JPS58140641A - 免疫定量法 - Google Patents
免疫定量法Info
- Publication number
- JPS58140641A JPS58140641A JP2274582A JP2274582A JPS58140641A JP S58140641 A JPS58140641 A JP S58140641A JP 2274582 A JP2274582 A JP 2274582A JP 2274582 A JP2274582 A JP 2274582A JP S58140641 A JPS58140641 A JP S58140641A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- antigen
- antibodies
- different
- labeled antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
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- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
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- Engineering & Computer Science (AREA)
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- Biomedical Technology (AREA)
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
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- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、多成分を同時に定量できる免疫定量法に係り
、特に化学発光物質を標識化合物として用いる化学発光
免疫定量法に好適な定量方法に関する。
、特に化学発光物質を標識化合物として用いる化学発光
免疫定量法に好適な定量方法に関する。
免疫学的手法を用いた微量生体成分の分析は。
これまで精力的に研究され、放射性同位元素を用いたラ
ジオイムノアッセイ（ＲＩＡ） （Ｒ，Ｙａｌ １ｏ
ｎａｎｄ Ｓ、Ｂｅｒｓｏｎ、 Ｎａｔｕｒｅ、 １８
４，１６４８ （１９５９目や酵素全利用したエンザイ
ムイムノアツセイ（Ｅ ＩＡ ） （Ｓ−Ａ ｖｒ
ａｆｆ１６ ａ８ ａ” Ｂ−Ｇｕｉ’ ｂｅｒ’ ＊
Ｃ−ＲＡｃａｄ、 ＳＣｉ、 、 ８ｅｒＤ、 ２７
３．２７０５ （１９７１目２＞Ｅ現在実用化されてい
る。その他、スピンラベル（Ｒ，、１ｅｕｔｅ、 ｅｔ
ａｌ、 、 Ｎａｔｕｒｅ、 Ｎｅｗ Ｂｉｏ１１２
３６．９３（１９７２目螢光性色素（Ｅ、５ｏｉｎｉ
’２ｎｄ ｉ、ｌ（ｅｍｍｉｌａ、 Ｃｌ１ｎ、Ｃｈ
ｅｍ、、 ２５．３５３（１９７９０などを標識化合物
として利用する研究も行なわれている。
ジオイムノアッセイ（ＲＩＡ） （Ｒ，Ｙａｌ １ｏ
ｎａｎｄ Ｓ、Ｂｅｒｓｏｎ、 Ｎａｔｕｒｅ、 １８
４，１６４８ （１９５９目や酵素全利用したエンザイ
ムイムノアツセイ（Ｅ ＩＡ ） （Ｓ−Ａ ｖｒ
ａｆｆ１６ ａ８ ａ” Ｂ−Ｇｕｉ’ ｂｅｒ’ ＊
Ｃ−ＲＡｃａｄ、 ＳＣｉ、 、 ８ｅｒＤ、 ２７
３．２７０５ （１９７１目２＞Ｅ現在実用化されてい
る。その他、スピンラベル（Ｒ，、１ｅｕｔｅ、 ｅｔ
ａｌ、 、 Ｎａｔｕｒｅ、 Ｎｅｗ Ｂｉｏ１１２
３６．９３（１９７２目螢光性色素（Ｅ、５ｏｉｎｉ
’２ｎｄ ｉ、ｌ（ｅｍｍｉｌａ、 Ｃｌ１ｎ、Ｃｈ
ｅｍ、、 ２５．３５３（１９７９０などを標識化合物
として利用する研究も行なわれている。
一方、近年特に注目されてきたのが化学発光物質を利用
するケミルミネッセンスイムノアッセイ（ＣＬＩＡ）
である。たとえば、ヒトＩｇＧにルミノールを標識し
てヒ）ＩｇＧｆ、測定したバーシュ（Ｌ、 ８． Ｈｅ
ｒｓｈ ）等の報告（Ａ ｕＢ ｌ 、 Ｂ ｉ ＯＣ
ｈｅｒｒ＋、 。
するケミルミネッセンスイムノアッセイ（ＣＬＩＡ）
である。たとえば、ヒトＩｇＧにルミノールを標識し
てヒ）ＩｇＧｆ、測定したバーシュ（Ｌ、 ８． Ｈｅ
ｒｓｈ ）等の報告（Ａ ｕＢ ｌ 、 Ｂ ｉ ＯＣ
ｈｅｒｒ＋、 。
９３．２６７（１９７９目、抗ウサギＩｇＧにルミノー
