CN106086160A - 一种测定5’‑核苷酸酶的试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种测定5’‑核苷酸酶的试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种测定5’‑核苷酸酶的试剂盒及其制备方法，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：试剂R1：Good’s缓冲液、5’‑次黄嘌呤核苷酸、黄嘌呤氧化酶、嘌呤核苷酸磷酸化酶、叠氮钠，其溶剂为纯化水，试剂R2：过氧化物酶、4‑氨基安替吡啉、3‑羟基‑2，4，6‑三溴苯甲酸、叠氮钠，其溶剂为纯化水，制备方法为：按照组分含量配制好试剂；将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；根据吸光度变化值计算出样本中的D‑3‑羟丁酸的浓度。本发明具有准确度高等优点。

Description

一种测定5’-核苷酸酶的试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及医学及生物化学技术领域，具体来说是一种测定5’-核苷酸酶的试剂盒及其制备方法。
背景技术
5’-核苷酸酶(5'-NT)，全称5’-核糖核苷酸磷酸水解酶。5’-核苷酸酶是一种对底物特异性不高的水解酶，可作用于多种核苷酸。主要参与核酸的分解代谢，能特异性的催化核苷5’-核苷酸酶和次黄嘌呤核苷酸，5’-核苷酸酶在人体的运动，细胞生长发育，纤维蛋白合成，提高表皮或内皮屏蔽功能，神经传递淋巴细胞的再循环及黏附，免疫应答等方面均发挥重要的作用。
5’-核苷酸酶在人体内分布广泛，如肝、胆、胰、肠、心、脑、肺、肾、垂体、甲状腺、前列腺、睾丸等脏器和组织中，定位在细胞膜上，肝胆系统是血清中5’-核苷酸酶的主要来源，在肝内主要存在于胆小管和窦状间隙内。
5’-核苷酸酶的活性测定方法目前多采用同位素底物测试法，但该方法需要特殊的仪器，且会有同位素产生的污染，因此不适合临床大量的标本检测,而其它的检测方法又存在准确度不高的缺陷。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术操作复杂、准确度低以及会产生同位素污染的缺陷，而提供一种测定5’-核苷酸酶的试剂盒及其制备方法。
本发明解决上述技术问题提供的技术方案是：本发明公开了一种测定5’-核苷酸酶的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
Good’s缓冲液 20~140 mmol/L
5’-次黄嘌呤核苷酸 1.2~4.8 KU/L
黄嘌呤氧化酶 0.8~3.4 KU/L
嘌呤核苷酸磷酸化酶 0.5~4.5 KU/L
叠氮钠 0.1~0.7 g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
过氧化物酶 0.4~3.6 KU/L
4-氨基安替吡啉 1.1~2.7 g/L
3-羟基-2，4，6-三溴苯甲酸 1.6~4.0 g/L
叠氮钠 0.1~0.7 g/L
其溶剂为纯化水。
作为优选，本发明公开了一种测定5’-核苷酸酶的试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
Good’s缓冲液 80 mmol/L
5’-次黄嘌呤核苷酸 3.0 KU/L
黄嘌呤氧化酶 2.1 KU/L
嘌呤核苷酸磷酸化酶 2.5 KU/L
叠氮钠 0.4 g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
过氧化物酶 2.0 KU/L
4-氨基安替吡啉 1.9 g/L
3-羟基-2，4，6-三溴苯甲酸 2.8 g/L
叠氮钠 0.4 g/L
其溶剂为纯化水。
作为优选，所述的试剂R1中，所述的Good’s缓冲液的pH值为6～8。
作为优选，本发明还公开了上述测定5’-核苷酸酶的试剂盒的制备方法和使用方法，包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
Good’s缓冲液 20~140 mmol/L
5’-次黄嘌呤核苷酸 1.2~4.8 KU/L
黄嘌呤氧化酶 0.8~3.4 KU/L
嘌呤核苷酸磷酸化酶 0.5~4.5 KU/L
叠氮钠 0.1~0.7 g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
过氧化物酶 0.4~3.6 KU/L
4-氨基安替吡啉 1.1~2.7 g/L
3-羟基-2，4，6-三溴苯甲酸 1.6~4.0 g/L
叠氮钠 0.1~0.7 g/L
其溶剂为纯化水；
（b）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
（c）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（d）根据吸光度变化值计算出样本中的5’-核苷酸酶的浓度。
