CN115015540A - 采用处理的nc膜及标记物与抗体结合的试纸条的制备方法 - Google Patents

采用处理的nc膜及标记物与抗体结合的试纸条的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种采用处理的NC膜及标记物与抗体结合的试纸条的制备方法，属于医疗检测试剂制备领域。包括氧化锌‑壳聚糖‑标记物制备，氧化锌‑壳聚糖‑标记物交联标记抗体，制得免疫硝酸纤，组装检测试纸条。优点是提高了抗体标记效果、增强了标记物与抗体或抗原结合效果，进而提高了灵敏度、稳定性、精准度。增加抗体的包被效率、提高吸附效果、蛋白分布更加均一，从而提高了免疫层析方法学的灵敏度、精准度和稳定性。

Description

采用处理的NC膜及标记物与抗体结合的试纸条的制备方法
技术领域
本发明涉及医疗检测试剂制备领域的一种技术，尤其涉及免疫层析方法学的试纸条制备中对硝酸纤维素膜(NC)膜特殊处理、标记物与抗体交联一种技术方法；经过上述处理后，能够解决待测物在NC膜上均匀分布、以及提高NC膜的吸附效果，同时也改变了标记物与抗体结合方式，提高抗体标记效率，从而提高了产品灵敏度、精准度、稳定性，降低了产品批内差。
背景技术
免疫层析技术是在20世纪60年代在发达国家兴起并被用于检测血清蛋白的一种结合了免疫技术和色谱层析技术的快速检测分析方法,利用胶体金、胶体碳、磁性纳米材料、稀土纳米材料、纳米微球、荧光微球、量子点等着色标记物,在层析时,标记物与待测物的络合物被相应的配体捕获而浓集显色于硝酸纤维素膜上的检测线,以纤维膜上显色条带的有无、颜色深浅和反射光线来定性或定量，广泛应用于各类快检项目中。
在免疫层析检测中，蛋白质固着于NC膜作为待测样本的捕获试剂；由于检测结果完全取决于捕获试剂在NC膜上达到良好的吸附效果，因此蛋白质在NC膜上均一、良好的吸附对标记物检测结果非常重要；蛋白质固着于NC膜作为待测样本的捕获试剂，在实际应用过程中NC会出现“咖啡环效应”，即抗原的识别区域呈现边缘浓度远高于中间浓度的不均匀现象，导致所得印迹常常呈现环状，非常不利于进行后续的准确定量分析。一般而言，“咖啡环效应”的影响随着抗原浓度的降低而愈发明显。由于检测结果完全取决于捕获试剂在NC膜上达到良好的吸附效果，因此蛋白质在NC膜上均一、良好的吸附对标记物检测结果非常重要。如果蛋白不能牢固的吸附于NC膜，那么蛋白吸附时发生扩散，从而导致检测线较宽、显色较弱而不是鲜艳而清晰，使检测结果难以解释、难以达到精准，在极端条件下，如果蛋白与NC膜的物理吸附作用太弱，流过的蛋白检测物和表面活性剂溶液可能将固着的蛋白从NC膜上洗掉，从而显示较宽或者根本不清晰的检测线，更难以解释检测结果。
其次在免疫层析检测中，标记物和抗体之间的结合采用的是简单的物理吸附方法，抗体非常容易从标记物表面脱落下来，导致标记物不稳定。
发明内容
本发明提供一种采用处理的NC膜及标记物与抗体结合的试纸条的制备方法，以解决现有技术存在的NC膜吸附蛋白量不足、蛋白在NC膜上分布不均一、结合力不强、以及抗体标记效率低的问题，从而提高产品稳定性、灵敏度、准确率，降低了产品批内差。
本发明采取的技术方案是，包括下列步骤：
(a)氧化锌-壳聚糖-标记物制备
1)N-羧乙基壳聚糖的合成：将4.0g壳聚糖加入到含有2.80mL丙烯酸的200mL水中，在50℃下，持续搅拌2天，反应完成后，在反应混合液中加入1mol/L的NaOH溶液，调节溶液的pH值至10-12，使其所有的羧酸全部转化为钠盐，将混合溶液倒入到丙酮中进行重沉淀，然后在水溶液中透析，除去未反应的丙烯酸，透析两天后，冷冻干燥得到N-羧乙基壳聚糖3.6g，产率90％；
2)纳米氧化锌颗粒制备：称取1.3225gZnAc2·2H2O溶解在20mL的蒸馏水中，缓慢滴加9mL 5mol/L的NaOH溶液，溶液先出现白色浑浊，继续滴加则浑浊完全消失；再加入11mL的蒸馏水，搅拌均匀，然后倒入低压反应釜中，将反应釜放入烘箱中，在170℃下加热12个小时，自然冷却至室温后，得到沉淀后，分别用水和乙醇清洗、离心两次，将沉淀放入烘箱内于60℃烘干备用；
3)N-羧乙基壳聚糖与纳米氧化锌混合溶液的制备：将5.00gN-羧乙基壳聚糖加入到300mL去离子水中，在室温下剧烈搅拌0.5h，充分溶解得到水溶性壳聚糖溶液，将上述水溶性壳聚糖溶液和纳米氧化锌混合，将混合液剧烈搅拌3h，使其混合均匀。
4)标记物的制备：包括胶体金、荧光微球和量子点的制备；
5)氧化锌-壳聚糖-标记物制备：以苯二甲醛作为交联剂，在常温下进行交联，交联结束，将所得的氧化锌-壳聚糖-胶体金或荧光微球或量子点洗涤，真空干燥24h；
(b)氧化锌-壳聚糖-标记物交联标记抗体：取1ml氧化锌-壳聚糖-胶体金或荧光微球或量子点悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边滴加抗体，加入抗体后，反应1min后，再到超声波上超声20-40秒，然后再反应1小时，加BSA进行封闭1小时，封闭好后进行离心，速度为10000r/min，15min，将保存液加入到离心后的液体中，使其分散均匀，待用；
(c)将硝酸纤维素膜用聚多巴胺处理液预处理后，喷点GDF-15抗体作为检测线，喷点羊抗鼠IgG抗体作为质控线，制得免疫硝酸纤维素膜；