ルを標識してウサギＩ ｇＧｔ−測定したシンプソン（
Ｊ、 Ｓ、 Ａ、 Ｓ ｉｍｐｉｏｎ ）等の報告（Ｎ
ｘｔｕｒｅ、 ２７９゜６４６（１９７９３）、テスト
ステロ／・アルブミンにルミノールを標識してテストス
テロンを測定したプラット（Ｊ、Ｊ、 ＰｒａｔｔＪ
等の報告（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ。
ルを標識してウサギＩ ｇＧｔ−測定したシンプソン（
Ｊ、 Ｓ、 Ａ、 Ｓ ｉｍｐｉｏｎ ）等の報告（Ｎ
ｘｔｕｒｅ、 ２７９゜６４６（１９７９３）、テスト
ステロ／・アルブミンにルミノールを標識してテストス
テロンを測定したプラット（Ｊ、Ｊ、 ＰｒａｔｔＪ
等の報告（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ。
Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１，１７９（１９７８））、Ｔ、に
イソルミノールを標識してＴ４ｔ−測定したシュレーダ
ー（ｌ（、Ｒ，，５ｉｈｒｏｅｄｅｒ Ｊ等の報告（Ｊ
、 Ｉｍｍｕｎｏｌ。
イソルミノールを標識してＴ４ｔ−測定したシュレーダ
ー（ｌ（、Ｒ，，５ｉｈｒｏｅｄｅｒ Ｊ等の報告（Ｊ
、 Ｉｍｍｕｎｏｌ。
Ｍｅｔｈｏｄｓ、 ２５．２７５ （１９７９０等が知
られテいル。
られテいル。
しかし、これらの報告はすべて、原理的なものであム単
−成分のみの定量を行なうものである。
−成分のみの定量を行なうものである。
免疫定量法の応用分野の１つである臨床検査においては
、同時に多成分の定量を行なう必要が充分あり、これを
行なうには、所定の単一操作を必要な成分の数だけ繰り
返さなければならなく、労力と、多くの被検溶液を要す
る。
、同時に多成分の定量を行なう必要が充分あり、これを
行なうには、所定の単一操作を必要な成分の数だけ繰り
返さなければならなく、労力と、多くの被検溶液を要す
る。
免疫定量法は、特に生体成分の微量分析に有効な分析法
の１つであるが、いくつかの成分について定量を行なう
には、同一操作を繰９返し行なう必要があり不便である
。本発明は、このような多成分の分析を１回の操作で行
なえるようにしたもので、特に臨床検査法としての簡便
さを図るものである。
の１つであるが、いくつかの成分について定量を行なう
には、同一操作を繰９返し行なう必要があり不便である
。本発明は、このような多成分の分析を１回の操作で行
なえるようにしたもので、特に臨床検査法としての簡便
さを図るものである。
極微量生化学物質を定量する免疫定量法においては、極
微量物質を直接計測するがゎシに、計測手段に適した物
質を被測定物質と同種の抗原又はこれに対する抗体に標
識として結合させ、この標識物質を計測して、間接的に
被測定物質を定量する。標ＦＩ＆物質は、計測が簡便で
、しかも計測に関して同じ性質の物質が被測定溶液中に
含まれないことが望まれる。これまで標識物質として放
射性同位体、酵素、螢光性色素、常磁性体（スピン）お
よび化学発光物質が検討されてきている。しかし、従、
米の方法では、１回の測定に１成分のみの測定しか行な
えず、複数種の被測定成分がある場合には、その種類だ
けの回数の測定が必要であり、また、測定に要する被検
液−薇も回数分だけ必要となる。
微量物質を直接計測するがゎシに、計測手段に適した物
質を被測定物質と同種の抗原又はこれに対する抗体に標
識として結合させ、この標識物質を計測して、間接的に
被測定物質を定量する。標ＦＩ＆物質は、計測が簡便で
、しかも計測に関して同じ性質の物質が被測定溶液中に
含まれないことが望まれる。これまで標識物質として放
射性同位体、酵素、螢光性色素、常磁性体（スピン）お
よび化学発光物質が検討されてきている。しかし、従、
米の方法では、１回の測定に１成分のみの測定しか行な
えず、複数種の被測定成分がある場合には、その種類だ
けの回数の測定が必要であり、また、測定に要する被検
液−薇も回数分だけ必要となる。
本発明は、被測定成分をそれぞれ抗原とする複数種の抗
体ｔ−固泥足化た固定化抗体と、被検液とを接触１反応
させた後、洗浄する。これとは別に検出方法の異なる標
識化合物を結合した被測定成分をそれぞれ抗原とする複
数種の抗体を準備し。
体ｔ−固泥足化た固定化抗体と、被検液とを接触１反応
させた後、洗浄する。これとは別に検出方法の異なる標
識化合物を結合した被測定成分をそれぞれ抗原とする複
数種の抗体を準備し。
両者を反応させ、洗浄したのち、標識化合物に適合し次
