KR101317492B1 - Ａｇ490을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 AG490 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 AG490 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 AG490 화합물은 염증성 사이토카인을 생성 및 분비하는 병인성 Th17 세포의 분화를 억제하는 효과가 우수하고, 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하고 염증 반응을 제어하는 특성을 갖는 면역조절 T 세포(Treg)의 활성을 증진시키는 효과가 우수하면서도 p53 유전자의 발현을 촉진시키므로 각종 면역반응의 조절 이상으로 유발되는 자가면역질환, 염증성질환 및 이식거부질환과 같은 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물 또는 면역 억제제로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

ＡＧ490을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating immune disease comprising ＡＧ490}

본 발명은 면역반응의 이상으로 유발되는 면역질환을 효과적으로 예방하고 치료하는데 사용될 수 있는 면역질환의 예방 또는 치료를 목적으로 한 약학 조성물에 관한 것이다.

각종 병원체에 대한 생체 방어 시스템으로 면역계에서 중심적 역할을 담당하는 세포군의 하나로 T 세포가 있다. T 세포는 인체의 흉선에서 생성되며 일련의 분화 과정을 거치면서 고유의 특성을 지닌 T 세포로 분화하게 되는데, 분화를 완료한 T 세포는 그 기능에 따라 크게 1형 보조 세포(Th1)와 2형 보조 세포(Th2)로 구분된다. 이 중에서 Th1 세포의 주된 기능은 세포 매개성 면역에 관여하고, Th2 세포는 체액성 면역에 관여하며, 면역계에서 이러한 두 세포 집단은 서로 과 활성화되지 않도록 서로 견제를 통해 면역계의 균형을 유지하고 있다.

따라서 면역 질환의 대부분은 이러한 두 면역 세포간의 불균형에 기인하는 것으로 볼 수 있는데, 예를 들어 Th1 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 면역질환이 발생할 수 있고, Th2 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 과민반응에 의한 면역질환이 발생하는 것으로 알려져 있다.

한편, Th1 세포의 분화에 대한 최근 연구 결과에 따르면, Th1 세포의 활성을 조절할 수 있는 새로운 그룹인 면역조절 T 세포(Treg)의 존재가 알려지면서 이를 이용한 면역질환의 치료에 대한 연구가 대두되고 있는데, Treg 세포는 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하여 염증 반응을 제어하는 특성이 있어, Treg 세포의 활성을 증가시키는 작용을 통해 면역질환과 염증질환을 치료하는 실험들이 많이 보고되고 있다.

또한, Treg 세포 이 외에 분화 과정에서 만들어지는 또 다른 그룹으로 Th17 세포가 있는데, Th17 세포는 미분화 T세포의 분화 과정에서 Treg 세포의 분화와 유사한 과정을 거치며 형성되는 것으로 알려져 있다. 즉, Treg 세포와 Th17 세포의 분화는 공통적으로 TGF-β의 존재 하에서 이루어지지만 Treg 세포의 경우 IL-6을 필요로 하지 않는 반면, Th17 세포의 경우에는 TGF-β와 함께 IL-6가 존재하는 상황에서 분화를 한다. 또한, 분화된 Th17 세포는 IL-17을 분비하는 것을 특징으로 한다.

Th17 세포는 Treg 세포와는 달리 면역질환에서 보이는 염증반응의 최전방에서 관여하여 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시키는 것이 밝혀지고 있다. 그러므로 면역질환 중 Treg 세포에 의해 제어되지 않는 면역질환의 경우, Th17 세포 활성의 억제를 표적으로 한 면역질환의 치료제 개발이 크게 부각되고 있다.

현재 사용되고 있는 면역질환치료제로는 T 세포에서의 신호변환 경로를 차단하는 면역 억제제가 가장 많이 사용되고 있는데, 이러한 면역억제제들은 독성, 감염, 임파종, 당뇨병, 진전(tremor), 두통, 설사, 고혈압, 오심, 신기능 장애 등의 부작용이 발생하는 문제점이 있다.

또한, T 세포의 활성화를 억제하는 방법을 통해 면역질환을 치료하는 방법 이외에도 면역 세포로부터 분비되는 사이토카인의 양을 조절하는 치료법 및 면역 세포로부터 분비되는 사이토카인을 표적으로 하는 항체를 이용한 치료법이 개발 중에 있다. 그러나 이러한 방법은 실제적으로 임상실험을 거쳐 환자들에게 적용하기까지 많은 시간이 소요되어야 하고, 항체를 이용하는 방법은 항체 제작 과정에서 너무 많은 비용이 든다는 문제점이 있다.

따라서 부작용이 없고 저렴하면서도 치료 효과가 우수한 새로운 면역질환 치료제의 개발이 필요한 실정이다.

이에 본 발명자들은 AG490 화합물이 병인성 세포인 Th17의 활성을 저해하고, 면역조절세포인 Treg의 활성을 Foxp3의 발현을 통해 증가시키는 작용이 있다는 사실 및 p53 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다는 사실을 최초로 규명함으로서, AG490을 면역 관련 질환의 치료제로 사용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 면역반응의 이상으로 유발되는 면역질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있도록, AG490 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 미분화 T 세포에 AG490 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리하는 단계를 포함하는 시험관(in vitro)내에서 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 시험관(in vitro)내에서 AG490 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)에 처리하는 단계를 포함하는 조절 T 세포를 활성화시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 시험관(in vitro)내에서 AG490 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 세포에 처리하는 단계를 포함하는 p53 유전자의 발현을 활성화시키는 방법을 제공하는 것이다.

나아가 본 발명의 다른 목적은 AG490 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역억제용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 AG490 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

<화학식 1>

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 AG490은 미분화 T 세포가 Th17 세포로 분화되는 것을 감소 또는 억제시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 AG490은 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성 또는 증폭을 촉진 또는 증가시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 AG490은 p53 유전자의 발현을 촉진 또는 증가시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역질환은 자가면역질환, 염증성질환 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection)질환으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 면역질환은 베체트병, 다발성 근육염/피부 근육염, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피피부염, 천식, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가면역 뇌수막염, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루프스, 애디슨병, 원형 탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상천포창, 건선, 류마티스열, 류마티스 관절염, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성빈혈 및 궤양성 대장염 중에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 AG490은 1μM ~ 20μM의 농도로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명은 미분화 T 세포에 AG490 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리하는 단계를 포함하는 시험관(in vitro)내에서 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화 감소 또는 억제는 IL-17 사이토카인의 생성 억제를 통해 이루어지는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 시험관(in vitro)내에서 AG490 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)에 처리하는 단계를 포함하는 조절 T 세포를 활성화시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 활성화된 조절 T 세포는 Foxp3의 발현이 증가될 수 있다.

