PT97937A - Processo para a preparacao de composicoes farmaceuticas para o tratamento de policitemia verdadeira contendo agentes inibidores de transformacao de protoporfirinogenio - Google Patents

Description

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a síntese do AM·

Nesta invenção os doentes com policitemia verdadeira são tratados com um agente inibidor enzimático que inibe a conversão enzimática do protoporfirinogénio em berne nas células do corpo· Verificámos que agentes, como certo tipo de compostos herbicidas, inibem a conversão enzimática do protoporfirinogénio em clorofila:.nas células das plantas também inibem a conversão enzimática de protoporfirinogénio em heme nas células dos mamíferos. Pensamos que a inibição por tais agentes afecta provavelmente o passo de transformação, do protoporfi-rogénio em protoporfirina IX por aeção de um enzima (protopor-firogénio oxidase) de modo a que o protoporfirinogénio não possa seguir o caminho enzimátieo normal até à protoporfirina IX, mas, em vez disso, seja oxidado na céula (por exemplo em citosol) mas fora do caminho normal (por exemplo fora da membrana organela). Sm resultado disso há uma acumulação da protoporfirina IX em sítios onde não é possível a transformação normal em heme. 0 efeito do agente no percurso enzimático é evidenciado, por exemplo, em culturas de células de tumores humanos (por exemplo células Hela), crescendo no escuro em presença de cerca de 1 ou 10 para 100/uM do agente, produzindo protoporfirina IX em excesso tanto nas células como no meio de cultura. 0 tratamento com o agente inibidor enzimático pode ser administrado por ingestão (por exemplo por via oral) ou injecção (por exemplo por via endovenosa ou intraperitoneal). Oom este fim o agente deve ser incorporado em preparaçães farmacêuticas convencionais tal como comprimidos, (por exemplo comprimidos ou comprimidos revestidos com pasta de açúcar e/ou xarope), supositórios, cápsulas (cápsulas de gelatina dura ou mo-

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•--"'Vê le), suspensóes, soluçóes, pôs ou ampolas* Hestas preparaçúes o agente pode estar misturado com um sólido farmacologicamen-te aceitável e/ou um veículo líquido que pode, se assim se desejar, ser um nutriente; por exemplo pode ser um sólido como o amido de milho, ou um diluente líquido como a água ou um 61eo comestível ou um óleo mineral ou um dissolvente, por exemplo, o dimetilsulfóxido. Como injecção o agente iniMdor enzimático pode usar-se numa composição estéril em que o agente está dissolvido ou disperso num veículo farmaceuticamente aceitável, por exemplo uma solução aquosa isotóniea como soro fisiológico (HaCl a 0,9 Í>) ou fosfato salino de Dulhecco (PBS] numa concentração de 2,5 mg ml"*^, ou o agente pode ser administrado num sistema lipossomal como o preparado fosfolipídi-co descrito a páginas 1659-1660 no Remington»a Pharmaceutical Sciences, 1985 (17a edição) publicado por Maek Publishing Company. Pode proceder-se de maneira análoga à formulação descrita por Jori et al., Br, J. Caneer (1983)» 48 na pág. 307, dissolvem-se 51,4 mg de dipalmitoil-difosfatidilcolina em 10 ml da solução de 1 ml do agente em clorofórmio-metanol (9:1» v/v) e após hem misturado deve eliminar-se o dissolvente no vácuo a 30°C, obtendo-se um resíduo sólido que deve ser res-supenso em 10 ml de tampão de fosfatos 0,01 H de pB 7,4, contendo 150 mM SíaOl, depois a solução turva é levada aos ultra--sons a 50°0 durante 30 minutos. 2) preferível, especialmente para administração oral, utilizar, sais solúveis em água, do agente inibidor enzimático que ou são acídieos e formam sais de sódio de potássio solúveis em água como uma sulfonamida acídiea do tipo descrito em International applications (PCI) ¥0 87/03782 ou ¥0 85/001939 e ¥0 87/037873 (por exemplo agentes 6c e 8h abaixo) ou um sal solúvel na água, ou um ácido carboxílico ou um seu sal solúvel como 0 de sódio conhecido como acifluorfeno.

tu"** A melhor via de administração e a dosagem com o melhor ratio terapêutico podem ser determinados por experimentação de rotina, hem conhecida no meio. Assim, o agente inibidor deve ser administrado a animais de laboratório, ratos ou ratinhos, para determinar o efeito das várias doses no número dos eri-trocitos e no teor em hemoglobina no sangue. Isto pode ser ensaiado, in vitro, usando células da medula dos doentes com policitemia verdadeira, como a linha de células eritroleucé-micas conhecidas como AICC K562 (linha de células referidas por exemplo num artigo de Bridges no J, Biol. Chem., 260 (11), 6811-6815 de 10 da Junho de 1985). Baseado nos dados obtidos in vitro e na experimentação animal e ainda em experiências adicionais (incluindo estudos convencionais de toxicidade de curto e médio prazo em mamíferos de maior tamanho com cães ou porcos) os ensaios de dosagem no homem poderão ser iniciados de acordo com protocolos que garantam segurança e sejam completamente descritos (de acordo com a Administração âa Experimentação no Homem - Human Experimenta ti on Seview Boards como exigem a leio e os programas dos centros médicos em que as experiências sejam conduzidas). los ensaios com ratos e ratinhos, o agente 8h (descrito abaixo) foi adicionado à dieta dos animais na concentração de 3000 ppm, durante 13 semanas, tendo provocado uma significativa des cida no número dos eritrocitos, níveis de hemoglobina, níveis de hematécrito, volume médio corpuscular e conteúdo médio corpuscular de hemoglobina, sem provocar a inibição da produção das células brancas do sangue. Depois de um período de recuperação de 28 dias em que se retirou o agente da dieta, a hemoglobina e o hematécrito voltaram ao nível normal.

