CN107314997A - 生物蛋白印迹水凝胶表面增强拉曼散射基底的制备方法 - Google Patents

生物蛋白印迹水凝胶表面增强拉曼散射基底的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了生物蛋白印迹水凝胶表面增强拉曼散射基底制备方法，该活性基底是由贵金属Ag和印迹水凝胶构建的核‑壳分层微纳结构。本发明以Ag球为衬底，通过氨基硅烷试剂对Ag球表面改性，运用表面印迹法在Ag球表面包覆不同厚度的水凝胶，制备核壳式活性SERS基底。本发明制备方法优点在于制备方法简单、绿色环保、常温常压、可应用于生物蛋白检测。该方法获得的基底稳定性高，印迹薄膜可控，具有高灵敏的SERS活性。

Description

生物蛋白印迹水凝胶表面增强拉曼散射基底的制备方法
技术领域
本发明属于蛋白质检测分析及表面增强拉曼光谱领域，具体涉及通过制备蛋白质印迹水凝胶表面增强拉曼(SERS)基底及制备方法，该活性基底具有生物相容性。
背景技术
蛋白质是人体中重要的生物大分子，是生命活动中最基本的物质之一，对于维持生命是十分重要和必不可少的，它是生命现象的物质基础。传统的蛋白质检测的技术存在使用的仪器设备价格昂贵，而且在实际操作过程中还需要对样品进行复杂的预处理和前处理，不能快速灵敏进行鉴定。因此，研究普遍适用性好、操作简便、灵敏度高的蛋白质检测技术的任务己日益迫切。
拉曼（Raman）技术是一种无损和快速的光谱分析技术，拉曼光谱具有指纹特征，可以实现对物质结构、成分、浓度等的检测。然而，拉曼光谱存在信号弱、灵敏度低和易受荧光干扰等缺点，使得拉曼光谱的应用研究受到限制。表面增强拉曼散射（Surface-enhancedRaman scattering, SERS）效应是一种特殊的拉曼增强效应，它是以拉曼光谱为原理，通过分子在纳米尺度金属粒子表面的吸附效应，最终获得极大增强的拉曼信号。
分子印迹技术是指制备对某一特定的目标分子具有特异选择性聚合物的过程，制备的聚合物对目标分子具有特异性吸附的能力。SERS技术与分子印迹技术相结合制备的印迹聚合物SERS基底对染料分子具有很好的特异性识别性能。本专利在印迹聚合物SERS基底的基础上，克服高温聚合反应条件，将蛋白质印迹水凝胶与SERS技术相结合，为生物蛋白提供一种快速、灵敏、高效的蛋白检测方法。
发明内容
本发明提供了制备方法简单、制备过程绿色环保的生物蛋白印迹水凝胶表面增强拉曼散射基底的制备方法，制备的SERS基底可以高灵敏、实时、快速、在线检测生物蛋白。
本发明的技术方案如下：
生物蛋白印迹水凝胶表面增强拉曼散射基底制备方法，其特征在于制备生物蛋白印迹水凝胶表面增强拉曼散射基底的制备按照以下方法进行：以Ag球为衬底，在Ag衬底表面采用硅烷试剂改性，采用表面印迹方法在改性的Ag球上均匀包覆印迹水凝胶薄膜，制备印迹水凝胶表面增强拉曼散射基底，然后以牛血清蛋白为检测物，进行拉曼光谱检测。
所述的Ag球是将AgNO3 水溶液加入超纯水中，再加入聚乙烯吡咯烷酮溶液，室温下进行搅拌，取抗坏血酸溶液快速加入上述混合溶液中，颜色由无色迅速变为银灰色，待颜色不再加深，15min后停止反应，即可形成Ag球，用水和乙醇交替洗除Ag球表面的聚乙烯吡咯烷酮溶液，通过离心获得Ag球纳米粒子，40 ℃下真空干燥 24 h，该Ag球的尺寸为500nm~2μm。
所述的硝酸银水溶液的质量浓度为0.5~4mg/ml的硝酸银水溶液；抗坏血酸溶液的质量浓度为0.01~0.5g/ml；聚乙烯吡咯烷酮溶液的质量浓度为1 mol/L。
所述在Ag球表面进行氨基硅烷试剂改性，是在常温常压下，Ag球置于水与乙醇以体积比为1/2~1/5的混合溶液中超声分散，滴入3-氨基丙基三乙氧基硅烷或γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷对Ag球表面进行改性。
所述的水与乙醇的混合液，水与乙醇的体积比例为1/2~1/5。
所述的用表面印迹方法在Ag球上均匀包覆印迹水凝胶薄膜，在常温常压下，改性的Ag球分散在超纯水为溶液中，以蛋白质为模板分子制备水凝胶。
所述的用表面印迹方法在Ag球上均匀包覆印迹水凝胶薄膜，Ag球与蛋白质的质量比例为1/5~1。
所述的用表面印迹方法在Ag球上均匀包覆印迹水凝胶薄膜，制备印迹水凝胶的反应时间为0.5~12h。
所述的在Ag球上均匀包覆印迹水凝胶薄膜，其特征在于：随着反应时间的延长，Ag球上包覆的印迹水凝胶薄膜厚度增加。
所述的表面印迹方法在Ag球上均匀包覆印迹水凝胶薄膜，所述的Ag球上包覆水凝胶包括以下步骤：（1）将蛋白质分散在磷酸缓冲溶液中，得到浓度为1mg/mL~4mg/mL的蛋白质溶液，再加入功能单体搅拌1小时，使功能单体与模板分子进行预聚合。（2）在步骤（1）制备的溶液中加入Ag球，超声分散均匀，加入交联剂与引发剂进行聚合，在Ag球表面聚合印迹水凝胶薄膜，再通过洗液洗除蛋白质分子。
所述的生物蛋白印迹水凝胶表面增强拉曼散射基底制备方法，对溶液中蛋白质检测的方法包括以下步骤：将印迹水凝胶包覆的Ag球分散在蛋白质溶液中，室温震荡2个小时后，将SERS基底取出置于玻璃片上，待溶液干燥后，进行拉曼光谱检测。
