JPH085560A - 化学発光測定方法 - Google Patents
化学発光測定方法Info
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- JPH085560A JPH085560A JP13705894A JP13705894A JPH085560A JP H085560 A JPH085560 A JP H085560A JP 13705894 A JP13705894 A JP 13705894A JP 13705894 A JP13705894 A JP 13705894A JP H085560 A JPH085560 A JP H085560A
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- Japan
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- reaction
- sensitizer
- chemiluminescence
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- oxidizing agent
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- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 酵素としてペルオキシダーゼを用い、化学発
光基質、酸化剤及び増感剤を用いる化学発光反応によ
り、酵素の活性を検出・定量する測定方法であって、ペ
ルオキシダーゼを含む反応系に、酸化剤、増感剤、
化学発光基質の順に添加することを特徴とする化学発
光測定方法。 【効果】 この化学発光測定方法は、発光量が高く、高
感度の測定が可能である。従って、酵素免疫測定法、Ｄ
ＮＡプローブ法等による生体微量成分の定量・分析等、
臨床検査や臨床化学の分野で広範囲に利用できる。
光基質、酸化剤及び増感剤を用いる化学発光反応によ
り、酵素の活性を検出・定量する測定方法であって、ペ
ルオキシダーゼを含む反応系に、酸化剤、増感剤、
化学発光基質の順に添加することを特徴とする化学発
光測定方法。 【効果】 この化学発光測定方法は、発光量が高く、高
感度の測定が可能である。従って、酵素免疫測定法、Ｄ
ＮＡプローブ法等による生体微量成分の定量・分析等、
臨床検査や臨床化学の分野で広範囲に利用できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、生物学的に特異的な結
合反応、例えば抗原抗体反応の検出・定量等に有用な化
学発光測定方法に関する。特に、臨床検査及び臨床化学
の分野等で生体微量成分の高感度な分析・定量に有用な
化学発光測定方法に関する。
合反応、例えば抗原抗体反応の検出・定量等に有用な化
学発光測定方法に関する。特に、臨床検査及び臨床化学
の分野等で生体微量成分の高感度な分析・定量に有用な
化学発光測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】分析対象物質を高感度に検出・定量する
ために、抗原、抗体、受容体等の特異的補足剤を用いた
特異的な結合反応を利用することが知られており、代表
的な測定方法にサンドイッチ型免疫測定法が知られてい
る。前記結合反応の検出用物質としては、ラジオアイソ
トープ、酵素、蛍光性物質、発光性物質等を利用するこ
とができる。これらのうち、酵素を検出用物質として用
いる免疫測定法（ＥＩＡ）は、ラジオアイソトープを用
いる免疫測定法（ＲＩＡ）のような危険性はなく、特異
的な結合反応を増幅することができ、一般にその酵素の
触媒活性を定量することによって、特異的に結合した被
検物質量を間接的に測定することができるため、広く用
いられている。酵素としてペルオキシダーゼを使用し、
この酵素活性をルミノール及び過酸化水素による化学発
光反応を利用して測定する方法は、通常発光が短寿命で
あるが、増感剤の添加により、発光量の増加及び発光持
