开展。
但是，对于SVF的提取和制备就现有技术而言，还存在以下的不足：
1.胶原酶用量较多且最后的残留量也较多，大大影响了SVF的纯度；
2.制备得到的SVF细胞活性和增殖活性较低。
发明内容
本发明的目的，就是为了解决上述问题而提供了一种SVF的制备方法，该方法制得的SVF的细胞活性和增殖活性较高。
为实现上述目的，本发明的技术方案实施如下：
本发明的一种SVF的制备方法，包括以下具体步骤：
步骤1：将抽吸的人体脂肪静置至脂肪和液体分层，去除所述液体，用生理盐水洗涤所述脂肪两次后，将所述脂肪装于无菌离心管中，并加入胶原酶溶液和生理盐水，所述胶原酶溶液与所述脂肪的体积比为1:10；
步骤2：将所述无菌离心管倾斜放置于恒温摇床中，37℃温度下消化30-90分钟，所述恒温摇床的振荡频率每分钟300-400次以上；
步骤3：将所述无菌离心管放入离心机中离心10分钟，离心力为300-400g，在无菌环境下吸出上层清液，在下层中加入10ml生理盐水重悬，并通过100μm单细胞滤网过滤，去除滤液，滤渣备用；
步骤4：将步骤3中的滤渣离心洗涤两次，离心力为600-700g，每次3-5分钟，即得所述SVF。
上述的一种SVF的制备方法中，所述步骤1的详细操作如下：将抽吸的人体脂肪静置至脂肪和液体分层，去除所述液体，用生理盐水洗涤所述脂肪两次后，将10ml所述脂肪装于50ml无菌离心管中，并加入1ml胶原酶溶液，随后加入生理盐水至所述无菌离心管中的总溶液体积达20ml为止。
上述的一种SVF的制备方法中，所述胶原酶溶液的制备方法如下：在600单位胶原酶中加入2ml生理盐水，充分混合，即制得胶原酶溶液，所述胶原酶溶液的浓度为1mg/ml。
本发明方法胶原酶用量较低，制备得到的SVF中胶原酶含量非常低，基本可以忽略不计，同时本发明方法制备得到的SVF在细胞活性和增殖活性上也较常规方法制得的SVF要更高。
附图说明
图1是本发明制得的SVF与其他方法得到的SVF的生长曲线图；
图2是本发明制得的SVF的细胞增殖情况；
图3是采用其他方法制得的SVF的细胞增殖情况。
具体实施方式
下面将结合实施例，对本发明作进一步说明。
实施例
本实施例SVF的制备方法，包括以下具体步骤：
步骤1：制备胶原酶溶液：在600单位胶原酶中加入2ml生理盐水，充分混合，即制得胶原酶溶液，该胶原酶溶液的浓度为1mg/ml；
步骤2：将抽吸的人体脂肪静置至脂肪和液体分层，去除所述液体，用生理盐水洗涤所述脂肪两次后，将10ml脂肪装于50ml无菌离心管中，并加入1ml胶原酶溶液，随后加入生理盐水至无菌离心管中的总溶液体积达20ml为止；
步骤3：将无菌离心管倾斜放置于恒温摇床中，37℃温度下消化30-90分钟，恒温摇床的振荡频率每分钟300-400次以上；
步骤4：将无菌离心管放入离心机中离心10分钟，离心力为300-400g，在无菌环境下吸出上层清液，在下层中加入10ml生理盐水重悬，并通过100μm单细胞滤网过滤，去除滤液，滤渣备用；
步骤5：将步骤4中的滤渣离心洗涤两次，离心力为600-700g，每次3-5分钟，即得SVF。
本发明方法制得的SVF与现有方法制得的SVF试验对比如下：
1.胶原酶残留的检测：
文献中常用的胶原酶的消化脂肪的消化浓度是0.075％。
本发明中胶原酶消化浓度为0.01％，低于常用胶原酶的消化浓度，在反复2～3次清洗后，在获得的SVF中胶原酶残留量非常低，可忽略不计。
2.胶原酶用量的比较：
20ml脂肪，本发明方法采用2mg胶原酶，而常规方法采用24mg胶原酶，最后制得的SVF的量无明显差异，分别为：1.11±0.13×106(n＝5)和1.09±0.21×106(n＝5)p>0.05。
3.采用CCK8法测试不同方法制备的SVF的细胞活性，结果如图1所示，图1中A为本发明方法制得的SVF，B为现有方法制得的SVF，由此可见，本发明方法制得的SVF的细胞活性更高。
4.不同方法制备的SVFP0培养6天(40×)，其中图2是本发明方法制得的SVF，图3是现有方法制得的SVF，通过比较可以看到本发明方法制得的SVF的增殖活性更强。
以上实施例仅供说明本发明之用，而非对本发明的限制，有关技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以作出各种变换或变型，因此所有等同的技术方案也应该属于本发明的范畴，应由各权利要求所限定。
Claims (3)
1.一种SVF的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
步骤1：将抽吸的人体脂肪静置至脂肪和液体分层，去除所述液体，用生理盐水洗涤所述脂肪两次后，将所述脂肪装于无菌离心管中，并加入胶原酶溶液和生理盐水，所述胶原酶溶液与所述脂肪的体积比为1:10；
步骤2：将所述无菌离心管倾斜放置于恒温摇床中，37℃温度下消化30-90分钟，所述恒温摇床的振荡频率每分钟300-400次以上；
步骤3：将所述无菌离心管放入离心机中离心10分钟，离心力为300-400g，在无菌环境下吸出上层清液，在下层中加入10ml生理盐水重悬，并通过100μm单细胞滤网过滤，去除滤液，滤渣备用；
步骤4：将步骤3中的滤渣离心洗涤两次，离心力为600-700g，每次3-5分钟，即得所述SVF。
2.如权利要求1所述的一种SVF的制备方法，其特征在于，所述步骤1的详细操作如下：将抽吸的人体脂肪静置至脂肪和液体分层，去除所述液体，用生理盐水洗涤所述脂肪两次后，将10ml所述脂肪装于50ml无菌离心管中，并加入1ml胶原酶溶液，随后加入生理盐水至所述无菌离心管中的总溶液体积达20ml为止。
3.如权利要求1或2所述的一种SVF的制备方法，其特征在于，所述胶原酶溶液的制备方法如下：在600单位胶原酶中加入2ml生理盐水，充分混合，即制得胶原酶溶液，所述胶原酶溶液的浓度为1mg/ml。
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