CN101793703A - 乳糖诊断/测定试剂(盒)及乳糖浓度测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的乳糖诊断/测定试剂(盒)，同时本发明还涉及测定乳糖浓度的方法、试剂的组成及成分，属于医学/食品检验测定技术领域。本发明的试剂(盒)主要成分包括：缓冲液、尿苷二磷酸、乳糖合成酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合及稳定剂；通过一系列的酶促反应，最终将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400-700nm波长处，测定染料含量的高低，进而直接反映出乳糖浓度的大小。
Description
技术领域
本发明涉及一种乳糖诊断/测定试剂(盒)，同时本发明还涉及测定乳糖浓度的方法，属于医学/食品检验测定技术领域。
背景技术
乳糖是婴幼儿主要的能量来源，进入体内后经小肠乳糖酶作用分解成葡萄糖和半乳糖，半乳糖是婴幼儿脑发育的必需物质，与婴幼儿大脑的迅速成长有密切联系。为防止乳清粉中掺加用其他还原糖如葡萄糖替代乳糖，乳糖的检测十分必要。
牛奶是一种营养丰富的食品，但如饮用不当，也会给健康带来不良影响。很多人在饮奶后出现腹部不适、腹胀、多屁、腹痛甚至腹泻等症状，这种现象在医学上称为乳糖不耐受症，其原因是这些人小肠缺乏乳糖酶、不能消化牛奶中的乳糖，乳糖进入结肠后，经结肠中的细菌发酵，产生大量气体、醋酸等物质所致。大量研究证实，患有乳糖不耐受的人还有大部分没有任何症状、只有人体生化指标改变的隐性不耐受者，医学上称为乳糖吸收不良或乳糖酶缺乏。
据统计，全世界都存在乳糖不耐受的问题，其中亚洲人发生率最高，为95％-100％。据中国疾病控制中心调查，我国北京、上海、广州等地3-13岁儿童乳糖不耐受症和乳糖吸收不良的发生率约为80％。乳糖不耐受除引起消化道症状外，还可造成人体营养吸收不良。据国外研究，乳糖不耐受可减少钙的摄入、减少峰值骨量、增加骨丢失从而引发骨质疏松症，乳糖不耐受可影响铁和锌的吸收，造成铁缺乏和锌缺乏，并可影响小儿的脑发育，对人体健康危害很大。
在食品分析领域中，酶分析法是广为使用并倍受诸如ISO等国际标准机构推荐的一种方法。酶析法理论发展成熟并且已为实验室普遍接受。使用高质量经纯化的酶可以实现对复杂物质中特定成份的检测。该方法可以检测的目标代谢物有糖类、酸类及其盐类、醇类和其他物质等。由此，各种食品样品均可被快速检测并获得良好的结果。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶联法(Couple Reaction)技术，计量通过酶联反应生成吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)所导致在400-700nm波长处吸光度的上升，得以测定乳糖浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的乳糖诊断/测定试剂(盒)，采用该试剂不仅可以在可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行乳糖浓度测定，而且测定速度快、灵敏度大、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明乳糖浓度测定方法如下：
乳糖+尿苷二磷酸乳糖合成酶尿苷二磷酸-半乳糖+葡萄糖
葡萄糖+氧葡萄糖氧化酶葡糖酸内酯+过氧化氢
过氧化氢+还原型色原体组合过氧化物酶吲嗒胺色原或
醌亚胺色原+水
这个方法应用乳糖合成酶(lactose synthase；EC 2.4.1.22)(偶)联葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase；EC 1.1.3.4)及过氧化物酶(peroxidase；EC 1.11.1.7)酶促反应终点比色法。乳糖合成酶酶解乳糖反应产生葡萄糖，再通过(偶)联合葡萄糖氧化酶的作用，最后生成的过氧化氢在过氧化物酶的作用下，将无色的还原型色原体组合氧化成有色的染料，从而可以通过可见光分析仪器，在400-700nm(根据还原型色原体组合的不同而定)波长处，测定染料-吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亚胺色原(Quioneimine dye)-含量高低的光吸收大小；通过测量400-700nm(根据还原型色原体组合的不同而定)处吸光度上升的程度，得出乳糖浓度大小测定结果。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，如下成分关系的本发明乳糖诊断/测定试剂(盒)较为理想：
缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
过氧化物酶 30000U/L
乳糖合成酶 10000U/L
葡萄糖氧化酶 12000U/L
尿苷二磷酸 6mmol/L
还原型色原体组合 0.1——20mmol/L
所述还原型色原体组合(Chromogen)可以是下列28个组合中的任何一个配对组合：
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N，N-双乙基-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，4-双氯石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3，5-双氯石碳酸磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
仨溴羥基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
双甲基苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3-甲基-乙基-羥基苯胺
4-氨基抗砒
石碳酸
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺
4-氨基抗砒
