JP2002323495A - 標識物としてパーオキシダーゼを用いる化学発光分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 従来法よりも更に感度の高い化学発光分析方
法を開発すること目的とする。 【解決手段】 増感剤の存在下に、パーオキシダーゼで
標識した分析対象物質と、ルミノール及び過酸化水素を
反応させ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析
方法において、反応液中の発光量を検出・測定する際、
反応液に非イオン性界面活性剤、あるいは脱脂乳及び／
又は卵白アルブミンを存存させる、化学発光分析方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、標識物としてパー
オキシダーゼを用いる化学発光分析方法に関するもの
で、生体の微量成分の分析、疾患の診断等に利用でき
る。

【０００２】

【従来の技術】分析対象物質を感度よく検出・測定する
方法としては、その物質に特異的に結合する抗体等の特
異結合試薬（予め、パーオキシダーゼ等の酵素で標識し
ておく場合が多い）を検体と反応させ、引き続いて標識
物であるパーオキシダーゼ等の酵素の触媒反応により生
じる信号を検出・測定する方法（いわゆる、酵素免疫測
定法等）が知られている。また、この酵素免疫測定法に
は、一抗体法、二抗体法、サンドイッチ法、ホモジーニ
アス法、ヘテロジーニアス法等、種々の改良法又は変法
が知られている。

【０００３】パーオキシダーゼ等の酵素の触媒反応で生
成するシグナルを効率よく測定する方法として、パーオ
キシダーゼにより触媒されるルミノール／過酸化水素の
化学発光を測定する方法があり、この場合しばしば、ル
ミノールの一電子酸化を助けるラジカル安定化剤が増感
剤として用いられる（Methods in Enzymology,Vol.133,
p.331-353,1986；特開平２−２９１２９９号公報）。

【０００４】一方、パーオキシダーゼの活性はポリオキ
シエチレンエーテル類の添加により増大することも知ら
れており（Clinica Chimica Acta, 109, 177-181, 198
1; J.Clin. Chem. Clin. Biochem., 19, 435-439, 198
1）、また酵素免疫測定法において緩衝液中にポリオキ
シエチレンエーテル類を含有させ、Ｓ／Ｎ比もしくは測
定感度を高める方法も提案されている（特表平２−５０
３０２９号公報）。

【０００５】また従来、担体や抗体（もしくは抗原）固
定化担体の非特異的反応をブロックする目的で、担体や
抗体（もしくは抗原）固定化担体をアルブミン、乳蛋白
質、卵白アルブミン等の蛋白質で処理することは知られ
ている（特開平１−２１７２６６号公報、特開平１−２
２４６６５号公報）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】分析対象物質が生体の
超微量物質等である場合には、何よりも更に感度の高い
方法の開発が望まれている。本発明は、従来法よりも更
に感度の高い方法を開発すること目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、感度の高
い方法を開発するべく、ルミノールの一電子酸化を容易
にする増感剤の存在下にパーオキシダーゼを用い、ルミ
ノール／過酸化水素系で反応を行う化学発光分析を種々
検討したところ、反応液に第２級アルコールポリエトキ
シレートを存在させると、パーオキシダーゼの活性（シ
グナル）が増大し、試薬ブランク（ノイズ）が低下して
Ｓ／Ｎ比が向上すること、並びに反応液に第２級直鎖ア
ルコールポリエトキシレートとともに脱脂乳及び／又は
卵白アルブミンを共存させると、両者の効果が相乗的も
しくは相加的に働いて、Ｓ／Ｎ比が大幅に向上すること
を見出し、本発明を完成した。

【０００８】すなわち、本発明は下記の（１）及び
（２）に関する。

【０００９】（１）増感剤の存在下に、パーオキシダー
ゼで標識した分析対象物質と、ルミノール及び過酸化水
素を反応させ、生じた発光量を検出・測定する化学発光
分析方法において、反応液中の発光量を検出・測定する
際、反応液に第２級アルコールポリエトキシレートを存
在させる、化学発光分析方法。

【００１０】（２）増感剤の存在下に、パーオキシダー
ゼで標識した分析対象物質と、ルミノール及び過酸化水
素を反応させ、生じた発光量を検出・測定する化学発光
分析方法において、反応液中の発光量を検出・測定する
際、反応液に第２級アルコールポリエトキシレートとと
もに脱脂乳及び／又は卵白アルブミンを存存させる、化
学発光分析方法。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明に用いる第２級アルコール
ポリエトキシレートは、化１