또한, 본 발명은 시험관(in vitro)내에서 AG490 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 세포에 처리하는 단계를 포함하는 p53 유전자의 발현을 활성화시키는 방법을 제공한다.

나아가, 본 발명은 AG490 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역억제용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 AG490 화합물은 염증성 사이토카인을 생성 및 분비하는 세포 독성 Th17 세포의 분화를 억제하는 효과가 우수하고, 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하고 염증 반응을 제어하는 특성을 갖는 면역조절 T 세포(Treg)의 활성을 증진시키는 효과가 우수하면서도 p53 유전자의 발현을 촉진하므로 면역반응의 조절 이상으로 유발되는 자가면역질환, 염증성질환 및 이식거부질환과 같은 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물 또는 면역 억제제로 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 약물에 대한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 체내에 대해 안정한 효과가 있다.

도 1은 마우스로부터 분리한 비장세포에 처리한 AG490에 의해 분화된 Th17 세포에서 분비하는 IL-17 단백질 분비량 변화를 ELISA로 통해 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 마우스로부터 분리한 비장세포에 처리한 AG490에 의해 분화된 Th17 세포에서 분비하는 IL-17 단백질 분비량 변화를 FACS stain을 통해 확인한 그래프이다.
도 3은 마우스로부터 분리한 비장세포에 처리한 AG490에 의해 분화된 Th17 세포에서 분비하는 IL-17 단백질 분비량 변화를 Real-time PCR을 통해 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 마우스로부터 분리한 비장세포로부터 분화된 Th17 세포에 AG490 처리에 따른 Foxp3 유전자 발현의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 마우스로부터 분리한 비장세포로부터 분화된 Th17 세포에 AG490 처리에 따른 p53 유전자의 발현의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 AG490을 관절염 마우스 동물 모델에 주입한 후 관절염 임상수치를 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 AG490 처리에 따른 마우스 면역세포의 T 세포증식억제 효과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 AG490을 관절염 마우스 동물 모델에 주입한 후 CⅡ-specific IgG2a 양을 측정하여 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 AG490을 관절염 마우스 동물 모델에 주입한 후 관절과 연골 조직의 파괴정도를 조직염색을 통해 확인한 것이다.
도10은 본 발명의 AG490을 관절염 마우스 동물 모델에 주입한 후 관절과 연골 조직의 파괴정도를 조직염색을 통해 확인한 후, 이들의 결과를 바탕으로 염증 수치 및 연골 손상 정도를 수치화하여 그래프로 나타낸 것이다.

본 발명은 AG490 화합물이 면역 조절작용 활성화를 통해 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 효과가 있음을 최초로 규명하였으며, AG490 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명자들은 면역질환 치료를 위한 새로운 면역 조절제를 개발하기 위해 AG490 화합물에 주목하였는데, AG490은 티로신 키나아제 억제제(tyrosine kinase inhibitors)인 티르포스틴(tyrphostin)에 해당하는 티로신 키나아제 패밀리(tyrosine kinase family) 중 하나이다. AG490은 티로신 인산화를 통해 STAT 전사인자를 활성화한다고 알려진 Janus kinase(JAKs: JAK-2, JAK3/STAT, JAK3/AP-1, JAK3/MAPK)를 타겟으로 하는 티로신 키나아제 억제제로 알려져 있으며, EGFR 티로신 키나아제의 선택적 억제제로도 알려져 있다. 티르포스틴 AG490의 투여는 허혈/재관류 상태인 심장에 대해 심장보호 역할을 할 수 있음이 보고된 바 있으며(Mascareno E, et al.(2000) Mol.Cell.Biochem. 212:171 및 Mascareno E, et al.(2001) Circulation 104:1), 그 화학명은 2-Cyano-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-N-(phenylmethyl)-2-propenamide; 2-Cyano-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-N-(benzyl)-2-propenamide 이다.

본 발명자들은 상기 AG490 화합물이 면역조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성을 촉진시키는 것과 동시에 병인성 세포인 Th17 세포 분화를 억제시키면서도, 종양억제 유전자(anti-oncogene)인 p53의 발현을 촉진시킬 수 있다는 사실을 최초로 규명하였고, 상기 AG490 화합물이 면역질환의 예방 또는 치료 효과를 유도할 수 있다는 사실을 발견하였다.

따라서 본 발명은 AG490 화합물을 유효성분으로 하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

일반적으로 면역계는 정상상태에서는 자가항원에 대한 특이적 면역반응을 제어하고 있으며, 외부항원에 대한 면역반응도 억제하고 있는 경우가 있는데, 예컨대 임산부의 태아에 대한 반응 및 만성감염상태에 있는 미생물에 대한 면역반응을 들 수 있다. 이러한 현상들은 항원 특이적 면역관용이 유도될 수 있는 기전으로 클론 제거(clonal deletion), 클론 무반응(anergy) 및 면역조절 T 세포(Treg)에 의한 능동적 통제에 의해 유도되는 것으로 알려져 있다. 이식항원에 대한 면역관용이 우연히 획득된 일부 환자나 실험적으로 면역관용을 유도한 동물모델을 조사해 보면 위의 세 가지 기전 모두 이식면역관용에 관여한다는 사실이 확인되고 있고, 특히 최근에는 면역조절 T 림프구가 이식면역반응 뿐만 아니라 자가면역, 종양면역, 감염면역반응 등 생체의 거의 모든 면역반응을 통제하는데 관여하는 중요한 세포로 주목받고 있다.

특히, 최근 그 존재가 밝혀진 면역조절 T 세포, 즉, 면역조절 T 림프구(Treg)는 크게 자연성(natural) Treg 와 적응성(adaptive) Treg 세포로 나눌 수 있으며, 자연성 Treg인 CD4+ CD25+ T 세포는 이 세포가 흉선에서 새로이 만들어질 때부터 면역억제기능을 부여받게 되며, 정상개체의 말초 CD4+ T 림프구 중 5~10%의 빈도로 존재한다. 아직까지 이 세포의 면역억제 기전은 정확히 파악되지 못하고 있지만, Foxp3라는 유전자의 발현 제어 인자가 이 세포의 분화와 활성에 중요한 역할을 수행한다는 사실이 최근에 밝혀졌다. 또한, 말초 자연성 T 세포는 특정 환경하에서 자가 또는 외부항원의 자극을 받으면 면역억제효과를 나타내는 세포로 분화될 수 있는데, 이를 적응성(adaptive) 또는 유도성(inducible) Treg로 부르며, IL-10을 분비하는 Tr1, TGF-β를 분비하는 Th3 및 CD8 Ts등이 여기에 해당한다.