N，N-双乙基-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2，4-双氯石碳酸
4-氨基抗砒
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒
3，5-双氯石碳酸磺酸
4-氨基抗砒
3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
4-氨基抗砒
仨溴羥基苯甲酸
4-氨基抗砒
双甲基苯胺
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
4-氨基抗砒
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
4-氨基抗砒
3-甲基-乙基-羥基苯胺
本发明的乳糖诊断/测定试剂(盒)可以是单剂，包括：缓冲液、稳定剂、乳糖合成酶、葡萄糖氧化酶、尿苷二磷酸、过氧化物酶、还原型色原体组合。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、尿苷二磷酸。
试剂2
缓冲液、稳定剂、过氧化物酶、还原型色原体组合、乳糖合成酶、葡萄糖氧化酶。
过氧化物酶、还原型色原体组合、乳糖合成酶、葡萄糖氧化酶、尿苷二磷酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、尿苷二磷酸。
试剂2
缓冲液、稳定剂、还原型色原体组合、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶。
试剂3
缓冲液、稳定剂、乳糖合成酶。
过氧化物酶、还原型色原体组合、乳糖合成酶、葡萄糖氧化酶、尿苷二磷酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的乳糖诊断/测定试剂为单试剂，包括：
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
乳糖合成酶 10000U/L
葡萄糖氧化酶 12000U/L
过氧化物酶 30000U/L
尿苷二磷酸 6mmol/L
4-氨基抗砒 2mmol/L
石碳酸 10mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长505nm，测试副波长600nm，被测乳糖样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为终点比色法，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长505nm吸光度上升的程度，从而测算出乳糖的浓度大小。
实施例二
本实施例的乳糖诊断/测定试剂为双试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
尿苷二磷酸 6mmol/L
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸 0.2mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
乳糖合成酶 10000U/L
葡萄糖氧化酶 12000U/L
过氧化物酶 30000U/L
4-氨基抗砒 0.6mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长546nm，测试副波长600nm，被测乳糖样品与试剂的体积比例为1/20，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为终点比色法，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长546nm吸光度上升的程度，从而测算出乳糖的浓度大小。
实施例三
本实施例的乳糖诊断/测定试剂为三试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
尿苷二磷酸 6mmol/L
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 0.6mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
葡萄糖氧化酶 12000U/L
过氧化物酶 30000U/L
双甲基苯胺 2mmol/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
乳糖合成酶 10000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长578nm，测试副波长660nm，被测乳糖样品与试剂的体积比例为1/30，反应方向为正反应(上升反应)，检测方法为终点比色法，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长578nm吸光度上升的程度，从而测算出乳糖的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明：采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(ΔA/min)≤0.0012；吸光度时间反应曲线应呈上升曲线直至终点；试剂可测有效(R≥0.99)线形范围可达15mmol/L；试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±4％；试剂测试的精密度(重复性)的变异系数(CV)≤2％；试剂的灵敏度可达0.0018±0.0009ΔA/mmol/L；试剂在2-8℃下保存，活性可以稳定一年；——本发明灵敏度高、精确度好，线形范围宽广，稳定期长，足以便于推广应用。
Claims (7)
1.一种酶比色法及酶联法技术的乳糖浓度测定方法，其方法如下：
乳糖+尿苷二磷酸 乳糖合成酶 尿苷二磷酸-半乳糖+葡萄糖
葡萄糖+氧 葡萄糖氧化酶 葡糖酸内酯+过氧化氢
过氧化氢+还原型色原体组合 过氧化物酶 吲嗒胺色原或
醌亚胺色原+水
将最终反应物置于可见光分析仪下，检测400-700nm处直接反映吲嗒胺色原或醌亚胺色原含量高低的光吸收程度，得出乳糖浓度大小测定结果。