Um outro aspecto da invenção refere-se ao uso do mesmo agente inibidor no tratamento da icterícia ou hiperbilirrubinemia neoi-

natal. Como se refere na Patente Norte Americana NS. 4831024 e nas referências aí citadas inibidores do berne oxigenase, tais como a protoporfirina de zinco e estanbo têm sido usadas com esse fim» presumivelmente porque enibem a transformação do heme em bilirrubina. Pensamos que os nossos agentes inibidores do enzima possam causar uma acumulação da protoporfirina em sítios que é impossível a transformação normal em heme , reduzindo também a produção de quantidades anormais de bilirrubina. 0 tratamento pode ser usado em crianças que apresentem uma produção de monoxido de carbono acima do normal» quando determinada pelo conhecido Screening test» considerando-se neste caso em risco aumentado de icterícia grave, veja-se o teste descrito por Smith et al. relatado na Patente Norte Americana NS. 4 831 024 por exemplo. Nos ensaios preliminares mos naimais para ajudar a determinar a dose e o modo de administração podem usar-se ratos da espécie mutante de ratos listar (também designados como ratos Gunn que têm icterícia aco-lúrica hereditária), como se descreve na literatura citada na Patente Norte Americana referida acima.

Os agentes enzimo inibidores desta invenção são inibidores específicos da transformação enziraática do protoporfininogé-nio em heme uma vez que eles não operam como venenos do enzima desnaturando-o ou ligando-se em ligação cruzada (por exemplo os reagentes sulfídrilo), não são materiais preferencialmente afectando as condiçães de oxidação como os receptores de electrães. Os agentes apresentados por esta invenção têm potenciais redox mais negativos do que -500 mV, igual ou mais negativos do que -800mV (medidos de maneira convencional num dissolvente aprdtieo para o agente por voltametria cíclica ou polarograficamente). Deeidiu-se também que o agente não fosse um tetrapirrol e que a sua concentração inibitória de 50 $ (I5Q) para o protoporfininogénio oxidase fosse inferior a cer-

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ca de 10yuM (um pI^Q maior que 5)» de preferência menor que 1 yum (um pI5Q maior que 6), menor que 0,3yuM, por exemplo um Içjq de cerca de 0,1 ou 0,03 ou 0,01 yuM ou menos. 0 agente inibidor de enzima tem de preferência alta capacidade para romper o plasmalema da planta. Para avaliar esta capacidade usa-se o teste do Fluxo (Efflux Experiment) descrito no artigo de Halling e Peters no Plant Physiology, 84, 1114-5 (1987). Heste (Eest (descrito mais detalhadamente no Apêndice A) os agentes escolhidos mostram um fluxo total de 50 $ no mínimo para uma taxa de tratamento de 1yuM ou 100 nM; materiais altamente activos como o l-(4-cloro-2-fluor-5-propargiloxife-nil)-3-metil-4-difluormetil- Δ -1»2 »4-triazolino-5-ona ou lactofeno (descrito a seguir), dão percentagens de fluxo total aeima de 90 $ para a concentração de 100 nl.

Outro ensaio para determinar a capacidade de um material romper o plasmalema do material planta é o Ensaio de inibição da cor verde induzida pela luz (light Induced Greening Inibition !Dest) descrito mais detalhadamente no Apêndice B. Este te st mede a capacidade de inibir a produção da cor verde pela luz do mutante Y-l da Chlamydomonas reinhardt, branqueada no escuro, (tepo de alga que quando cresce no escuro não fabrico clorofila, tornando-se assim numa massa de algas esbranquiçadas devido ás novas células não verdes, e que voltam a produzir clorofila quando expostas à luz). Muitos dos compostos escolhidos (agentes) usados nesta invenção têm a capacidade de inibir a produção de cor verde à luz no mínimo em 50 # quando o composto é usado numa concentração de 10 M» de pre- 6 —7 ferência na concentração de 10 M ou menos, por exemplo 10 M. Contudo compostos ionizados na água, como os compostos parecidos ao 6c em que o ião operativo está carregado negativamente não respondem bem neste ensaio; aparentemente as células das

algas resistem à entrada do grupo aeídieo. Sm contrapartida, muitos dos compostos escolhidos, quando usados na concentração citada no Ensaio da inibição da produção de cor verde à luz dão uma eupernadante que mostra um pico de absorção da luz a cerca de 405 um mais alto do que o pico da clorofila (o pico a cerca de 668 nm neste sistema), por exemplo o super-nadante mostra um pico a 405 um cu;ja altura ê 2,3 ou 4 vezes a altura do pico a 668 nm.