本发明的检测原理是：5’-核苷酸酶催化5’-次黄嘌呤核苷酸水解生成次黄苷和氨，次黄苷在嘌呤核苷磷酸化酶作用下生成次黄嘌呤，次黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶作用下生成尿酸和过氧化氢，过氧化氢与4-氨基安替吡啉和TBHBA在过氧化物酶作用下生成醌亚胺化合物，通过测定相应波长处吸光度变化值得出样本中5’-核苷酸酶的活性。
样本中5’-核苷酸酶(5'-NT)的活性（U/L）=CS×（U/L）
式中：ΔAU/min 待测样品平均每分钟的吸光度变化值
ΔAB/min 校准液平均每分钟的吸光度变化值
CS 校准液中5’-NT的浓度
与现有技术相比，本发明具有以下有益优点：
与同位素检测法相比，除了没有同位素造成的环境污染之外，利用酶偶联反应的方法，可使反应更灵敏，更容易检测，而且结果更稳定，测量准确度更高。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于这些实施例。
实施例1
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中
试剂R1：
Good’s缓冲液 80 mmol/L
5’-次黄嘌呤核苷酸 3.0 KU/L
黄嘌呤氧化酶 2.1 KU/L
嘌呤核苷酸磷酸化酶 2.5 KU/L
叠氮钠 0.4 g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
过氧化物酶 2.0 KU/L
4-氨基安替吡啉 1.9 g/L
3-羟基-2，4，6-三溴苯甲酸 2.8 g/L
叠氮钠 0.4 g/L
其溶剂为纯化水。
实施例2
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，其中
试剂R1：
Good’s缓冲液 20 mmol/L
5’-次黄嘌呤核苷酸 1.2KU/L
黄嘌呤氧化酶 3.4 KU/L
嘌呤核苷酸磷酸化酶 4.5 KU/L
叠氮钠 0.7 g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
过氧化物酶 0.4KU/L
4-氨基安替吡啉 1.1 g/L
3-羟基-2，4，6-三溴苯甲酸 1.6 g/L
叠氮钠 0.7 g/L
其溶剂为纯化水。
实施例3
试剂盒的制备和使用方法
1、按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
Good’s缓冲液 80 mmol/L
5’-次黄嘌呤核苷酸 3.0 KU/L
黄嘌呤氧化酶 2.1 KU/L
嘌呤核苷酸磷酸化酶 2.5 KU/L
叠氮钠 0.4 g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
过氧化物酶 2.0 KU/L
4-氨基安替吡啉 1.9 g/L
3-羟基-2，4，6-三溴苯甲酸 2.8 g/L
叠氮钠 0.4 g/L
其溶剂为纯化水。
2、全自动生化分析仪参数设置
（a）检测温度：37℃；
（b）检测波长：主波长505nm、副波长700nm；
（c）反应时间 ：8min，其中，孵育时间 5min，加入试剂 R2 后立即测定读取吸光度 A1，3min后读取吸光度 A2，计算吸光度变化 ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 反应方向：负反应。
3、检测步骤
（a）取180μl试剂R1与4.8μl待测样本混匀；
（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
（c）加入60μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，3min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA ＝ A2-A1；
(d) 根据5’-NT的活性（U/L）= CS×（U/L）计算出样本中的5’-核苷酸酶的浓度。
实施例4
试剂盒的制备和使用方法
1、按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
Good’s缓冲液 20 mmol/L
5’-次黄嘌呤核苷酸 1.2KU/L
黄嘌呤氧化酶 3.4 KU/L
嘌呤核苷酸磷酸化酶 4.5 KU/L
叠氮钠 0.7 g/L
其溶剂为纯化水。
试剂R2：
过氧化物酶 0.4KU/L
4-氨基安替吡啉 1.1 g/L
3-羟基-2，4，6-三溴苯甲酸 1.6 g/L
叠氮钠 0.7 g/L
其溶剂为纯化水。
2、全自动生化分析仪参数设置
（a）检测温度：37℃；
（b）检测波长：主波长505nm、副波长700nm；
（c）反应时间 ：8min，其中，孵育时间 5min，加入试剂 R2 后立即测定读取吸光度 A1，3min后读取吸光度 A2，计算吸光度变化 ΔA ＝ A2-A1 ；
