CN110358746B - 一种修饰的pnp及其制备和在5’-核苷酸酶检测中的应用 - Google Patents

一种修饰的pnp及其制备和在5’-核苷酸酶检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种修饰的PNP及其制备和在5’‑核苷酸酶检测中的应用，涉及到医学免疫体外诊断领域，所述修饰的PNP为PNP的氨基酸侧链经酰化修饰。并由其制备了稳定的5’‑核苷酸检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2；所述试剂R1包括缓冲液、4‑AA、修饰的嘌呤核苷磷酸氧化酶、过氧化物酶、黄嘌呤氧化酶、防腐剂、除干扰剂；所述试剂R2包括缓冲液，5’‑核苷磷酸盐。本发明对5’核苷酸酶检测的酶比色法加以改进，通过对参与反应的嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)进行化学修饰，使试剂抗干扰能力增强达到灵敏度高的效果。

Description

一种修饰的PNP及其制备和在5’-核苷酸酶检测中的应用
技术领域
本发明涉及5’-核苷酸酶检测技术领域，具体涉及一种修饰的PNP及其制备和在5’-核苷酸酶检测中的应用。
背景技术
5’-NT在人体的运动、细胞生长发育、纤维蛋白合成、提高表皮或内皮屏障功能、神经传递及淋巴的再循环及黏附、免疫应答等方面均发挥重要的作用。近年来，5’-NT在很多疾病，包括肝脏等疾病的发生发展过程中的作用越来越受到人们的重视。5’-NT在人体组织中广泛存在，如肝、胆、肠、脑、心、胰等。定位于细胞质膜上，在肝内此酶主要存在于胆小管和窦状隙膜内，而5’-NT要释放入血必须要经肝胆系统内的高浓度胆汁酸去垢处理，因此患者一旦患有肝胆疾病，血清中的5’-NT水平就会出现异常。
众多研究资料表明，血清5’-NT活性升高主要见于肝胆胰系统疾病及某些恶性肿瘤，如阻塞性黄疸、肝癌、肝炎等，其活性变化与ALP一致，故有较特异的诊断价值。骨骼系统疾病，如肿瘤转移、畸形性骨炎、佝偻病、甲状旁腺功能亢进，通常ALP活性升高，而5’-NT正常。因此ALP和5’-NT同时测定有助于肝胆和骨骼系统疾病的鉴别诊断。准确的测定5’-NT显得尤为重要，测定方法也得到不断开发和改进。
诊断方法：5’-NT测定主要是酶比色法，次黄嘌呤核苷-5’-单磷酸二钠盐(5’IMP)在5’-NT催化下水解生成磷酸和次黄嘌呤核苷，同时偶联黄嘌呤氧化酶和核苷酸磷酸化酶，使次黄苷最终氧化成过氧化氢和尿酸，最后在4-AAP和3-羟基-2,4,6-三溴苯甲酸(TBHBA)的参与下经过氧化酶的催化生成红色醌亚胺，在550nm处检测吸光度的增高速率即可计算出5’-NT活性。
上述方法具有抗干扰能力强，且不受内源性和外源性磷酸干扰，适合自动化快速测定的特点，为临床常规开展5’-NT检测应用创造有利条件。目前各试剂厂家纷纷推出基于该测定原理的5’-NT试剂，但是该法测定过程中需要PO4 3-和Mg2+(或Mn2+)生成沉淀的问题，使得测定试剂中PO4 3-和Mg2+(或Mn2+)的浓度远远低于反应所需的最适浓度，从而造成比色反应进行的不彻底，测定时灵敏度低，重复性不佳，给临床进一步推广应用此方法带来困难。基于目前测定血清5’-NT诸多方法所存在的各种缺点，研发一种抗干扰能力强，测定灵敏度高，能真实反应血清5’–NT活性并能实现手工和全自动生化分析的匀相法测定新技术，已成为该研究领域的发展趋势。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提供一种修饰的PNP及其制备和在5’-核苷酸酶检测中的应用。本发明对5’核苷酸酶检测的酶比色法加以改进，通过对参与反应的嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)进行化学修饰，提高试剂稳定性、增强抗干扰能力以及提高检测灵敏度效果。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种修饰的嘌呤核苷磷酸化酶，所述嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸侧链经酰化修饰。