Entre os agentes enzimo-inibidores que podem ser usados na prática desta invenção são compostos herbicidas das classes seguintes (JL a G): A - Herbicidas aril-heterocíclicos com a fórmula geral

Ph - NHat em que "Ph” é um fenilo substituído, de preferência o 2,4-fe-nilo dissubstituído ou mais prefereneialmente o 2,4»5-fonilo trissubstituído; e HHet é um anel heterocíclico pentagonal ou hexagonal tendo de 1 a 4 átomos de azoto no anel com uma das fórmulas: -F-C=0 ou -H-C-OH ou -tf-C-Cl IJ l\ l\

Q Q G - R QO-R em que Q representa o radical do anel heterocíclico e R representa hidrogénio ou um grupo de substituição. Esta classe .de compostos inclui materiais como os designados ”a classe das imidas cíclicas dos herbicidas” num artigo de Wakabayashi et al., J. Pe3tieide Sei, 11, 635-460 (1986) apresentando os seguintes compostos, 3?ig. 1: $

ο 10 fik /, Ύ· Μ !, I; / 0 composto I é um herbicida aril oxadiazol, designado 2-tert--butil-4(2,4-dicloro-5-isopropoxifenil)-4 ^-1,3,4-oxadiazoli-ηο-5-ona. Outro é o 2-alquil-4-(2»4>5-feailo trissubstituído)- o - A -l»3»4-oxadiazolino-5-onas que podem ser usados na presente invenção estão publicados por exemplo nas patentes lorte--Americanas N2s. 3 385 862; 3 836 539» e 3 876 413. 0 composto II é um herbicida aril tetrahidroindazol» designado por 3-cloro-2-(4-cloro-2-fluor-5-isopropoxifenil)-4»5»6,7--tetra-hidro-2H-indazol. Outros 3-substituído-2-(2,4»5-fenilo trissubstituído) tetra-hidro indazol que podem ser usado nesta invenção foram publicados por exemplo na patente lorte-Ame-ricana ns. 4 670 043.

Os compostos III, IT e 7 são herbicidas aril tetra-hidroftali-mida. Outros aril tetra-hidroftalimidas que podem ser usados na presente invenção foram publicados, por exemplo, nas patentes lorte-Amecricanas 3J2s. 4 431 822; 4 670 046; 4 670 042 e 4 439 229 na International application (PCI) WO 87/07602. As últimas duas citaçSes acima referidas também revelam outros anéis !Het que podem ser usados, tais anéis são ilustrados, por exemplo, nas colunas 4 linha 25 à coluna 5 linha 20 da Patente Norte-Americana 12. 4 439 229 θ das páginas 12 a 14 de ¥0 87/07602.

Outros herbicidas convenientes do tipo PH-NHet são: aril trialolinonas tais como as que são descritas nas Patentes lorte-Americanas is.s. 4 318 731; 4 398 943; 4 404 019; ..... 4 702 945; 4 705 557; 4 702 763; 4 761 174 e International appilications (PCI) ¥0 85/01637, WO 85/04307, WO 87/00730, WO 86/04481 e WO 88/01133; aril tetrazolinonas tais como as que se descrevem nas Patentes Norte-Americanas ns. 4 734 124 e International applieations 11 . ? (PCI) ¥0 85/01939 e ¥0 87/03873; aril triazinedionas tais como as que se descrevem nas Patentes Norte-Americanas Ns. 4 755 217 e 4 766 233 International ap-plication (PCI) ¥0 86/00072; aril hidantoínas tais como as que se descrevem na Patente Norte-Americana ns. 4 427 438; aril imidazolopirimidinas tais como as que se revelam na Patente Alemã Federal PT 2604989 (Derwent Abstracts adesão NS. 65326X); Kokai japanesa ΙβΟ-158147A (derwent Abstracts adesão NS. 85-240363)» e European publicado na aplicação de patente EP 230874 (Derwent Abstracts adesão Ns. 87-215141); aril piâdildiazinas, tais como os compostos do tipo do composto 8x do Exemplo 8 abaixo; aril diazinedionas» tais como 0 composto do tipo dos composto 8e e 8v do Exemplo 8 abaixo; aril piradiazinonas tais como os compostos do tipo do composto 8f do Exemplo 8 abaixo; aril oxadiazolinonas tais como os revelados na Kokai japonesa 159-148769 (derwente Abstracts adesão NS. 84-246949) ou Kokai japonesa J62-161772 (Derwent Abstracts adesão NS. 87-238787); aril oxadiazinonas, tal como os compostos do tipo dos compostos 8K e 8 m do Exemplo 8 abaixo; aril benzamidazóis como os compostos do tipo do composto 8ad do Exemplo 8 abaixo; aril iminotriazolpiridazinas» como os revelados nas Patentes Norte-Americanas 4 913 723; 4 906 281; e 4 906 279» aril triazóis, composto do tipo dos compostos do $1, 8r e 8ah do Exemplo 8 abaixo; aril pirróis como os revelados na European published patent applications EP 255 601 (derwent Abstracts lis. 88-037583) e EP 260 288 (Derwent Abstracts adesão N®. 88-127 433)» aril urazôis* como os revelados na patente Norte-americana N2. 4 452 981; e aril hexahidroxipiridazinas, como as reveladas na Patente Norte-Americana NS. 4 619 687; B. Uretanos aril heterocídicos como os descritos na Patente Norte-Americana 4 521 242. C. Ureias aril heterocíelieas como as descritas na Kokai japonesa (Japonesa Kokai) J 58-225081 (derwent Abstracts adesão NS. 84-034261). D. Aril amidas como os compostos do tipo dos compostos 8aj e 8ak do Exemplo 8 abaixo. E. Herbicidas fenil éter como os que tem uma estrutura p-halo ou p-nitrofenoxifenilo como os seguintes materiais comercialmente disponíveis: 5- (2-eloro-4- (trifluorme til) f e noxi) -2-ni tro-N-me tanossulf onil-benzamida (fciaasafen) I.