測定方法で、それぞれの被測定成分を定量することを特
徴とするものである。
測定方法で、それぞれの被測定成分を定量することを特
徴とするものである。
この際、固定化抗体は、１つの担体に複数種の抗体を固
定しても良いし、１種類の抗体を固定した固定化抗体を
４１ａ橿混合したものでも良い。
定しても良いし、１種類の抗体を固定した固定化抗体を
４１ａ橿混合したものでも良い。
標識抗体として、たとえば発光波長の異なる化学発光物
質を用いれば、それぞれの波長で発光を測定することに
より、検出も１回で済ますことができる。
質を用いれば、それぞれの波長で発光を測定することに
より、検出も１回で済ますことができる。
尚、固定化抗体の作成、及び標識抗体の作成は公知の方
法によって行なうことができる。
法によって行なうことができる。
標識物質としてＩｆｉ、放射性物質、酵素、螢光性色素
、常磁性体（スピン）、生物発光物質および化学発光物
質が用いられる。測定方法の異なる各種標識物質の組み
合わせで、本免疫定量法を実施することが可能である。
、常磁性体（スピン）、生物発光物質および化学発光物
質が用いられる。測定方法の異なる各種標識物質の組み
合わせで、本免疫定量法を実施することが可能である。
その−例として、測定が１回で可能な１発光波長の異な
る化学発光物質を用いた例について、以下に述べる。
る化学発光物質を用いた例について、以下に述べる。
化学発光物としては、ルミノール、イソルミノール、ロ
フィン、ルシゲニン、スカトール等カｊく知られており
１％にルミノール、インルミノールについては、標識化
合物としての利用が、−すでに行なわれている（Ｓｔｍ
ｐｓｏｎ、ｅｔｇｔ、、Ｎａｔｕｒｅ。
フィン、ルシゲニン、スカトール等カｊく知られており
１％にルミノール、インルミノールについては、標識化
合物としての利用が、−すでに行なわれている（Ｓｔｍ
ｐｓｏｎ、ｅｔｇｔ、、Ｎａｔｕｒｅ。
２７９．６４６−６４７ （１９７９３等］。
化学発光物質は一般的に、フタラジド構造あるいはヒド
ラジド構造をもち、これに結合した骨格部分の構造およ
びその置換基に依存した発光波長をもつ。たとえば、次
に示す、ルミノール（１）、８−アミノ−ナフチルヒド
ラジド■、および１−ヒドロオキシアントラセン−２−
カルボヒドラジド［相］ではそれぞれ、４２６ｎｍ、５
０４ｎｍおよび６６０ｎｍＫ発光の極大をもつ。
ラジド構造をもち、これに結合した骨格部分の構造およ
びその置換基に依存した発光波長をもつ。たとえば、次
に示す、ルミノール（１）、８−アミノ−ナフチルヒド
ラジド■、および１−ヒドロオキシアントラセン−２−
カルボヒドラジド［相］ではそれぞれ、４２６ｎｍ、５
０４ｎｍおよび６６０ｎｍＫ発光の極大をもつ。
したがって、上記のような、発光系が同じで、異なる発
光波長をもつ、化学発光物質を、本発明に満足する標識
化合物として利用することができる。
光波長をもつ、化学発光物質を、本発明に満足する標識
化合物として利用することができる。
ルミノールや８−アミノナフチルヒドラジドは公知の方
法（Ｓｉｍｐｓｏｎ、 ｅｔ ａｌ 、、 Ｎ ａｔｕ
ｒｅ、 ２７９゜６４６−６４７（１９７９））で抗体
に結合できる。またｌ−ヒドロオキシアントラセン−２
−カルボヒドラジド（ｌＩＤは、７位あるいは８位にニ
トロ基を導入し、還元してアミノ化した後同様な方法で
抗体に結合できる。
法（Ｓｉｍｐｓｏｎ、 ｅｔ ａｌ 、、 Ｎ ａｔｕ
ｒｅ、 ２７９゜６４６−６４７（１９７９））で抗体
に結合できる。またｌ−ヒドロオキシアントラセン−２
−カルボヒドラジド（ｌＩＤは、７位あるいは８位にニ
トロ基を導入し、還元してアミノ化した後同様な方法で
抗体に結合できる。
以下に、ルミノールおよび８−アミツナ７チルヒドラジ
ドを標識した抗体を用いてヒトＩｇＧおよびヤギＩｇＧ
を定量した例を述べる。
ドを標識した抗体を用いてヒトＩｇＧおよびヤギＩｇＧ
を定量した例を述べる。
抗ヒト・ウサギＩ ｇ Ｇ （ＡＨＩｇＧ）および抗ヤ
ギ・ウサギＩ ｇ Ｇ （ＡＧＩｇＧ）を表面をアミン
化した粒径０．５ｍφのポリスチレンビーズに、グルタ
ルアルデヒドで固定化した。ＡＨＩｇＧ及びＡＧＩｇＧ
は等量結合させた。
ギ・ウサギＩ ｇ Ｇ （ＡＧＩｇＧ）を表面をアミン
化した粒径０．５ｍφのポリスチレンビーズに、グルタ
ルアルデヒドで固定化した。ＡＨＩｇＧ及びＡＧＩｇＧ
は等量結合させた。
一方、これと別にルミノール、および８−アミノナフチ
ルヒドラジドをジアゾ化し、それぞれＡＨＩｇＧおよび
