CN105527439A - 一种ngal时间分辨荧光纳米免疫层析定量检测试纸条及其制备方法 - Google Patents

一种ngal时间分辨荧光纳米免疫层析定量检测试纸条及其制备方法 Download PDF

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卢志珍
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Abstract

本发明公开了一种NGAL时间分辨荧光纳米免疫层析定量检测试纸条及其制备方法，该试纸条包括背衬底板，该背衬底板上设置有硝酸纤维素膜、样品结合垫和吸水膜，该样品结合垫和吸水膜分别叠压在硝酸纤维素膜的两端上；该样品结合垫上包被有时间分辨荧光物质标记的NGAL单克隆抗体；该硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，该检测线包被有另一个表位的NGAL单克隆抗体，该质控线包被有羊抗鼠IgG。本发明具有灵敏度高，特异性强、稳定性好和无放射性污染等特点，可广泛应用于NGAL的临床免疫检验和科学研究中。

Description

一种NGAL时间分辨荧光纳米免疫层析定量检测试纸条及其制备方法
技术领域
本发明属于免疫层析检测技术领域，具体涉及一种NGAL时间分辨荧光纳米免疫层析定量检测试纸条及其制备方法。
背景技术
急性肾损伤(Acutekidneyinjury，AKI)是由多种原因引起的肾功能在短时间内下降而出现的临床综合征。迄今为止，AKI依然是十分常见而严重的临床问题。如果在AKI的早期阶段进行治疗，可以很大程度上降低肾衰竭的发生。因此尽早诊断AKI已成为肾病治疗的一个关键因素。但缺乏特异性的早期临床诊断指标，是治疗该病的主要障碍，导致AKI的发生率、病死率居高不下。人类中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL，载脂蛋白-2)是由中性粒细胞和某些上皮细胞如肾小管所表达的微量蛋白。缺血性或肾毒性肾损伤时，NGAL由肾脏大量表达，并被释放到尿液和血浆。NGAL含量在损伤发生后2小时内升高，是一种早期且敏感的肾损伤标志，成为一种高效的新型AKI早期肾损伤临床诊断标志物。截止目前还未有一种NGAL时间分辨荧光纳米免疫层析定量检测试纸条。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种NGAL时间分辨荧光纳米免疫层析定量检测试纸条及其制备方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
一种NGAL时间分辨荧光纳米免疫层析定量检测试纸条，包括背衬底板，该背衬底板上设置有硝酸纤维素膜、样品结合垫和吸水膜，该样品结合垫和吸水膜分别叠压在硝酸纤维素膜的两端上；该样品结合垫上包被有时间分辨荧光物质标记的NGAL单克隆抗体；该硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，该检测线包被有另一个表位的NGAL单克隆抗体，该质控线包被有羊抗鼠IgG。
一实施例中：所述时间分辨荧光物质为镧系元素、镧系元素与乳胶的结合物、镧系元素的螯合物中的一种。
一实施例中：所述镧系元素为铕，铽，钐或镝中的一种。
一实施例中：所述样品结合垫为玻璃纤维素膜或聚酯膜。
一实施例中：所述样品结合垫为玻璃纤维素膜或聚酯膜经含有表面活性剂的缓冲液预封闭后干燥而得。
一实施例中：所述试纸条外还包裹有一壳体。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：
上述的NGAL时间分辨荧光纳米免疫层析定量检测试纸条的制备方法，包括：
1)将硝酸纤维素膜固定在背衬底板上；用磷酸盐缓冲液将另一个表位的NGAL单克隆抗体稀释至0.9～1.1mg/ml，用0.04～0.06M的MES缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释至0.9～1.1mg/ml，再分别将稀释后的NGAL单克隆抗体和羊抗鼠IgG抗体均匀划至硝酸纤维素膜上，制备检测线和质控线；36～38℃干燥过夜；