【化１】 （化１中、Ｒ^１及びＲ^２は、同じであっても異なっても
よい飽和脂肪族アルキル基、ｎは１以上の整数である）
で表される分枝アルキルポリオキシエチレンエーテルで
ある。

【００１２】このような第２級アルコールポリエトキシ
レートとしては、旭電化工業（株）製「アデカトール
ＳＯ シリーズ」があり、アデカトール ＳＯ−８０、ア
デカトール ＳＯ−１０５、アデカトール ＳＯ−１２
０、アデカトール ＳＯ−１３５、アデカトール ＳＯ−
１４５、アデカトール ＳＯ−１６０等が使用できる。

【００１３】これら第２級アルコールポリエトキシレー
トは、反応に用いる緩衝液又は反応液に含有させる。そ
の使用量は、少なくとも化学発光のＳ／Ｎ比を向上させ
る量で、通常、０．０１〜１０重量％の範囲、好ましく
は０．０２〜２重量％の範囲で用いる。使用量が０．０
１重量％未満であると化学発光のＳ／Ｎ比を向上させる
程度が低く、１０重量％を超えると液の粘性が大きくな
り、試薬の均一な混合が困難となる。なお、以下本明細
書で単に％とあるのは、特に断わらない限り重量％を意
味する。

【００１４】本発明における化学発光分析は、増感剤の
存在下に、標識物であるパーオキシダーゼとルミノール
及び過酸化水素を反応させ、生じた発光を検出・測定す
る分析法であれば特に限定するものではなく、一抗体免
疫分析法、二抗体免疫分析法、競合分析法、サンドイッ
チ法、ホモジーニアス法、ヘテロジーニアス法、ウェス
ターン分析法、ＤＮＡプローブ法等の各種分析法に利用
できるが、特に、次のような固相サンドイッチ法に好適
に用いられる。以下、固相サンドイッチ法の手順等を説
明する。

【００１５】手順： (1) 分析対象物質の特定部位に結合できる第１の結合試
薬（例えば、第１抗体）を固相担体に固定して第１結合
試薬固定化担体とする。

【００１６】(2) 非特異的結合を防止するため、予めタ
ンパク質で処理（ブロッキング処理）した第１結合試薬
固定化担体に、検体を直接又は水性溶媒とともに加え、
インキュベートし、第１結合試薬固定化担体／分析対象
物質の複合体を形成させる。

【００１７】(3) 洗浄液で洗浄する。

【００１８】(4) これに、分析対象物質の他の特定部位
に結合でき、かつパーオキシダーゼで標識された第２の
結合試薬（例えば、第２抗体）を水性溶媒とともに加
え、第１結合試薬固定化担体／分析対象物質／パーオキ
シダーゼ標識化第２結合試薬の複合体を形成させる。

【００１９】(5) 洗浄液で洗浄する。

【００２０】(6) 水性溶媒中、ルミノール、過酸化水素
及び増感剤、並びに第２級アルコールポリエトキシレー
トを加える。

【００２１】(7) 生じる発光量を測定する；固相担体に
固定する第１の結合試薬は、分析対象物質が抗原となり
うるようなものの場合は抗体（ポリクローナル抗体、モ
ノクローナル抗体、又は抗体断片等）が好適に用いら
れ、分析対象物質が核酸である場合は、それに相補する
（１本鎖の）核酸又は核酸断片が好適に用いられる。

【００２２】パーオキシダーゼで標識される第２の結合
試薬は、分析対象物質が抗原となりうるようなものか核
酸か等により、第１の結合試薬が結合する部位とは異な
る部位で分析対象物質に結合できる、抗体又は核酸が用
いられる。

【００２３】第２の結合試薬をパーオキシダーゼで標識
するには、マレイミド・ヒンジ法、サクシンイミド法等
によりパーオキシダーゼを直接標識するか、第２の結合
試薬にビオチニル基等の化学基を有せしめたのち、これ
と反応するアビジン等の化学基を有するパーオキシダー
ゼを反応させ、間接的に標識すればよい。

