CN114018882A - 一种基于流式荧光技术的同步检测吗啡和冰毒的检测方法及试剂盒 - Google Patents

一种基于流式荧光技术的同步检测吗啡和冰毒的检测方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于流式荧光技术同步检测吗啡和冰毒的检测方法及试剂盒，是以磁性荧光编码微球作为载体、以藻红蛋白作为荧光标记物，在一个待测样品中同时检测吗啡和冰毒的一种流式荧光免疫分析法。在本发明中，分别将冰毒抗原和吗啡抗原共价偶联于不同磁性聚苯乙烯荧光编码微球表面，同时分别将吗啡抗体、冰毒抗体与藻红蛋白共价偶联，利用竞争分析法，形成微球‑抗原‑抗体荧光免疫复合体。通过识别不同编码微球区分两种检测物，通过检测藻红蛋白荧光强度计算待测物浓度。本发明可以同时检测待测样品中冰毒和吗啡含量，效率高、特异性强、灵敏度高、重复性好，可用于缉毒筛查，具有较好的应用前景。

Description

一种基于流式荧光技术的同步检测吗啡和冰毒的检测方法及 试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测方法及试剂盒，更具体一点说，涉及一种基于流式荧光技术的同步检测吗啡和冰毒的检测方法及试剂盒，属于生物技术检测领域。
背景技术
冰毒(甲基苯丙胺)(methamphetamine)又称甲基安非他明、去氧麻黄碱、盐酸甲基苯丙胺。因其原料外观为纯白结晶体，晶莹剔透，故被吸毒、贩毒者称为“冰”。由于它的毒性剧烈，人们便称之为“冰毒”。冰毒属于兴奋剂类精神药品，具有强烈的中枢兴奋作用，由于其刺激性强、持久力强，使用一次便会上瘾，因此被称为毒品之王。
吗啡(Morphine)，为阿片受体激动剂，在鸦片中的含量为4％-21％，平均10％左右。1806年德国化学家泽尔蒂纳首次将其从鸦片中分离出来，并使用希腊梦神Morpheus的名字将其命名为吗啡。其衍生物盐酸吗啡是临床上常用的麻醉剂，有极强的镇痛作用，而且它的镇痛作用有较好的选择性，多用于创伤、手术、烧伤等引起的剧痛，也用于心肌梗死引起的心绞痛，还可作为镇痛、镇咳和止泻剂；吗啡的二乙酸酯又被称为海洛因。但其最大缺点是易成瘾。这使得长期吸食者无论从身体上还是心理上都会对吗啡产生严重的依赖性，造成严重的毒物癖，从而对自身和社会均造成极大的危害，众所周知，吗啡是海洛因在体内代谢的主要产物，吸食海洛因后可以在体液中检测到吗啡的存在。其最大缺点是易成瘾。这使得长期吸食者无论从身体上还是心理上都会对吗啡产生严重的依赖性，造成严重的毒物癖，从而对自身和社会均造成极大的危害。
毒品威胁着人类的健康，威胁着全世界的社会稳定和经济发展，是当今世界最严重的社会问题。在同一样品中，同步地、准确地、快速地检测待测样品中冰毒和海洛因的含量具有重要的意义。
流式微球技术利用球形基质作为载体,以流式细胞术作为检测平台,可以在较短时间内对样品进行大规模检测。该系统主要基于流式荧光编码微球，检测通量大、灵敏度高,可实现同步检测多靶标，具有较为广阔的应用空间。
发明内容
本发明提供了一种基于流式荧光技术的冰毒与吗啡的检测方法，利用不同荧光编码磁性微球和藻红蛋白实现在同一份样品中同步检测冰毒和吗啡。
本发明提供了一种基于流式荧光技术的冰毒与吗啡的检测的试剂盒
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明一种基于流式荧光技术的同步检测吗啡和冰毒的检测方法，其特征在于该检测方法为：首先，将冰毒和吗啡抗原分别包被在不同荧光编码磁性微球表面，形成微球-抗原复合物；
将冰毒抗体和吗啡抗体分别与藻红蛋白偶联，并对抗体的使用量进行优化，确定适合的抗体使用剂量，避免检测抗体过量；