metil 5-(2»4-(ϋο1θΓθ£βηοχ1)-2-ηί^οΐ3θηζοΕΪο (bifenoxi)

!5- (2-cloro-4- (trif luorme til) ^eixoxiJ-E-nitrobenzoato de sódio 'acifluorfeno)

2-cloro-1-(3-e toxi-4-aitrofe noxi)-4-tri fluormetilbe nzino (oxifluorfeno)

outros herbicidas difenil-éter comereialmente disponíveis são lactofeno: l-(carboetoxi)etil 5-(2-eloro-4-trifluormetilfeno-xi )-2-nitrobenzota, ' 15 / /· tf / τ fluorglicofeno; (carboe toxi )me til 5- (2-cloro-4-trifluoime til-fenoxi)-2-nitrobenzoato, cloronitrofeno: 2,4» 6-tricloro-(4-nitrofenoxi)-benzino, fluordifeno: 2-nitr o-l-(4-nitrof enoxi)-4-trifluorma til- benzino, nitrobeno: 2,4-dicloro-4-(4-nitrof enoxi ) benzino, elometoxifeno: 4-.(2,4-diclorofenoxi)-2-metoxi-l-nitrob62l·- zeno.

Ainda um outro herbicida difenil éter apropriado é o metil--5- (2-cloro-4-tri£luorme tilfenoxi )-2-nitroaeetofenona oxima--O-aeetato. 3?. Herbicidas aril pirazol como os referidos na Patente Norte-Americana ns. 4 563 210; 4 596 390 e 4 459 150 e German Offenlegunsschrift 3520327 Al. G. Compostos de fórmula:

em que Γ í O ou S e wPhn tem 0 significado acima definido, tal como os compostos referidos na edição Suropean Patent ap-plication 273 417 ou Derwent Abstracts adesSo ns. 87-040 749* 16 / *' ' . y ύ

Alguns lierbicidas inibidores enzimátieos são referidos em Matringe et al., EEBS UB5ERS Vol. 245, no 1, 2, páginas 35-38 (1989) 9 Yanase et al., Pe3ticide Biochemistry and Physiology vol 35, páginas 70-80 (1989).

Alguns agentes de tratamento específico são:

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Determinação do 50 (a) Usando enzima em cloroplastos intactos:

Protoporfirogénio IX («Protogenio IX"). Proto IX foi adquirido em Porphyrin Products» logan, UI e purificado segundo o descrito por Ϊ. P. Puesler et al.» Plant Pbyaiol, 67» 246-249 (1981). protogénio IX foi preparado por redução do Proto IX com um amalgama Ha / Fg segundo descrito por Μ. Y. Jacobs e J. M. Jacobs, Enzyme, 28» 206-219 (1982), utilizando o Proto IX purificado numa concentração de 300yuM.

Material Planta. Pepino (Oucumis sativus 1. cultivar 'Wiscon-sin SMR18*) foi cultivado numa câmara escura de crescimento em vermieulite irrigada com um fertilizante (9-45-15) comercial. As sementeiras cresceram a 25®C e a uma humidade relativa de 80 a 90 #. Iluminação intermitente, um minuto de luz ' por um ciclo de 60 minutos com uma intensidade medida de 25 juE/m seg” (PAR) foi fornecida por um "Bright Stick” da General Electrica controlado por um marcador electrónico. Isto proporcionou tecido capaz de sintetizar rapidamente a clrofila enquanto se reduziam as reservas de amido e os níveis de cloro.» fila inicial.

Isolamento dos cloroplastos. Os cloroplastos em desenvolvimento foram isolados como foi descrito por £. P. Pueeler et al., Plant Physiol., 75» 662-664 (1984) excepto que no passo final de purificação os plastídeos foram centrifugados e passados por uma almofada de filtração (Percool cushion) de 40 a 45 $ (v/v)* Os cloroplastos foram resuspensos num tampão contendo 0,51 de manitol, 20 mM 3!ES, 10 mM HEPES, pH 7,7, 1 mMEEIA, 1 m-M MgClg» 1 $ (p/v) de albumina de soro de boi β 1 mM di-tioeritritol para uma concentração final de 2 mg prote£na/ml.

Ensaios da Protoporfirinogénlo Oxidase. Os ensaios foram eon-duzidos conforme as referências de J. Al. Jacobs β N. J. Ja-coba, Arcb. Biocbem. Biopbys. 229» 312-219 (1984). Amostras (0,2 ml) da suspensão de eloroplastos foram preincubados no escuro durante 15 minutos com várias concentraçtSes de acifluoij·-feno-metilo (”AFMW) ou com 0,2 $> (v/v) de acetona (como woon-trolo"). Para iniciar a reacção junta-se à suspensão cinquenta yul de Protogánio IX recentemente preparado (cerca de 15 nm) Os ensaios terminaram com a adição de 2,75 ml de meio fluoro-métrico de N. J. Jacobs e J. M. Jacobs Enzyme, 28» 206-219 (1982) consistindo em 1 $ (v/v) de Iween 20 (monolaurato de polioxietileno sorbitano), 50 nl Iris-HOl, pH 8,5, 1 riM EDTA; 1 mM ditioeritritol (WDIEH) foi substituído por 5 mM glutati-ão. As suspensães foram então lidas directamente num espectro-fluorimetro SPEX Fluorolog-2 equipado com um dispositivo de fluorescência para amostras biológicas turvas. A quantidade de Proto IX produzida foi quantificada de uma curva padrão (da quantidade de Proto IX versus emissão a 630 nM, na excitação a 400 nm) resultante do Proto Ix purificado em meio fluorimótrico.