또한, 앞서 종래기술에도 기술한 바와 같이, T 세포는 Treg 세포 이외에 분화 과정을 통해 Th17 세포로도 분화되는데, Th17 세포는 Treg 세포와 공통적으로 TGF-β의 존재 하에서 이루어지지만 Treg 세포의 경우 IL-6을 필요로 하지 않는 반면, Th17 세포의 경우에는 TGF-β와 함께 IL-6가 존재하는 상황에서 분화하고, IL-17을 분비하는 것을 특징으로 한다.

또한, Th17 세포는 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시키는 세포독성을 가지는 특성이 있다. 따라서 Th17 세포로의 분화 또는 활성의 억제는 면역질환을 치료할 수 있는 방법 중 하나이다.

한편, p53 유전자는 암 억제 유전자(tumor suppressor gene)라고 불리는 유전자로서 50~60%의 암 환자의 경우 이 유전자에 돌연변이 또는 결손이 일어나 p53 단백질이 활성을 나타내지 못한다고 보고되어 있다. 구체적으로 p53 단백질은 세포내에 DNA 손상이 유발된 경우 세포를 세포 주기 G1기에 멈추게 하여 DNA 손상을 복구(repair)하는 과정이 이루어지게 함으로서 암세포가 생성되지 못하도록 작용한다. 또한 p53 단백질은 이미 암세포가 성장하여 급격히 커진 경우, 형질전환된 세포가 스스로 사멸되도록 하는 프로그램(programmed cell death, PCD)을 작동시켜 이상 세포를 조직 내에서 제거하는 아폽토시스(apoptosis)가 유발되도록 작용하여 암이 진행되는 것을 막는다고 알려져 있다. 이외에도 p53 단백질은 세포 분열시 방추사의 작용에도 관여하며, G1-사이클린 의존성 키나제(G1-cyclin dependent kinases, cdks)를 억제하는 p21WAF1/CIP1 단백질을 포함한 몇몇 유전자의 발현을 조절하여 암을 억제하는 작용을 나타낸다고도 알려져 있다.

그러나 무엇보다 p53 유전자가 관심을 끌고 있는 이유는 p53이 guardian of genome으로 불릴 정도로, 광범위하게 세포 주기, 세포 분화, DNA 복구, 아폽토시스 등과 같은 각종 세포 반응에서 중요한 역할을 담당하기 때문이다. 대표적인 자가면역질환의 하나인 류마티스 관절염(RA)을 앓는 환자들의 활막세포로서, 섬유모세포 모습을 보인다고 알려진 FLS(fibroblast like synoviocyte)에서 p53과 관련한 체세포 돌연변이(somatic mutation)가 처음으로 보고 된 이후(Firestein GS, Echeverri F, Yeo M, Zvaifler NJ, Green DR. Somatic mutations in the p53 tumor suppressor gene in rheumatoid arthritis synovium. Proc Natl Acad Sci U S A 1997; 94: 10895-900), 이를 뒷받침하는 많은 연구가 진행되었다. 이러한 학설은 정상 FLS에서 p53 기능을 억제시키면 정상 FLS가 RA에서 관찰되는 공격적, 침습적 성향을 보이는 FLS로 바뀌는 사실이 입증하였다(Pap T, Muller-Ladner U, Gay R, Gay S. Gene therapy in rheumatoid arthritis: how to target joint destruction? Arthritis Res 1999; 1: 5-9).

또한, 류마티스 관절염 환자에서 얻은 활막조직과 배양 활막세포 모두에서 p53 돌연변이가 상당수에서 발견되었고, 이들 대부분은 이행 돌연변이(transition mutation)로서, 만성 염증과정 중 발생하는 활성 산소(reactive oxygen), 활성 질소(reactive nitrogen)에 의해 발생하는 것으로 알려져 있다. 더불어, 체내에서 p53 돌연변이는 주로 dominant negative로 작용하여 정상적인 p53의 세포 조절 작용에 영향을 미쳐 활막세포 증식을 유발하며, 콜라겐 유발 관절염 모델에서 p53 유전자를 제거하면(p53-/- mice) 관절염이 더욱 심한 형태로 발생하는 결과를 보인다(Yamanishi Y, Boyle DL, Pinkoski MJ, et al. Regulation of joint destruction and inflammation by p53 in collagen-induced arthritis. Am J Pathol 2002; 160: 123-30).

이렇듯 p53 유전자 및 단백질은 항암요법에서 뿐만 아니라 류마티스 관절염을 포함한 면역질환에 관련한 세포반응 조절 인자로서 그 유용성이 널리 알려져 있는바, p53 유전자의 발현을 활성화시켜 p53 단백질의 생성을 촉진시킬 수 있다면 암은 물론 각종 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 하나의 방법이 될 수 있을 것이다.

이에 본 발명자들은 본 발명에 따른 AG490 화합물이 미분화 T 세포가 Th17 세포로 분화되는 것을 감소 또는 억제시킬 수 있는 지에 대하여 조사하고, T 세포의 조절, 구체적으로 조절 T 세포(Treg 세포)의 분화 조절을 증가 또는 촉진시킬 수 있는지를 조사하고자 하였으며, 더불어 AG490 화합물이 p53 유전자의 발현을 촉진 또는 증가시킬 수 있는지 확인하였다.

이에 본 발명의 일실시예에서는 T 세포가 Th17 세포로 분화될 수 있는 자극조건을 형성한 후, AG490 화합물을 각 농도별로 처리하여 배양하고, Th17세포로 분화한 세포에서의 IL-17 생성량을 측정하였고, 이를 통해 Th17 세포의 분화정도를 확인하였다. 이를 위하여 본 발명자들은 마우스로부터 분리된 비장 세포를 모아 ELISA, real-time PCR, FACs stain을 각각 진행하였다(실시예 1 참조).

그 모든 결과에서 AG490을 처리하지 않은 대조군에 비하여 AG490을 처리한 실험군의 경우 IL-17의 생성이 AG490의 농도에 비례하여 두드러지게 감소하였고, IL-17의 발현은 AG490의 농도에 비례하여 점점 감소하는 것으로 나타났다(도 1 내지 3 참조).