【００２４】第２の結合試薬を標識するパーオキシダー
ゼとしては、西洋ワサビ由来の塩基性アイソザイムが好
適である。塩基性アイソザイムにはＢ、Ｃ、Ｄ及びＥの
型が知られているが、これらの中ではＣ型が最も好まし
い。

【００２５】用いる固相担体としては、通常、マイクロ
タイタプレートが好適である。このようなマイクロタイ
タプレートとしては、ブラックモジュールプレート（Ｎ
ｕｎｃ社製）、マイクロフルオロプレート黒（ダイナテ
ク社製）、マイクロフルオロリモーバウェル黒（ダイナ
テク社製）等がある。場合によっては、隣接ウェルから
の迷光を防止する白色系のマイクロタイタプレートを使
用することもできる。このようなマイクロタイタプレー
トとしては白色顔料を含む、マイクロフルオロプレート
白（ダイナテク社製）、マイクロフルオロリモーバウェ
ル白（ダイナテク社製）、あるいは白色プレート（住友
ベークライト社製）等がある。

【００２６】発光反応に用いられるルミノールは、通常
入手できる試薬グレードのものには製造原料であるヒド
ラジン及び硫化物イオンが混入している場合が多いの
で、再結晶を繰り返し、精製したものを用いる。

【００２７】本発明に用いられる増感剤は、ルミノール
の一電子酸化を助けて増感作用を有するもので、４−ヨ
ードフェノール、４−ブロモフェノール、４−クロロフ
ェノール、４−フェニルフェノール、２−クロロ−４−
フェニルフェノール、４−（２'−チエニル）フェノー
ル、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、４−〔４'−
（２'−メチル）チアゾリル〕フェノール、４−〔２'−
（４'−メチル）チアゾリル〕フェノール、４−（２'−
ベンゾチアゾリル）フェノール、３−（１０−フェノチ
アジル）−ｎ−プロピル−スルホン酸塩等がある。

【００２８】これらの増感剤の存在下にパーオキシダー
ゼの触媒作用でルミノール／過酸化水素の発光反応を行
うと、増感剤が増感ラジカルとなり、これがルミノール
と反応し発光する。

【００２９】反応液の溶媒は通常、水性溶媒を用いる。
水性溶媒には、水又はリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グ
ッド緩衝液等の緩衝液等がある。これら緩衝液のｐＨは
通常、５〜１２、好ましくは７〜１１とする。ｐＨが５
未満であると、パーオキシダーゼの最適ｐＨから外れて
発光量が弱くなり、ｐＨが１２を超えると、パーオキシ
ダーゼ活性に依存しない発光（ノイズ）が強くなる。

【００３０】本発明で用いられる脱脂乳は、脂肪分を除
いたミルクのことで、別名、脱脂粉乳、スキムミルク等
とも呼ばれる。これは市販品、例えば、「MILK DILUENT
/BLOCKING SOLUTION」（ＫＰＬ社製、コード番号：50-8
2-01）、「ブロックエース」（大日本製薬製、コード番
号：UK-B25）、「ブロックエース粉末」（大日本製薬
製、コード番号：UK-B80）等が容易に入手できる。

【００３１】また、本発明で用いられる卵白アルブミン
は、卵白から分離される分子量４万５千、等電点４．６
のタンパク質で、これについても市販品、例えば、「ア
ルブミン、卵白、５回結晶」（生化学工業社製、コード
番号：250440）、「オボアルブミン」（太陽化学社製、
コード番号：300-00711）、「アルブミン、卵製」（和
光純薬工業社製、コード番号：018-09882）、「Albumin
chicken egg」（シグマ社製、コード番号：A7641）等
が容易に入手できる。

【００３２】これら脱脂乳又は卵白アルブミンの使用濃
度は、それぞれ、少なくともＳ／Ｎ比が向上する濃度と
する。通常、その濃度はそれぞれ、反応液の最終濃度で
０．０１〜０．５％、好ましくは０．０２〜０．２％の
範囲である。濃度が０．０１％未満ではＳ／Ｎ比を向上
させる効果が少なく、０．５％を超えると特異的発光反
応を抑えるため好ましくない。