Para determinar a quantidade da oxidação não enzimática a Proto IX no ensaio acima, 0 mesmo ensaio foi realizado, utilizando em vez de suspensão de eloroplastos activos, uma suspensSo em que os eloroplastos foram inactivados por aquecimento a 85 C durante 15 minutos. Subtraindo a quantidade de Proto IX assim produzida da quantidade produzida na presença de cloro-plastos activos dá a quantidade de Proto IX formado enzimati-camente. Os resultados são apresentados graficamente na Figura I (em que LSD indica a diferença significativa mínima, como ê convencional). A Fig. I mostra que 0 valor de ^50 (a concentração que dá 50 $ de inibição) 4 menor que O^uM, isto á, cerca de 0,03/uM. J. £ ή

Ensaios do efeito de 10yum ABÍ na conversão enzimática de Proto IX em Proto IX de magnésio na suspensão de cloroplastos (em presença de ΑΪΡ) mostra que o ABI não tinha poder de inibição naquela conversão. (b) Uso do enzima isolado:

Material Planta e homogeneização: Ervilhas (Pisum sativum var. little Marvel) verminadas a 202C no escuro numa câmara de crescimento durante dez dias. As plantas foram iluminadas durante uma hora por dia» o que permite uma expansão significativa de folhas enquanto minimiza a síntese de clorofila. As folhas eram de uma cor pálida de amarelo esverdeado.

As folhas foram então homogeneizadas em 500 ml de meio de moagem constituído por manitol 0,5 M, BEPES 10 mM, IES 20 mM, EMA 1 mM, Mg 01g 1 mM, cisteína 5 mM e BSA 0,2, pH 7,7. A pasta foi então passada através de quatro camadas de um pano e depois através duma rede de nylon com uma malha de 43 mi-cron. 0 homogeneizado foi então centrifugado a 400 rotaçães durante 3 minutos. A massa resultante foi utilizada para isolamento dos plastídeos.

Aumento dos etioplastos e purificação. Â massa (fracção de plastídeos) foi ressuspensa em 40 ml do meio do ensaio (meio de moagem sem cisteína e contendo ME 1 mM e ESA 1 $) e cen-trifugada a 150 rotaçUes para remover os fragmentos celulares. 0 sobrenadante resultante foi centrifugado a 4000 rota-çBes e a massa ressuspensa foi recoberta com Percoll a 40 $. Após centrifugação a 6500 rotaçóes durante 3 minutos os etioplastos intactos ficam amassados no fundo do tubo. 0 teor em proteína foi determinado utilizando o método BioRad. li f v-

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Solubilização do Enzima; 0 enzima foi solubilizado seguindo o processo de Jacobs e Jacobs. Os plastídeos foram amassados e ressuspensos em 2,5 ml de tampão constituído por Tris-Mel 20 mM, glicerol 30 fo, e MB 1 ml, pH 7,5. Após ultrassons a 60 mHz foi adicionado um volume do meio detergente de extracção; Triton 100 X 10 $, KOI 8 $ e PMSF 10 mM, para dar um detergente final: razão de proteínas de 0,7 (p/p). Após três horas a 4820, a preparação da membrana foi ultracentrifugada a 100000 rotaçães durante 1 hora num Beokman L2-65B.

Gel de Filtração: 0 sobrenadante contendo o enzima solubilizado foi então dessalgado numa coluna Pharmacia PD-10 G-25M Sephadex. As colunas foram lavadas com 25 ml de Tampão de Blui--ção (Bistri-HCl 20 mM, glicerol 20 $>, Triton X 0,1 $>, pff 6,8). As amostras foram deitadas na coluna e eluídas com 3,5 ml do tampão. 0 primeiro ml da fraeção foi deitado fora e as restantes 2,5 ml foram recolhidos. Estas fracçães foram depois congeladas sob Fg a -772C.

Purificação Utilizando Gromatografia UBAE: Um volume de 0,75 ml le preparação do enzima solubilizado dos plaatídeos foi deita-lo numa coluna laters Proteín-Pak DEAE-5 PW (8 mmx 7,5 cm) 3quilibrada com Tampão de Eluição. Após 60 minutos de lavagem oom Tampão de Eluição (1 ml/minuto), o enzima foi aluído com iam gradiente linear UaGl 0,1 M para além de 100 minutos, líu-Lou-se depois o gradiente de HaCl 0,1 M para HaCl 0,8 M em 30 linutos. Uma fraeção de 4 ml foi recolhida e analizada quanto !i actividade. Os picos foram detectados usando um detector íaters 494 UV a 260 nm, sensibilidade: 1 AU.

Actividade protoporfirigénio oxidase: A conversão enzimática iiio protoporfirogénio IX em protoporfirina IX foi analisada como ite descreve na secção (a) anterior.

Neste teste, o composto 6c mostra valores de 150 de 0,8 a 0,3 (correspondendo a um pI50 de 6,1 a 6,5, em que pI50 é log negativo do *50 lolaridade); para AM o valor foi de 0,08juM. (pI50 de 7,1) e para o composto 8v o valor foi de 0,08 a 0,03 ;uM (pI50 de 7,1 a 7,5).