将优化剂量的偶联抗体和待测样品同时与荧光编码磁性微球孵育，最终形成微球-抗原-藻红蛋白偶联抗体荧光免疫复合物；
经仪器检测荧光类型和荧光信号强度完成检测。
优选的，形成微球-抗原复合物后，利用离心管和磁力架对荧光编码磁性微球进行洗涤和分离，去除未结合抗原。
优选的，荧光编码磁性微球为具有羧基基团的磁性聚苯乙烯荧光编码微球。
优选的，包被抗原微球是通过活化荧光微球表面的羧基基团，将羧基基团分别与冰毒抗原、吗啡抗原上的氨基形成共价键，从而形成复合物。
优选的，检测抗体是指与藻红蛋白偶联的冰毒单克隆抗体和吗啡单克隆抗体。
优选的，将冰毒和吗啡抗原分别包被在不同荧光编码磁性微球表面过程中包被比例和孵育条件：10μg抗原包被5×106个荧光编码磁性微球，抗原与荧光编码磁性微球的孵育条件为室温避光震荡1.5h。
优选的，冰毒抗原和吗啡抗原共价偶联于荧光编码磁性微球表面，利用冰毒抗原和吗啡抗原、待测样品中的冰毒分子和吗啡分子、藻红蛋白偶联的冰毒抗体和吗啡抗体，形成微球-抗原-藻红蛋白偶联抗体荧光免疫复合物，通过竞争法进行检测。
优选的，经仪器检测荧光类型和荧光信号强度完成检测中以藻红蛋白作为荧光标记物，根据其荧光强度计算待测物含量。
优选的，藻红蛋白偶联冰毒抗体和吗啡抗体的浓度为30μg/mL，每1mg抗体偶联藻红蛋白3.5mg。
本发明一种基于流式荧光技术的同步检测吗啡和冰毒检测的试剂盒，包含：包括试剂盒以及放在试剂盒内的多个药剂盒，其中，具有放置不同荧光编码磁性微球的药剂盒，荧光编码微球包含有分别包被冰毒抗原和吗啡抗原的荧光编码微球；具有放置检测抗体的药剂盒，检测抗体包括分别偶联藻红蛋白的冰毒抗体和吗啡抗体，具有放置标准品溶液的药剂盒，所述标准品溶液包括冰毒标准品和吗啡标准品溶液，具有放置缓冲液的药剂盒，所述缓冲液为pH7.4的PBS缓冲液；试剂盒里设有可发性聚苯乙烯泡沫层，试剂盒包括盒体与盒盖，盒体与盒盖由酚醛塑料材质的连接轴连接，试剂盒底部预制有存放碎冰的冰槽。
有益效果：通过识别不同编码微球区分两种检测物，通过检测藻红蛋白荧光强度计算待测物浓度。本发明可以同时检测待测样品中冰毒和吗啡含量，效率高、特异性强、灵敏度高、重复性好，可用于缉毒筛查，具有较好的应用前景；试剂盒使用可发性聚苯乙烯泡沫材质，盒体与盒盖由酚醛塑料材质的连接轴连接，试剂盒底部预制有存放碎冰的冰槽，结构简单，实用性强。
附图说明
图1是本发明冰毒检测标准曲线图。
图2是本发明吗啡检测标准曲线图。
具体实施方式
以下结合说明书附图1-2，对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。
为使本发明的目的、方法及优点更加清楚明确，下面结合具体实施例对本发明做出详细说明，所述的实施例只用于说明本发明，而不是用于对本发明进行限定，任何在本发明基础上所做的修改、等同替换等均在本发明的保护范围内。
本发明一种基于流式荧光技术的同步检测吗啡和冰毒的检测方法的技术解决方案如下：
首先，将冰毒和吗啡抗原分别包被在不同荧光编码磁性微球表面，形成微球-抗原复合物，10μg抗原包被5×106个磁珠，抗原与微球的孵育条件为室温避光震荡1.5h。利用离心管和磁力架对编码荧光微球进行洗涤和分离，去除未结合抗原。将冰毒抗体和吗啡抗体分别与藻红蛋白偶联，并对抗体的使用量进行优化，确定适合的抗体使用剂量，避免检测抗体过量。将优化剂量的偶联抗体和待测样品同时与微球孵育，孵育条件为避光、37℃震荡1h，最终形成微球-冰毒/吗啡-藻红蛋白偶联抗体荧光免疫复合物，经仪器检测荧光类型和荧光信号强度完成检测。