2.一种乳糖诊断/测定试剂(盒)，主要成分包括：
缓冲液 20——500mmol/L
稳定剂 1——4000mmol/L
过氧化物酶 500——80000U/L
乳糖合成酶 1000——80000U/L
葡萄糖氧化酶 1000——80000U/L
尿苷二磷酸 1——50mmol/L
还原型色原体组合 0.1——20mmol/L
试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范围外，试剂仍会反应作用。
其特征在于：试剂(盒)可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3.根据权利要求2所述乳糖诊断/测定试剂(盒)，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、乳糖合成酶、葡萄糖氧化酶、尿苷二磷酸、过氧化物酶、还原型色原体组合组成单剂试剂。
4.根据权利要求2所述乳糖诊断/测定试剂(盒)，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、乳糖合成酶、葡萄糖氧化酶、尿苷二磷酸、过氧化物酶、还原型色原体组合组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、尿苷二磷酸、还原型色原体组合组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、乳糖合成酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成。过氧化物酶、还原型色原体组合、乳糖合成酶、葡萄糖氧化酶、尿苷二磷酸在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5.根据权利要求2所述乳糖诊断/测定试剂(盒)，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、乳糖合成酶、葡萄糖氧化酶、尿苷二磷酸、过氧化物酶、还原型色原体组合组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、尿苷二磷酸、还原型色原体组合组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、还原型色原体组合组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、乳糖合成酶组成。过氧化物酶、还原型色原体组合乳糖合成酶、葡萄糖氧化酶、尿苷二磷酸在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述乳糖诊断/测定试剂(盒)，其特征在于：还包括稳定剂1-4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(AmmoniaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐剂中的至少一种。
7.根据权利要求2所述乳糖诊断/测定试剂(盒)，其特征在于：所述还原型色原体组合可以是下列28个组合中的任一个配对组合：
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N，N-双乙基-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，4-双氯石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3，5-双氯石碳酸磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
仨溴羥基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
双甲基苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3-甲基-乙基-羥基苯胺
4-氨基抗砒
石碳酸
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(3-硫丙基)-m-噻啶胺
4-氨基抗砒
N，N-双乙基-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2，4-双氯石碳酸
4-氨基抗砒
2，4，6-仨溴-3-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒
3，5-双氯石碳酸磺酸
4-氨基抗砒
3，5-双氯-2-羟基-苯磺酸
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺钠盐
4-氨基抗砒
仨溴羥基苯甲酸
4-氨基抗砒
双甲基苯胺
4-氨基抗砒
N-乙基-N-(2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺
4-氨基抗砒
2，2’-AZINO-双(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
4-氨基抗砒
4-羥基-3-甲氧基苯甲酸
4-氨基抗砒
3-甲基-乙基-羥基苯胺
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|---|---|---|---|---|
| CN110398469A (zh) * | 2019-07-16 | 2019-11-01 | 北京知几未来医疗科技有限公司 | 一种用于确定体液葡萄糖水平的反应液及方法 |
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2009
- 2009-02-04 CN CN200910028215A patent/CN101793703A/zh active Pending
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