Apêndice A

Teste de percentagem do fluxo 0 test de percentagem do fluxo utiliza cotilédones colhidos de plantas novas de pepinos estiolados. Num passo inicial uma massa de cotilédones é tratada no escuro com uma solução aquosa tamponada, contendo um açúcar radiomarcado. A quantidade de açúcar recebida pelas cotilédones é depois medido (por contagem como se descreve abaixo). A massa dos cotilédones é depois dividida em duas porçbes*, uma porção dos cotilédones é tratada no escuro com uma soluçSo aquosa tamponada, contendo o composto a ser testado, enquanto a outra porção é tratada da mesma maneira, no escuro, com uma solução idêntica à. anterior sem o composto em análise, como controlo. Os cotilédones em contacto com as soluçães aquosas são expostas à luz durante 16 horas e depois retiradas das soluçbes aquosas; estas são então medidas (por contagem) para determinar o seu conteúdo em material radiomarcado. Os resultados são expressos como Percentagem de Fluxo calculado como segue em que S é a quantidade de material radiomarcado (por cotilédone) calculado nos cotilédones no tratamento inicial é a quantidade de material radiomarcado (por cotilédone) na solução aquosa contendo o composto em análise apés exposição à luz e S_ é a quantidade c

de material radiomarcado (por cotilédone) na solução açiuosa de controlo apôs exposição à luz.

Percentagem do Pluxo = % menos SQ

S

Mais especificamente empregam-se no Teste de Percentagem de fluxo os seguintes materiais e condiçúes

Material Planta: Sementes de Pepino (cucumis sativus lu Cultivar wWisconsin SMR 18M) que germinou e cresceu em vermiculite irrigada com um fertilizante (9-45-15), As plantas novas cresceram a 25fiC e 80-90 $ ds HR numa câmara escura de incubação. Os cotilédones foram colhidos de plantas novas estioladas cinco dias após a plantação e foram lavadas com 1,0 mM Ca012» tudo sob luz verde.

Solução tampão: KC1 1 mM, CaClg 1 mM e fosfato de potássio 2,0 mM, ajustado a pH 6,5 (com iaOH). Açúcar radiomarcado: 3-0-metil-3-(U-14C)glucose de actividade específica 10,9 GB /mmol (Amersham Corp., Arlington Heights Π).

Iratamento inicial: Cotilédones lavados (180 a 230) são colo cados num Erlenmeyer de 250 ml de boca larga com rolha esmerilada contendo 50 ml de solução de tampão e o açúcar radiomar-eado é adicionado em quantidade para dar a concentração de 600 aM deste na solução. 0 balão é agitado durante 24 horas a 125 rpm num agitador giratório no escuro. Os cotilédones são então recobertos com uma malha de nylon e lavados três tfezes em 20 ml volumes de 1 mM CaClg. A determinação do açúcar radiomarcado l medido por digestão de três amostras de cinco cotilédones 36 cada em tecido SHC solubilizante (Amersham Corp.) e medindo o macerado resultante num espectrómetro de cintilação líquida. (Os resultados destas digestães foram equivalentes à mesma determinação feita por combustão das amostras dos cotilédones num autooxidizante).

Tratamento com o composto a ser analizado (e tratamento controlo) .

Cinco dos cotilédones foram colocados a flutuar, do lado superior em relação ao eixo em 3 ml de solução de tampão numa placa de Petri tapada e com o diâmetro de 35 mm. 0 composto em análise é depois adicionado (numa solução em acetona) na quantidade necessária para se obter a concentração predeterminada (a seguir discutida) do composto em análise na solução tampão, a concentração de acetona na solução tampão é então 0,1 # (v/v) no controlo bem como na solução contendo o composto em análise. Os cotilédones flutuantes são então movimentados por agitação das caixas de Petri a 90 rpm na superfície de um agitador giratório durante 16 boras. ir

Exposição à luz: As caixas de Petri contendo os cotilédones flutuando nas soluçSes são expostas durante 16 boras à iluminação proveniente de quatro lâmpadas fluorescentes GE E2QT12-C -2 -1 com uma intensidade de 150 uE m seg na região foto sinteticamente activa do espectro (PAR) (medido na superfície dos cotilédones) enquanto as caixas de Petri estão a ser agitadas.

Medição da çuantidade de material radiornarcado no líquido: To· do o líquido é separado dos cotilédones e então medido num espectrómetro de cintilação líquido.

Escuridão: Todos os tratamentos anteriores à iluminação sSo realizados no escuro ou sob luz fluorescente verde (este é a luz filtrada através de um filtro de plástico que deixa passai a luz de 450-600 nm).

Meios de Cultura Sais Apêndice Meio M Molaridade B Stock ml Stock/l citrado de sódio, 6H20 1,7 x 10-½ 10 io 5 Traços de metais como abaixo como abaixo 10 Ee CI3, 6H20 0,37 x 10-½ 1 $ 1 CaCl2,2H20 0,36 x 10"% 5,3 # 1 MgS04, 7h20 1,2 X 10“% 10 % 3 hh4no3 3,7 x 10-½ 10 i 3 EH2P04 2,2 X 10“3M 10 i 3 e2hpo4 1,7 x 10-½ 10 i 3

Stock (solugáo mSe) da mistura de Tragos de Metais) H3BO3 100 mg/l ZnS04, 7H20 100 mg/l MnS04, 4H20 40 mg/l 38 C0C12, 6H20 20 mg/l Na Mo04,2H20 20 mg/l CuS04 4 mg/l 0 Meio de Cultura A prepara-se adicionando 10 ml/1 de uma solução aquosa a 10 $> de acetato de sódio (7,5 x 10-¾) ao meio M.