2)取0.18～0.22μm的时间分辨荧光物质乳胶微球，与0.04～0.06M的MES缓冲液均匀混合，超声分散使得乳胶微球均匀分散于MES缓冲液中；加入18～22mg/ml的EDC溶液，常温振荡活化25～35min后，离心，去除上清；用0.04～0.06M的pH7.4～7.6的硼酸缓冲液复溶洗涤若干次后，超声分散，加入0.9～1.1mg/ml的NGAL单克隆抗体溶液，常温振荡1.5～2.5h后，离心，去除上清，再加入封闭液，常温、140～180rpm下振荡封闭0.5～1.5h；离心，去除上清，再加入偶联存储液，超声分散，即得标记有时间分辨荧光物质乳胶微球的NGAL单克隆抗体；所述时间分辨荧光物质乳胶微球、MES缓冲液、EDC溶液、每次加入的硼酸缓冲液、NGAL单克隆抗体溶液、封闭液、偶联储存液的体积比为1.8～2.2:9～11:0.9～1.1:9～11:0.9～1.1:9～11:9～11；
3)取玻璃纤维素膜，用含有表面活性剂的缓冲液进行预封闭后，45～55℃干燥过夜；将步骤2)得到的标记有时间分辨荧光物质乳胶微球的NGAL单克隆抗体按照9～11μl/cm的量超声喷雾至干燥好的玻璃纤维素膜上，45～55℃干燥过夜，制备得到样品结合垫；
4)将步骤3)得到的样品结合垫固定叠压在步骤1)得到的硝酸纤维素膜的一端，并将吸水膜固定叠压在硝酸纤维素膜的另一端，裁剪，并装入层析条壳体中，即得成品。
一实施例中：所述步骤3)中，含有表面活性剂的缓冲液为95～105mM的pH7.3～7.5的PB缓冲液，且其中含有1.4～1.6％NaCl，4.8～5.2％BSA、0.4～0.6％吐温-20和4.8～5.2％蔗糖。
一实施例中：所述步骤2)中，封闭液为38～42mM的pH7.4～7.6的甘氨酸溶液，且其中含有4.8～5.2％BSA、0.09～0.11％叠氮钠。
一实施例中：所述步骤2)中，偶联储存液为38～42mM的pH7.4～7.6的甘氨酸溶液且其中含有4.8～5.2％BSA、0.09～0.11％叠氮钠，0.9～1.1％NaCl，4～32％海藻糖，0.08～3.5％聚合物；该聚合物为PEG20000，PVP，PVA中的一种。
本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
1.传统的定量检测试纸条分别设有样品垫和结合垫，血清/血浆等样品首先与样品垫接触，样品垫对样品进行预处理，去除样品中杂质颗粒，调节样品液pH值或粘度等，减缓样品渗透速度，有利于样品的均匀分布；经样品垫预处理过后的均匀的样品再流动至结合垫上与标记抗体发生结合，才能够保证定量反应的准确性，如果不经预处理，样品在结合垫上的结合量无法把握，且结合稳定性也差，更加难以实现定量效果；而本发明采用一个样品结合垫代替传统的样品垫和结合垫，制备得到的样品结合垫上准确而均匀地分布有标记抗体，既能保证样品得到预处理，又能保证样品结合一定量的标记抗体，保证了定量反应的准确性，经检测，准确度和精密度良好；同时，也简化了试纸条的结构和制备过程。
2.本发明的NGAL时间分辨荧光纳米免疫层析定量检测试纸条，利用时间分辨荧光免疫分析(time-resolvedfluoro-immunoassay，TRFIA)这种新型非放射性标记免疫分析技术。与传统的荧光素标记不同，采用具有独特荧光特性的镧系元素及其螯合物作为时间分辨荧光物质，镧系元素激发光与发射光之间的Stokes位移较大，避免了激发及发射光谱存在的重叠问题，排除激发光的干扰，通过波长分辨方式使其明显的区别于背景荧光；且镧系元素激发光光谱较宽，可采用只允许发射荧光通过的滤光片，从而进一步将抢特异性荧光和背景荧光区分开，消除干扰；镧系离子螯合物的荧光衰变时间长，为传统荧光的103～106倍，通过测定时间差可以实现高信噪比；同时其可以反复接受激发，从而大大提高仪器探测到的信号值，有效排除样品自然荧光的干扰，具有灵敏度高，特异性强、稳定性好和无放射性污染等特点，可广泛应用于NGAL的临床免疫检验和科学研究中。