【００３３】反応液には、操作性、安定性等の性能を上
げるために、他の添加物、例えば、マンニトール、ソル
ビトール等の糖アルコール等を添加してもよい。

【００３４】以下に実験例を示す。

【００３５】

【実施例】実験例１ ４−［４'−（２'−メチル）チア
ゾリル］フェノール存在下の化学発光反応における第２
級アルコールポリエトキシレートの添加効果 化学発光反応（無添加対照）は以下のようにして行っ
た。すなわち、ブラックモジュールプレート（Ｎｕｎｃ
社製，４７５５１５）に、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）
標識化抗エンドセリン抗体（ヤマサ醤油社製、ＭＣＡ
ＥＴ−０２）の１／１０^５希釈液〔希釈用緩衝液として
５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）を使
用〕１００μｌを注入し、次いで２ｍＭ ４−［４'−
（２'−メチル）チアゾリル］フェノールのジメチルス
ルフォキシド溶液８μｌ、４ｍＭ過酸化水素含有の５０
ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０）５０μｌ及び
２０ｍＭルミノール５０μlを添加し、ルミノメータ
（コロナ電気社製、MLR-100型）で１０分後の発光量を
測光し、シグナル（Ｓ）とした（測光条件：Response 6
4、Sense Auto）。また、ＰＯＤ標識化抗エンドセリン
抗体の１／１０^５希釈液の代わりに、５０ｍＭホウ酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）を用い同様に操作して
発光量を測光し、これをノイズ（Ｎ）とした。

【００３６】第２級アルコールポリエトキシレートの添
加試験は、使用するＰＯＤ標識化抗エンドセリン抗体希
釈用５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）
中に、予めアデカトール ＳＯ−１３５（旭電化工業
製）を０．１重量％含有させたほかは、上記と同様に操
作した。

【００３７】また、比較添加実験としてアデカトール
ＳＯ−１３５の代わりに、ポリオキシエチレンソルビタ
ンモノラウレート（和光純薬工業製、「ツィーン２
０」）を用い、同様に行った。表１に測定結果を示す。

【００３８】アデカトールＳＯ−１３５の添加では、無
添加に比べ発光のノイズが約２／３、シグナルは約１．
５倍、Ｓ／Ｎ比は２倍強となった。一方、ツィーン２０
の添加では、無添加に比べ発光ノイズの低減はみられ
ず、シグナルの若干の増加だけがみられた。

【００３９】

【表１】 ＊：添加物の濃度は、無添加を除きそれぞれの成分の濃
度が０．１％である（以下、実験例２〜９も同じ）。

【００４０】実験例２ ４−［４'−（２'−メチル）チ
アゾリル］フェノール存在下の化学発光反応における種
々の非イオン性界面活性剤の添加効果 非イオン性界面活性剤として第２級アルコールポリエト
キシレート（アデカトール ＳＯ−１３５）のほか、種
々のものを用い、実験例１と同様に試験した。結果を表
２に示す。

【００４１】

【表２】 Ｓ／Ｎを改善する効果の高い順は、アデカトール ＳＯ
−１３５＞アデカトール ＮＰ−６９５＞アデカトール
ＮＰ−７００＞アデカトール ＬＯ−９＞アデカトー
ル ＰＣ−１０＞ツィーン２０であった（表２）。

【００４２】実験例３ ４−［２'−（４'−メチル）チ
アゾリル］フェノール存在下の化学発光反応における第
２級アルコールポリエトキシレートの添加効果 増感剤としての２ｍＭの４−［４'−（２'−メチル）チ
アゾリル］フェノールの代わりに２０ｍＭの４−［２'
−（４'−メチル）チアゾリル］フェノールを用いたほ
かは、実験例１と同様に行った。結果を表３に示した。

【００４３】

【表３】 実験例４ ４−（２'−チエニル）フェノール存在下の
化学発光反応における第２級アルコールポリエトキシレ
ートの添加効果 増感剤としての２ｍＭの４−［４'−（２'−メチル）チ
アゾリル］フェノールの代わりに１ｍＭの４−（２'−
チエニル）フェノールを用いたほかは、実験例１と同様
に行った。結果を表４に示した。

【００４４】

【表４】 実験例５ ３−（１０−フェノチアジル）−ｎ−プロピ
ル−スルホン酸塩存在下の化学発光反応における第２級
アルコールポリエトキシレートの添加効果 増感剤としての２ｍＭの４−［４'−（２'−メチル）チ
アゾリル］フェノールの代わりに２０ｍＭの３−（１０
−フェノチアジル）−ｎ−プロピル−スルホン酸塩を用
いたほかは、実験例１と同様に行った。結果を表５に示
す。