続時間の長期化が図れ、この反応を用いるとＲＩＡに匹
敵する高感度な測定が可能となることが知られている。
そのために種々の増感剤が検討されている（特開昭５９
−１７１８３９号公報、特表昭５９−５００２５２号公
報、特開平２−２９１２９９号公報等）。
ために、抗原、抗体、受容体等の特異的補足剤を用いた
特異的な結合反応を利用することが知られており、代表
的な測定方法にサンドイッチ型免疫測定法が知られてい
る。前記結合反応の検出用物質としては、ラジオアイソ
トープ、酵素、蛍光性物質、発光性物質等を利用するこ
とができる。これらのうち、酵素を検出用物質として用
いる免疫測定法（ＥＩＡ）は、ラジオアイソトープを用
いる免疫測定法（ＲＩＡ）のような危険性はなく、特異
的な結合反応を増幅することができ、一般にその酵素の
触媒活性を定量することによって、特異的に結合した被
検物質量を間接的に測定することができるため、広く用
いられている。酵素としてペルオキシダーゼを使用し、
この酵素活性をルミノール及び過酸化水素による化学発
光反応を利用して測定する方法は、通常発光が短寿命で
あるが、増感剤の添加により、発光量の増加及び発光持
続時間の長期化が図れ、この反応を用いるとＲＩＡに匹
敵する高感度な測定が可能となることが知られている。
そのために種々の増感剤が検討されている（特開昭５９
−１７１８３９号公報、特表昭５９−５００２５２号公
報、特開平２−２９１２９９号公報等）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】試薬の構成及び反応時
の混合順序として、上記特開昭５９−１７１８３９号公
報、特表昭５９−５００２５２号公報等には、ペルオキ
シダーゼ、ルミノール、増感剤及び酸化剤の４つを別々
の試薬として保存し、反応時に混合してルミネセンス反
応を開始させることが記載される。さらに具体的には、
使用の数時間前にルミノールと過酸化水素を混合して溶
液を調製し、これを増感剤を予め加えた、ペルオキシダ
ーゼ−抗体複合体を含む反応系に注入して反応を開始さ
せる方法が記載されている。また、上記特開平２−２９
１２９９号公報等には、ルミノールと過酸化水素水を使
用の約２時間前に混合し、使用直前にさらに増感剤を加
えて混合した混合液を、反応系に添加する方法が記載さ
れている。一般に、これらの化学発光反応を利用する測
定方法が適用される分析対象物質は超微量であることが
多々有り、上記各方法で充分ということはなく、さらに
高感度でかつ安定な測定法及び保存安定性の高い試薬の
開発が望まれている。本発明は、これらの課題を解決す
るものであり、試薬の添加順序の点から、鋭意検討を行
った結果なし得た、さらに高感度でかつ安定な測定方法
を提供するものである。
の混合順序として、上記特開昭５９−１７１８３９号公
報、特表昭５９−５００２５２号公報等には、ペルオキ
シダーゼ、ルミノール、増感剤及び酸化剤の４つを別々
の試薬として保存し、反応時に混合してルミネセンス反
応を開始させることが記載される。さらに具体的には、
使用の数時間前にルミノールと過酸化水素を混合して溶
液を調製し、これを増感剤を予め加えた、ペルオキシダ
ーゼ−抗体複合体を含む反応系に注入して反応を開始さ
せる方法が記載されている。また、上記特開平２−２９
１２９９号公報等には、ルミノールと過酸化水素水を使
用の約２時間前に混合し、使用直前にさらに増感剤を加
えて混合した混合液を、反応系に添加する方法が記載さ
れている。一般に、これらの化学発光反応を利用する測
定方法が適用される分析対象物質は超微量であることが
多々有り、上記各方法で充分ということはなく、さらに
高感度でかつ安定な測定法及び保存安定性の高い試薬の
開発が望まれている。本発明は、これらの課題を解決す
るものであり、試薬の添加順序の点から、鋭意検討を行
った結果なし得た、さらに高感度でかつ安定な測定方法
を提供するものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】即ち本発明は、酵素とし
てペルオキシダーゼを用い、化学発光基質、酸化剤及び
