CN116297727A - 一种甲胎蛋白和异常凝血酶原电致发光传感器的制备及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种甲胎蛋白和异常凝血酶原电致发光传感器的制备及其应用，本发明是以特异性识别甲胎蛋白和异常凝血酶原的双特异性抗体为基础，利用铂纳米粒子介孔硅石墨烯纳米复合材料(PtNPsM‑SiGS)标记上述双特异性抗体，从而制得双特异性抗体标记的luminol‑Ru‑PtNPsM‑SiGS/anti‑AFP/DCP传感器。本发明的双特异性抗体标记传感器，可以在同一支电极上一次性同时检测甲胎蛋白和异常凝血酶原，显著提高了检测效率，对临床早期诊断肝癌具有重要的科学意义和应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及电致发光传感器技术领域，更具体地，涉及一种甲胎蛋白和异常凝血酶原电致发光传感器的制备及其应用。
背景技术
原发性肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)是全世界最常见的消化道恶性肿瘤之一，在癌症致死病因中居第3位。原发性肝细胞肝癌起病较隐匿，早期并没有明显的临床症状，主要依靠影像学检查和肝穿刺活检确诊，大多数患者在确诊时已是中晚期，因其侵袭性强、进展快、预后差，严重危害人们的健康。
甲胎蛋白(AFP)自20世纪70年代开始被用于原发性肝细胞肝癌的筛查和诊断，被认为是原发性肝细胞肝癌诊断和预后判断的首选血清标志物。然而，长期的临床实践表明，30％～40％的PLC患者AFP呈阴性，而部分肝硬化、慢性肝病等非原发性肝细胞肝癌患者其AFP水平呈不同程度的升高。
异常凝血酶原(DCP)是美国食品药品监督管理局(FDA)批准上市的血清标志物，它是一种无凝血功能的蛋白质，当肝细胞发生癌变时机体因缺乏维生素K、维生素K利用障碍或者存在维生素K拮抗剂而大量合成。研究表明，在HCC之外肝病患者的血清DCP水平轻度升高，但HCC患者的血清DCP水平却显著升高，在90％的HCC患者中都会出现DCP增高，均值高达900ug/L。
一方面，上述各个肝癌血清标志物单独检测准确性和可靠性都存在或多或少的问题。另一方面，现有肝癌血清标志物的检测方法存在重现性差、分析成本高等问题。因此，迫切需要开发一种新的检测方法。
发明内容
针对现有技术所存在的技术问题，本发明提供了一种甲胎蛋白和异常凝血酶原电致发光传感器的制备及其应用。本研究以特异性识别甲胎蛋白和异常凝血酶原的双特异性抗体为基础，构建一种基于电致化学发光免疫传感器，进而实现提升肝癌早期诊断的灵敏度和特异性。在临床上可用于肝癌或高危人群的早期筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测。
本发明的目的之一是提供特异性识别甲胎蛋白和异常凝血酶原的双特异性抗体。所述双特异性抗体包含特异性结合甲胎蛋白的第一个抗体的重链和轻链，以及特异性结合异常凝血酶原的第二个抗体的重链和轻链。
优选地，所述特异性结合甲胎蛋白的第一个抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的CDR1-3分别如：SEQ ID NO.1-3所示，所述轻链可变区的CDR4-6分别如：SEQ ID NO.4-6所示。
进一步地，所述特异性结合甲胎蛋白的第二个抗体的重链和轻链包括如SEQ IDNO.7和8所示的氨基酸；
进一步地，所述特异性结合异常凝血酶原的第二个抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的CDR1-3分别如：SEQ ID NO.9-11所示，所述轻链可变区的CDR4-6分别如：SEQ ID NO.12-14所示。
进一步地，所述特异性结合异常凝血酶原的第二个抗体的重链和轻链包括如SEQID NO.15和16所示的氨基酸；
优选地，本发明所述双特异性抗体的结构示意图如图1所示，该双特异性抗体是由2条重链(H)和2条轻链(L)组成，呈Y字形，与天然抗体不同的是，双特异性抗体的两条重链与轻链来源不同，故可拥有两种不同的Fab和Fc结构域，具有天然抗体难以比拟的结构优势。其中，特异性结合甲胎蛋白抗体的VH和特异性结合异常凝血酶原的VH通过linker连接形成双特异性抗体；进一步在2条多肽的C末端引入半胱氨酸，形成链间二硫键，可以提高目标抗体的稳定性。