【００４５】

【表５】 実験例６ ４−［４'−（２'−メチル）チアゾリル］フ
ェノール存在下の化学発光反応における、第２級アルコ
ールポリエトキシレート及び脱脂乳の共存効果 添加剤無添加の試験（無添加対照）は以下のように操作
した。

【００４６】ブラックモジュールプレートに、ペルオキ
シダーゼ（ＰＯＤ）標識化抗エンドセリン抗体の１／１
０^５希釈液〔希釈用緩衝液として５０ｍＭホウ酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ１０．０）を使用〕１００μｌを注入
し、次いで２ｍＭ ４−［４'−（２'−メチル）チアゾ
リル］フェノールのジメチルスルフォキシド溶液８μ
ｌ、４ｍＭ過酸化水素含有の５０ｍＭホウ酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ１０）５０μｌ及び２０ｍＭルミノール５
０μｌを添加し、ルミノメータで１０分後の発光量を測
光し、シグナル（Ｓ）とした。ノイズ（Ｎ）の測定は、
ＰＯＤ標識化抗エンドセリン抗体の１／１０^５希釈液の
代わりに、５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１
０．０）を使用した。

【００４７】第２級アルコールポリエトキシレート（ア
デカトール ＳＯ−１３５）、脱脂乳及びその両者の添
加試験は、使用するＰＯＤ標識化抗エンドセリン抗体希
釈用５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）
中に、予めそれぞれ０．１重量％含有させたほかは、上
記と同様にして行った。結果を表６に示す。なお、脱脂
乳は「MILK DILUENT/BLOCKING SOLUTION」（ＫＰＬ社
製、コード番号：50-82-01）を使用した（以下の実験例
７〜９及び実施例１〜３において用いた脱脂乳も同
じ）。

【００４８】

【表６】 アデカトール ＳＯ−１３５及び脱脂乳の両者の添加で
は、Ｓ／Ｎ比は１５．９となり、アデカトール ＳＯ−
１３５の単独添加の場合（Ｓ／Ｎ比＝２．７５）又は脱
脂乳の単独添加の場合（Ｓ／Ｎ比＝１２．２）よりも更
に改善された（表６）。

【００４９】実験例７ ４−［２'−（４'−メチル）チ
アゾリル］フェノール存在下の化学発光反応における、
第２級アルコールポリエトキシレート及び脱脂乳の共存
効果 増感剤としての２ｍＭの４−［４'−（２'−メチル）チ
アゾリル］フェノールの代わりに２０ｍＭの４−［２'
−（４'−メチル）チアゾリル］フェノールを用い、実
験例６と同様にして行った。結果を表７に示す。

【００５０】

【表７】 実験例８ ３−（１０−フェノチアジル）−ｎ−プロピ
ル−スルホン酸塩存在下の化学発光反応における、第２
級アルコールポリエトキシレート及び脱脂乳の共存効果 増感剤としての２ｍＭの４−［４'−（２'−メチル）チ
アゾリル］フェノールの代わりに２０ｍＭの３−（１０
−フェノチアジル）−ｎ−プロピル−スルホン酸塩を用
いたほかは、実験例６と同様にして行った。結果を表８
に示す。

【００５１】

【表８】 実験例９ ｐ−ヨードフェノール存在下の化学発光反応
における、第２級アルコールポリエトキシレート及び脱
脂乳の共存効果 増感剤としてｐ−ヨードフェノールを用いたほかは、実
験例６と同様にして行った。結果を表９に示す。

【００５２】

【表９】 実施例１ エンドセリン−１の検量線（その１） 標準となるエンドセリン−１（ＥＴ−１と略す。ヒト由
来、ペプチド研究所製、コード番号４１９８−ｓ）を
０．１％ツィーン２０及び０．１％脱脂乳含有ダルベッ
コリン酸緩衝生理食塩液（以下、希釈用緩衝液とい
う。）で希釈し、それぞれ２、５、１０、２０及び４０
ｐｇ／ｍｌの濃度のエンドセリン−１標準溶液を作成し
た。