Os componentes são adicionados a água destilada pela ordem indicada acima e autoclavadas a 1 atmosfera durante 15 minutos.

Cultura Stock desenvolvidas na Presença de Luz:

As culturas Stock de células Y-l são mantidas em cultura pura num líquido de cultura no Meio A ou M» de preferencia no meio M num ciclo de 14/10 horas claro/escuro a 25δ0 em balbes Erle-nmeçer fechados com rolhas de poliuretano. As culturas Stoek são incubadas sem arejamento suplementar nos agitadores rotativos a 125 rpm. A intensidade da luz ao nível da cultura é de —2 1 12Q/uP*m seg- (PAR). Sob estas condiçBes as culturas estão num modo de crescimento semi-síncrono até atingirem uma fase estacionária de 2-4 x 10^ células/ml.

Crescimento de Culturas sem luz (Crescimento da Cultura em mei3 escuro)

As células da fase estacionária das culturas Stoek que cresceram em presença da luz (7»5 ml) são transferidas para um balão de Erlenmeçer contendo 750 ml do Meio A. As células são incubadas no escuro com arejamento por intermédio de um tubo de arejamento submerso, a 25SC durante trôs ou quatro dias. Durante este período esta cultura de células 1-1 sofrerão -sete ou oito divistJes celulares, perdendo toda a clorofila vi- 39 τ

J sível, e a concentração será de 2-3 x 10® células/ml.

Preparagão das Células para Usar no Ensaio:

As células sSo recolhidas de tuna cultura recentemente preparada e tendo crescido no escuro (750 ml) por centrifugação a baixa velocidade, isto é * cerca de 2000 rpm» durante aproxi— madamente cinco minutos a cerca de 20SC. As células são cuidadosamente ressuspensas em 50 ml do Meio · TJma amostra desta suspensão aproximadamente 0,25 ml) será examinada quanto à mobilidade e após fixação com uma solução aquosa de glute-raldeído a 1 % deverá fazer-se uma contagem de células para determinar o número de eélulas/ml. Uma contagem de células 7 considerada normal é de cerca de 5 x 10 eélulas/ml. Colocam--se aliquo.tas de 1 ml (10 células/ml) em recipientes de ensaio (por exemplo placas de cultura de tecidos Palcon com 24 cavidades). Nesta altura as células são muito móveis e tôm cor amarela. 0 composto em análise é dissolvido num dissovente (acetona, etanol, dimetilsulfóxido, ou água, de preferência, acetona) para se obter uma concentração que seja 1000 vezes a concentração final. Um^ul desta solução é colocada em cada duas cavidades com uma mieroseringa de 5 ou 10yul.

Quatro cavidades de controlo por placa de cultura de tecido são preparadas da maneira acima descrita sem o composto em análise. As placas de cultura de tecido são cobertas com uma tampa de plástico transparente e colocadas numa câmara de -2 -1 crescimento com uma intensidade luminosa de 70-90yuE m seg durante 13-16 horas a 25SC. Se os conteúdos das cavidades do ensaio aparacem amarelas eles são extraídos como se descreve na Avaliação dos Resultados na Secção abaixo. Se o conteúdo 40 /4 ti ? 1 tensidade de cerca de 600 /UE m seg“ antes de serem extraí- das cavidades do ensaio aparece transparente ou de cor verde pálido, são colocados num agitador rotativo a cerca de 125 rpm e são irradiadas durante duas horas com uma luz com a in- /' dos.

AvaliaçSo dos Resultados

Uma solução aquosa de sulfato de sédio dodecilo a 10 $ (250 yul) e metanol (1 ml) é adicionado a cada cavidade de ensaio e é misturado completamente. As misturas ficam em repouso no escuro durante três ou quatro horas. As placas de cultura de tecido são centrifugadas à temperatura amhiente a baixa velocidade (ca. 2000 rpm) durante 5 minutos. Os sobrenadantes são removidos β analisados num espectrofotómetro Beckman Modelo 35 entre 350 nm e 500 nm em relação à presença de protoporfirina IX, a 668 nm que é 0 pico de absorção da clorofila neste dissolvente, e a 720 nm para usar uma leitura turbidimétrica.

Análise dos Dados:

Para cada cavidade obtém-se ura valor de verdura subtraindo a leitura a 720 m da leitura de 668 nm. Estes valores são as médias para cada concentração dos compostos a ser analisados e para 0 controlo. A percentagem de inibição é 100 x Cl Média do valor de verdura para a concentração ) ' ~ particular Média do valor de verdura para 0 controlo.