3.本发明的NGAL时间分辨荧光纳米免疫层析定量检测试纸条制作方便，可批量生产；体积小，便于携带。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为本发明的NGAL时间分辨荧光纳米免疫层析定量检测试纸条结构示意图。
附图标记：样品结合垫1；时间分辨荧光物质标记的NGAL单克隆抗体2；硝酸纤维素膜3；检测线4；质控线5；吸水膜6；背衬底板7。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明的内容：
请查阅图1，一种NGAL时间分辨荧光纳米免疫层析定量检测试纸条，包括背衬底板7，该背衬底板7上设置有硝酸纤维素膜3、样品结合垫1和吸水膜6，该样品结合垫1和吸水膜6分别叠压在硝酸纤维素膜3的两端上；该样品结合垫1上包被有时间分辨荧光物质标记的NGAL单克隆抗体2；该硝酸纤维素膜3上设有检测线4(T线)和质控线5(C线)，检测线4(T线)包被有另一个表位的NGAL单克隆抗体，质控线5(C线)包被有羊抗鼠IgG。
上述试纸条的具体制备方法为：
1)硝酸纤维素膜(NC膜)处理
将NC膜贴至背衬底板的制定位置，取10mM的pH7.4磷酸盐缓冲液将另一个表位的NGAL单克隆抗体稀释至1mg/ml，用于制备T线；用0.05M的MES缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释至1mg/ml，用于制备C线；按1μl/cm划液量，通过biodot划膜仪将上述两种稀释后的抗体均匀的划至NC膜上制备T线和C线；将划好的NC膜放置于37℃干燥箱中，干燥过夜。
2)标记时间分辨荧光物质乳胶微球的NGAL单克隆抗体的制备
取100μl的粒径0.2μm的时间分辨荧光物质乳胶微球，与500μl的0.05M的MES缓冲液在离心管中均匀混合，冰浴下，使用JY92-IIDN型超声波细胞破碎仪按超声强度10％，超声3s暂停3s，总共超声1min的条件进行超声分散使得乳胶微球均匀分散于MES缓冲液中；加入50μl的20mg/ml的EDC溶液，常温振荡活化30min后，16000rpm离心30min，去除上清；用500μl的0.05M的pH7.5的硼酸缓冲液复溶，冰浴下超声分散，离心洗涤一遍，再次离心，去除上清后，再次加入500μl的0.05M的pH7.5的硼酸缓冲液复溶，冰浴下超声分散，加入50μl的1mg/ml的NGAL单克隆抗体溶液，常温振荡2h后，离心，去除上清，再加入500μl封闭液，治愈摇床常温、160rpm下振荡封闭1h；封闭完成后，离心，去除上清，再加入500μl偶联存储液，超声分散，即得标记有时间分辨荧光物质乳胶微球的NGAL单克隆抗体；4℃保存备用；
3)样品结合垫的处理
取玻璃纤维素膜用含有表面活性剂的缓冲液浸泡10min进行预封闭后，取出，沥干水分，50℃干燥过夜；通过Biodot仪器的airjet喷头，将步骤2)得到的标记有时间分辨荧光物质乳胶微球的NGAL单克隆抗体稀释10倍后，按照10μl/cm的量超声喷雾至干燥好的玻璃纤维素膜上，50℃干燥过夜，制备得到样品结合垫。
本实施例之中，所述时间分辨荧光物质乳胶微球为含铕乳胶微球，即时间分辨荧光物质为镧系元素铕与乳胶的结合物；根据需要，所述时间分辨荧光物质可以调整为镧系元素、镧系元素与乳胶的结合物、镧系元素的螯合物中的一种；镧系元素可以为铕，铽，钐或镝中的一种。
4)组装
将步骤3)得到的样品结合垫固定叠压在步骤1)得到的硝酸纤维素膜的一端，并将吸水膜固定叠压在硝酸纤维素膜的另一端，用裁膜仪按每条4mm的宽度进行裁剪，并装入层析条壳体中，即得成品。
上述方法中采用的各类溶液的制备方法如下：
0.05M的MES缓冲液：称取4.265gMES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)盐，溶解在80ml水中，用2M的氢氧化钠水溶液调节pH值为6.0，定容至100ml，得到0.2M的MES溶液，使用时用水稀释四倍即得。
20mg/ml的EDC溶液：称取0.020gEDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)，溶解于1ml的水中，即得。