(d)将预处理的样品垫、步骤(b)制备的氧化锌-壳聚糖-标记物标记抗体的玻璃纤维膜、步骤(c)制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试纸条，最后将检测试纸条装入塑料外壳。
本发明所述步骤(a)氧化锌-壳聚糖-标记物制备中，1)N-羧乙基壳聚糖的合成，在水溶液中透析时，采用的透析膜截取分子量为8000-12000g/mol。
本发明所述步骤(a)氧化锌-壳聚糖-标记物制备中，2)纳米氧化锌颗粒制备，缓慢滴加9mL 5mol/L的NaOH溶液，该NaOH溶液为新配制的溶液。
本发明所述步骤(a)氧化锌-壳聚糖-标记物制备中，3)N-羧乙基壳聚糖与纳米氧化锌混合溶液的制备，所述水溶性壳聚糖溶液和纳米氧化锌的混合比例是，N-羧乙基壳聚糖与氧化锌的质量之比为100/5、100/8或100/10。
本发明所述步骤(a)氧化锌-壳聚糖-标记物制备中，4)标记物的制备包括胶体金的制备：将装有99ml纯化水的圆底烧瓶放入电热套指定位置加热，接通电热套电源，加热10分钟后，待烧瓶中的水即将沸腾之时开启转数控制开关，调至400rpm，纯化水液面形成漩涡，并用注射器缓慢将1ml 1％氯化金溶液沿漩涡边缘加入，待溶液开始沸腾，没有形成大气泡之前，快速加入1％柠檬酸三钠溶液1.4ml，同时观察颜色变化，白色变黑再渐变为紫色，停止加热，保持磁力搅拌，待溶液冷却到室温后，加水称重补足重量。
本发明所述步骤(a)氧化锌-壳聚糖-标记物制备中，4)标记物的制备包括荧光微球的制备：取100ul固含为1％的微球悬浮液，用超纯水稀释10倍，即1000ul，加入到EP管中，取40ul的N-羟基琥珀酰亚胺液(NHS)加入微球悬浮液中混匀，然后接着加入40ul的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐液(EDC)加入微球悬浮液液中混匀，常温下反应0.5小时，将反应后的悬浮液用超声波超声，使管壁上的微球重新悬浮在水溶液中，然后将微球悬浮液离心，离心条件10000r/min、20min，倒掉上清液，加入1ml超纯水，然后用超声波超声分散均匀。
本发明所述步骤(a)氧化锌-壳聚糖-标记物制备中，4)标记物的制备包括量子点的制备：水溶性量子点的制备：取油溶性量子点CdSe/ZnS溶解在正己烷中，制得油溶性量子点溶液，在巯基甘醇单甲醚溶液中加入油溶性量子点溶液，得到水溶性量子点。
本发明步骤(c)所述的聚多巴胺处理液，聚多巴胺浓度为0.1-3％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
多巴胺(dopamine,DA)因其结合儿茶酚官能团和赖氨酸的氨基官能团，也被证明具有超强的黏附性能。DA在碱性溶液中可发生氧化自聚合，在材料表面形成具有超强黏性的聚多巴胺(PDA)层，从而实现在各种材料表面的超强黏附。PDA形成过程简单且不需要有机溶剂，仅需将材料浸入含DA的碱性Tris-Hcl缓冲液或其他碱性溶液中，即可在表面形成PDA层，因此，PDA被广泛应用于材料的表面改性。综上，聚多巴胺可以从电荷作用和疏水作用两方面来提高NC膜蛋白的包被效率、提高吸附效果、蛋白分布更加均一。
甲壳素是地球上储量仅次于纤维素的可再生资源，壳聚糖是甲壳素脱乙酰基衍生物，由2-氨基2-脱氧-β-D-葡萄糖通过β-1，4-糖苷键连接形成的聚合物。由于壳聚糖具有良好的生物相容性、生物可降解性、广谱抗菌性、防腐性、无抗原性，以及可止血和促进伤口愈合等特殊功能，使得壳聚糖成为组织工程支架材料中最有应用前景的生物大分子之一。纳米氧化锌(ZnO)是白色六方晶系结晶或球形粒子，粒径小于100nm，平均粒径50nm，比表面积大于4m2/g，具有极高的化学活性及优异的催化性和光催化活性。
本发明研究探讨了氧化锌-壳聚糖-标记物纳米颗粒对与抗体结合的影响，先制备好氧化锌-壳聚糖-标记物纳米颗粒，使其与标记用的抗体进行结合；这样的结合方式，会使标记物与抗体牢牢吸附在一起，从而抗体或抗原不会从标记物表面脱落，提高标记效率及免疫层析方法学的稳定性、灵敏度和精准度。
本发明研究同时也探讨了聚多巴胺处理过的NC对其吸附蛋白效果的影响，先用制备好的聚多巴胺溶液对NC进行科学处理，处理后可以增加抗体的包被效率、提高吸附效果、蛋白分布更加均一，从而提高了免疫层析方法学的灵敏度、精准度。
综上，为了提高免疫层析技术的灵敏度、稳定性、精准度，我们通过对硝酸纤维素膜用聚多巴胺处理液进行了预处理、将抗体或抗原与制备好氧化锌-壳聚糖-标记物来结合，达到了提高试纸灵敏度、稳定性、精准度的目的。
本发明的有益效果在于：
1、本发明涉及两个技术处理环节其操作科学性强、构思新颖、具有创造性，能够解决目前应用免疫层析技术的产品其灵敏度低、稳定性不强、精准度不高、批内差大的实际问题。
2、本发明设计了氧化锌-壳聚糖-标记物与抗体的结合，并非标记物与抗体或抗原简单的物理结合，从提高了抗体标记效果、增强了标记物与抗体或抗原结合效果，进而提高了灵敏度、稳定性、精准度。
3、本发明对硝酸纤维素膜进行聚多巴胺预处理，对包被硝酸纤维素膜的抗体进行了修饰，增加抗体的包被效率、提高吸附效果、蛋白分布更加均一，从而提高了免疫层析方法学的灵敏度、精准度和稳定性。
具体实施方式
实施例1
1、氧化锌-壳聚糖-标记物的制备