본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 본 발명자들은 T 세포가 Th17 세포로 분화될 수 있는 자극조건 하에서 AG490이 면역조절 T 세포(Treg)의 활성 또는 증식에 어떠한 영향을 미치는지를 조사하기 위하여, AG490의 처리에 따른 Foxp3 유전자의 발현정도를 측정하였다. 그 결과, AG490을 처리한 군의 경우에는 AG490을 처리하지 않은 군에 비해 현저하게 유전자의 발현이 증가하는 것으로 나타났다. 또한, Foxp3 유전자의 발현 정도는 처리한 AG490의 농도에 비례하여 증가하는 것으로 나타났다(도 4 참조).

상기 Foxp3는 흉선(thymus)으로부터 유래하는 면역조절 T 세포(Regulatory T cell)에 주로 존재하고, CD4+ CD25+ 표지 항원을 가진 세포에 존재하는 전사 조절 인자(transcriptional factor)로서, 그 기능은 Foxp3를 발현하는 T 세포에 대한 항원 인지시 항원에 대해 저반응성을 가짐과 동시에 흉선으로부터 분화되어 나온 Foxp3를 발현하지 않는 CD4+ CD25- T 세포 중 잠재적으로 자가 면역증을 유발할 수 있는 T 세포들에 대하여 IL-2의 생성과 세포분열 현상을 억제하는 억제자 T 세포 (suppressor T cell)로서의 역할을 가지고 있다. 또한, Foxp3는 Foxp3를 발현하는 조절 T 세포 및 이와 세포-세포간 접촉(cell-cell contact)을 통해 CD25- T 세포에 대하여서는 IL-2 뿐만이 아니라 전사인자인 NFAT의 영향을 받는 IL-4, IFN-γ 등의 전사 조절을 억제하는 기능을 하는 것으로 밝혀져 있다. 따라서 상기와 같은 작용을 하는 Foxp3를 발현하고 있는 T 세포의 경우, 면역반응을 억제 또는 조절하는 작용을 통해 면역질환을 치료하는데 응용되고 있고, 또한, 인간에 존재하는 Foxp3를 발현하는 CD4+ T 세포의 자가 항원 특이적인 T 세포(self-antigen specific T cell clone)를 고농도의 IL-2 사이토카인 처리 및 항-CD3, 항-CD28 항체와의 조합처리를 통해서 그 수를 증가시켜 세포 치료방법으로 응용하고자 하는 시도들이 있어왔다. 따라서 Foxp3의 발현 확인은 Treg 세포의 활성 또는 증폭을 측정할 수 있는 지표가 된다.

본 발명의 또 다른 일실시예에서는, 본 발명에 따른 AG490 화합물이 T 세포가 Th17 세포로 분화될 수 있는 자극조건 하에서 p53 유전자의 발현에 미치는 영향에 대해 분석하였다. 그 결과, AG490을 처리한 군의 경우 AG490을 처리하지 않은 대조군에 비교하여, p53 유전자의 발현이 증가됨을 확인할 수 있었고, AG490의 처리 농도에 비례하여 탁월한 p53 유전자 발현의 증가 또는 촉진 효능을 알 수 있었다(도 5 참조).

따라서 본 발명자들은 상기 결과를 통해 AG490 화합물이 미분화된 T 세포가 IL-17을 생성하는 병인성 세포인 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제한다는 사실을 알 수 있었으며, 염증적 사이토카인인 IL-17의 생성을 억제함을 확인할 수 있었다. 또한, 면역조절세포인 Treg의 주요인자인 Foxp3의 발현을 증가시킨다는 사실 및 p53 유전자의 발현을 촉진하는 작용을 하는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명의 또 다른 일실시예에서는, AG490 화합물의 처리에 따른 관절염 개선 효과를 in vivo상에서 확인하기 위하여, 관절염 마우스 동물모델을 제작한 후 AG490 화합물을 처리한 후 관절염 수치 측정, CⅡ specific IgG2a 양 측정, 면역조직화학염색법을 통한 관절파괴 정도를 분석하였다. 그 결과 AG490 화합물 처리군에서 관절염 수치, CⅡ specific IgG2a 양이 유의적으로 낮게 나타났으며, 관절파괴정도도 낮게 측정되었다.

그러므로 본 발명에 따른 AG490 화합물은 미분화 T 세포가 병인세포인 Th17 세포로 분화되는 것을 감소 또는 억제시키면서도, 동시에 조절 T 세포(Treg)를 활성 또는 증폭시키며, p53 유전자의 발현 또한 촉진 또는 증가시켜 p53 단백질을 활성화시킴으로서 암 또는 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 특징이 있다.

즉, 본 발명에 따른 AG490 화합물은 면역반응 또는 염증반응을 억제하고, 유익한 세포조절 작용을 유발함으로써 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명에서 상기 "활성"이란 생체 내에서 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg), 즉, 자연성(natural) Treg 와 적응성(adaptive) Treg 세포를 모두 포함하는 Treg 세포가 가지는 모든 기작이 촉진 또는 증진되는 것을 말하며, 생체 내의 면역반응이 정상상태를 유지하도록 면역조절작용, 예컨대 면역억제반응이 촉진 또는 증진되는 것을 말한다.

또한, 상기 "증폭(expansion)"이란 미분화 T 세포가 조절 T 세포로 분화 및 증식되는 것을 말하는 것으로서, '분화(differentiation)'는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말하며, '증식(proliferation)' 은 세포가 분열되어 동질의 것이 불어나는 것으로서 보통 다세포생물의 체내에서 세포수가 증가되어 가는 것을 말한다.

그러므로 본 발명은 AG490 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 AG490은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다.

<화학식 1>

본 발명에 따른 상기 AG490 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

본 발명에 따른 AG490 화합물은 천연으로부터 분리되거나 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조된 것을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 AG490 화합물은 미분화 T 세포가 병인세포인 Th17 세포로 분화하는 것을 감소 또는 억제시킬 수 있고, 동시에 조절 T 세포의 활성 또는 증폭을 촉진 또는 증진시키는 작용 및 p53 유전자의 발현을 촉진 또는 증가시키는 작용을 통해 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명에서 상기 암은 비정상적인 세포의 빠르고 제어되지 않는 성장을 특징으로 하는 질환으로 정의된다. 암 세포는 국부적으로 확산되거나 또는 혈류 및 림프계를 통해 신체의 다른 부분으로 확산될 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 암의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 결장암, 직장암, 항문부근암, 골암, 위암, 뇌척수종양, 두경부암, 흉선종, 중피종, 식도암, 담도암, 방광암, 고환암, 소장암, 생식세포종, 자궁 내막암, 나팔관암종, 질암종, 음문암종, 다발성 골수종, 육종, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 방광암, 요도암, 뇌하수체 선종, 신장골반 암종, 척수 종양, 다발성 골수종, 신경교종암, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 조혈종양, 섬유육종, 신경아세포종, 성상세포종, 유방암, 자궁경부암, 난소암, 전립선암, 췌장암, 신장암, 간암, 뇌암, 폐암, 림프종, 백혈병, 악성 흑색종, 피부암 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 "면역질환"은 포유류 면역계의 구성성분들이 포유류의 병리상태를 야기하거나, 매개하거나 또는 기타 공헌하는 질환을 의미한다. 또한, 면역 반응의 자극 또는 중단이 그 질병의 진행에 보상적인 효과를 갖는 질환을 모두 포함할 수 있는데, 본 발명에서는 과민성 면역반응으로 인해 야기되는 질환들을 포함할 수 있다. 이러한 면역질환의 예로는 이에 제한되지는 않으나, 자가면역질환, 염증성질환 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection)질환 등을 모두 포함할 수 있다.

