CN111849886A

CN111849886A - Svf细胞以及制备方法与应用

Info

Publication number: CN111849886A
Application number: CN202010774237.0A
Authority: CN
Inventors: 董健伸; 徐汝强; 孙永沛; 程洪斌; 王晓东; 徐俊; 顾非凡; 高振宇
Original assignee: Bopin Shanghai Bio Medicine Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Bopinbeilai Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2020-08-04
Filing date: 2020-08-04
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2040-08-04
Also published as: CN111849886B

Abstract

本发明公开了SVF细胞以及制备方法与应用，将洗涤后的脂肪与SVF提取试剂混合，消化后离心处理，然后去除上层脂质，剩余部分加入洗涤液后过滤，所得细胞与洗涤液混合后离心分离，去除上清液，得到SVF细胞。本发明采用限定比例的混合胶原酶结合透明质酸，制备的SVF细胞活性大、活率高，而且得到的SVF细胞中胶原酶几乎没有残留，制备的SVF细胞可用于后续临床疾病治疗研究，比如关节炎药物的制备研究、软骨损伤药物的制备研究、美容药物的制备研究等。

Description

SVF细胞以及制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术，具体涉及SVF细胞以及制备方法与应用。

背景技术

作为能够完全为人体所接受并能够大量获得的组织填充材料，自体脂肪组织是理论上最理想的的软组织填充材料来源。然而脂肪移植物的低存活率及其体积存留的不可预知性限制了其临床应用。2007年Yoshimura等报导了将基质血管成分细胞辅助脂肪移植应用于隆胸手术,取得了良好的效果。间充质干细胞(MSCs)被首次发现存在于骨髓中,它是一种具有多向分化潜能的细胞,具有促进组织再生的潜能。MSCs能通过促进局部组织的血管形成及组织再生从而加速创面的愈合。但是由于骨髓中的MSCs含量较低而且提取困难而限制了骨髓来源的MSCs在临床中的应用。研究发现脂肪组织中也存在着大量的MSCs,而脂肪组织具有来源丰富、获取对组织损伤小的特点，传统的化学消化法所分离获得基质血管片段(SVF)为细胞悬液,并非黏附在细胞外基质(ECM)上的生理状态,所以移植后ASCs易被宿主巨噬细胞吞噬,使成熟脂肪细胞和ASCs均不能长久成活,这是导致脂肪移植保留率不稳定的主要原因，现有技术通过对Nanofat进一步的处理,提取一种富集SVF细胞和ECM的高浓度产物,以提高脂肪移植的成活率和稳定性,特命名为脂肪来源干细胞基质胶ECM/SVF-gel。2001年Zuk首次发现SVF包含多种细胞成分,包括MSCs、内皮前体细胞、巨噬细胞、平滑肌细胞等成分,而且可以诱导分化为成脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞等。还有研究认为SVF可以通过分化成血管内皮细胞、分泌促血管形成及抗凋亡的生长因子等多方面来促进难愈性创面的愈合。现有研究将SVF应用于各种病因所致的难愈性创面上,对其愈合结果进行综合性临床研究,从而对SVF的应用疗效做更全面的评估。这可以给今后SVF的应用提供更有价值的依据,从而解决难愈性创面治疗的这一难题。现有技术一般采用胶原酶溶解脂肪后离心过滤，对细胞活性有较大影响。

发明内容

本发明提供SVF细胞以及制备方法与应用，得到的SVF细胞存活率高，其中SVF可以称为基质血管成分，优选脂肪基质血管成分。

本发明采用如下技术方案：

SVF细胞及其提取方法，包括以下步骤，将洗涤后的脂肪与SVF提取试剂混合，消化后离心处理，然后去除上层脂质，剩余部分加入洗涤液后过滤，所得细胞与洗涤液混合后离心分离，去除上清液，得到SVF细胞。

本发明的SVF提取试剂，包括胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、透明质酸以及生理盐水。

本发明中，SVF提取试剂由胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、透明质酸加入生理盐水中制备得到；SVF提取试剂中，胶原酶Ⅰ的质量浓度为0.05～0.15%、胶原酶Ⅱ的质量浓度为0.15～0.25%、胶原酶Ⅳ的质量浓度为0.03～0.08%、透明质酸的浓度为0.8～1.5g/L，优选的，SVF提取试剂中，胶原酶Ⅰ的质量浓度为0.1%、胶原酶Ⅱ的质量浓度为0.2%、胶原酶Ⅳ的质量浓度为0.05%、透明质酸的浓度为1g/L。