所述包被抗原是指BSA-冰毒和BSA-吗啡。所述包被抗原微球，是通过活化荧光微球表面的羧基[利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)]，将其与BSA-冰毒和BSA-吗啡上的氨基形成共价键，从而形成复合物。所述检测抗体是指与藻红蛋白偶联的冰毒单克隆抗体和吗啡单克隆抗体。所述样品制备过程中的离心管和磁力架，可用酶标板和96孔板磁力架替代。所述荧光检测分析是指利用检测仪器发射的两束不同波长激发光照射免疫复合体，由荧光编码微球的荧光类型确定检测指标类型、由藻红蛋白的荧光强度确定检测指标含量。检测仪器优选Tesmi F4000全自动流式荧光发光免疫分析仪。磁性微球优选美国Luminex生产。
美国Luminex公司可以提供编码微球。
以下结合附图1-2、实施例1-4对本申请作进一步详细说明。
实施例1微球-冰毒抗原偶联
5×106个微球为一个批次，将其加入至1.5mL离心管中，依次加入EDC和NHS溶液，在室温、酸性条件下活化微球表面30min，随后利用磁力架将微球清洗，加入10μg抗原，室温避光震荡1.5h，利用磁力架去除未过量的抗原，加入1％BSA，室温避光震荡30h以封闭未结合位点。
实施例2藻红蛋白偶联冰毒抗体
藻红蛋白冻干粉用0.1M pH值7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，浓度调整到5-10mg/mL。将琥珀酰亚胺-4-(N-甲基马来酰亚胺)环已烷-1-碳酸酯)(SMCC)溶解于无水二甲基亚砜(DMSO)配制成10mg/mL，每毫克的藻红蛋白添加11uL的琥珀酰亚胺-4-(N-甲基马来酰亚胺)环已烷-1-碳酸酯)(SMCC)，室温旋转反应1h。将衍生化的藻红蛋白过柱，收集藻红蛋白峰。二硫苏糖醇(DTT)溶解于蒸馏水中，配制成1mol/L，调整抗体的浓度，使其浓度为4mg/mL。每mL抗体溶液中加入20ul的二硫苏糖醇(DTT)，室温静置反应40min，将反应液过柱，收集抗体部分。每mg抗体加入3.2mg的琥珀酰亚胺-4-(N-甲基马来酰亚胺)环已烷-1-碳酸酯)(SMCC)衍生化的藻红蛋白，于室温旋转反应1h，使藻红蛋白分子上的马来酰亚胺基和抗体上的巯基实现共价交联。加入3.4微升N-乙基马来酰胺(NEM)，于室温旋转反应1h，使抗体上的巯基封闭。将交联物于存储缓冲液中透析后保存于冰箱。
实施例3微球-冰毒/吗啡-藻红蛋白偶联抗体荧光免疫复合物形成
1.5mL离心管中加入微球-冰毒抗原偶联物，将藻红蛋白偶联抗体和待测样品同时与微球孵育，孵育条件为避光、37℃震荡1h，得到微球-冰毒/吗啡-藻红蛋白偶联抗体荧光免疫复合物，上机检测，由荧光编码微球的荧光类型确定检测指标类型、由藻红蛋白的荧光强度确定检测指标含量。
实施例4冰毒、吗啡检测的线性范围、灵敏度、特异性及精密度
分别配制冰毒和吗啡的标准品，利用本试剂盒进行检测，绘制标准曲线，利用荧光值和浓度值绘制标准曲线，冰毒检测的线性方程为：Log10(Y)＝5.75148-0.72868Log10(X)，R2＝0.99672，线性范围为2ng/ml～1000ng/ml，吗啡检测的线性方程为：Log10(Y)＝5.90790-0.78742Log10(X)，R2＝0.99088，线性范围为2ng/ml～1000ng/ml，结果图1所示。
平行测定10次0ng/ml参考标准品的荧光值，并计算其均值(mean)及标准差(SD)，采用mean-2SD代入标准曲线方程，计算得到本试剂盒对冰毒的检测灵敏度为1.21ng/ml，对吗啡的检测灵敏度为0.75ng/ml。
分别检测冰毒和吗啡的低值样本、中值样本、高值样本各10次，得到冰毒检测的批内变异系数为5.77％-7.12％(＜10％)，批间变异系数为7.52％-12.36％(＜15％)。吗啡检测的批内变异系数为3.40％-5.68％(＜10％)，批间变异系数为8.14％-13.62％。