또한, 모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중의 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 비자기(non-self) 항원들에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있는 능력을 가지고 있다. 이처럼 자기항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라고 한다.

그러나 이러한 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는데 이러한 과정에 의해 발생되는 질환을 자가면역질환이라고 한다.

또한, "염증성 질환"이란 염증유발인자 또는 방사선조사 등 유해한 자극으로 인해 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1(interleukin-1), IL-6, 프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 또는 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증유발물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 말한다.

한편, 성공적인 장기 이식을 위해서는 이식할 세포 및 장기에 대한 수혜자의 면역 거부반응을 극복해야 한다. 이식면역거부반응의 주요 매개체는 T 세포로서, 이식편(graft)에 발현되어져 있는 주조직적합성분자(major histocompatibility complex, MHC)를 T 세포 수용체(T cell receptor)가 인지함으로써 면역반응이 유도되어 이식거부반응이 발생되게 된다. 따라서 이러한 이식면역거부반응을 감소시키기 위해 면역억제제들이 사용되고 있는데 이러한 면역억제제들의 공통된 목적은 이식편에 대한 T 세포-매개 면역반응을 억제하는 것이며, 최근에는 조절 T 세포를 이용하여 면역반응을 억제함으로써 이식거부질환을 치료하려는 방법이 시도되고 있다.

또한, 본 발명에서 상기 면역질환의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 베체트병, 다발성 근육염/피부 근육염, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피피부염, 천식, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가면역 뇌수막염, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루프스, 애디슨병, 원형 탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상천포창, 건선, 류마티스열, 류마티스 관절염, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성빈혈, 궤양성 대장염 등을 포함할 수 있다.

그러므로 본 발명에 따른 상기 조성물은 면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 조성물에 함유되는 AG490은 1~20μM의 농도로 포함될 수 있다.

상기 "치료"란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 "치료"란 용어는 "치료하는"이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 면역질환의 "치료" 또는 "치료요법"은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:

(1) 면역질환의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴,

(2) 면역질환의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함,

(3) 면역질환을 경감시킴.

(4) 면역질환의 재발을 예방함, 및

(5) 면역질환의 증상을 완화함(palliating)

본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 AG490 화합물 또는 그의 염을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 면역질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

본 발명에 따른 AG490 화합물 또는 그의 염의 약학적으로 유효한 양은 0.5~100mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5~5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서 약학적으로 허용되는이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 면역질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

따라서 본 발명은 AG490 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약제를 제공할 수 있으며, 나아가 본 발명은 AG490 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 면역억제용 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 미분화 T 세포에 AG490 화합물 또는 그의 염을 처리하는 단계를 포함하는 시험관(in vitro)내에서 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제하는 방법을 제공할 수 있으며, 상기 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화 또는 활성의 감소 또는 억제는 IL-17 사이토카인의 생성 억제를 통해 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명은 시험관(in vitro)내에서 AG490 화합물 또는 그의 염을 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)에 처리하는 단계를 포함하는 조절 T 세포를 활성화시키는 방법을 제공할 수 있으며, 본 발명에 따라 활성화된 상기 조절 T 세포는 Foxp3의 발현이 증가될 수 있다.

더불어, 본 발명은 시험관(in vitro)내에서 AG490 화합물 또는 그의 염을 세포에 처리하는 단계를 포함하는 p53 유전자의 발현을 활성화시키는 방법을 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 시험관(in vitro)내에서 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제하는 방법, 조절 T 세포를 활성화시키는 방법, 및 p53 유전자의 발현을 활성화시키는 방법에 있어서 AG490 화합물을 세포에 처리하는 방법은 상기 세포를 배양하는 배지에 AG490 화합물을 직접 처리하거나 또는 상기 본 발명에 따른 AG490 화합물을 유효성분으로 하는 조성물을 배양 배지에 처리하는 것일 수 있다. 또한, 이때 상기 배양 배지에 처리할 수 있는 AG490 화합물의 농도는 최종농도가 1μM~20μM이 되도록 처리할 수 있으며, 본 발명의 일실시에에서는 AG490 화합물의 농도가 최종 2.5μM, 5μM 및 10μM이 되도록 세포의 배양 배지에 첨가하였다.

나아가 본 발명에 따른 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 면역 조절 T 세포(Treg)의 활성 또는 증폭 효과가 우수하고, 염증성 사이토카인을 생성하는 병인성 세포인 Th17 세포 분화를 억제하는 효과가 뛰어나며, p53 유전자의 발현을 활성화시키는 효과가 우수할 뿐만 아니라, 약물에 대한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 체내에 대해 안정한 특징이 있다.

따라서 본 발명은 AG490 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 면역질환의 증상을 개선 또는 예방할 수 있는 식품용 조성물을 제공할 수 있으며, 본 발명에 따른 상기 식품용 조성물은 면역질환 증상의 개선 또는 예방에 효과가 있는 식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 용이하게 활용할 수 있다.

본원에서 상기 "식품"이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.

본원발명에 따른 상기 식품용 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본원발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

또한, 상기 "기능성 식품"이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

또한, 본원발명에서 상기 "음료"란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 면역질환 증상의 개선 또는 예방용 조성물을 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

나아가 상기 기술한 것 이외에 본원발명의 면역질환 증상의 개선 또는 예방을 위한 식품용 조성물을 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

본원발명의 식품용 조성물을 함유하는 식품에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001중량% 내지 90중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 40중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100ml를 기준으로 0.001g 내지 2g, 바람직하게는 0.01g 내지 0.1g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1>

AG490 에 의한 IL -17 분비 억제 효과 분석

본 발명자들은 AG490 화합물이 면역질환을 치료할 수 있는 효과가 있는지 확인하기 위해, 이러한 질환과 관련된 Th17세포에서 AG490에 의한 IL-17 사이토카인의 분비 변화를 측정하였으며, 이를 위해 Th17세포를 하기 기재된 바와 같이 CD4+ T세포로부터 분화시켜 수득하였다.