本发明提供了一种可以快速、实时、高灵敏在线生物蛋白的表面增强拉曼散射SERS基底的制备方法，SERS基底的最低检测限可以达到10-8 mol/L。本发明是在常温常压下，采用绿色合成的方法制备了生物蛋白印迹水凝胶SERS基底，通过印迹孔穴与目标蛋白分子在空间和位点的匹配作用，提高了对生物蛋白的捕捉。制备的超薄的SERS核壳结构大大提高了SERS基底的灵敏度，采用印迹水凝胶做为壳，使得核壳SERS基底检测技术应用于生物蛋白，拓宽了蛋白检测技术领域。
附图说明
图1为实施例1银粒子扫描电子显微镜图。
图2为实施例2银粒子的扫描电子显微镜图。
图3为实施例3牛血清蛋白水凝胶印迹SERS基底的扫描电镜电子显微镜图片。
图4为实施例4血红蛋白水凝胶印迹SERS基底的扫描电子显微镜图片。
图5为实施例5制备的SERS基底检测牛血清蛋白的拉曼光谱。
具体实施方式
实施例1
生物蛋白印迹水凝胶表面增强拉曼散射基底制备方法，包括以下步骤：
A、制备Ag球衬底，包括以下步骤：在室温的条件下，配置200 ml浓度为4mg/ml的硝酸银水溶液，配置0.5g/ml的抗坏血酸溶液，通过化学沉淀法制备Ag球，该Ag球由小粒径银纳米粒子聚集组成，Ag粒子形貌呈现球形，平均粒径在500nm左右，分散性较好，表面光滑整洁，见附图1。
所述的Ag球为衬底是在室温的条件下，配置浓度为4.0mg/ml的硝酸银水溶液，配置0.5g/ml的抗坏血酸溶液，根据以下步骤制备Ag球：首先取 0.2 mL的AgNO3水溶液加入装有10 mL超纯水的烧杯中，再加入2 mL浓度为1 mol/L的聚乙烯吡咯烷酮溶液，室温下进行磁力搅拌，取0.2 mL的抗坏血酸溶液快速加入上述混合溶液中，颜色由无色迅速变为银灰色，过几分钟后颜色不再加深，15 min后停止反应，用水和乙醇交替洗除Ag球表面的 PVP表面活性剂，通过离心获得Ag球纳米粒子，40 ℃下真空干燥24 h，该Ag球的尺寸为500nm。
B、Ag球表面氨基改性，包括以下步骤：所述的条件在常温常压下，Ag球置于水与乙醇的混合溶液（体积比为1/4）中超声分散，滴入1mL的3-氨基丙基三乙氧基硅烷对Ag球表面进行改性。
C、采用表面印迹方法在Ag球上均匀包覆印迹水凝胶薄膜，包括以下步骤：（1）将牛血清蛋白质80mg分散在磷酸缓冲溶液中，得到浓度为4mg/mL的牛血清蛋白质溶液，再加入100mg功能单体（N,N'-亚甲基双丙烯酰胺与丙烯酸）搅拌1小时，使功能单体与模板分子进行预聚合。（2）在步骤（1）制备的溶液中加入80mg的Ag球，使Ag球与牛血清蛋白质的质量比例为1：1，溶液超声分散均匀，加入5 mL的交联剂（四甲基乙二胺）与20mg的引发剂进行聚合，以牛血清蛋白质为模板分子制备水凝胶，反应时间为0.5~12h，在Ag球表面聚合印迹水凝胶薄膜，再通过洗液洗除牛血清蛋白质分子，得到的产物真空干燥24小时。
D、对溶液中牛血清蛋白质检测的方法包括以下步骤：将印迹水凝胶包覆的Ag球分散在蛋白质溶液中，室温震荡2个小时后，将SERS基底取出置于玻璃片上，待溶液干燥后，进行拉曼光谱检测。
本实施提供了一种可以快速、实时、高灵敏在线生物蛋白的表面增强拉曼散射SERS基底的制备方法，SERS基底的最低检测限可以达到10-8 mol/L。本实施是在常温常压下，采用绿色合成的方法制备了生物蛋白印迹水凝胶SERS基底，通过印迹孔穴与目标蛋白分子在空间和位点的匹配作用，提高了对生物蛋白的捕捉。制备的超薄的SERS核壳结构大大提高了SERS基底的灵敏度，采用印迹水凝胶做为壳，使得核壳SERS基底检测技术应用于生物蛋白，拓宽了蛋白检测技术领域。
实施例2：本实施方式与实施例1不同的是：步骤A，其它与实施1相同。
A、制备Ag球衬底，包括以下步骤：在室温的条件下，配置100 ml浓度为8mg/ml的硝酸银水溶液，配置0.15g/ml的抗坏血酸溶液，通过化学沉淀法制备Ag球，该Ag球由小粒径银纳米粒子聚集组成，通过扫描电镜图片可知，当提高硝酸银浓度时，制备的Ag球尺寸变小，平均粒径在200nm左右。（见附图2）
实施例3：本实施方式与实施例1不同的是：步骤B中3-氨基丙基三乙氧基硅烷替换为γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷。其它与实施方式一相同。（见附图3），从图片结果可知，银球表面发生了很大的变化，包覆了一层薄膜。
实施例4：本实施方式与实施例1不同的是：步骤C中牛血清蛋白为血红蛋白。其它与实施例1相同。（见附图4），通过SEM表征证明了水凝胶印迹薄膜包覆在Ag球的表面，通过图4与图3进行比较，血红蛋白水凝胶在Ag球表面包覆的印迹薄膜厚度增加。
实施例5：本实施方式与实施例1不同的是：步骤D，其它与实施方式一相同。对溶液中牛血清蛋白质检测的方法包括以下步骤：配置浓度分别为10-4、10-6、10-8mol/L的牛血清蛋白质水溶液，然后向5 ml的牛血清蛋白水溶液中加入0.05 g的SERS基底，震荡吸附24小时，进行拉曼光谱检测，得到拉曼光谱（见附图5），完成SERS基底对牛血清蛋白的表面增强拉曼光谱检测。在试验中，所用的拉曼光谱为共聚焦拉曼光谱仪，检测范围为500-2000纳米。由图5所知，随着牛血清蛋白的下降，SERS基底对牛血清蛋白检测的拉曼光谱的特征峰值也在减弱。从图中可以看到SERS基底对牛血清蛋白的检测极限可达到10-8 mol/L。