ＡＧＩｇＧに結合させ、透析およびゲル濾過で稍製した
。
ルヒドラジドをジアゾ化し、それぞれＡＨＩｇＧおよび
ＡＧＩｇＧに結合させ、透析およびゲル濾過で稍製した
。
これと、檀々の濃度の標準ヒトＩｇＧ血清およびヤギＩ
ｇＧをそれぞれ２０μを加え、３７Ｃで４時間静かに振
とうしてから前記バッファーで洗浄し、次いでバッファ
０．５ｍｔと標識ＡＨＩｇＧおよび標識ＡＧＩｇＧｋそ
れぞれ２０μを加え、同様に振とうしてから、十分洗浄
し、ビーズ上に残存する標識ルで同様に測定した。
ｇＧをそれぞれ２０μを加え、３７Ｃで４時間静かに振
とうしてから前記バッファーで洗浄し、次いでバッファ
０．５ｍｔと標識ＡＨＩｇＧおよび標識ＡＧＩｇＧｋそ
れぞれ２０μを加え、同様に振とうしてから、十分洗浄
し、ビーズ上に残存する標識ルで同様に測定した。
測定装置の概略ｔｌ−第１図に示す。１ｃＷＩ角型石英
セル（螢光測定用］（図中ＩＪに、測定するビーズを入
れ、測光できる状態にしてから、外部から発光触媒を導
入し、発光を開始させた。触媒として１ｍＭＨ！０１１
００μｔと５μＭへミンのアルカリ溶液２ｍｌを用いた
。発生した光は、互いに直角な２方向に設けた集光レン
ズ（２および５）で果められモノクロメータ（３および
６Ｊｔｌ−通過して、フォトマル（４および７）に受光
された。それぞれの波長で得られたフォトンカウント値
を、データ処理し、ヒトＩｇＧｔおよびヤギＩｇＧ１１
ｉＪｌ出した。
セル（螢光測定用］（図中ＩＪに、測定するビーズを入
れ、測光できる状態にしてから、外部から発光触媒を導
入し、発光を開始させた。触媒として１ｍＭＨ！０１１
００μｔと５μＭへミンのアルカリ溶液２ｍｌを用いた
。発生した光は、互いに直角な２方向に設けた集光レン
ズ（２および５）で果められモノクロメータ（３および
６Ｊｔｌ−通過して、フォトマル（４および７）に受光
された。それぞれの波長で得られたフォトンカウント値
を、データ処理し、ヒトＩｇＧｔおよびヤギＩｇＧ１１
ｉＪｌ出した。
上記の方法により、１０ｎｇ／ｍ／、 のヒトＩｇＧ
およびヤギＩｇＧが容易に測定できた・上記実施例にお
いては、２成分の免疫足前について示したが、３成分以
上の定量法にも応用できることは明らかである。尚この
際、発光波長が充分に離れており、発光スペクトルが重
なりをもたない方が良いことは言うまでもないが１発光
スペクトルのすそが互いに重なり合っていても、データ
処理により分離、計測できる。
およびヤギＩｇＧが容易に測定できた・上記実施例にお
いては、２成分の免疫足前について示したが、３成分以
上の定量法にも応用できることは明らかである。尚この
際、発光波長が充分に離れており、発光スペクトルが重
なりをもたない方が良いことは言うまでもないが１発光
スペクトルのすそが互いに重なり合っていても、データ
処理により分離、計測できる。
化学発光物質以外の標識化合物を用いた場合でも、検出
波長が異なるなど検出法が異なれば、本発明を有効に適
用できることは明らかである。
波長が異なるなど検出法が異なれば、本発明を有効に適
用できることは明らかである。
本発明によれば、同時に多種類の極微量手本成分を定量
することができるので、手法およびシステムの簡略化が
行なえる。また、必要とする被検液量も、従来法で成分
数だけ分析を繰り返したのに比べて、少量ですむという
効果がある。
することができるので、手法およびシステムの簡略化が
行なえる。また、必要とする被検液量も、従来法で成分
数だけ分析を繰り返したのに比べて、少量ですむという
効果がある。
また、固定化された抗体を用いることなく、抗原の異な
る２種類以上の抗体と互いに検出法の異なる標Ｗ＆物質
を結合させ、この標識された抗体と抗原を含む被検試料
の溶液を接触させ、抗体と抗原を反応させ、未反応の抗
体をクロマトなどで分離し、反応した標識物質（２種以
上１の量を測定しても同様に多成分を同時に電量できる
。
る２種類以上の抗体と互いに検出法の異なる標Ｗ＆物質
を結合させ、この標識された抗体と抗原を含む被検試料
の溶液を接触させ、抗体と抗原を反応させ、未反応の抗
体をクロマトなどで分離し、反応した標識物質（２種以
上１の量を測定しても同様に多成分を同時に電量できる
。
第１図は、発光測定系の概略図である。
１・・・反応セル、２，５・・・集光レンズ、３，６・
・・モノクロメータ、４．７・・フォトマル。 ■ ） 図
・・モノクロメータ、４．７・・フォトマル。 ■ ） 図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、抗原の異なる２樵類以上の抗体をそれぞれ固定化し