0.05M的pH7.5的硼酸缓冲液：称取1.2366g硼砂(H3BO3)，加水80ml溶解完全，用2M的氢氧化钠水溶液调节pH值为7.5，定容至100ml，得到0.2M的硼酸缓冲液，使用时用水稀释四倍即得。
封闭液：40mM的甘氨酸溶液，用TB缓冲液调节至pH7.5后，加入BSA(牛血清白蛋白)和叠氮钠并使其终浓度分别为5％和0.1％，摇匀，即得。
偶联储存液：40mM的甘氨酸溶液，用TB缓冲液调节至pH7.5后，加入BSA、叠氮钠、NaCl，海藻糖和聚合物并使其终浓度分别为5％、0.1％，1％，5～30％，0.1～3％，摇匀，即得；其中，聚合物为PEG20000(聚乙二醇20000)，PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，PVA(聚乙烯醇)中的一种。
含有表面活性剂的缓冲液：100mM的pH7.4的PB缓冲液，加入NaCl，BSA、吐温-20和蔗糖并使其终浓度分别为1.5％，5％，0.5％和5％，摇匀，即得。
本发明的试纸条利用双抗夹心法进行检测：将待测样品量取75μL滴加到样品垫上，样品中的NGAL与样品垫上时间分辨荧光物质标记的NGAL单克隆抗体结合，形成抗原-标记抗体复合物。经层析原理，依次与硝酸纤维素膜上的另一个表位的NGAL抗体(T线)和羊抗鼠IgG抗体(C线)形成抗体-抗原-标记抗体复合物。在时间分辨荧光分析仪的激发光激发下，标记元素显现荧光，结合的标记抗体越多，荧光强度越高，从而进行定量检测。
健康人群尿液中NGAL平均浓度为5.3ng/mL(范围0.7～9.6ng/mL)；血浆中NGAL平均浓度63ng/mL(范围3～106ng/mL)。肾损伤后NGAL水平急剧上升。任意选择的重症监护室患者尿液中NGAL浓度可达到110ng/mL～40,000ng/mL；血浆中NGAL平均浓度25ng/mL～3491ng/mL。尿NGAL水平高于350ng/mL或血浆NGAL水平高于400ng/mL，急性肾功能衰竭阳性预测值约为90％。
实验例：样品的定量检测
1.标准曲线制作
1.1取NGAL校准品一套，具体值见下表
1.2检测方法
1.2.1取校准品75μl，加入实施例1制备的层析条中样品窗口；
1.2.210分钟之后，用时间分辨荧光定量分析仪定量检测发光值。
1.2.3每个校准品检测三次，取T/C值的平均值。具体结果见下表：
1.3标准曲线制备
根据上述检测结果，以T/C值的对数值为X轴，以浓度的对数值为Y轴进行线性回归，，得到线性方程y＝-0.054x2+1.0185x-4.9287，R2＝0.999。
2精密度测试：
2.1取制备好的9张层析条，配置一个浓度(700ng/mL)的NGAL工作校准品，
2.2取75μl样品，一次性加入层析条的检测口；
2.3待样品层析10min之后，用时间分辨荧光定量分析仪对结果进行扫描分析，结果如下表，说明本发明的NGAL时间分辨荧光纳米免疫层析定量检测试纸条精密度良好。
3准确性测试：
3.1配置30ng/mL，60ng/mL，150ng/mL，400ng/mL，800ng/mL浓度的工作校准品。
3.2各取75μl样品，一次性加入层析条的检测口；
3.3待样品层析10min之后，用时间分辨荧光定量分析仪对结果进行扫描分析，结果如下表，说明本发明的NGAL时间分辨荧光纳米免疫层析定量检测试纸条准确度良好。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (10)

1.一种NGAL时间分辨荧光纳米免疫层析定量检测试纸条，其特征在于：包括背衬底板，该背衬底板上设置有硝酸纤维素膜、样品结合垫和吸水膜，该样品结合垫和吸水膜分别叠压在硝酸纤维素膜的两端上；该样品结合垫上包被有时间分辨荧光物质标记的NGAL单克隆抗体；该硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，该检测线包被有另一个表位的NGAL单克隆抗体，该质控线包被有羊抗鼠IgG。
2.根据权利要求1所述的一种NGAL时间分辨荧光纳米免疫层析定量检测试纸条，其特征在于：所述时间分辨荧光物质为镧系元素、镧系元素与乳胶的结合物、镧系元素的螯合物中的一种。