本发明还提供了一种修饰的嘌呤核苷磷酸化酶的制备方法，包括以下步骤：
A、将嘌呤核苷磷酸化酶与酰化试剂进行反应；
B、在步骤A所得反应物中加入尿素进行反应，使蛋白质变性；
C、步骤B后加入半胱氨酸使蛋白质复性，即得所述氨基酸侧链经酰化修饰后的嘌呤核苷磷酸化酶。
优选地，步骤A中，所述酰化试剂包括乙酸乙酯、二异丙基氟磷酸、丹磺酰氯、硫代三氟中的一种几种混合。
优选地，步骤A中，所述嘌呤核苷磷酸化酶与酰化试剂的质量比例为1:(3-5)。
优选地，步骤A中，所述反应的具体步骤为：在室温下搅拌8-12小时；所述反应在溶剂存在条件下进行，所述溶剂为乙二醇。
优选地，步骤B中，所述反应的具体步骤为：在室温下搅拌6-8小时；所述尿素的加入量为10-100g每升步骤A所得反应物。
优选地，步骤C中，所述半胱氨酸的加入量为100-1000KU，蛋白质复性的具体步骤为：在40-55℃下静置30分钟，进行高温变性。
本发明还提供了一种修饰的嘌呤核苷磷酸化酶在5’-核苷酸酶检测中的应用。
本发明还提供了一种稳定的5’-核苷酸酶检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2；所述试剂R1包括以下浓度的各组分：10-100mmol/L缓冲液、1-10mmol/L 4-AA、0.1-10U/ml前述的修饰的嘌呤核苷磷酸化酶(若超过10U/ml线性会受影响)、0.1-10U/ml过氧化物酶、0.1-10U/ml黄嘌呤氧化酶、0.1-10g/ml防腐剂、0.1-10g/L除干扰剂；
所述试剂R2包括以下浓度的各组分：10-100mmol/L缓冲液，10-100mmol/L 5’-核苷磷酸盐。
所述试剂R1中，修饰的嘌呤核苷磷酸化酶若超过10U/ml则线性会受影响。
优选地，所述缓冲液为PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Good’s缓冲液中的一种或几种；
所述防腐剂为叠氮钠或proclin300。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过氨基酸侧链经酰化修饰改变嘌呤核苷磷酸化酶空间结构，修饰后的酶在5’核苷酸酶检测试剂中稳定性显著提高，同时不与还原性辅酶互相干扰，达到灵敏度高的效果。
本发明的5’核苷酸酶检测试剂盒的重复性好，试剂稳定，操作简便、灵敏度高、特异性好，测定快速、测定结果准确可靠。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为5’-NT参考标准的标准曲线，其中X轴表示5’-NT的含量，Y轴表示吸光度；
图2为分别采用本发明试剂和国外某知名公司的5”-NT试剂的测定结果分析；采用日立全自动生化分析仪对50份人血清(包含正常和异常标本)按各自参数同时进行测定，对测定值进行相关分析，其中X轴表示的是本发明试剂测定的病人血清结果，Y轴表示的是某公司试剂测定的病人血清结果，相关系数R2＝0.9998，回归方程为y＝1.0372x+1.0219。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例提供了一种修饰的嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)，其制备方法如下：
A、在乙二醇存在条件下，将嘌呤核苷磷酸化酶与酰化试剂乙酸乙酯按质量比1:3混合，在室温下搅拌反应8小时；
B、在步骤A所得反应溶液中加入尿素，在室温下搅拌反应6小时，使蛋白质变性；
C、步骤B后加入半胱氨酸使蛋白质复性，即得所述氨基酸侧链经酰化修饰后的嘌呤核苷磷酸化酶。
实施例2
本实施例提供了一种修饰的嘌呤核苷磷酸化酶，其制备方法如下：
A、在乙二醇存在条件下，将嘌呤核苷磷酸化酶与酰化试剂二异丙基氟磷酸按质量比1:4混合，在室温下搅拌反应12小时；
B、在步骤A所得反应溶液中加入尿素，在室温下搅拌反应8小时，使蛋白质变性；
C、步骤B后加入半胱氨酸使蛋白质复性，即得所述氨基酸侧链经酰化修饰后的嘌呤核苷磷酸化酶。
实施例3
本实施例提供了一种修饰的嘌呤核苷磷酸化酶，其制备方法如下：
A、在乙二醇存在条件下，将嘌呤核苷磷酸化酶与酰化试剂硫代三氟按质量比1:5混合，在室温下搅拌反应10小时；