优选地，所述linker为甘氨酸-丝氨酸连接子，其结构式由(GS)n表示，n为1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12；进一步地，所述连接子结构式由(GGGGS)n表示，n为1,2,3,4,5；进一步地，所述连接子结构式由(GGGGS)2。
进一步地，所述双特异性抗体的结构形式不限于DART、BiTE或TandAb等。
本发明的目的之二是提供一种甲胎蛋白和异常凝血酶原电致化学发光免疫传感器的制备方法，将所制备的电致化学发光免疫传感器，用于同时检测甲胎蛋白和异常凝血酶原。
具体而言，本发明所述方法包括以下步骤：
(1)铂纳米粒子介孔硅石墨烯纳米复合材料(PtNPsM-SiGS)的制备：将10mL的3mg/mL氧化石墨烯水溶液，0.5g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，25mg氢氧化钠和45mL超纯水混合，超声40min；45℃下磁力搅拌，逐滴加入正硅酸四乙酯(TEOS)的乙醇溶液，反应11h；加入80mL的质量分数为85％的水合肼的水溶液，75℃加热3h，加热结束后，采用乙醇进行离心洗涤三次；将离心后的沉淀产品溶于丙酮中搅拌24h，离心三次；将离心后的沉淀产品溶于50mL乙醇中，加入200μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，搅拌12h，离心分离；将离心后的沉淀产品溶于45mL水，得到氨基化介孔硅石墨烯纳米复合材料(M-SiGS)；将4mL M-SiGS水溶液和50mL铂纳米粒子溶液混合，搅拌4h，离心分离两次，取离心后底部材料进行真空干燥，得到PtNPsM-SiGS；所述的TEOS乙醇溶液是由400μL TEOS溶于1.6mL的乙醇中制得；
(2)称取1.5mg的PtNPsM-SiGS加入到2mL的1×10-3mol/L三联吡啶钌(Ru(bpy)3Cl2)溶液、2mL的1×10-3mol/L鲁米诺(luminol)溶液和10μg/mL特异性识别甲胎蛋白和异常凝血酶原的双特异性抗体(anti-AFP/DCP)溶液中，超声3h，搅拌10h，离心分离上清，得到双特异性抗体标记luminol-Ru-PtNPsM-SiGS/anti-AFP/DCP；
(3)在工作电极的表面，修饰一层纳米多孔金膜，室温下自然晾干；随后在其表面上滴加10μL的10μg/mLanti-AFP/DCP溶液，室温下孵化3h，然后用超纯水清洗，晾干；用超纯水洗去没有交联上的抗体，滴加质量分数为1％的牛血清白蛋白溶液，37℃下放置2h，用pH为7.5的PBS缓冲溶液洗涤晾干，在4℃下储存备用，制得甲胎蛋白和异常凝血酶原电致化学发光免疫传感器。
本发明的目的之三是还提供了一种应用上述所述甲胎蛋白和异常凝血酶原电致化学发光免疫传感器用于甲胎蛋白和异常凝血酶原的同时检测的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)把已知浓度的甲胎蛋白和异常凝血酶原溶液加入到50μL的pH为7.5的PBS缓冲溶液中，制得抗原混合溶液，取15μL抗原混合溶液滴涂到前述所述所制备的电致化学发光免疫传感器的工作电极上，放置2h；
(2)将5μL双特异性抗体标记luminol-Ru-PtNPsM-SiGS/anti-AFP/DCP滴涂到工作电极表面上，3h后用pH为7.5的PBS缓冲溶进行清洗，得到组装的工作电极；
(3)将参比电极、对电极和组装的工作电极连接在电致化学发光设备上，在电解槽中加入15mL的30mmol/L三乙醇胺的水溶液，用循环伏安法对组装的工作电极施加循环电压；双特异性抗体标记luminol-Ru-PtNPsM-SiGS/anti-AFP/DCP在不同的电压下产生光信号，根据所得电致化学发光的光信号强度与甲胎蛋白和异常凝血酶原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；
(4)将待测样品溶液代替甲胎蛋白和异常凝血酶原的标准溶液，按照所述甲胎蛋白和异常凝血酶原的工作曲线的绘制方法进行检测；
(5)用于甲胎蛋白(AFP)和异常凝血酶原(DCP)的检测范围：AFP浓度在0.002～3.5ng/mL，DCP抗原浓度在0.001～2.5ng/mL，AFP检出限为0.25pg/mL，DCP检出限为0.1pg/mL。
本发明的目的之四是上述所述双特异性抗体或上述任一项所述方法在制备用于肝癌或高危人群的早期筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测试剂或试剂盒中的应用。