<1-1> Th17 세포로의 분화 유도 및 AG490 처리

본 발명자들은 AG490 화합물이 병인성 세포인 Th17세포에서 염증성 사이토카인인 IL-17의 생성을 억제하는 활성이 있는지를 확인하기 위해 먼저 마우스로부터 비장(spleen)세포를 수득하였는데, 즉, 마우스로부터 적출된 비장은 유리 슬라이드를 이용하여(teasing slide) 비장 조직을 잘게 갈은 후 적혈구 용혈 용액으로 비장내의 적혈구를 제거하였다, 이후 PBS 완충 용액을 첨가하고 원심분리하여 세척함으로써 비장세포를 수득하였다. 그런 뒤, 상기 비장에서 분리한 단일세포 1× 106에 대하여 anti-CD3 항체가 1μg/mL로 코팅(coating) 처리된 24 웰 플레이트에 분주하고, Th17세포를 자극시킬 수 있는 조건인 anti-CD28 항체 1μg/mL, TGF-β 2ng/ml, IL-6 20ng/ml, anti-IL-4 10μg/ml, anti-IFNr 10μg/ml를 동시에 함께 처리한 후, 3일 동안 세포를 배양하였으며, 이때 상기 세포에 AG490 화합물을 각각 2.5μM, 5μM, 10μM의 농도로 처리하여 배양하였다. 이때 대조군으로는 AG490 화합물을 처리하지 않은 군을 사용하였다.

<1-2> ELISA 를 통한 발현분석

상기에서 배양한 세포들의 배양 상층액을 모아 sandwich ELISA를 이용하여 IL-17 발현 정도를 측정하였다. 이를 위해 먼저 96웰 플레이트에 단클론성 anti-IL-17을 2μg/mL으로 처리하여 4℃에서 밤새 반응시켰으며, 반응 후 차단용액(1% BSA/PBST)으로 비특이적 결합을 차단시켰다. 이후 IL-17 recombinant를 1/2씩 연속 희석하여 standard로 사용하였으며, 세포배양 상층액을 넣고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후, biotinylated anti-IL-17을 2시간 동안 실온에서 반응시킨 후 4회 세척한 다음, ExtraAvidin-Alkaline Phosphatase conjugate를 희석하여 첨가하고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후, PNPP/DEA 용액을 넣고 발색한 후 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 병인성 세포인 Th17 세포로부터 생성되는 염증성 사이토카인인 IL-17은 본 발명의 AG490 화합물의 처리에 의해 그 생성이 억제되는 것으로 나타났으며, AG490 농도에 의존적으로 IL-17의 생성이 감소되는 것으로 나타났다. 이로서 본 발명자들은 AG490 처리에 의해 미분화 T 세포가 IL-17을 분비하는 Th17 세포로 분화되는 것이 억제된다는 사실을 확인할 수 있었다.

<1-3> FACs Stain 을 통한 분석

AG490 처리에 따른 병인성 세포인 Th17 세포로부터 생성되는 염증성 사이토카인인 IL-17의 생성량을 살펴보기 위하여, 상기에서 배양한 마우스의 비장세포를 모은 후, 당업계에서 사용되고 있는 유세포분석을 위한 FACs buffer로 세척하였다. 비특이성 결합을 억제하기 위해 blocking을 4℃에서 15분간 반응한 뒤, 세포 표면 인자인 anti CD4-PerCP를 넣고 4℃에서 30분간 반응한 뒤, FACS buffer로 세척하였다. 세포 내 IL-17의 양을 측정하기 위해 cytofix/cytoperm 시료를 처리하여 30분간 반응한 뒤 perm wash buffer로 세척하였다. 그 다음, anti IL-17 PE를 넣고 4℃에서 30분간 반응한 뒤 perm wash buffer로 세척하였다. 염색이 끝난 세포는 FACs buffer로 세척한 후, 유세포분석기(FACs,fluorescent-activated cell sorter)를 이용하여 AG490 화합물 처리에 따른 IL-17 사이토카인의 발현 정도를 분석하였다.

그 결과, 본 발명자들은 AG490을 처리하였을 경우, 도 2에 나타난 바와 같이, 대조군의 경우는 IL-17의 발현정도가 11.8로 나타났고, AG490을 2.5μM 처리한 경우는 11로 나타났으며, 5μM를 처리하였을 경우는 8.11로 나타났다. 또한, AG490을 10μM로 처리한 경우에는 IL-17의 발현정도가 3.7로 매우 적은 값을 나타내었다.

따라서 상기의 결과를 통해 AG490의 처리로 인해 IL-17의 발현이 감소된다는 사실을 알 수 있었으며, 이러한 발현변화는 AG490의 처리 농도에 비례하여 더욱 감소한다는 사실을 확인할 수 있었다. 이는 ELISA를 이용하여 측정한 결과와 일치하는 결과였다.

<1-4> Real - time PCR 을 통한 분석

AG490의 효과를 알아보기 위하여, Th17 세포로부터 생성되는 염증성 사이토카인인 IL-17의 유전자 발현을 상기에서 배양한 비장 세포 RNA를 이용하여 Real-time PCR로 확인하였다.

Real-time PCR은 LightCycler 2.0 System Instrument를 이용하여 수행하였고, 이를 위한 반응 화합물은 각각의 cDNA 1μl, start용 효소인 premix Ex Taq 10μl, 표 1에 기재된 서열을 갖는 프라이머 쌍을 혼합한 후 증류수로 최종 부피를 20μl로 만들었다. 반응 조건은 95℃에서 먼저 10분간 반응시킨 후 95℃에서 10초간 변형 반응, 60℃에서 5초간 결합 반응, 72℃에서 10초간 신장 반응을 총 50회 반응시켰다. Cycle threshold(Ct)값을 분석하여 IL-17의 mRNA 발현량을 beta-actin mRNA 발현량과 상대정량으로 나타내었다.

프라이머 서열

프라이머	프라이머 서열	서열번호
IL-17 센스	5'-TCT CAT CCA GCA AGA GAT CC-3'	1
IL-17 안티센스	5'-AGT TTG GGA CCC CTT TAC AC-3'	2
Foxp3 센스	5'-GGC CCT TCT CCA GGA CAG A-3'	3
Foxp3 안티센스	5'-GCT GAT CAT GGC TGG GTT GT-3'	4
p53 센스	5'-ACT CAG ACT GAC TGC CTC TG-3'	5
p53 안티센스	5'-TTA TGA CTT CAG GGC TGA GA-3'	6

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, AG490을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 AG490 주입군에서 IL-17 유전자 발현이 유의적으로 감소함을 알 수 있었으며, AG490의 처리 농도가 증가할수록 IL-17의 발현 정도는 비례하여 감소함을 알 수 있었다. 특히, AG490을 10μM로 처리하였을 때에는 IL-17의 발현은 거의 발견되지 않아 뛰어난 항 면역작용을 확인할 수 있었다.