N-羧乙基壳聚糖的合成：将4.0g壳聚糖加入到含有2.80mL丙烯酸的200mL水中，在50℃下，持续搅拌2天，反应完成后，在反应混合液中加入1mol/L的NaOH溶液，调节溶液的pH值至10，使其所有的羧酸全部转化为钠盐，将混合溶液倒入到丙酮中进行重沉淀，然后在水溶液中透析，透析膜截取分子量为8000g/mol，除去未反应的丙烯酸，透析两天后，冷冻干燥得到N-羧乙基壳聚糖3.6g，产率90％；
纳米氧化锌颗粒制备：称取1.3225gZnAc2·2H2O溶解在20mL的蒸馏水中,缓慢滴加9mL新配制的5mol/L的NaOH溶液，溶液先出现白色浑浊，继续滴加则浑浊完全消失，再加入11mL的蒸馏水，搅拌均匀，然后倒入低压反应釜中，将反应釜放入烘箱中，在170℃下加热12个小时，自然冷却至室温后，得到沉淀后，分别用水和乙醇清洗、离心两次，将沉淀放入烘箱内于60℃烘干备用；
N-羧乙基壳聚糖与纳米氧化锌混合溶液的制备：将5.00gN-羧乙基壳聚糖加入到300mL去离子水中，在室温下剧烈搅拌0.5h，充分溶解得到水溶性壳聚糖溶液，将上述水溶性壳聚糖溶液和纳米氧化锌按一定的比例混合，使得N-羧乙基壳聚糖与氧化锌的质量之比为100/5，将混合液剧烈搅拌3h，使其混合均匀；
标记物的制备，以胶体金的制备为例：
将装有99ml纯化水的圆底烧瓶放入电热套指定位置加热，接通电热套电源，同时注意加热时间。加热10分钟后，待烧瓶中的水即将沸腾之时开启转数控制开关，调至400rpm左右，纯化水液面形成漩涡为佳，并用注射器缓慢将1ml 1％氯化金溶液沿漩涡边缘加入，待溶液开始沸腾，没有形成大气泡之前，快速加入1％柠檬酸三钠溶液1.4ml，同时观察颜色变化，白色变黑再渐变为紫色，停止加热，保持磁力搅拌，待溶液冷却到室温后，加水称重补足重量；
氧化锌-壳聚糖-胶体金制备：以苯二甲醛作为交联剂，在常温下进行交联；交联结束，将所得的氧化锌-壳聚糖-胶体金洗涤，真空干燥24h。
2、交联抗体，取1ml活化后的标记物悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边滴加抗体，加入抗体后，大约反应1min后，再到超声波上超声30秒，然后再反应1小时，加BSA进行封闭1小时，封闭好后进行离心，速度为10000r/min，15min，将保存液加入到离心后的液体中，使其分散均匀，待用；
3、固相硝酸纤维素膜
1)聚多巴胺处理液预处理硝酸纤维素膜
配制聚多巴胺处理液：聚多巴胺配成浓度为0.1％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
聚多巴胺处理液预处理硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜放入聚多巴胺处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；
2)将硝酸纤维素膜用聚多巴胺处理液预处理后，喷点GDF-15抗体作为检测线，喷点羊抗鼠IgG抗体作为质控线，制得免疫硝酸纤维素膜；
4、将预处理的样品垫、氧化锌-壳聚糖-胶体金-抗体的玻璃纤维膜、聚多巴胺处理的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
实施例2
1、氧化锌-壳聚糖-标记物的制备
N-羧乙基壳聚糖的合成：将4.0g壳聚糖加入到含有2.80mL丙烯酸的200mL水中，在50℃下，持续搅拌2天，反应完成后，在反应混合液中加入1mol/L的NaOH溶液，调节溶液的pH值至11，使其所有的羧酸全部转化为钠盐，将混合溶液倒入到丙酮中进行重沉淀，然后在水溶液中透析，透析膜截取分子量为10000g/mol，除去未反应的丙烯酸，透析两天后，冷冻干燥得到N-羧乙基壳聚糖3.6g，产率90％；
纳米氧化锌颗粒制备：称取1.3225gZnAc2·2H2O溶解在20mL的蒸馏水中,缓慢滴加9mL新配制的5mol/L的NaOH溶液,溶液先出现白色浑浊,继续滴加则浑浊完全消失，再加入11mL的蒸馏水,搅拌均匀,然后倒入低压反应釜中。将反应釜放入烘箱中，在170℃下加热12个小时。自然冷却至室温后,得到沉淀后,分别用水和乙醇清洗、离心两次。将沉淀放入烘箱内于60℃烘干备用
N-羧乙基壳聚糖与纳米氧化锌混合溶液的制备：将5.00gN-羧乙基壳聚糖加入到300mL去离子水中，在室温下剧烈搅拌0.5h，充分溶解得到水溶性壳聚糖溶液。将上述水溶性壳聚糖溶液和纳米氧化锌按一定的比例混合，使得N-羧乙基壳聚糖与氧化锌的质量之比为100/8，将混合液剧烈搅拌3h，使其混合均匀；
标记物的制备，以荧光微球的制备为例：
取100ul固含为1％的微球悬浮液，用超纯水稀释10倍,即1000ul，加入到EP管中，取40ul的N-羟基琥珀酰亚胺液(NHS)加入微球悬浮液中混匀，然后接着加入40ul的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐液(EDC)加入微球悬浮液液中混匀，常温下反应0.5小时，将反应后的悬浮液用超声波超声，使管壁上的微球重新悬浮在水溶液中，然后将微球悬浮液离心，离心条件10000r/min、20min，倒掉上清液，加入1ml超纯水，然后用超声波超声分散均匀；
氧化锌-壳聚糖-荧光微球制备：以苯二甲醛作为交联剂，在常温下进行交联；交联结束，将所得的氧化锌-壳聚糖-荧光微球洗涤，真空干燥24h。