(d) 反应方向：负反应。
3、检测步骤
（a）取180μl试剂R1与4.8μl待测样本混匀；
（b）将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；
（c）加入60μl试剂R2，立即测定读取吸光度A1，3min后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA ＝ A2-A1；
(d) 根据5’-NT的活性（U/L）= CS×（U/L）计算出样本中的5’-核苷酸酶的浓度。
表1为实施例1所制得的测定5’-核苷酸酶的试剂盒以及实施例2所制得的测定5’-核苷酸酶的试剂盒分别对质控品1进行测定的结果，其中质控品1中的5’-核苷酸酶的浓度为15U/L，测定结果见表1：
表1
由表1可知，本发明所制得的测定5’-核苷酸酶的试剂盒对质控品1的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
表2为实施例1所制得的测定5’-核苷酸酶的试剂盒以及实施例2所制得的测定5’-核苷酸酶的试剂盒分别对质控品2进行测定的结果，其中质控品2中的5’-核苷酸酶的浓度为40U/L，测定结果见表2：
表2
由表2可知，本发明所制得的测定5’-核苷酸酶的试剂盒对质控品2的测定结果偏差较小，因此测定准确度高，而且实施例1为最优的选择。
表3为实施例3所制得的测定5’-核苷酸酶的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定以及实施例4所制得的测定5’-核苷酸酶的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定，对所得的结果进行SD和CV的计算，结果如下：
表3
由表3可知本发明所制得的测定5’-核苷酸酶的试剂盒的精密度比较好，而且由表1可知，实施例3为最优的选择。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (4)

1.一种测定5’-核苷酸酶的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
Good’s缓冲液 20~140 mmol/L
5’-次黄嘌呤核苷酸 1.2~4.8 KU/L
黄嘌呤氧化酶 0.8~3.4 KU/L
嘌呤核苷酸磷酸化酶 0.5~4.5 KU/L
叠氮钠 0.1~0.7 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
过氧化物酶 0.4~3.6 KU/L
4-氨基安替吡啉 1.1~2.7 g/L
3-羟基-2，4，6-三溴苯甲酸 1.6~4.0 g/L
叠氮钠 0.1~0.7 g/L
其溶剂为纯化水。
2.根据权利要求1所述的一种测定5’-核苷酸酶的试剂盒，其特征在于：包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
试剂R1：
Good’s缓冲液 80 mmol/L
5’-次黄嘌呤核苷酸 3.0 KU/L
黄嘌呤氧化酶 2.1 KU/L
嘌呤核苷酸磷酸化酶 2.5 KU/L
叠氮钠 0.4 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
过氧化物酶 2.0 KU/L
4-氨基安替吡啉 1.9 g/L
3-羟基-2，4，6-三溴苯甲酸 2.8 g/L
叠氮钠 0.4 g/L
其溶剂为纯化水。
3.根据权利要求1或2所述的一种测定5’-核苷酸酶的试剂盒，其特征在于：所述的试剂R1中，所述的Good’s缓冲液的pH值为6～8。
4.根据权利要求1或2所述的一种测定5’-核苷酸酶的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于：包括以下步骤：
（a）按照下列组分含量配制好试剂：
试剂R1：
Good’s缓冲液 20~140 mmol/L
5’-次黄嘌呤核苷酸 1.2~4.8 KU/L
黄嘌呤氧化酶 0.8~3.4 KU/L
嘌呤核苷酸磷酸化酶 0.5~4.5 KU/L
叠氮钠 0.1~0.7 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2：
过氧化物酶 0.4~3.6 KU/L
4-氨基安替吡啉 1.1~2.7 g/L
3-羟基-2，4，6-三溴苯甲酸 1.6~4.0 g/L
叠氮钠 0.1~0.7 g/L
其溶剂为纯化水;
（b）将待测样本与试剂R1和试剂R2混合，使其充分反应；
（c）用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值；
（d）根据吸光度变化值计算出样本中的5’-核苷酸酶的浓度。
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