【００５３】予め、抗エンドセリン抗体（免疫生物研究
所社製、抗エンドセリン^{１５−２１}特異的抗体、コード
番号：１６１５５）を５０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ
７．０）で希釈して５μｇ／ｍｌとし、ブラックモジュ
ールプレート（ヌンク社製、コード番号４７５５１５）
の各ウェルに２００μｌずつ分注し、４℃で一晩放置し
て、抗体をプレートのウェルに吸着させた。イオン交換
蒸留水で２回洗浄後、ウェルに０．５％脱脂乳４００μ
ｌを加え、３７℃で６時間保温し（ブロッキング処
理）、その後０．１％ツイーン２０含有カルシウムフリ
ーダルベッコ燐酸緩衝生理食塩液で３回洗浄して、抗体
固定化プレートとした。

【００５４】先に準備したエンドセリン−１の標準溶液
それぞれ２００μｌずつをプレートのウェルにとり、室
温で一晩放置した。その後、０．１％ツィーン２０含有
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩液（以下、洗浄用緩衝液
という。）で１０回洗浄し、希釈用緩衝液で２μｇ／ｍ
ｌに調整したパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識化抗エン
ドセリン−１抗体（免疫生物研究所社製、コード番号１
６１６５）２００μｌずつを各ウェルに加え、３７℃で
２時間インキュベートした。洗浄用緩衝液で１０回洗浄
後、各ウェルに順次、アデカトールＳＯ−１３５を０．
１％含む２ｍＭ過酸化水素含有５０ｍＭ（ｐＨ１０）ホ
ウ酸ナトリウム緩衝液（以下、発光基質液Ａという。）
１００μｌ、次いで２０ｍＭルミノールと０．３２ｍＭ
４−［４'−（２'−メチル）チアゾリル］フェノール
含有５０ｍＭ（ｐＨ１０）ホウ酸ナトリウム緩衝液との
１：１（容量比）混合液（以下、発光基質液Ｂとい
う。）１００μｌを加えた。その１０分後に、ルミノメ
ータで発光量を測光した。なお試薬ブランクは、エンド
セリン−１の標準溶液の代わりに希釈用緩衝液を同じ容
量とり、同様に操作したものとした。横軸にエンドセリ
ン−１の濃度をとり、縦軸に発光量（ルミカウント）を
とり、グラフにプロットしてエンドセリン−１の検量線
とした（図１中の１）。

【００５５】また、発光基質液Ａとして２ｍＭ過酸化水
素含有５０ｍＭ（ｐＨ１０）ホウ酸ナトリウム緩衝液
（アデカトールＳＯ−１３５及び脱脂乳のいずれもに不
含）を用い、同様に操作して、これを比較対照とした。

【００５６】実施例２ エンドセリン−１の検量線（そ
の２） 発光基質液Ａとして、０．１％アデカトールＳＯ−１３
５及び０．１％脱脂乳を含む２ｍＭ過酸化水素含有５０
ｍＭ（ｐＨ１０）ホウ酸ナトリウム緩衝液を用いたほか
は、実施例１と同様にしてエンドセリン−１の検量線を
作成した（図１中の２）。

【００５７】実施例１及び実施例２の結果（図１）か
ら、発光反応時にアデカトールＳＯ−１３５が存在する
とき、特にアデカトールＳＯ−１３５及び脱脂乳の両者
が共存するとき、エンドセリン−１の検量線の傾斜が大
きく、測定感度が高いことが分かる。

【００５８】実施例３ 健常人の血漿中のエンドセリン
−１の測定 標準となるエンドセリン−１（ペプチド研究所製、コー
ド番号４１９８−ｓ）をエンドセリン−１不含血漿で希
釈し、それぞれ２、５、１０、２０及び４０ｐｇ／ｍｌ
の濃度のエンドセリン−１標準溶液を作成した。

【００５９】上記エンドセリン−１標準溶液並びに検体
（健常人の血漿：６体）について、実施例２と同様にし
て操作し、発光量を求めた。エンドセリン−１標準溶液
の発光量（検量線）から、検体のエンドセリン−１の濃
度を求めた。

【００６０】

【表１０】

【００６１】

【発明の効果】本発明は、パーオキシダーゼを標識物に
用いる化学発光分析における、非特異的発光反応すなわ
ち試薬ブランク（ノイズ）を低下させ、特異的発光反応
すなわちシグナル量を増強させ、Ｓ／Ｎ比（シグナル／
ノイズの比）を向上させる。したがって、測定値の信頼
性は向上する。