増感剤を用いる化学発光反応により、酵素の活性を検出
・定量する測定方法であって、ペルオキシダーゼを含む
反応系に、酸化剤、増感剤、化学発光基質の順に
添加することを特徴とする化学発光測定方法に関する。
てペルオキシダーゼを用い、化学発光基質、酸化剤及び
増感剤を用いる化学発光反応により、酵素の活性を検出
・定量する測定方法であって、ペルオキシダーゼを含む
反応系に、酸化剤、増感剤、化学発光基質の順に
添加することを特徴とする化学発光測定方法に関する。
【０００５】本発明における化学発光測定方法は、酵素
としてペルオキシダーゼを用い、酵素活性の検出・定量
に化学発光基質、酸化剤及び増感剤を用いるものであれ
ば、測定対象、測定手法に特に制限はない。例えば、ペ
ルオキシダーゼを標識酵素として用いる特異的結合反応
系として、酵素免疫測定法の一抗体法、二抗体法、競合
分析法、サンドイッチ分析法、ホモジーニアス分析法、
ヘテロジーニアス分析法、ウエスタン分析法、ＤＮＡプ
ローブ法等の各種分析法に利用できる。
としてペルオキシダーゼを用い、酵素活性の検出・定量
に化学発光基質、酸化剤及び増感剤を用いるものであれ
ば、測定対象、測定手法に特に制限はない。例えば、ペ
ルオキシダーゼを標識酵素として用いる特異的結合反応
系として、酵素免疫測定法の一抗体法、二抗体法、競合
分析法、サンドイッチ分析法、ホモジーニアス分析法、
ヘテロジーニアス分析法、ウエスタン分析法、ＤＮＡプ
ローブ法等の各種分析法に利用できる。
【０００６】本発明で用いられるペルオキシダーゼは特
に限定するものではないが、西洋ワサビペルオキシダー
ゼの塩基性アイソザイムが増感剤との組合せにより、高
い特異発光量が得られる点から好適である。西洋ワサビ
ペルオキシダーゼの塩基性アイソザイムにはＢ、Ｃ、Ｄ
及びＥの各型が知られているが、これらの中ではＣ型が
ＲＺ値（ヘミンとタンパク質の比を示す）及び酵素活性
の点で最も好ましい。これは、例えば東洋紡（株）から
市販され入手可能である。
に限定するものではないが、西洋ワサビペルオキシダー
ゼの塩基性アイソザイムが増感剤との組合せにより、高
い特異発光量が得られる点から好適である。西洋ワサビ
ペルオキシダーゼの塩基性アイソザイムにはＢ、Ｃ、Ｄ
及びＥの各型が知られているが、これらの中ではＣ型が
ＲＺ値（ヘミンとタンパク質の比を示す）及び酵素活性
の点で最も好ましい。これは、例えば東洋紡（株）から
市販され入手可能である。
【０００７】化学発光反応に用いる化学発光基質として
は、ルミノール類、ルシゲニンなどがあるが、ルミノー
ル類が好ましく、具体的には、ルミノール、イソルミノ
ール、Ｎ−エチルイソルミノール、Ｎ−（４−アミノブ
チル）−Ｎ−エチルイソルミノールヘミサクシミド、Ｎ
−（６−アミノヘキシル）−Ｎ−エチルイソルミノール
等が挙げられる。中でもルミノール又はイソルミノール
が好ましく、特にルミノールが好ましい。ルミノール
は、通常入手できる試薬グレードのものには、製造原料
であるヒドラジン及び硫化物イオンが混入している場合
が多いので、再結晶を繰返し精製したものを用いるのが
好ましい。
は、ルミノール類、ルシゲニンなどがあるが、ルミノー
ル類が好ましく、具体的には、ルミノール、イソルミノ
ール、Ｎ−エチルイソルミノール、Ｎ−（４−アミノブ
チル）−Ｎ−エチルイソルミノールヘミサクシミド、Ｎ
−（６−アミノヘキシル）−Ｎ−エチルイソルミノール
等が挙げられる。中でもルミノール又はイソルミノール
が好ましく、特にルミノールが好ましい。ルミノール
は、通常入手できる試薬グレードのものには、製造原料
であるヒドラジン及び硫化物イオンが混入している場合
が多いので、再結晶を繰返し精製したものを用いるのが
好ましい。
【０００８】化学発光反応に用いる酸化剤としては、過
酸化水素、過硼素酸塩、過酸化尿素などが挙げられる
が、過酸化水素が好ましい。化学発光反応に用いる増感
剤は、増発光効果や発光持続性効果のあるものであれば
特に限定するものではないが、ｐ−ヨードフェノール、
ｐ−ブロムフェノール、フェノールインドフェノール、