表1冰毒检测精密度
Figure BDA0003322998110000061
表2吗啡检测精密度
Figure BDA0003322998110000062
Figure BDA0003322998110000071
最后，需要注意的是，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于流式荧光技术的同步检测吗啡和冰毒的检测方法，其特征在于该检测方法为：首先，将冰毒和吗啡抗原分别包被在不同荧光编码磁性微球表面，形成微球-抗原复合物；将冰毒抗体和吗啡抗体分别与藻红蛋白偶联以达到标记物最大信号强度80％时的抗体浓度为实验浓度，最大信号强度在没有待测样品的情况下用偶联藻红蛋白的抗体与偶联抗原的微球滴定测得；
将优化剂量的偶联抗体和待测样品同时与荧光编码磁性微球孵育，最终形成微球-抗原-藻红蛋白偶联抗体荧光免疫复合物；经仪器检测荧光类型和荧光信号强度完成检测。
2.如权利要求1所述的一种基于流式荧光技术的同步检测吗啡和冰毒的检测方法，其特征在于：形成微球-抗原复合物后，利用离心管和磁力架对荧光编码磁性微球进行洗涤和分离，去除未结合抗原。
3.如权利要求1或2所述的一种基于流式荧光技术的同步检测吗啡和冰毒的检测方法，其特征在于：荧光编码磁性微球为具有羧基基团的磁性聚苯乙烯荧光编码微球。
4.如权利要求1所述的一种基于流式荧光技术的同步检测吗啡和冰毒的检测方法，其特征在于：包被抗原微球是通过活化荧光微球表面的羧基基团，将羧基基团分别与冰毒抗原、吗啡抗原上的氨基形成共价键，从而形成复合物。
5.如权利要求1所述的一种基于流式荧光技术的同步检测吗啡和冰毒的检测方法，其特征在于：检测抗体是指与藻红蛋白偶联的冰毒单克隆抗体和吗啡单克隆抗体。
6.如权利要求1或2或4所述的一种基于流式荧光技术的同步检测吗啡和冰毒的检测方法，其特征在于：将冰毒和吗啡抗原分别包被在不同荧光编码磁性微球表面过程中包被比例和孵育条件：10μg抗原包被5×106个荧光编码磁性微球，抗原与荧光编码磁性微球的孵育条件为室温避光震荡1.5h。
7.如权利要求1所述的一种基于流式荧光技术的同步检测吗啡和冰毒的检测方法，其特征在于：冰毒抗原和吗啡抗原共价偶联于荧光编码磁性微球表面，利用冰毒抗原和吗啡抗原、待测样品中的冰毒分子和吗啡分子、藻红蛋白偶联的冰毒抗体和吗啡抗体，形成微球-抗原-藻红蛋白偶联抗体荧光免疫复合物，通过竞争法进行检测。
8.如权利要求1所述的一种基于流式荧光技术的同步检测吗啡和冰毒的检测方法，其特征在于：经仪器检测荧光类型和荧光信号强度完成检测中以藻红蛋白作为荧光标记物，根据其荧光强度计算待测物含量。
9.如权利要求1所述的一种基于流式荧光技术的同步检测吗啡和冰毒的检测方法，其特征在于：藻红蛋白偶联冰毒抗体和吗啡抗体的浓度为30μg/mL，每1mg抗体偶联藻红蛋白3.5mg。
10.一种如权利1-6所述的基于流式荧光技术的同步检测吗啡和冰毒检测的试剂盒，其特征在于包含：包括试剂盒以及放在试剂盒内的多个药剂盒，其中，具有放置不同荧光编码磁性微球的药剂盒，荧光编码微球包含有分别包被冰毒抗原和吗啡抗原的荧光编码微球；具有放置检测抗体的药剂盒，检测抗体包括分别偶联藻红蛋白的冰毒抗体和吗啡抗体，具有放置标准品溶液的药剂盒，所述标准品溶液包括冰毒标准品和吗啡标准品溶液，具有放置缓冲液的药剂盒，所述缓冲液为pH7.4的PBS缓冲液，试剂盒里设有可发性聚苯乙烯泡沫层，试剂盒包括盒体与盒盖，盒体与盒盖由酚醛塑料材质的连接轴连接，试剂盒底部预制有存放碎冰的冰槽。
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