B、在步骤A所得反应溶液中加入尿素，在室温下搅拌反应7小时，使蛋白质变性；
C、步骤B后加入半胱氨酸使蛋白质复性，即得所述氨基酸侧链经酰化修饰后的嘌呤核苷磷酸化酶。
实施例4
本实施例提供了一种5’-NT检测试剂盒，其各组分的组成如下：
试剂R1为：
Figure GDA0002669780210000041
Figure GDA0002669780210000051
试剂R2为：
缓冲液 20mmol/L
5’-NT核苷磷酸盐 10mmol/L
防腐剂 0.9g/L
各种成分可以室温下依次添加，或者同时添加，或者是分别单独包装并与检测之前在即时配制。
本实施例描述的5’-NT检测试剂盒，适用于各种类型的全自动生化仪，以日立7170全自动生化仪为例，其操作如表1。分析方法：速率法，即试剂R1、R2的用量分别为180ul和60ul，样本量8ul；180ul试剂R1加入8ul样本于37℃3min后加入60ul R2，延迟1min后开始读点，读数时间约180s；检测主波长为546nm，副波长为700nm。
采用本实施例的试剂及上述测定方法，采用日立7170生化分析仪测得的5’-NT标准品(Roche公司C.f.a.s.)的曲线(如图1所示)，其中X轴表示5’-NT含量(U/L)；Y轴表示吸光度。
表1
Figure GDA0002669780210000052
实施例5
本实施例提供了一种5’-NT检测试剂盒，其各组分的组成如下：
试剂R1为：
Figure GDA0002669780210000053
Figure GDA0002669780210000061
试剂R2为：
缓冲液 20mmol/L
5’核苷磷酸盐 10mmol/L
防腐剂 0.9g/L
各种成分可以室温下依次添加，或者同时添加，或者是分别单独包装并于检测之前再即时配制。
本实施例描述的5’-NT检测试剂盒，适用于各种类型的全自动生化仪，以日立7170全自动生化仪为例，其操作如表1。分析方法：速率法，即试剂R1、R2的用量分别为225ul和75ul，样本量10ul；225ul试剂R1加入10ul样本于37℃3min后加入75ul R2，延迟1min后开始读点，读数时间约180s；检测主波长为546nm，副波长为700nm。
采用本试剂及上述测定方法，采用日立7170生化分析仪测得的LPS标准品(Roche公司C.f.a.s.)的曲线(如图1所示)，其中X轴表示5’-NT含量(U/L)；Y轴表示吸光度。
表2
Figure GDA0002669780210000062
实施例6
本实施例与实施例4的方法基本相同，不同之处仅在于：本实施例的试剂R1中，采用实施例3制备的修饰的PNP代替实施例2制备的修饰的PNP。
对比例1
本对比例与实施例4的方法基本相同，不同之处仅在于：本对比例的试剂R1中，采用未修饰的PNP代替实施例1制备的修饰的PNP。
对比例2
本对比例与实施例4的方法基本相同，不同之处仅在于：本对比例的试剂R1中，采用以下方法制备修饰的PNP代替实施例1制备的修饰的PNP。
本对比例制备修饰的PNP的步骤如下：
在乙二醇存在条件下，将嘌呤核苷磷酸化酶与酰化试剂乙酸乙酯按质量比1:3混合，在室温下搅拌反应8小时，即得。
验证实施例1：检测试剂的相关性试验
使用本发明试剂(具体配方同实施例4)和对照试剂A公司的5’-NT试剂，采用自动7170全自动生化分析仪对50份人血清(包括正常和异常标本)按各自参数同时进行测定，对测定值进行相关性分析。按照与上述“表1”中的参数进行测定，测定结果见图2，X，Y轴均为测定值(5’-NT的含量U/L)，
由图2的结果看出，两种试剂的相关系数为R2＝0.9998，回归方程为y＝1.0372x+1.0219。结果表明本试剂与进口试剂测定病人血清相关性良好，具有很好的特异性和准确性。结果准确度达到98.1％。
采用实施例5和6制备的试剂对人血清进行测定，并进行相关性分析，结果同样具有良好的相关性和很好的特异性和准确性。结果准确度分别达到99.2％、99.6％。
采用对比例1制备的试剂对对人血清进行测定，并进行相关性分析，结果准确度达到97％。
采用对比例2制备的试剂对对人血清进行测定，并进行相关性分析，结果准确度为94％。