2、交联抗体，取1ml活化后的标记物悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边滴加抗体。加入抗体后，大约反应1min后，再到超声波上超声20秒，然后再反应1小时，加BSA进行封闭1小时，封闭好后进行离心，速度为10000r/min，15min，将保存液加入到离心后的液体中，使其分散均匀，待用；
3、固相硝酸纤维素膜
1)聚多巴胺处理液预处理硝酸纤维素膜
配制聚多巴胺处理液：聚多巴胺配成浓度为1％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
聚多巴胺处理液预处理硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜放入聚多巴胺处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；
2)将硝酸纤维素膜用聚多巴胺处理液预处理后，喷点GDF-15抗体作为检测线，喷点羊抗鼠IgG抗体作为质控线，制得免疫硝酸纤维素膜。
4、将预处理的样品垫、氧化锌-壳聚糖-荧光微球-抗体的玻璃纤维膜、聚多巴胺处理的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
实施例3
1、氧化锌-壳聚糖-标记物的制备
N-羧乙基壳聚糖的合成：将4.0g壳聚糖加入到含有2.80mL丙烯酸的200mL水中，在50℃下，持续搅拌2天，反应完成后，在反应混合液中加入1mol/L的NaOH溶液，调节溶液的pH值至12，使其所有的羧酸全部转化为钠盐。将混合溶液倒入到丙酮中进行重沉淀，然后在水溶液中透析，透析膜截取分子量为12000g/mol，除去未反应的丙烯酸。透析两天后，冷冻干燥得到N-羧乙基壳聚糖3.6g，产率90％；
纳米氧化锌颗粒制备：称取1.3225gZnAc2·2H2O溶解在20mL的蒸馏水中,缓慢滴加9mL新配制的5mol/L的NaOH溶液，溶液先出现白色浑浊，继续滴加则浑浊完全消失，再加入11mL的蒸馏水，搅拌均匀，然后倒入低压反应釜中，将反应釜放入烘箱中，在170℃下加热12个小时，自然冷却至室温后,得到沉淀后,分别用水和乙醇清洗、离心两次，将沉淀放入烘箱内于60℃烘干备用；
N-羧乙基壳聚糖与纳米氧化锌混合溶液的制备：将5.00gN-羧乙基壳聚糖加入到300mL去离子水中，在室温下剧烈搅拌0.5h，充分溶解得到水溶性壳聚糖溶液，将上述水溶性壳聚糖溶液和纳米氧化锌按一定的比例混合，使得N-羧乙基壳聚糖与氧化锌的质量之比为100/10，将混合液剧烈搅拌3h，使其混合均匀；
标记物的制备，以量子点的制备为例：
取油溶性量子点CdSe/ZnS溶解在正己烷中，制得油溶性量子点溶液，在巯基甘醇单甲醚溶液中加入油溶性量子点溶液，得到水溶性量子点；
氧化锌-壳聚糖-量子点制备：以苯二甲醛作为交联剂，在常温下进行交联；交联结束，将所得的氧化锌-壳聚糖-量子点洗涤，真空干燥24h；
2、交联抗体，取1ml活化后的标记物悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边滴加抗体，加入抗体后，大约反应1min后，再到超声波上超声40秒，然后再反应1小时，加BSA进行封闭1小时，封闭好后进行离心，速度为10000r/min，15min，将保存液加入到离心后的液体中，使其分散均匀，待用；
3、固相硝酸纤维素膜
1)聚多巴胺处理液预处理硝酸纤维素膜
配制聚多巴胺处理液：聚多巴胺配成浓度为3％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
聚多巴胺处理液预处理硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜放入聚多巴胺处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；
2)将硝酸纤维素膜用聚多巴胺处理液预处理后，喷点GDF-15抗体作为检测线，喷点羊抗鼠IgG抗体作为质控线，制得免疫硝酸纤维素膜；
4、将预处理的样品垫、氧化锌-壳聚糖-量子点-抗体的玻璃纤维膜、聚多巴胺处理的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
下边通过实验例来进一步说明本发明效果。
实验例1
1、聚多巴胺处理液对硝酸纤维素膜抗体吸附能力的比较(胶体金法检测试纸)
1.1材料与方法
1.1.1材料：硝酸纤维素膜，孔径4.5um，购自美国通用电气公司，聚多巴胺购自Sigma公司
1.1.2硝酸纤维素膜处理方法
1.1.2.1配制聚多巴胺处理液
配制聚多巴胺处理液：聚多巴胺由蒸馏水配置成浓度为1％，经0.22μm滤膜过滤，备用；
1.1.2.2硝酸纤维素膜处理方法
将硝酸纤维素膜放入聚多巴胺处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；
1.1.3实验方法
以制备生长分化因子-15(GDF-15)胶体金法检测试纸产品为例。
分别将未处理和已处理过的硝酸纤维素膜按照上述实施例工艺流程制备GDF-15胶体金检测试纸，测试流程参照试纸说明书，比较硝酸纤维素膜未处理和处理后胶体金指标差异。