Claims (23)

1. REIVINDICAÇÕES: a 1 - Processo para a preparação de composições farmacêuticas para o tratamento de policitemia verdadeira contendo agentes inibidores da transformação de protoporfirinogénio com optenção de heme, caracterizado pelo facto de se misturar um composto que é um agente inibidor especifico da transformação enzimática de protoporfirinogénio com obtenção de heme em células de mamíferos, com uma substancia veicular farmaceuticamente aceitável ou com um sistema lipossonal de tal maneira que a sua concentração máxima seja de preferencia igual a 0,25 por cento em peso.
2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido composto não ser um tetrapirrol e ter um potencial redox mais negativo do que -500 mV. a
3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o mencionado composto ter uma concentração inibitória de 50 por cento para protoporfirinogénio - oxida-se menor do que 10yuM. a
4. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de a citada concentração inibitória de 50 por cento ser menor do que 1 /uM. 3
5. 5 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido composto ser um composto herbicida da familia dos éteres difenilicos.

   a
6. 6 - Processo de acordo com a reivindicação 5'f caracterizado pelo facto de o mencionado éter nitrodifenilico ter um substituinte de éster de ácido carboxilico. 7a - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de o citado substituinte ser um substituinte de alcoxicarbonil inferior-alcoxicarbonilo inferior. 8a - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de o referido éter nitrodefenilico ter um substituinte alcoxi inferior.
7. 9 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o mencionado composto ter a fórmula Ph - NHet na qual "Ph" é um radical fenilo substituido e NHet é um anel heterociclico pentagonal ou hexagonal que tem um a quatro átomos de azoto no anel e que tem uma das seguintes fórmulas -N- ou -N-Ç-OH ou -N-C-Cl

   -R -R nas quais Q representa a parte restante do anel heterociclico e R representa hidrogénio ou um grupo substituinte. 10a - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o citado composto ter a fórmula

   Ph-N

   na qual Ph é um radical fenilo substituído. 11a - Processo de acordo com a reivindicação 1, câracterizado pelo facto de o referido composto ter a fórmula

   na qual Ph é um radical fenilo substituído.
8. 12 - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de Ph ser um radical fenilo que tem um substituinte de fórmula :n-so2-r em que R é alquilo inferior- a
9. 13 - Processo de acordo com a reivindiucação 9, caracterizado pelo facto de Ph ser fenilo que tem um substituinte que inclui um grupo 1-(alcoxicarbonilo inferior)-etoxi terminal. 14a - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de o mencionado substituinte ser um substituinte [1-(alcoxicarbonilo inferior)-etoxi]-fenoxi.
10. 15 - Proceso para a preparação de‘composições farmacêuticas para o tratamento de hiperbilirrubinemia neonatal ou evitar

    a sua ocorrência em crianças recem-nascidas susceptíveis a essa combinação contendo um agente inibidor da transformação de protoporfirinogénio com obtenção de heme, caracterizado pelo facto de se misturar um composto inibidor específico da transformação enzimática de protoporfirinogénio para obtenção de heme em células de mamíferos com uma substancia veicular numa proproção em peso de preferencia inferior a 0,25%. 16a - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo facto de o citado composto inibidor não ser um tetrapirrol e ter um potencial de redox mais negativo’ do que - 500 mV. 17a - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo facto de o referido composto ter uma Dl^g para a protoporfirinogénio-oxidase menor do que 10jjM.
11. 18 - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo facto de a mencionada DI^q ser menor do que yuM.
12. 19 - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo facto de o citado inibidor ser um herbicida de éter nitrodifenílico.
13. 20 - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo facto de o referido éter nitrodefinilico ter um substituinte de éster de ácido dicarboxilico,
14. 21 - Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo facto de o mencionado substituinte ser um substituinte alcoxicarbonil inferior-alcoxicarbonilo inferior. '45 // // o
15. 22 - Processo de acordo com a reivindicação 19, caraterizado pelo facto de o citado éter nitrodifenilico ter um substituinte alcoxi inferior. 23a - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo facto de o referido composto ter a fórmula Ph - NHet na qual "Ph" é um radical fenilo substituído e NHet é um anel heterociclico pentagonal ou hexagonal que tem um a quatro átomos de azoto no anel e que tem uma das fórmulas -N-C=0h/ ou '-OH ou C—R

    R em que Q representa a parte restante para completar o anel heterociclico e R representa um átomo de hidrogénio ou um grupo substituinte.

    24a - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo facto de o mencionado composto ter a fórmula Ph-N na qual Ph é fenilo substituido. as
16. 25 - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo facto de o citado composto ter a fórmula Ph-N i S 46 ;k-s

    na qual Ph é fenilo substituído. Q
17. 26 - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo facto de Ph ser fenilo que tem um substituinte de fórmula ^,n-so2-r em que R é alquilo inferior. 27a - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo facto de Ph ser fenilo que tem um substituinte que inclui um grupo l-(alcoxicarbonilo inferior)-etoxi terminal.
18. 28 - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo facto de o referido substituinte ser um grupo [l-(alcoxicarbonilo inferior)-etoxi]-fenoxi. 29a - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o citado composto ser uma aril-triazolinona.
19. 30 - Processo de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo facto de o referido composto ser l-[2,4- dicloro-5-(N-metil-sulfonilamino)-fenil]-3-metil-4- 2 difeluormetil-^ -1,2,4-triazo-lino-5-ona. £
20. 31 - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de NHet ser um anel de triazolinona.
21. 32 - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracrerizado pelo facto de o mencionado composto ser uma aril-triazolinona.
22. 33 - Processo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo facto de o citado composto ser l-[2,4- ο 4'7 . V -'V-f: dicloro-5-(N-metil-sulfonilamino)-fenil]-3-metil-4-difluorme-2 til- A 1,2,4-triazo- lino-5-ona.
23. 34 - Processo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo facto de NHet ser um anel de triazolinona. Lisboa, 11 de Junho de 1991 fo Agente Oficial da Propriedade Industrial MM® m]k S1LVINA VIEIRA PEREIRA FERRBRA Agonto Oficial d3 Prnpricdcda Industrial AdjUntO R. Castilho; 201-8. t.-1Go0 U330A Telefs. 651339-654613