固定化抗体を準備する工程、互いに検出法の異なる標識
物質を、上記抗体と同種の抗体にそれぞれ結合させ標識
された抗体を準備する工程、抗原を含む被検試料の溶液
を上記固定化抗体と接触させ、それぞれ対応する抗体と
反応させる工程、上記標識された抗体を、上記固定化抗
体と反応した抗原と接触させ、それぞれ対応する抗原と
反応させる工程及び上記抗原と反応した標識された抗体
の量を検出する工程を含むことを特徴とする多成分免疫
定量法。 ２、上記検出法の異なる標識物質が、互いに発光波長の
異なる化学発光物質である特許請求の範囲第１項記載の
多成分免疫定量法。 ３、抗原の異なる２４類以上の抗体と、互いに検出法の
異なる標識物質とを結合させ標識された抗体を準備する
工程、抗原を含む被検試料の溶液を上記標識された抗体
と接触させ、それぞれ対応する抗体と反応させる工程、
上記抗原と反応した標識された抗体と、未反応の標識さ
れた抗体とを分離する工程及び上記抗原と反応した標識
された抗体の量を検出する工程を含むととｔ−％徴とす
る多成分免疫定量法。 ４、上記検出法の異なる標識物質が、互いに発光波長の
異なる化学発光物質である特許請求の範囲第３項記載の
多成分免疫定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2274582A JPS58140641A (ja) | 1982-02-17 | 1982-02-17 | 免疫定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2274582A JPS58140641A (ja) | 1982-02-17 | 1982-02-17 | 免疫定量法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58140641A true JPS58140641A (ja) | 1983-08-20 |
Family
ID=12091230
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2274582A Pending JPS58140641A (ja) | 1982-02-17 | 1982-02-17 | 免疫定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58140641A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62298761A (ja) * | 1986-06-19 | 1987-12-25 | Agency Of Ind Science & Technol | 蛍光イムノアツセイ法 |
| US4743561A (en) * | 1985-03-05 | 1988-05-10 | Abbott Laboratories | Luminescent assay with a reagent to alter transmitive properties of assay solution |
| JPH03218463A (ja) * | 1989-10-09 | 1991-09-26 | Tokuyama Soda Co Ltd | 抗体固定化不溶性担体粒子 |
-
1982
- 1982-02-17 JP JP2274582A patent/JPS58140641A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4743561A (en) * | 1985-03-05 | 1988-05-10 | Abbott Laboratories | Luminescent assay with a reagent to alter transmitive properties of assay solution |
| JPS62298761A (ja) * | 1986-06-19 | 1987-12-25 | Agency Of Ind Science & Technol | 蛍光イムノアツセイ法 |
| JPH03218463A (ja) * | 1989-10-09 | 1991-09-26 | Tokuyama Soda Co Ltd | 抗体固定化不溶性担体粒子 |
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