本发明的目的之五是提供一种用于肝癌或高危人群的早期筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测试剂或试剂盒，所述试剂盒包括所述双特异性抗体。
进一步地，所述试剂或试剂盒还包括记载甲胎蛋白和异常凝血酶原的同时检测方法。
本发明的优点如下：首次制备了同时识别甲胎蛋白(AFP)和异常凝血酶原(DCP)的双特异性抗体，并将所述抗体应用于制备电致化学发光免疫传感器，该传感器相比于现有传感器而言，制备过程更为简便，节省了原材料，适合于大规模检测，显著提高了检测效率，该免疫传感器的制备对临床早期诊断肝癌具有重要的科学意义和应用价值。
附图说明
图1是本发明所述双特异性抗体的结构示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，并不用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本发明提供特异性识别甲胎蛋白和异常凝血酶原的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含特异性结合甲胎蛋白的第一个抗体的重链和轻链，以及特异性结合异常凝血酶原的第二个抗体的重链和轻链。
所述特异性结合甲胎蛋白的第一个抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的CDR1-3分别如：SEQ ID NO.1-3所示，所述轻链可变区的CDR4-6分别如：SEQ IDNO.4-6所示。优选地，所述特异性结合甲胎蛋白的第二个抗体的重链和轻链包括如SEQ IDNO.7和8所示的氨基酸；
所述特异性结合异常凝血酶原的第二个抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的CDR1-3分别如：SEQ ID NO.9-11所示，所述轻链可变区的CDR4-6分别如：SEQID NO.12-14所示。优选地，所述特异性结合异常凝血酶原的第二个抗体的重链和轻链包括如SEQ ID NO.15和16所示的氨基酸。
优选地，本发明所述双特异性抗体的结构示意图如图1所示，该双特异性抗体是由2条重链(H)和2条轻链(L)组成，呈Y字形，与天然抗体不同的是，双特异性抗体的两条重链与轻链来源不同，故可拥有两种不同的Fab和Fc结构域，具有天然抗体难以比拟的结构优势。其中，特异性结合甲胎蛋白抗体的VH和特异性结合异常凝血酶原的VH通过linker连接形成双特异性抗体；进一步在2条多肽的C末端引入半胱氨酸，形成链间二硫键，可以提高目标抗体的稳定性。进一步地，所述双特异性抗体的结构形式不限于DART、BiTE或TandAb等。优选地，所述linker为甘氨酸-丝氨酸连接子，其结构式由(GS)n表示，n为1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12；进一步地，所述连接子结构式由(GGGGS)n表示，n为1,2,3,4,5；进一步地，所述连接子结构式由(GGGGS)2。
实施例2
采用GE Biacore T200检测实施例1中的双特异性抗体的亲和动力学常数，具体实验操作如仪器说明书所示。实验结果：根据检测结果，双特异性抗体亲和力数据如下表1：
表1.抗体亲和动力学分析
实验结论：本发明获得的双特异性抗体与甲胎蛋白AFP和异常凝血酶原DCP均具有高亲和力，适合用于后续构建免疫传感器。
实施例3
一种甲胎蛋白和异常凝血酶原电致化学发光免疫传感器的制备方法，将所制备的电致化学发光免疫传感器，用于同时检测甲胎蛋白和异常凝血酶原。
具体而言，本发明所述方法包括以下步骤：
(1)铂纳米粒子介孔硅石墨烯纳米复合材料(PtNPsM-SiGS)的制备：将10mL的3mg/mL氧化石墨烯水溶液，0.5g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，25mg氢氧化钠和45mL超纯水混合，超声40min；45℃下磁力搅拌，逐滴加入正硅酸四乙酯(TEOS)的乙醇溶液，反应11h；加入80mL的质量分数为85％的水合肼的水溶液，75℃加热3h，加热结束后，采用乙醇进行离心洗涤三次；将离心后的沉淀产品溶于丙酮中搅拌24h，离心三次；将离心后的沉淀产品溶于50mL乙醇中，加入200μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，搅拌12h，离心分离；将离心后的沉淀产品溶于45mL水，得到氨基化介孔硅石墨烯纳米复合材料(M-SiGS)；将4mL M-SiGS水溶液和50mL铂纳米粒子溶液混合，搅拌4h，离心分离两次，取离心后底部材料进行真空干燥，得到PtNPsM-SiGS；所述的TEOS乙醇溶液是由400μL TEOS溶于1.6mL的乙醇中制得；