４−［４′−（２′−メチル）チアゾリル］フェノール
等のフェノール誘導体、６−ハイドロキシベンゾチアゾ
ール、４−（４−ハイドロキシフェニル）チアゾール等
のベンゾチアゾール誘導体、３−（１０−フェノチアジ
ル）−プロピルスルホン酸塩、ｐ−ヒドロキシフェニル
プロピオン酸、ジエチルアニリン等が好ましいものとし
て用いられる。特に好ましいものは、Ｓ／Ｎ比（シグナ
ルとノイズの比）が高い点で４−［４′−（２′−メチ
ル）チアゾリル］フェノールである。
酸化水素、過硼素酸塩、過酸化尿素などが挙げられる
が、過酸化水素が好ましい。化学発光反応に用いる増感
剤は、増発光効果や発光持続性効果のあるものであれば
特に限定するものではないが、ｐ−ヨードフェノール、
ｐ−ブロムフェノール、フェノールインドフェノール、
４−［４′−（２′−メチル）チアゾリル］フェノール
等のフェノール誘導体、６−ハイドロキシベンゾチアゾ
ール、４−（４−ハイドロキシフェニル）チアゾール等
のベンゾチアゾール誘導体、３−（１０−フェノチアジ
ル）−プロピルスルホン酸塩、ｐ−ヒドロキシフェニル
プロピオン酸、ジエチルアニリン等が好ましいものとし
て用いられる。特に好ましいものは、Ｓ／Ｎ比（シグナ
ルとノイズの比）が高い点で４−［４′−（２′−メチ
ル）チアゾリル］フェノールである。
【０００９】本発明の化学発光測定方法には、酸化剤、
化学発光基質、増感剤の３成分を別々に保存してなる化
学発光測定試薬を用いる。酸化剤溶液は安定性や発光反
応のＳ／Ｎ比を高めるために、緩衝液に防腐剤や界面活
性剤やタンパク質等を添加した溶液を溶媒として用いる
のが好ましい。酸化剤の濃度は、高発光が得られる濃度
であれば特に限定するものではないが、０．１〜１０ｍ
Ｍの溶液とするのが好ましい。増感剤の濃度は、Ｓ／Ｎ
比の高い発光が得られれば特に限定するものではない
が、０．０１〜５ｍＭの範囲の溶液とするのが好まし
い。化学発光基質の濃度は、１〜５０ｍＭの範囲の溶液
とするのが好ましい。
化学発光基質、増感剤の３成分を別々に保存してなる化
学発光測定試薬を用いる。酸化剤溶液は安定性や発光反
応のＳ／Ｎ比を高めるために、緩衝液に防腐剤や界面活
性剤やタンパク質等を添加した溶液を溶媒として用いる
のが好ましい。酸化剤の濃度は、高発光が得られる濃度
であれば特に限定するものではないが、０．１〜１０ｍ
Ｍの溶液とするのが好ましい。増感剤の濃度は、Ｓ／Ｎ
比の高い発光が得られれば特に限定するものではない
が、０．０１〜５ｍＭの範囲の溶液とするのが好まし
い。化学発光基質の濃度は、１〜５０ｍＭの範囲の溶液
とするのが好ましい。
【００１０】本発明の化学発光測定方法は、予め化学発
光に関与する材料をペルオキシダーゼを含む反応系に、
酸化剤、増感剤、化学発光基質の順に添加するこ
とを特徴とする。この方法により感度が高い測定が可能
である。反応温度は、低温では、化学発光反応が遅いの
で、反応は室温（１５〜３０℃）で行うのが好ましい。
そのために、、の各溶液を低温で保管している場
合には、これらの試薬を反応前に室温に戻しておくこと
が好ましい。
光に関与する材料をペルオキシダーゼを含む反応系に、
酸化剤、増感剤、化学発光基質の順に添加するこ
とを特徴とする。この方法により感度が高い測定が可能
である。反応温度は、低温では、化学発光反応が遅いの
で、反応は室温（１５〜３０℃）で行うのが好ましい。
そのために、、の各溶液を低温で保管している場
合には、これらの試薬を反応前に室温に戻しておくこと
が好ましい。
【００１１】反応時間は、用いる増感剤の種類等により
異なるが、経時的に安定した発光が得られる時間を選択
する方が良い。通常は、１時間以内が好ましく、特にフ
ェノール誘導体を増感剤に用いた場合は、２０分以内が
好ましい。本発明を利用できる測定対象物は、ペルオキ
シダーゼを直接又は標識物として用いる反応を利用する
ものであれば特に限定するものではないが、酵素免疫測
定法との組み合わせにより測定対象物の濃度がpg／mlオ
ーダーまでの高感度測定が可能となるので、成長ホルモ
ンやエンドセリンの測定にも好ましい方法として適用で