本发明中，洗涤后的脂肪为现有技术，本发明的创造性在于提供新的SVF提取试剂，采用限定比例的混合胶原酶结合透明质酸，制备的SVF细胞活性好、活率高；优选的，洗涤后的脂肪与SVF提取试剂的体积比为1∶1；消化为37℃消化1小时，进一步优选的，消化时振荡。

本发明中，离心处理为450～550g离心4～6分钟；离心分离为250～350g离心2～4分钟；优选的，离心处理为500g离心5分钟；离心分离为300g离心3分钟。

本发明中，洗涤液为生理盐水；生理盐水一般为0.9%生理盐水。

现有技术一般采用一种胶原酶或者再加入添加剂进行消化脂肪得到SVF细胞，存在胶原酶残留以及细胞过度消化的问题，尤其是加入白蛋白后，SVF细胞纯度不高；本发明采用限定比例的混合胶原酶结合透明质酸，制备的SVF细胞活性大、活率高，而且得到的SVF细胞中胶原酶几乎没有残留，制备的SVF细胞可用于后续临床疾病治疗研究，比如关节炎药物的制备研究、软骨损伤药物的制备研究、美容药物的制备研究等。

附图说明

图1为本发明采集的脂肪图；

图2为本发明脂肪酶解消化同样；

图3为本发明实施例消化获得的SVF细胞；

图4为本发明实施例获得SVF细胞直径分布图；

图5为本发明实施例以及对比SVF细胞活性；

图6为本发明实施例以及对比SVF细胞总数图；

图7为本发明实施例获得SVF细胞活率；

图8为本发明实施例获得SVF细胞活率；

图9为本发明对比例获得SVF细胞-2活率；

图10为本发明对比例获得SVF细胞-3活率；

图11为本发明对比例获得SVF细胞-4活率；

图12为本发明对比例获得SVF细胞-5活率。

具体实施方式

本发明将洗涤后的脂肪与SVF提取试剂混合，消化后离心处理，然后去除上层脂质，剩余部分加入洗涤液后过滤，滤饼与洗涤液混合后离心分离，去除上清液，得到SVF细胞。

本发明的SVF提取试剂由胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、透明质酸以及生理盐水组成。涉及的原料为市售常规产品，具体的操作方法以及测试方法为本领域常规方法，制备在室温、常规条件下进行；使用Sigma公司胶原酶、默克公司的透明质酸。本发明实施例与对比例进行平行试验，除了SVF提取试剂的组成不同，其他条件都一样。

实施例

将胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、透明质酸加入生理盐水中制备得到SVF提取试剂，其中胶原酶Ⅰ的质量浓度为0.1%、胶原酶Ⅱ的质量浓度为0.2%、胶原酶Ⅳ的质量浓度为0.05%、透明质酸浓度为1g/L。

提取SVF细胞的方法，包括以下步骤：

（1）将脂肪组织（腹部、如图1）加入PBS（pH7.2）中洗涤，静置分层后，吸除下层洗涤液，再洗涤至洗涤液无色，吸除下层洗涤液，得到洗涤后的脂肪；

（2）将洗涤后的脂肪加入离心管中，再加入等体积的SVF提取试剂，于37℃振荡（80rpm）消化1小时，得到消化液，肉眼观察不到颗粒状物质，见图2；

（3）将消化液500g离心5分钟，然后去除上层脂质，剩余部分加入5倍体积的生理盐水，然后过滤（80μm滤膜），滤饼加入生理盐水中，然后300g离心3分钟，去除上清液，得到SVF细胞-1，见图3，图4为其粒径分布（细胞计数仪），可以看出本发明得到的SVF细胞中，脂肪干细胞比例很高。

对比例

将胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ加入生理盐水中制备得到SVF提取试剂，其中胶原酶Ⅰ的质量浓度为0.1%、胶原酶Ⅱ的质量浓度为0.2%、胶原酶Ⅳ的质量浓度为0.05%。然后按照实施例提取SVF细胞的方法，得到SVF细胞-2。

将胶原酶Ⅰ加入生理盐水中制备得到SVF提取试剂，其中胶原酶Ⅰ的质量浓度为0.3%。然后按照实施例提取SVF细胞的方法，得到SVF细胞-3。

将胶原酶Ⅰ、透明质酸加入生理盐水中制备得到SVF提取试剂，其中胶原酶Ⅰ的质量浓度为0.3%、透明质酸为1g/L。然后按照实施例提取SVF细胞的方法，得到SVF细胞-4。

将胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、人血白蛋白加入生理盐水中制备得到SVF提取试剂，其中胶原酶Ⅰ的质量浓度为0.1%、胶原酶Ⅱ的质量浓度为0.2%、胶原酶Ⅳ的质量浓度为0.05%、人血白蛋白的质量浓度为1%。然后按照实施例提取SVF细胞的方法，得到SVF细胞-5。

将胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、透明质酸加入生理盐水中制备得到SVF提取试剂，其中胶原酶Ⅰ的质量浓度为0.1%、胶原酶Ⅱ的质量浓度为0.2%、胶原酶Ⅳ的质量浓度为0.05%、透明质酸为10g/L。然后按照实施例提取SVF细胞的方法，得到SVF细胞-6。

结果表征

1、胶原酶残留

使用Sigma公司的胶原酶活性检测试剂盒检测胶原酶在最终的SVF细胞中的含量，实施例未检测到胶原酶残留。

2、SVF细胞活性

采用常规CCK8法，培养120h的结果见图5，横坐标1～6分别表示SVF细胞-1、SVF细胞-2、SVF细胞-3、SVF细胞-4、SVF细胞-5、SVF细胞-6。

3、SVF细胞量与细胞活率

将实施例提取的SVF细胞、对比例提取的SVF细胞每个重复1次，每次取5个样本，按平均值计算平均细胞数量，用台盼蓝计算细胞存活率，具体为现有常规方法。图6（第二次制备）为实施例提取的SVF细胞、对比例提取的SVF细胞平均细胞数量（数量级为10⁷），横坐标1～6分别对应SVF细胞-1、SVF细胞-2、SVF细胞-3、SVF细胞-4、SVF细胞-5、SVF细胞-6。SVF细胞-1、SVF细胞-2、SVF细胞-3、SVF细胞-4、SVF细胞-5、SVF细胞-6第一次制备、第二次制备的细胞存活率分别为95.94%、94.07%，91.79%、90.28%，68.68%、73.27%，78.43%、79.21%，90.81%、88.18%，90.67%、87.14%。

使用台盼蓝染色法鉴定细胞活率，结果经本发明实施例方法消化获得的SVF细胞活率高，见图7、图8，分别为第一次制备、第二次制备；图9为SVF细胞-2台盼蓝染色法鉴定细胞活率图，图10为SVF细胞-3台盼蓝染色法鉴定细胞活率图，图11为SVF细胞-4台盼蓝染色法鉴定细胞活率图，图12为SVF细胞-5台盼蓝染色法鉴定细胞活率图。

Claims

1.SVF细胞，其特征在于，SVF细胞的提取方法包括以下步骤，将洗涤后的脂肪与SVF提取试剂混合，消化后离心处理，然后去除上层脂质，剩余部分加入洗涤液后过滤，再与洗涤液混合后离心分离，去除上清液，得到SVF细胞；SVF提取试剂包括胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、透明质酸以及生理盐水。

2.根据权利要求1所述SVF细胞，其特征在于，将胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、透明质酸加入生理盐水中制备得到SVF提取试剂。

3.根据权利要求1所述SVF细胞，其特征在于，SVF提取试剂中，胶原酶Ⅰ的质量浓度为0.05～0.15%；胶原酶Ⅱ的质量浓度为0.15～0.25%；胶原酶Ⅳ的质量浓度为0.03～0.08%。

4.根据权利要求3所述SVF细胞，其特征在于，SVF提取试剂中，胶原酶Ⅰ的质量浓度为0.1%、胶原酶Ⅱ的质量浓度为0.2%、胶原酶Ⅳ的质量浓度为0.05%。

5.根据权利要求1所述SVF细胞，其特征在于，透明质酸的浓度为0.8～1.5g/L。

6.权利要求1所述SVF细胞在制备药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物包括关节炎药物、软骨损伤药物、美容药物。

8.SVF细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，将洗涤后的脂肪与SVF提取试剂混合，消化后离心处理，然后去除上层脂质，剩余部分加入洗涤液后过滤，再与洗涤液混合后离心分离，去除上清液，得到SVF细胞；SVF提取试剂包括胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、胶原酶Ⅳ、透明质酸以及生理盐水。

9.根据权利要求8所述SVF细胞的制备方法，其特征在于，洗涤后的脂肪与SVF提取试剂的体积比为1∶1；消化为37℃消化1小时。

10.根据权利要求8所述SVF细胞的制备方法，其特征在于，离心处理为450～550g离心4～6分钟；离心分离为250～350g离心2～4分钟。