(2)称取1.5mg的PtNPsM-SiGS加入到2mL的1×10-3mol/L三联吡啶钌(Ru(bpy)3Cl2)溶液、2mL的1×10-3mol/L鲁米诺(luminol)溶液和10μg/mL特异性识别甲胎蛋白和异常凝血酶原的双特异性抗体(anti-AFP/DCP)溶液中，超声3h，搅拌10h，离心分离上清，得到双特异性抗体标记luminol-Ru-PtNPsM-SiGS/anti-AFP/DCP；
(3)在工作电极的表面，修饰一层纳米多孔金膜，室温下自然晾干；随后在其表面上滴加10μL的10μg/mLanti-AFP/DCP溶液，室温下孵化3h，然后用超纯水清洗，晾干；用超纯水洗去没有交联上的抗体，滴加质量分数为1％的牛血清白蛋白溶液，37℃下放置2h，用pH为7.5的PBS缓冲溶液洗涤晾干，在4℃下储存备用，制得甲胎蛋白和异常凝血酶原电致化学发光免疫传感器。
实施例4
本发明还提供了一种应用上述所述甲胎蛋白和异常凝血酶原电致化学发光免疫传感器用于甲胎蛋白和异常凝血酶原的同时检测的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)把已知浓度的甲胎蛋白和异常凝血酶原溶液加入到50μL的pH＝7.5的PBS缓冲溶液中，制得抗原混合溶液，取15μL抗原混合溶液滴涂到前述所述的所制备的电致化学发光免疫传感器的工作电极上，放置2h；
(2)将5μL双特异性抗体标记luminol-Ru-PtNPsM-SiGS/anti-AFP/DCP滴涂到工作电极表面上，3h后用pH为7.5的PBS缓冲溶进行清洗，得到组装的工作电极；
(3)将参比电极、对电极和组装的工作电极连接在电致化学发光设备上，在电解槽中加入15mL的30mmol/L三乙醇胺的水溶液，用循环伏安法对组装的工作电极施加循环电压；双特异性抗体标记luminol-Ru-PtNPsM-SiGS/anti-AFP/DCP在不同的电压下产生光信号，根据所得电致化学发光的光信号强度与甲胎蛋白和异常凝血酶原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；
(4)将待测样品溶液代替甲胎蛋白和异常凝血酶原的标准溶液，按照所述甲胎蛋白和异常凝血酶原的工作曲线的绘制方法进行检测；
(5)用于甲胎蛋白(AFP)和异常凝血酶原(DCP)的检测范围：AFP浓度在0.002～3.5ng/mL，DCP抗原浓度在0.001～2.5ng/mL，AFP检出限为0.25pg/mL，DCP检出限为0.1pg/mL。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种特异性识别甲胎蛋白和异常凝血酶原的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体包含特异性结合甲胎蛋白的第一个抗体的重链和轻链，以及特异性结合异常凝血酶原的第二个抗体的重链和轻链。
2.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述特异性结合甲胎蛋白的第一个抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的CDR1-3分别如：SEQ ID NO.1-3所示，所述轻链可变区的CDR4-6分别如：SEQ ID NO.4-6所示。
3.如权利要求2所述的双特异性抗体，其特征在于，所述特异性结合甲胎蛋白的第一个抗体的重链和轻链包括如SEQ ID NO.7和8所示的氨基酸。
4.如权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述特异性结合异常凝血酶原的第二个抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的CDR1-3分别如：SEQ ID NO.9-11所示，所述轻链可变区的CDR4-6分别如：SEQ ID NO.12-14所示。
5.如权利要求2所述的双特异性抗体，其特征在于，所述特异性结合异常凝血酶原的第二个抗体的重链和轻链包括如SEQ ID NO.15和16所示的氨基酸。