きる。また、化学発光反応はpHが高いほど発光量は増大
するが、同時にペルオキシダーゼの触媒能に依存しない
発光量も増大するので、両者を考慮してpH７〜１１の範
囲で反応が行えるように試薬のpHを調製することが好ま
しい。
異なるが、経時的に安定した発光が得られる時間を選択
する方が良い。通常は、１時間以内が好ましく、特にフ
ェノール誘導体を増感剤に用いた場合は、２０分以内が
好ましい。本発明を利用できる測定対象物は、ペルオキ
シダーゼを直接又は標識物として用いる反応を利用する
ものであれば特に限定するものではないが、酵素免疫測
定法との組み合わせにより測定対象物の濃度がpg／mlオ
ーダーまでの高感度測定が可能となるので、成長ホルモ
ンやエンドセリンの測定にも好ましい方法として適用で
きる。また、化学発光反応はpHが高いほど発光量は増大
するが、同時にペルオキシダーゼの触媒能に依存しない
発光量も増大するので、両者を考慮してpH７〜１１の範
囲で反応が行えるように試薬のpHを調製することが好ま
しい。
【００１２】
【実施例】本発明をさらに実施例により詳述する。 実施例１ 化学発光測定試薬の添加順序が発光量に及ぼす影響抗エ
ンドセリンポリクローナル抗体（（株）免疫生物研究所
製１６１５５）を固定化した黒色のマイクロフルオロリ
モーパルウェル（ダイナテク社製）に、リン酸ナトリウ
ム緩衝液（pH７．２）でエンドセリンを種々の濃度（０
〜５０ng／ml）に希釈した溶液２００μlを注入し、４
℃で２４時間反応後ウェルを洗浄し、ペルオキシダーゼ
標識抗エンドセリンポリクローナル抗体（（株）免疫生
物研究所製１６１６５）の濃度２μg／ml液を２００μl
注入し３７℃で２時間反応させることにより、抗原抗体
反応によりウェルに固定したエンドセリンと結合させ
た。洗浄後、ペルオキシダーゼを触媒とするルミノール
／過酸化水素の化学発光を測定した。
ンドセリンポリクローナル抗体（（株）免疫生物研究所
製１６１５５）を固定化した黒色のマイクロフルオロリ
モーパルウェル（ダイナテク社製）に、リン酸ナトリウ
ム緩衝液（pH７．２）でエンドセリンを種々の濃度（０
〜５０ng／ml）に希釈した溶液２００μlを注入し、４
℃で２４時間反応後ウェルを洗浄し、ペルオキシダーゼ
標識抗エンドセリンポリクローナル抗体（（株）免疫生
物研究所製１６１６５）の濃度２μg／ml液を２００μl
注入し３７℃で２時間反応させることにより、抗原抗体
反応によりウェルに固定したエンドセリンと結合させ
た。洗浄後、ペルオキシダーゼを触媒とするルミノール
／過酸化水素の化学発光を測定した。
【００１３】測定に用いた化学発光測定試薬を次に示
す。 Ａ．過酸化水素溶液（２ｍＭ過酸化水素、０．１％（ｖ
／ｖ）ツィーン２０、０．１％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳、
０．０５％（ｗ／ｖ）卵白アルブミンを含む１０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（pH７）） Ｂ．増感剤溶液（２ｍＭ４−［４′−（２′−メチル）
チアゾリル］フェノールを含むジメチルスルホキシド） Ｃ．ルミノール溶液（２０ｍＭルミノールを含む４５．
５ｍＭＮａＯＨと０．２Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（pH
１０）の１：１の混合液）
す。 Ａ．過酸化水素溶液（２ｍＭ過酸化水素、０．１％（ｖ
／ｖ）ツィーン２０、０．１％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳、
０．０５％（ｗ／ｖ）卵白アルブミンを含む１０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（pH７）） Ｂ．増感剤溶液（２ｍＭ４−［４′−（２′−メチル）
チアゾリル］フェノールを含むジメチルスルホキシド） Ｃ．ルミノール溶液（２０ｍＭルミノールを含む４５．
５ｍＭＮａＯＨと０．２Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（pH