1.2结果:
1.2.1抗体吸附强度比较
取处理组和未处理组试纸，分别加入待检样品，通过免疫定量分析仪读取胶体金显色情况判断处理后膜对抗体吸附能力的影响，结果见表1。结果显示：处理后的硝酸纤维素膜在溶液浸润性方面要明显优于未处理膜，尤其在浓度较低时，提高了反应的灵敏度。
表1硝酸纤维素膜抗体吸附能力比较
Figure BDA0003600071940000091
1.2.2硝酸纤维素膜稳定性比较
取聚多巴胺处理组和未处理组试纸，通过37℃加速实验观察实验数据来判断处理后硝酸纤维素膜上吸附蛋白的稳定性，免疫定量分析仪读取结果见表2。表2结果与表1结果比较发现，处理后硝酸纤维素膜颜色变化与10天前基本一致，稳定性好。
表2硝酸纤维素膜加速稳定性比较(37℃放置10天)
Figure BDA0003600071940000101
实验例2
1、聚多巴胺处理液对硝酸纤维素膜抗体吸附能力的比较(荧光微球法检测试纸)
1.1材料与方法
1.1.1材料：硝酸纤维素膜，孔径4.5um，购自美国通用电气公司，聚多巴胺购自Sigma公司
1.1.2硝酸纤维素膜处理方法
1.1.2.1配制聚多巴胺处理液
配制聚多巴胺处理液：聚多巴胺由蒸馏水配置成浓度为1％，，经0.22μm滤膜过滤，备用。
1.1.2.2硝酸纤维素膜处理方法
将硝酸纤维素膜放入聚多巴胺处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥。
1.1.3实验方法
以制备生长分化因子-15(GDF-15)荧光微球法检测试纸产品为例。
分别将未处理和已处理过的硝酸纤维素膜按照上述实施例工艺流程制备GDF-15荧光微球检测试纸，测试流程参照试纸说明书，比较硝酸纤维素膜未处理和处理后指标差异。
2、结果
2.1抗体吸附强度比较
取处理组和未处理组试纸，分别加入待检样品，通过免疫定量分析仪读取荧光显色情况判断处理后膜对抗体吸附能力的影响，结果见表3。结果显示，处理后的硝酸纤维素膜在溶液浸润性方面要明显优于未处理膜，尤其在浓度较低时，提高了反应的灵敏度。
表3硝酸纤维素膜抗体吸附能力比较
Figure BDA0003600071940000111
2.2硝酸纤维素膜稳定性比较
取聚多巴胺处理组和未处理组试纸，通过37℃加速实验观察实验数据来判断处理后硝酸纤维素膜上吸附蛋白的稳定性，免疫定量分析仪读取结果见表4。表4结果与表3结果比较发现，处理后硝酸纤维素膜显色反应与10天前基本一致，稳定性好。
表4硝酸纤维素膜加速稳定性比较(37℃放置10天)
Figure BDA0003600071940000112
实验例3
1、聚多巴胺处理液对硝酸纤维素膜抗体吸附能力的比较(量子点法检测试纸)
1.1材料与方法
1.1.1材料：硝酸纤维素膜，孔径4.5um，购自美国通用电气公司，聚多巴胺购自Sigma公司
1.1.2硝酸纤维素膜处理方法
1.1.2.1配制聚多巴胺处理液
配制聚多巴胺处理液：聚多巴胺由蒸馏水配置成浓度为1％，，经0.22μm滤膜过滤，备用。
1.1.2.2硝酸纤维素膜处理方法
将硝酸纤维素膜放入聚多巴胺处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥。
1.1.3实验方法
以制备生长分化因子-15(GDF-15)量子点法检测试纸产品为例。
分别将未处理和已处理过的硝酸纤维素膜按照上述实施例工艺流程制备GDF-15量子点检测试纸，测试流程参照试纸说明书，比较硝酸纤维素膜未处理和处理后指标差异。
2、结果
2.1抗体吸附强度比较
取处理组和未处理组试纸，分别加入待检样品，通过免疫定量分析仪读取量子点显色情况判断处理后膜对抗体吸附能力的影响，结果见表5。结果显示，处理后的硝酸纤维素膜在溶液浸润性方面要明显优于未处理膜，尤其在浓度较低时，提高了反应的灵敏度。
表5硝酸纤维素膜抗体吸附能力比较
Figure BDA0003600071940000121
2.2硝酸纤维素膜稳定性比较
取聚多巴胺处理组和未处理组试纸，通过37℃加速实验观察实验数据来判断处理后硝酸纤维素膜上吸附蛋白的稳定性，免疫定量分析仪读取结果见表6。表6结果与表5结果比较发现，处理后硝酸纤维素膜颜色变化与10天前基本一致，稳定性好。
表6硝酸纤维素膜加速稳定性比较(37℃放置10天)
Figure BDA0003600071940000122
实验例4
1、氧化锌-壳聚糖-胶体金-GDF15标记效果研究
1.1材料：硝酸纤维素膜，孔径4.5um，购自美国通用电气公司
1.2制备氧化锌-壳聚糖-胶体金-GDF15
N-羧乙基壳聚糖的合成：将4.0g壳聚糖加入到含有2.80mL丙烯酸的200mL水中，在50℃下，持续搅拌2天。反应完成后，在反应混合液中加入1mol/L的NaOH溶液，调节溶液的pH值至10-12，使其所有的羧酸全部转化为钠盐。将混合溶液倒入到丙酮中进行重沉淀，然后在水溶液中透析(透析膜截取分子量为8000-12000g/mol)，除去未反应的丙烯酸。透析两天后，冷冻干燥得到N-羧乙基壳聚糖3.6g，产率90％。
纳米氧化锌颗粒制备：称取1.3225gZnAc2·2H2O溶解在20mL的蒸馏水中,缓慢滴加9mL新配制的5mol/L的NaOH溶液,溶液先出现白色浑浊,继续滴加则浑浊完全消失。再加入11mL的蒸馏水,搅拌均匀,然后倒入低压反应釜中。将反应釜放入烘箱中,在170℃下加热12个小时。自然冷却至室温后,得到沉淀后,分别用水和乙醇清洗、离心两次。将沉淀放入烘箱内于60℃烘干备用