此外，以上实验是采用日立公司制造的7170全自动生化仪进行的，但本发明的试剂不限于上述仪器，还适用于其他全自动或半自动生化分析仪。
验证实施例2：最低检测限试验
本实验目的是检测试剂在测试临床样本时的最小检出感度。
采用实施例4试剂、对照试剂、标准品、空白溶液(一般是生理食盐水和精制水)、正常人血清样本。
机器：日立7170自动生化分析仪。
操作步骤：使用生理食盐水或是去离子水溶解样本，然后50％稀释成5个点，和零点一起每一个样本测试5次，计算平均值，求得SD数值。
结果解析：根据检测数据，计算SD数值和CV数值，分别计算1SD，2SD，从最小的开始，其平均值－2SD的数值在零点平均值+2SD以上的就是试剂的最小检出感度。
表3结果显示，本发明实施例4试剂测定稀释1/16、1/8、1/4、1/2血清时，测定平均值－2SD的数值均大于零点平均值+2SD，表明本发明试剂最低检测限至少可以达到4.07U/L。而对照A公司试剂测定稀释1/16、1/8、1/4、1/2血清，并比较血清平均值－2SD与零点平均值+2SD大小，其中1/16、1/8稀释平均值－2SD的数值小于零点平均值+2SD，1/4、1/2稀释平均值－2SD的数值大于零点平均值+2SD，表明A公司试剂最低检测限为15U/L左右。
表3
Figure GDA0002669780210000081
Figure GDA0002669780210000091
验证实施例3：稳定性试验
本实验目的是检测试剂中PNP含量随时间的变化。
机器：紫外分光光度计。
操作步骤：在340nm处测定试剂R2吸光度，吸光度值与PNP含量成正比
结果解析：根据检测数据，计算PNP含量变化。
表5结果显示，本发明采用实施例4配制的试剂在贮存条件下放置12个月后PNP含量降低了29.42％，目前市售产品稳定性都不好，普遍试剂贮存条件下放置12个月后PNP含量降低50％，本实验结果表明本发明试剂稳定性明显好于目前市售产品。
表5
Figure GDA0002669780210000092
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

Claims (5)

1.一种修饰的嘌呤核苷磷酸化酶，其特征在于，所述嘌呤核苷磷酸化酶的氨基酸侧链经酰化修饰；
所述的修饰的嘌呤核苷磷酸化酶的制备方法包括以下步骤：
A、将嘌呤核苷磷酸化酶与酰化试剂进行反应；
B、在步骤A所得反应物中加入尿素进行反应，使蛋白质变性；
C、步骤B后加热半胱氨酸使蛋白质复性，即得所述氨基酸侧链经酰化修饰后的嘌呤核苷磷酸化酶；
步骤A中，所述嘌呤核苷磷酸化酶与酰化试剂的质量比例为1:(3-5)；
步骤A中，所述酰化试剂包括乙酸乙酯、二异丙基氟磷酸、丹磺酰氯、硫代三氟中的一种或几种混合；
步骤A中，所述反应的具体步骤为：在室温下搅拌8-12小时；
步骤B中，所述反应的具体步骤为：在室温下搅拌6-8小时；所述尿素的加入量为10-100g每升步骤A所得反应物；
步骤C中，所述半胱氨酸的加入量为100-1000KU；蛋白质复性的具体步骤为：在40-55℃下静置30分钟。
2.根据权利要求1所述的修饰的嘌呤核苷磷酸化酶，其特征在于，步骤A中，所述反应在溶剂存在条件下进行，所述溶剂为乙二醇。
3.一种根据权利要求1所述的修饰的嘌呤核苷磷酸化酶在5’-核苷酸酶检测中的应用。
4.一种稳定的5’-核苷酸酶检测试剂盒，其特征在于，包括试剂R1和试剂R2；所述试剂R1包括以下浓度的各组分：10-100mmol/L缓冲液、1-10mmol/L 4-AA、0.1-10U/ml权利要求1所述的修饰的嘌呤核苷磷酸化酶、0.1-10U/ml过氧化物酶、0.1-10U/ml黄嘌呤氧化酶、0.1-10g/ml防腐剂、0.1-10g/L除干扰剂；
所述试剂R2包括以下浓度的各组分：10-100mmol/L缓冲液，10-100mmol/L 5’-核苷磷酸盐。
5.根据权利要求4所述的稳定的5’-核苷酸酶检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为PBS缓冲液、HEPES缓冲液、Good’s缓冲液中的一种或几种；
所述防腐剂为叠氮钠或proclin300。
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