１０）の１：１の混合液）
【００１４】測定ａはＡを１００μl、Ｂを８μl、Ｃを
１００μlの順に約１分間隔で添加、測定ｂはＢを８μ
l、Ａを１００μl、Ｃを１００μlの順に約１分間隔で
添加、測定ｃはＢを８μl添加した約１分後ＡとＣを測
定１時間前に体積比１：１で混合したもの２００μlの
順に添加し、それぞれ撹拌し１０分後に、化学発光測定
装置（コロナ電気（株）製（ＭＬＲ−１００））を用い
て発光量を測定した。図１にエンドセリン濃度と発光量
との関係を示したが、増感剤溶液を第一番目に添加した
測定ｂおよびｃの発光量に比較し、測定ａは、非常に高
い発光量が得られた。
１００μlの順に約１分間隔で添加、測定ｂはＢを８μ
l、Ａを１００μl、Ｃを１００μlの順に約１分間隔で
添加、測定ｃはＢを８μl添加した約１分後ＡとＣを測
定１時間前に体積比１：１で混合したもの２００μlの
順に添加し、それぞれ撹拌し１０分後に、化学発光測定
装置（コロナ電気（株）製（ＭＬＲ−１００））を用い
て発光量を測定した。図１にエンドセリン濃度と発光量
との関係を示したが、増感剤溶液を第一番目に添加した
測定ｂおよびｃの発光量に比較し、測定ａは、非常に高
い発光量が得られた。
【００１５】
【発明の効果】本発明の化学発光測定方法は、発光量が
高く、高感度の測定が可能である。従って、酵素免疫測
定法、ＤＮＡプローブ法等による生体微量成分の定量・
分析等、臨床検査や臨床化学の分野で広範囲に利用でき
る。
高く、高感度の測定が可能である。従って、酵素免疫測
定法、ＤＮＡプローブ法等による生体微量成分の定量・
分析等、臨床検査や臨床化学の分野で広範囲に利用でき
る。
【図１】横軸にエンドセリン濃度、縦軸に発光量を示
し、化学発光試薬の添加方法と発光量との関係を表すグ
ラフである。なお、縦軸において、１カウントは１．２
×１０-16Ｗの発光量である。
し、化学発光試薬の添加方法と発光量との関係を表すグ
ラフである。なお、縦軸において、１カウントは１．２
×１０-16Ｗの発光量である。
Claims (3)
- 【請求項１】 酵素としてペルオキシダーゼを用い、化
学発光基質、酸化剤及び増感剤を用いる化学発光反応に
より、酵素の活性を検出・定量する測定方法であって、
ペルオキシダーゼを含む反応系に、酸化剤、増感
剤、化学発光基質の順に添加することを特徴とする化
学発光測定方法。 - 【請求項２】 化学発光基質がルミノール類である請求
項１記載の化学発光測定方法。 - 【請求項３】 酸化剤が過酸化水素である請求項１又は
２記載の化学発光測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13705894A JPH085560A (ja) | 1994-06-20 | 1994-06-20 | 化学発光測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13705894A JPH085560A (ja) | 1994-06-20 | 1994-06-20 | 化学発光測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH085560A true JPH085560A (ja) | 1996-01-12 |
Family
ID=15189909
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13705894A Pending JPH085560A (ja) | 1994-06-20 | 1994-06-20 | 化学発光測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH085560A (ja) |
-
1994
- 1994-06-20 JP JP13705894A patent/JPH085560A/ja active Pending
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