N-羧乙基壳聚糖与纳米氧化锌混合溶液的制备：将5.00gN-羧乙基壳聚糖加入到300mL去离子水中，在室温下剧烈搅拌0.5h，充分溶解得到水溶性壳聚糖溶液。将上述水溶性壳聚糖溶液和纳米氧化锌按一定的比例混合，使得N-羧乙基壳聚糖与氧化锌的质量之比为100/5，100/8，100/10。将混合液剧烈搅拌3h，使其混合均匀。
胶体金制备：将装有99ml纯化水的圆底烧瓶放入电热套指定位置加热，接通电热套电源，同时注意加热时间。加热10分钟后，待烧瓶中的水即将沸腾之时开启转数控制开关，调至400rpm左右，纯化水液面形成漩涡为佳，并用注射器缓慢将1ml 1％氯化金溶液沿漩涡边缘加入，待溶液开始沸腾，没有形成大气泡之前，快速加入1％柠檬酸三钠溶液1.4ml，同时观察颜色变化(白色变黑再渐变为紫色)，停止加热，保持磁力搅拌，待溶液冷却到室温后，加水称重补足重量。
氧化锌-壳聚糖-胶体金制备：以苯二甲醛作为交联剂，在常温下进行交联；交联结束，将所得的氧化锌-壳聚糖-胶体金洗涤，真空干燥24h。
交联抗体：取1ml活化后的标记物悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边滴加GDF15抗体。加入抗体后，大约反应1min后，再到超声波上超声30秒左右，然后再反应1小时。加BSA进行封闭1小时。封闭好后进行离心，速度为10000r/min,15min。将保存液加入到离心后的液体中，使其分散均匀，待用。
2、实验方法
分别将氧化锌-壳聚糖-胶体金-GDF15与未修饰的胶体金-GDF15按照上述实施例工艺流程制备GDF15检测试纸，测试流程参照试纸说明书，比较氧化锌-壳聚糖处理和未处理对抗体标记能力和稳定性指标差异。
3、结果
3.1抗体标记比较
取氧化锌-壳聚糖处理组和未处理组试纸，分别加入待检样品，通过免疫定量分析仪读取显色情况判断处理后膜对抗体标记能力，结果见表7。结果显示，氧化锌-壳聚糖修饰组尤其在浓度较低时，提高了反应的灵敏度，表明蛋白吸附能力明显增强，提高了反应灵敏度。
表7氧化锌-壳聚糖修饰对抗体吸附能力比较
Figure BDA0003600071940000141
3.2稳定性比较
取氧化锌-壳聚糖处理组和未处理组试纸，通过37℃加速实验观察显色情况来判断氧化锌-壳聚糖修饰后吸附抗体的稳定性，免疫定量分析仪读取结果见表8。表8结果与表7结果比较发现，处理后变化与10天前基本一致，稳定性好。
表8加速稳定性比较(37℃放置10天)
Figure BDA0003600071940000142
实验例5
1、氧化锌-壳聚糖-荧光微球-GDF15标记效果研究
1.1材料：硝酸纤维素膜，孔径4.5um，购自美国通用电气公司
1.2制备氧化锌-壳聚糖-荧光微球-GDF15
N-羧乙基壳聚糖的合成：将4.0g壳聚糖加入到含有2.80mL丙烯酸的200mL水中，在50℃下，持续搅拌2天。反应完成后，在反应混合液中加入1mol/L的NaOH溶液，调节溶液的pH值至10-12，使其所有的羧酸全部转化为钠盐。将混合溶液倒入到丙酮中进行重沉淀，然后在水溶液中透析(透析膜截取分子量为8000-12000g/mol)，除去未反应的丙烯酸。透析两天后，冷冻干燥得到N-羧乙基壳聚糖3.6g，产率90％。
纳米氧化锌颗粒制备：称取1.3225gZnAc2·2H2O溶解在20mL的蒸馏水中,缓慢滴加9mL新配制的5mol/L的NaOH溶液,溶液先出现白色浑浊,继续滴加则浑浊完全消失。再加入11mL的蒸馏水,搅拌均匀,然后倒入低压反应釜中。将反应釜放入烘箱中,在170℃下加热12个小时。自然冷却至室温后,得到沉淀后,分别用水和乙醇清洗、离心两次。将沉淀放入烘箱内于60℃烘干备用
N-羧乙基壳聚糖与纳米氧化锌混合溶液的制备：将5.00gN-羧乙基壳聚糖加入到300mL去离子水中，在室温下剧烈搅拌0.5h，充分溶解得到水溶性壳聚糖溶液。将上述水溶性壳聚糖溶液和纳米氧化锌按一定的比例混合，使得N-羧乙基壳聚糖与氧化锌的质量之比为100/5，100/8，100/10。将混合液剧烈搅拌3h，使其混合均匀。
荧光微球制备：取100ul固含为1％的微球悬浮液，用超纯水稀释10倍,即1000ul，加入到EP管中。取40ul的N-羟基琥珀酰亚胺液(NHS)加入微球悬浮液中混匀，然后接着加入40ul的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐液(EDC)加入微球悬浮液液中混匀，常温下反应0.5小时。将反应后的悬浮液用超声波超声，使管壁上的微球重新悬浮在水溶液中，然后将微球悬浮液离心，离心条件10000r/min、20min。倒掉上清液，加入1ml超纯水，然后用超声波超声分散均匀。
氧化锌-壳聚糖-荧光微球制备：以苯二甲醛作为交联剂，在常温下进行交联；交联结束，将所得的氧化锌-壳聚糖-荧光微球洗涤，真空干燥24h。
交联抗体：取1ml活化后的标记物悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边滴加GDF15抗体。加入抗体后，大约反应1min后，再到超声波上超声30秒左右，然后再反应1小时。加BSA进行封闭1小时。封闭好后进行离心，速度为10000r/min,15min。将保存液加入到离心后的液体中，使其分散均匀，待用。