6.一种甲胎蛋白和异常凝血酶原电致化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)铂纳米粒子介孔硅石墨烯纳米复合材料(PtNPsM-SiGS)的制备：将10mL的3mg/mL氧化石墨烯水溶液，0.5g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，25mg氢氧化钠和45mL超纯水混合，超声40min；45℃下磁力搅拌，逐滴加入正硅酸四乙酯(TEOS)的乙醇溶液，反应11h；加入80mL的质量分数为85％的水合肼的水溶液，75℃加热3h，加热结束后，采用乙醇进行离心洗涤三次；将离心后的沉淀产品溶于丙酮中搅拌24h，离心三次；将离心后的沉淀产品溶于50mL乙醇中，加入200μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，搅拌12h，离心分离；将离心后的沉淀产品溶于45mL水，得到氨基化介孔硅石墨烯纳米复合材料(M-SiGS)；将4mL M-SiGS水溶液和50mL铂纳米粒子溶液混合，搅拌4h，离心分离两次，取离心后底部材料进行真空干燥，得到PtNPsM-SiGS；所述的TEOS乙醇溶液是由400μL TEOS溶于1.6mL的乙醇中制得；
(2)称取1.5mg的PtNPsM-SiGS加入到2mL的1×10-3mol/L三联吡啶钌(Ru(bpy)3Cl2)溶液、2mL的1×10-3mol/L鲁米诺(luminol)溶液和10μg/mL特异性识别甲胎蛋白和异常凝血酶原的双特异性抗体(anti-AFP/DCP)溶液中，超声3h，搅拌10h，离心分离上清，得到双特异性抗体标记luminol-Ru-PtNPsM-SiGS/anti-AFP/DCP；
(3)在工作电极的表面，修饰一层纳米多孔金膜，室温下自然晾干；随后在其表面上滴加10μL的10μg/mLanti-AFP/DCP溶液，室温下孵化3h，然后用超纯水清洗，晾干；用超纯水洗去没有交联上的抗体，滴加质量分数为1％的牛血清白蛋白溶液，37℃下放置2h，用pH为7.5的PBS缓冲溶液洗涤晾干，在4℃下储存备用，制得甲胎蛋白和异常凝血酶原电致化学发光免疫传感器。
7.一种用于甲胎蛋白和异常凝血酶原的同时检测的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将已知浓度的甲胎蛋白和异常凝血酶原溶液加入到50μL且pH为7.5的PBS缓冲溶液中，制得抗原混合溶液，取15μL抗原混合溶液滴涂到权利要求6所制备的电致化学发光免疫传感器的工作电极上，放置2h；
(2)将5μL双特异性抗体标记luminol-Ru-PtNPsM-SiGS/anti-AFP/DCP滴涂到工作电极表面上，3h后用pH为7.5的PBS缓冲溶进行清洗，得到组装的工作电极；
(3)将参比电极、对电极和组装的工作电极连接在电致化学发光设备上，在电解槽中加入15mL的30mmol/L三乙醇胺的水溶液，用循环伏安法对组装的工作电极施加循环电压；双特异性抗体标记luminol-Ru-PtNPsM-SiGS/anti-AFP/DCP在不同的电压下产生光信号，根据所得电致化学发光的光信号强度与甲胎蛋白和异常凝血酶原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；
(4)将待测样品溶液代替甲胎蛋白和异常凝血酶原的标准溶液，按照所述甲胎蛋白和异常凝血酶原的工作曲线的绘制方法进行检测；
(5)用于甲胎蛋白(AFP)和异常凝血酶原(DCP)的检测范围：AFP浓度在0.002～3.5ng/mL，DCP抗原浓度在0.001～2.5ng/mL，AFP检出限为0.25pg/mL，DCP检出限为0.1pg/mL。
8.一种根据权利要求1-5任一项所述双特异性抗体或权利要求6-7任一项所述方法在制备用于肝癌或高危人群的早期筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测试剂或试剂盒中的应用。
9.一种用于肝癌或高危人群的早期筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒包括1-5任一项所述双特异性抗体。
10.如权利要求9所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒还包括记载权利要求7所述的检测方法。
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