【００６２】また、本発明をエンドセリン−１の測定に
利用すると、血漿（又は血清）の濃縮等の前処理なく、
直接、定量できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】エンドセリン−１の検量線を示すグラフであ
る。

【符号の説明】

１…０．１％アデカトールＳＯ−１３５を含む発光基質
液Ａを用いた場合の検量線（実施例１）。 ２…０．１％アデカトールＳＯ−１３５及び０．１％脱
脂乳を含む発光基質液Ａを用いた場合の検量線（実施例
２）。

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【手続補正書】

【提出日】平成１４年５月１７日（２００２．５．１
７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４０

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４０】実験例２ ４−［４'−（２'−メチル）チ
アゾリル］フェノール存在下の化学発光反応における種
々の非イオン性界面活性剤の添加効果 非イオン性界面活性剤として第２級アルコールエトキシ
レート（アデカトールＳＯ−１３５）のほか、種々のも
のを用い、実験例１と同様に試験した。使用した非イオ
ン性界面活性剤であるアデカトール（商品名、旭電化社
製）のうち、アデカトール ＬＯシリーズ（アデカトー
ル ＬＯ−９）は、第１級アルコールエトキシレートで
あり、アデカトール ＮＰシリーズ（アデカトール ＮＰ
−６９５およびＮＰ−７００）はノニルフェノールエト
キシレートであり、さらに、アデカトール ＰＣシリー
ズ（アデカトール ＰＣ−１０）は多核フェノールエト
キシレートである。また、ツィーン２０（ポリオキシエ
チレンソルビタンモノラウレート）は、ポリオキシエチ
レンソルビタン脂肪酸エステルである。結果を表２に示
す。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】増感剤の存在下に、パーオキシダーゼで標
   識した分析対象物質と、ルミノール及び過酸化水素を反
   応させ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析方
   法において、 反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液に非イオ
   ン性界面活性剤を存在させる、化学発光分析方法。
2. 【請求項２】増感剤の存在下に、パーオキシダーゼで標
   識した分析対象物質と、ルミノール及び過酸化水素を反
   応させ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析方
   法において、 反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液に脱脂乳
   及び／又は卵白アルブミンを存在させる、化学発光分析
   方法。
3. 【請求項３】増感剤の存在下に、パーオキシダーゼで標
   識した分析対象物質と、ルミノール及び過酸化水素を反
   応させ、生じた発光量を検出・測定する化学発光分析方
   法において、 反応液中の発光量を検出・測定する際、反応液に非イオ
   ン性界面活性剤とともに脱脂乳及び／又は卵白アルブミ
   ンを存存させる、化学発光分析方法。
4. 【請求項４】非イオン性界面活性剤が、第１級アルコー
   ルエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、
   多核フェノールエトキシレート、または、ポリオキシエ
   チレンソルビタン脂肪酸エステルから選択される非イオ
   ン性界面活性剤である請求項１または請求項３記載の化
   学発光分析方法。
5. 【請求項５】反応液中の発光量を検出・測定する際、さ
   らに、反応液に糖アルコールを存在させる請求項１から
   請求項４のいずれかに記載の化学発光分析方法。
6. 【請求項６】増感剤と、ルミノールと、過酸化水素と、
   非イオン性界面活性剤とを含む、パーオキシダーゼで標
   識された分析対象物質を測定するための化学発光分析用
   試薬。
7. 【請求項７】増感剤と、ルミノールと、過酸化水素と、
   脱脂乳及び／又は卵白アルブミンとを含む、パーオキシ
   ダーゼで標識された分析対象物質を測定するための化学
   発光分析用試薬。
8. 【請求項８】増感剤と、ルミノールと、過酸化水素と、
   非イオン性界面活性剤と、脱脂乳及び／又は卵白アルブ
   ミンとを含む、パーオキシダーゼで標識された分析対象
   物質を測定するための化学発光分析用試薬。
9. 【請求項９】非イオン性界面活性剤が、第１級アルコー
   ルエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、
   多核フェノールエトキシレート、または、ポリオキシエ
   チレンソルビタン脂肪酸エステルから選択される非イオ
   ン性界面活性剤である請求項６または請求項８記載の化
   学発光分析用試薬。
10. 【請求項１０】さらに、糖アルコールを含む、請求項６
    から請求項９のいずれかに記載の化学発光分析用試薬。