2、实验方法
分别将氧化锌-壳聚糖-荧光微球-GDF15与未修饰的荧光微球-GDF15按照上述实施例工艺流程制备GDF15检测试纸，测试流程参照试纸说明书，比较氧化锌-壳聚糖处理和未处理对抗体标记能力和稳定性指标差异。
3、结果
3.1抗体标记比较
取氧化锌-壳聚糖处理组和未处理组试纸，分别加入待检样品，通过免疫定量分析仪读取显色情况判断处理后膜对抗体标记能力，结果见表9。结果显示，氧化锌-壳聚糖修饰组尤其在浓度较低时，提高了反应的灵敏度，表明蛋白吸附能力明显增强，提高了反应灵敏度。
表9氧化锌-壳聚糖修饰对抗体吸附能力比较
Figure BDA0003600071940000151
3.2稳定性比较
取氧化锌-壳聚糖处理组和未处理组试纸，通过37℃加速实验观察显色情况来判断氧化锌-壳聚糖修饰后吸附抗体的稳定性，免疫定量分析仪读取结果见表10。表10结果与表9结果比较发现，处理后变化与10天前基本一致，稳定性好。
表10加速稳定性比较(37℃放置10天)
Figure BDA0003600071940000161
实验例6
1、氧化锌-壳聚糖-量子点-GDF15标记效果研究
1.1材料：硝酸纤维素膜，孔径4.5um，购自美国通用电气公司
1.2制备氧化锌-壳聚糖-量子点-GDF15
N-羧乙基壳聚糖的合成：将4.0g壳聚糖加入到含有2.80mL丙烯酸的200mL水中，在50℃下，持续搅拌2天。反应完成后，在反应混合液中加入1mol/L的NaOH溶液，调节溶液的pH值至10-12，使其所有的羧酸全部转化为钠盐。将混合溶液倒入到丙酮中进行重沉淀，然后在水溶液中透析(透析膜截取分子量为8000-12000g/mol)，除去未反应的丙烯酸。透析两天后，冷冻干燥得到N-羧乙基壳聚糖3.6g，产率90％。
纳米氧化锌颗粒制备：称取1.3225gZnAc2·2H2O溶解在20mL的蒸馏水中,缓慢滴加9mL新配制的5mol/L的NaOH溶液,溶液先出现白色浑浊,继续滴加则浑浊完全消失。再加入11mL的蒸馏水,搅拌均匀,然后倒入低压反应釜中。将反应釜放入烘箱中,在170℃下加热12个小时。自然冷却至室温后,得到沉淀后,分别用水和乙醇清洗、离心两次。将沉淀放入烘箱内于60℃烘干备用
N-羧乙基壳聚糖与纳米氧化锌混合溶液的制备：将5.00gN-羧乙基壳聚糖加入到300mL去离子水中，在室温下剧烈搅拌0.5h，充分溶解得到水溶性壳聚糖溶液。将上述水溶性壳聚糖溶液和纳米氧化锌按一定的比例混合，使得N-羧乙基壳聚糖与氧化锌的质量之比为100/5，100/8，100/10。将混合液剧烈搅拌3h，使其混合均匀。
量子点的制备：取油溶性量子点CdSe/ZnS溶解在正己烷中，制得油溶性量子点溶液，在巯基甘醇单甲醚溶液中加入油溶性量子点溶液，得到水溶性量子点。
氧化锌-壳聚糖-量子点制备：以苯二甲醛作为交联剂，在常温下进行交联；交联结束，将所得的氧化锌-壳聚糖-量子点洗涤，真空干燥24h。
交联抗体：取1ml活化后的标记物悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边滴加GDF15抗体。加入抗体后，大约反应1min后，再到超声波上超声30秒左右，然后再反应1小时。加BSA进行封闭1小时。封闭好后进行离心，速度为10000r/min,15min。将保存液加入到离心后的液体中，使其分散均匀，待用。
2、实验方法
分别将氧化锌-壳聚糖-量子点-GDF15与未修饰的量子点-GDF15按照上述实施例工艺流程制备GDF15检测试纸，测试流程参照试纸说明书，比较氧化锌-壳聚糖处理和未处理对抗体标记能力和稳定性指标差异。
3、结果
3.1抗体标记比较
取氧化锌-壳聚糖处理组和未处理组试纸，分别加入待检样品，通过免疫定量分析仪读取显色情况判断处理后膜对抗体标记能力，结果见表11。结果显示，氧化锌-壳聚糖修饰组尤其在浓度较低时，提高了反应的灵敏度，表明蛋白吸附能力明显增强，提高了反应灵敏度。
表11氧化锌-壳聚糖修饰对抗体吸附能力比较
Figure BDA0003600071940000171
3.2稳定性比较
取氧化锌-壳聚糖处理组和未处理组试纸，通过37℃加速实验观察显色情况来判断氧化锌-壳聚糖修饰后吸附抗体的稳定性，免疫定量分析仪读取结果见表12。表12结果与表11结果比较发现，处理后变化与10天前基本一致，稳定性好。
表12加速稳定性比较(37℃放置10天)
Figure BDA0003600071940000172
以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡对本发明所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种采用处理的NC膜及标记物与抗体结合的试纸条的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：
(a)氧化锌-壳聚糖-标记物制备
1)N-羧乙基壳聚糖的合成：将4.0g壳聚糖加入到含有2.80mL丙烯酸的200mL水中，在50℃下，持续搅拌2天，反应完成后，在反应混合液中加入1mol/L的NaOH溶液，调节溶液的pH值至10-12，使其所有的羧酸全部转化为钠盐，将混合溶液倒入到丙酮中进行重沉淀，然后在水溶液中透析，除去未反应的丙烯酸，透析两天后，冷冻干燥得到N-羧乙基壳聚糖3.6g，产率90％；