3.根据权利要求2所述的一种NGAL时间分辨荧光纳米免疫层析定量检测试纸条，其特征在于：所述镧系元素为铕，铽，钐或镝中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种NGAL时间分辨荧光纳米免疫层析定量检测试纸条，其特征在于：所述样品结合垫为玻璃纤维素膜或聚酯膜。
5.根据权利要求4所述的一种NGAL时间分辨荧光纳米免疫层析定量检测试纸条，其特征在于：所述样品结合垫为玻璃纤维素膜或聚酯膜经含有表面活性剂的缓冲液预封闭后干燥而得。
6.根据权利要求1所述的一种NGAL时间分辨荧光纳米免疫层析定量检测试纸条，其特征在于：所述试纸条外还包裹有一壳体。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的NGAL时间分辨荧光纳米免疫层析定量检测试纸条的制备方法，其特征在于：包括：
1)将硝酸纤维素膜固定在背衬底板上；用磷酸盐缓冲液将另一个表位的NGAL单克隆抗体稀释至0.9～1.1mg/ml，用0.04～0.06M的MES缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释至0.9～1.1mg/ml，再分别将稀释后的NGAL单克隆抗体和羊抗鼠IgG抗体均匀划至硝酸纤维素膜上，制备检测线和质控线；36～38℃干燥过夜；
2)取0.18～0.22μm的时间分辨荧光物质乳胶微球，与0.04～0.06M的MES缓冲液均匀混合，超声分散使得乳胶微球均匀分散于MES缓冲液中；加入18～22mg/ml的EDC溶液，常温振荡活化25～35min后，离心，去除上清；用0.04～0.06M的pH7.4～7.6的硼酸缓冲液复溶洗涤若干次后，超声分散，加入0.9～1.1mg/ml的NGAL单克隆抗体溶液，常温振荡1.5～2.5h后，离心，去除上清，再加入封闭液，常温、140～180rpm下振荡封闭0.5～1.5h；离心，去除上清，再加入偶联存储液，超声分散，即得标记有时间分辨荧光物质乳胶微球的NGAL单克隆抗体；所述时间分辨荧光物质乳胶微球、MES缓冲液、EDC溶液、每次加入的硼酸缓冲液、NGAL单克隆抗体溶液、封闭液、偶联储存液的体积比为1.8～2.2:9～11:0.9～1.1:9～11:0.9～1.1:9～11:9～11；
3)取玻璃纤维素膜，用含有表面活性剂的缓冲液进行预封闭后，45～55℃干燥过夜；将步骤2)得到的标记有时间分辨荧光物质乳胶微球的NGAL单克隆抗体按照9～11μl/cm的量超声喷雾至干燥好的玻璃纤维素膜上，45～55℃干燥过夜，制备得到样品结合垫；
4)将步骤3)得到的样品结合垫固定叠压在步骤1)得到的硝酸纤维素膜的一端，并将吸水膜固定叠压在硝酸纤维素膜的另一端，裁剪，并装入层析条壳体中，即得成品。
8.根据权利要求7中任一项所述的NGAL时间分辨荧光纳米免疫层析定量检测试纸条的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中，封闭液为38～42mM的pH7.4～7.6的甘氨酸溶液，且其中含有4.8～5.2％BSA、0.09～0.11％叠氮钠。
9.根据权利要求7中任一项所述的NGAL时间分辨荧光纳米免疫层析定量检测试纸条的制备方法，其特征在于：所述步骤2)中，偶联储存液为38～42mM的pH7.4～7.6的甘氨酸溶液且其中含有4.8～5.2％BSA、0.09～0.11％叠氮钠，0.9～1.1％NaCl，4～32％海藻糖，0.08～3.5％聚合物；该聚合物为PEG20000，PVP，PVA中的一种。
10.根据权利要求7中任一项所述的NGAL时间分辨荧光纳米免疫层析定量检测试纸条的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中，含有表面活性剂的缓冲液为95～105mM的pH7.3～7.5的PB缓冲液，且其中含有1.4～1.6％NaCl，4.8～5.2％BSA、0.4～0.6％吐温-20和4.8～5.2％蔗糖。
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