< 실시예 2>

AG490 이 Foxp3 유전자 발현에 미치는 영향 분석

제어성 T 림프구, 즉 Treg(regulatory T lymphocytes) 세포는 면역 관용의 유지에서 핵심적인 역할을 수행하는 것으로 알려져 있고(Nat. Rev. Immunol. 2009, 7:305), 주로 흉선에서 생산되고 전사 인자인 Foxp3의 발현이 요구되며, Foxp3는 염증성 사이토카인의 생성을 억제하는 역할도 하는 것으로 알려져 있다.

이에 본 발명자들은 본 발명에 따른 AG490 화합물이 면역조절 세포인 Treg 세포의 활성을 활성화시키는 작용이 있는지를 조사하기 위해, 상기 실시예 1의 세포 자극 조건으로 마우스의 비장 세포를 자극시킨 후, 상기 세포로부터 발현되는 Foxp3의 발현 정도, 즉, mRNA를 Real-time PCR 반응을 통해 측정하였다.

Real-time PCR은 LightCycler 2.0 System Instrument를 이용하여 수행하였고, 이를 위한 반응 화합물은 각각의 cDNA 1μl, start용 효소인 premix Ex Taq 10μl, 상기 표 1에 기재된 서열을 갖는 프라이머 쌍을 혼합한 후 증류수로 최종 부피를 20μl로 만들었다. 반응 조건은 95℃에서 먼저 10분간 반응시킨 후 95℃에서 10초간 변형 반응, 60℃에서 5초간 결합 반응, 72℃에서 10초간 신장 반응을 총 50회 반응시켰다. Cycle threshold(Ct)값을 분석하여 Foxp3의 mRNA 발현량을 beta-actin mRNA 발현량과의 상대정량으로 나타내었다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, Foxp3의 발현은 AG490의 처리에 의해 유의적으로 촉진되며, 이는 AG490의 농도 의존적으로 점점 증가하는 것으로 나타났다. 따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 AG490의 Foxp3 발현 활성화 효과를 확인함에 따라 AG490이 면역조절세포인 Treg 세포를 활성화시키는 작용을 통해 면역질환을 예방 및 치료할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

< 실시예 3>

AG490 이 p53 유전자 발현에 미치는 영향 분석

본 발명자들은 AG490 화합물이 병인성 세포인 Th17세포에서 종양억제유전자로도 잘 알려진 p53 유전자의 발현을 촉진하는 활성이 있는지를 확인하기 위해 상기 <실시예 1>에서 배양한 Th17세포에 AG490을 2.5, 5, 10μM 처리한 후, AG490을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 p53 유전자의 발현을 Real-time PCR 반응을 통해 살펴보았다.

Real-time PCR은 LightCycler 2.0 System Instrument를 이용하여 수행하였고, 이를 위한 반응 화합물은 각각의 cDNA 1μl, start용 효소인 premix Ex Taq 10μl, 상기 표 1에 기재된 서열을 갖는 프라이머 쌍을 혼합한 후 증류수로 최종 부피를 20μl로 만들었다. 반응 조건은 95℃에서 먼저 10분간 반응시킨 후 95℃에서 10초간 변형 반응, 60℃에서 5초간 결합 반응, 72℃에서 10초간 신장 반응을 총 50회 반응시켰다. Cycle threshold(Ct)값을 분석하여 p53의 mRNA 발현량을 beta-actin mRNA 발현량과의 상대정량으로 나타내었다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, p53의 발현은 AG490의 처리에 의해 유의적으로 촉진되며, 이는 AG490의 농도 의존적으로 점점 증가함을 알 수 있었다. 특히 하는 것으로 나타났다. 특히, AG490을 10μM로 처리하였을 때에 p53 유전자의 발현이 급격히 증대되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 AG490 화합물이 각종 세포반응을 조절하는 p53 유전자의 발현을 활성화시킬 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

< 실시예 4>

AG490 화합물의 처리에 따른 관절염 개선 효과

실시예 <4-1> 관절염 동물모델에 AG490 화합물 주입

관절염 마우스 모델 (collagen-induced arthritis: 이하 간단하게 ‘CIA'라 함)을 제조하기 위해 6주령의 수컷 DBA/1J 마우스에 제2형 콜라겐(bovine type Ⅱ collagen: 이하 간단하게 ‘CⅡ'라 함)과 CFA(complete freud's adjuvant) 각각을 100μl 씩 혼합하여 피내주사로 1차 면역하였다. 1주일 후에 AG490 화합물을 3일 마다 500μg/mice, 복강 내 주사하였다 (총 9회).

실시예 <4-2> 관절염 수치 측정

본 발명의 AG490 화합물 처리에 따른 관절염의 치료 효과를 알아보기 위하여, 상기 실시예<4-1>을 통해 제조된 마우스(AG490 화합물 주입된 관절염 마우스)를 희생하여 관절염증의 임상수치(clinical score)를 측정하였다. 대조군으로는 AG490 화합물을 처리하지 않은 군을 사용하였다.

상기 임상수치는 관절염증 질환의 진행 정도를 매일 마우스의 관절염 병변을 육안으로 관찰하여, 발이나 꼬리 부위의 종창 및 발적 여부 대한 각각의 점수를 매기는 임상점수체계를 사용하여 평가하였다.

그 결과 도 6에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 AG490 화합물을 처리한 경우 대조군에 비하여 관절염 수치가 유의적으로 낮아지는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 <4-3> AG490 화합물 처리에 따른 세포증식 효과

AG490 화합물에 의한 T cell 증식억제(면역반응 조절 효과)를 확인하기 위하여 CIA 및 AG490 처리군의 비장세포를 분리하여 2 x 10⁵ 세포를 96 웰 플레이트에 분주하고, 제2형 콜라겐 100μg으로 자극하여 3일간 배양하였다. 최종 배양 시간 16시간 전에 [3H]thymidine 1μCi을 세포에 처리하고, 16시간 후에 (총 3일 배양) Betaplate scintillation counter 기계를 사용하여 세포의 증식을 측정하였다.