2)纳米氧化锌颗粒制备：称取1.3225gZnAc2·2H2O溶解在20mL的蒸馏水中，缓慢滴加9mL 5mol/L的NaOH溶液，溶液先出现白色浑浊，继续滴加则浑浊完全消失；再加入11mL的蒸馏水，搅拌均匀，然后倒入低压反应釜中，将反应釜放入烘箱中，在170℃下加热12个小时，自然冷却至室温后，得到沉淀后，分别用水和乙醇清洗、离心两次，将沉淀放入烘箱内于60℃烘干备用；
3)N-羧乙基壳聚糖与纳米氧化锌混合溶液的制备：将5.00gN-羧乙基壳聚糖加入到300mL去离子水中，在室温下剧烈搅拌0.5h，充分溶解得到水溶性壳聚糖溶液，将上述水溶性壳聚糖溶液和纳米氧化锌混合，将混合液剧烈搅拌3h，使其混合均匀。
4)标记物的制备：包括胶体金、荧光微球和量子点的制备；
5)氧化锌-壳聚糖-标记物制备：以苯二甲醛作为交联剂，在常温下进行交联，交联结束，将所得的氧化锌-壳聚糖-胶体金或荧光微球或量子点洗涤，真空干燥24h；
(b)氧化锌-壳聚糖-标记物交联标记抗体：取1ml氧化锌-壳聚糖-胶体金或荧光微球或量子点悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边滴加抗体，加入抗体后，反应1min后，再到超声波上超声20-40秒，然后再反应1小时，加BSA进行封闭1小时，封闭好后进行离心，速度为10000r/min，15min，将保存液加入到离心后的液体中，使其分散均匀，待用；
(c)将硝酸纤维素膜用聚多巴胺处理液预处理后，喷点GDF-15抗体作为检测线，喷点羊抗鼠IgG抗体作为质控线，制得免疫硝酸纤维素膜；
(d)将预处理的样品垫、步骤(b)制备的氧化锌-壳聚糖-标记物标记抗体的玻璃纤维膜、步骤(c)制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试纸条，最后将检测试纸条装入塑料外壳。
2.根据权利要求1所述的一种采用处理的NC膜及标记物与抗体结合的试纸条的制备方法，其特征在于：所述步骤(a)氧化锌-壳聚糖-标记物制备中，1)N-羧乙基壳聚糖的合成，在水溶液中透析时，采用的透析膜截取分子量为8000-12000g/mol。
3.根据权利要求1所述的一种采用处理的NC膜及标记物与抗体结合的试纸条的制备方法，其特征在于：所述步骤(a)氧化锌-壳聚糖-标记物制备中，2)纳米氧化锌颗粒制备，缓慢滴加9mL 5mol/L的NaOH溶液，该NaOH溶液为新配制的溶液。
4.根据权利要求1所述的一种采用处理的NC膜及标记物与抗体结合的试纸条的制备方法，其特征在于：所述步骤(a)氧化锌-壳聚糖-标记物制备中，3)N-羧乙基壳聚糖与纳米氧化锌混合溶液的制备，所述水溶性壳聚糖溶液和纳米氧化锌的混合比例是，N-羧乙基壳聚糖与氧化锌的质量之比为100/5、100/8或100/10。
5.根据权利要求1所述的一种采用处理的NC膜及标记物与抗体结合的试纸条的制备方法，其特征在于：所述步骤(a)氧化锌-壳聚糖-标记物制备中，4)标记物的制备包括胶体金的制备：将装有99ml纯化水的圆底烧瓶放入电热套指定位置加热，接通电热套电源，加热10分钟后，待烧瓶中的水即将沸腾之时开启转数控制开关，调至400rpm，纯化水液面形成漩涡，并用注射器缓慢将1ml 1％氯化金溶液沿漩涡边缘加入，待溶液开始沸腾，没有形成大气泡之前，快速加入1％柠檬酸三钠溶液1.4ml，同时观察颜色变化，白色变黑再渐变为紫色，停止加热，保持磁力搅拌，待溶液冷却到室温后，加水称重补足重量。
6.根据权利要求1所述的一种采用处理的NC膜及标记物与抗体结合的试纸条的制备方法，其特征在于：所述步骤(a)氧化锌-壳聚糖-标记物制备中，4)标记物的制备包括荧光微球的制备：取100ul固含为1％的微球悬浮液，用超纯水稀释10倍，即1000ul，加入到EP管中，取40ul的N-羟基琥珀酰亚胺液(NHS)加入微球悬浮液中混匀，然后接着加入40ul的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐液(EDC)加入微球悬浮液液中混匀，常温下反应0.5小时，将反应后的悬浮液用超声波超声，使管壁上的微球重新悬浮在水溶液中，然后将微球悬浮液离心，离心条件10000r/min、20min，倒掉上清液，加入1ml超纯水，然后用超声波超声分散均匀。
7.根据权利要求1所述的一种采用处理的NC膜及标记物与抗体结合的试纸条的制备方法，其特征在于：所述步骤(a)氧化锌-壳聚糖-标记物制备中，4)标记物的制备包括量子点的制备：水溶性量子点的制备：取油溶性量子点CdSe/ZnS溶解在正己烷中，制得油溶性量子点溶液，在巯基甘醇单甲醚溶液中加入油溶性量子点溶液，得到水溶性量子点。
8.根据权利要求1所述的一种采用处理的NC膜及标记物与抗体结合的试纸条的制备方法，其特征在于：步骤(c)所述的聚多巴胺处理液，聚多巴胺浓度为0.1-3％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
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