Claims (9)

1.生物蛋白印迹水凝胶表面增强拉曼散射基底的制备方法，其特征在于，具体方法为：以Ag球为衬底，在Ag球衬底表面采用氨基硅烷试剂改性，在改性的Ag球上采用表面印迹方法均匀包覆印迹水凝胶薄膜，制得印迹水凝胶表面增强拉曼散射基底。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Ag球是将AgNO3 水溶液加入超纯水中，再加入聚乙烯吡咯烷酮溶液，室温下进行搅拌，取抗坏血酸溶液快速加入上述混合溶液中，颜色由无色迅速变为银灰色，待颜色不再加深，15 min 后停止反应，即可形成Ag球，用水和乙醇交替洗除Ag球表面的聚乙烯吡咯烷酮溶液，通过离心获得Ag球纳米粒子，40 ℃下真空干燥 24 h，该Ag球的尺寸为500nm~2μm。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，硝酸银水溶液的质量浓度为0.5~4mg/ml的硝酸银水溶液；抗坏血酸溶液的质量浓度为0.01~0.5g/ml；聚乙烯吡咯烷酮溶液的质量浓度为1 mol/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述在Ag球表面进行氨基硅烷试剂改性，是在常温常压下，Ag球置于水与乙醇以体积比为1/2~1/5的混合溶液中超声分散，滴入3-氨基丙基三乙氧基硅烷或γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷对Ag球表面进行改性。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用表面印迹方法在Ag球上均匀包覆印迹水凝胶薄膜是在常温常压下，改性的Ag球分散在超纯水为溶液中；将蛋白质分散在磷酸缓冲溶液中，得到浓度为1mg/mL~4mg/mL的蛋白质溶液，再加入功能单体搅拌0.5-2小时，使功能单体与模板分子进行预聚合；再在制备的预聚合溶液中加入改性的Ag球超纯水溶液中，超声分散均匀，加入交联剂与引发剂进行聚合，聚合反应0.5-12h，在Ag球表面聚合印迹水凝胶薄膜，再通过洗液洗除蛋白质分子，得到产物经真空干燥12h后即为生物蛋白印迹水凝胶表面增强拉曼散射基底。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，1mg/mL~4mg/mL的蛋白质溶液与Ag球的质量比例为1/5-1。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的功能单体为N,N'-亚甲基双丙烯酰胺与丙烯酸以质量比为1：2-5的混合物，功能单体与蛋白质的摩尔比为1：5-10。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的交联剂为四甲基乙二胺，交联剂与蛋白质的摩尔比为1：25-40，所述的引发剂为偶氮二异丁腈，占所有原料的质量比为千分之一。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蛋白质溶液为牛血清蛋白或血红蛋白。
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