그 결과 도 7에서 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 본 발명의 AG490 화합물을 처리한 실험군에서 T 세포의 증식이 억제되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 <4-4> CⅡ- specific IgG2a 측정

관절염 마우스에 AG490 화합물을 주입한 시점으로부터 4 주 후에 마우스의 혈청을 채취하여 마우스 항 CⅡ IgG2a 농도를 ELISA 방법으로 측정하였다(Bethyl Lab Co., Montgomery, TX). 대조군으로는 AG490 화합물을 처리하지 않은 군을 사용하였다.

항 CⅡ IgG2a 항체 측정방법은 다음과 같다. CⅡ를 4μg/ml 농도로 0.05M sodium carbonate coating buffer (pH 9.6)에 희석하여 96 웰(well) 마이크로티터 플레이트(microtiter plate)에 도포한 다음 4℃에서 18시간 방치하였다. 도포된 용액을 제거한 후 비특이적인 결합을 억제하기 위하여 1% 소 혈청 알부민(BSA: Amre-sco, solon, Ohio)이 포함된 TBS(pH 8.0)를 200μl씩 넣고 1시간 실온에서 반응시켰다. 항 CⅡ IgG2a 측정을 위해서 검체를 1:1,000으로 희석하였으며, 이때 희석 용액은 1% BAS, 0.05% 트윈 20(Amreco)이 포함된 TBS(pH 8.0) 용액을 사용하였다. 다음으로, 희석해 둔 혈청 샘플을 웰(well)당 50μl씩 넣고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝나면 0.05% 트윈 20(Amresco)이 포함된 TBS 용액(pH 8.0)으로 5회 수세한 후, detection 항체/HRP conjugate(anti-mouse IgG HRP)를 1:75,000으로 희석하여 각 웰당 50μl씩 넣어 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후, IgG washing buffer로 5회 수세한 후, TMB+H₂O₂ 시스템(KPL, Gaithersbufg, MD)으로 발색하였고, 1N H₂SO₄를 같은 양으로 넣어 반응을 중지시켰다. 이는 ELISA reader를 이용하여 450nm에서 흡광도로 읽었으며, 항체 측정 결과는 흡광도 자체로 표시하였다.

그 결과 도 8에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 AG490 화합물을 처리한 경우 대조군에 비하여 CⅡ 특이적인 항 CⅡ IgG2a 항체가 유의적으로 감소된 것을 optical density (OD) 값을 통해 확인할 수 있었다. 이를 통해 본 발명의 AG490 화합물이 면역반응을 효과적으로 억제시킬 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 <4-5> 면역조직화학염색법을 통한 관절파괴 정도 분석

본 발명의 AG490 화합물 처리에 따른 관절염의 치료 효과를 알아보기 위하여, 상기 실시예<4-1>을 통해 제조된 마우스(AG490 화합물 주입된 관절염 마우스)를 희생하여 관절파괴 정도를 면역조직화합염색법을 통하여 분석하였다. 대조군으로는 AG490 화합물을 처리하지 않은 군을 사용하였다.

면역조직화학염색법은 다음과 같은 과정으로 실시하였다. 상기에서 사용하는 마우스 군의 관절을 채취 후, 10% 중성완충포르말린에 고정하고 EDTA로 뼈를 탈회시킨 다음 파라핀에 포매한 후 관절 조직을 7um 두께의 절편을 만들어 슬라이드에 부착하였다. 기본 염색을 진행하기 전에 자일렌을 이용하여 탈 파라핀 과정을 통과 후, 에탄올을 고농도에서 저농도까지 함수시켰다. 염색과정은 헤마톡실린/에오신 (hematoxylin/eosin) 염색을 수행하였으며, 연골에 포함된 프로테오글리칸을 감지할 수 있는 Safranin O와 Toluidine blue 방법을 사용하였다. 마우스 관절에서 면역조직화학염색법을 시행하였으며, 광학현미경으로 분석하였다.

그 결과 도 9에서 나타낸 바와 같이, 관절염 마우스 동물 모델에 본 발명의 AG490 화합물을 처리한 경우 대조군에 비하여 마우스의 골수 부위에서 관절의 파괴가 완화되는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 <4-6> 염증 수치 및 연골 손상 정도 분석

상기 실시예<4-5> 조직염색 결과를 바탕으로 염증 수치 및 연골 손상 정도를 수치화하였다. 면역조직화학염색법 수행 후, 염증 수치는 H&E 염색 결과를, 연골 손상은 safranin O와 Toluidine blue 염색 결과를 수치화하였다. 수치화 기준은 아래와 같다.

0 = no destruction

1 = minimal erosion, limited to single spots

2 = slight to moderate erosion in a limited area

3 = more extensive erosion

4 = general destruction

그 결과 도 10에서 나타낸 바와 같이, 관절염 마우스 동물 모델에 본 발명의 AG490 화합물을 처리한 경우 대조군에 비하여 염증 수치 및 연골 손상이 확연이 줄어드는 것으로 나타났다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

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Claims (13)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 AG490 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 조성물:
   <화학식 1>
   

   
2. 제1항에 있어서,
   상기 AG490은 미분화 T 세포가 Th17 세포로 분화되는 것을 감소 또는 억제시키는 것을 특징으로 하는 관절염의 예방 또는 치료용 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 AG490은 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성 또는 증폭을 촉진 또는 증가시키는 것을 특징으로 하는 관절염의 예방 또는 치료용 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 AG490은 p53 유전자의 발현을 촉진 또는 증가시키는 것을 특징으로 하는 관절염의 예방 또는 치료용 조성물.
5. 삭제
6. 삭제
7. 제1항에 있어서,
   상기 AG490 화합물은 1uM ~ 20uM의 농도로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 관절염의 예방 또는 치료용 조성물.
8. 미분화 T 세포에 AG490 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리하는 단계를 포함하는 시험관(in vitro)내에서 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제하는 방법.
9. 제8항에 있어서,
   상기 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화 감소 또는 억제는 IL-17 사이토카인의 생성 억제를 통해 이루어짐을 특징으로 하는 시험관(in vitro)내에서 미분화 T 세포의 Th17 세포로의 분화를 감소 또는 억제하는 방법.
10. 시험관(in vitro)내에서 AG490 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)에 처리하는 단계를 포함하는 조절 T 세포를 활성화시키는 방법.
11. 제10항에 있어서,
    활성화된 조절 T 세포는 Foxp3의 발현이 증가되는 것을 특징으로 하는 조절성 T 세포를 활성화시키는 방법.
12. 시험관(in vitro)내에서 AG490 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 세포에 처리하는 단계를 포함하는 p53 유전자의 발현을 활성화시키는 방법.
13. 삭제

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