DK161111B

DK161111B - Fluorometrisk bestemmelse

Info

Publication number: DK161111B
Application number: DK157184A
Authority: DK
Inventors: Mark Raymond Shaffar
Original assignee: Abbott Lab
Priority date: 1984-03-15
Filing date: 1984-03-15
Publication date: 1991-05-27
Also published as: DK161111C; DK157184D0; DK157184A

Description

i

DK 161111 B

Sædvanlige ikke-isotop-metoder til analyse inden for området klinisk medicinsk diagnostik indebærer spektrofotometrisk eller f1uorometrisk bestemmelse af klinisk betydningsfulde stoffer, der i det følgende omtales som ligander. Disse metoder er 5 meget følsomme og specifikke og er baseret på måling af ændringer i de optiske egenskaber, dvs. de transmitterende eller fluoroscerende egenskaber af en bestemmelsesopløsning, og som skyldes tilstedeværelse af en særlig ligand i bestemmelsesopløsningen .

10

Ved en spektrofotometrisk bestemmelse frembringer reaktion i bestemmelsesopløsningen mellem liganden, der skal bestemmes, og et reagenssystem, som er specifikt for liganden, en påviselig ændring i bestemmelsesopløsningens transmitterende egen-15 skaber. Ændringen i de transmitterende egenskaber angår den mængde lys, som absorberes eller spredes af en bestemmelsesopløsning inden for et specielt bølgelængdebånd, når en lysstråle af kendt intensitet går gennem bestemmelsesopløsningen. Ændringen i de transmitterende egenskaber af en bestemmelsesop-20 løsning måles ved at lede monokromatisk lys, der har en kendt intensitet, gennem bestemmelsesopløsningen og bestemme forholdet mellem intensiteten af det transmitterede eller spredte lys og intensiteten af det indfaldende lys. Den omstændighed, at næsten alle ligander enten absorberer energi med en bestemt 25 bølgelængde eller reagerer i en bestemmelsesopløsning med et særligt reagenssystem til frembringelse af en påviselig ændring i de transmitterende egenskaber af bestemmelsesopløsningen, har resulteret i udvikling af talrige specifikke spektro-fotometriske bestemmelser. Spektrofotometriske bestemmelser, 30 som er baseret på måling af ændringer i de transmitterende egenskaber af en bestemmelsesopløsning som et mål for en ligand i bestemmelsesopløsningen, indbefatter f.eks. bestemmel -ser, ved hvilke der er en ændring i farven af bestemmelsesopløsningen, dvs. kolorimetriske bestemmelser, og bestemmelser, 35 ved hvilke der er en ændring i uklarheden af bestemmelsesopløsningen, dvs. turbidimetriske eller nefelometriske bestemmelser. Ved en kolorimetrisk bestemmelse omtaltes ændringen i de

DK 161111B

2 transmitterende egenskaber af en bestemmelsesopløsning i almindelighed som absorbansen af bestemmelsesopløsningen og afhænger af ændringen i farven af bestemmelsesopløsningen som følge af reaktion af liganden, der skal bestemmes, og reagens-5 systemet, der er specifikt for liganden. Absorbansen af be stemmelsesopløsningen står i forbindelse med koncentrationen af liganden i bestemmelsesopløsningen. En kolorimetrisk bestemmelse anvender et kromogent reagenssystem, som er i stand til at reagere i en bestemmelsesopløsning med en særlig li-10 gand, der har interesse, til fremstilling af en påviselig ændring i de transmitterende egenskaber, specielt farven af bestemmelsesopløsningen. Talrige kromogene reagenssystemer, der er nyttige til bestemmelsen af særlige ligander, er blevet udviklet og findes i handelen. Princippet i turbidimetriske be-15 stemmelser er at bestemme den mængde lys, som spredes eller blokeres af partikel formet stof, når lys passerer gennem en bestemmelsesopløsning. Ved en turbidimetrisk bestemmelse reagerer den ligand, der har interesse, med et reagenssystem specifikt for liganden til dannelse af en suspension af partikler 20 i bestemmelsesopløsningen. Når en lysstråle af kendt intensi tet ledes gennem en bestemmelsesopløsning, blokerer eller spreder suspensionen af partikler dannet ved reaktion af liganden og reagenssystemet det indfaldende lys og reducerer derved intensiteten af lyset, som transmitteres gennem bestem-25 melsesopløsningen. Ændringen i de transmitterende egenskaber ved en turbidimetrisk bestemmelse angår faldet i intensiteten af lyset, som transmitteres gennem en bestemmelsesopløsning, og står i relation til den mængde indfaldende lys, som spredes eller blokeres af suspensionen af partikler, og afhænger af 30 antallet af partikler, der er til stede, og tværsnitsarealet af disse partikler. En nefelometrisk bestemmelse ligner en turbidimetrisk bestemmelse derved, at liganden, der har interesse, reagerer med et reagenssystem, som er specifikt for liganden, til dannelse af en suspension af partikler i bestem-35 melsesopløsningen. Ved en nefelometrisk bestemmelse står ændringen i de transmitterende egenskaber af bestemmelsesopløsningen også i relation til den mængde indfaldende lys, der

DK 161111B

3 spredes eller blokeres af en suspension af partikler, men i modsætning til en turbidimetrisk bestemmelse, hvor intensiteten af lyset transmitteret gennem bestemmeIsesopløsn i ngen måles, måles det spredte eller blokerede lys i en vinkel med det 5 indfaldende lys på bestemmelsesopløsningen. Ved en nefelome-trisk bestemmelse angår ændringen i de transmitterende egenskaber derfor forskellen i intensiteter af indfaldende lys på bestemmelsesopløsningen og lys spredt i en vinkel med det indfaldende lys. Turbidimetriske og nefe1ometri ske bestemmelser 10 anvendes til analyse af blod, urin, rygmarvsvæsker etc. til bestemmelse af sådanne ligander som proteiner, hvor der ikke er nogen sammenlignelig kolorimetrisk bestemmelse på grund af mangelen på et effektivt kromogent reagenssystem. Yoe & Klim-man i Photoelectric Chemical Analysis, bind II, Nephelometry, 15 Wiley & Sons, Inc., New York 1929, beskriver forskellige nefe-lometriske bestemmelser.

Ved den f1uorometriske bestemmelse bliver typisk en ligand i bestemmelsesopløsningen kemisk eller immunologisk omdannet til 20 et fluorescerende kompleks eller konjugat og frembringer derved en påviselig ændring i de fluorescerende egenskaber af bestemmelsesopløsningen. Ændringen i de fluorescerende egenskaber af bestemmelsesopløsningen måles ved at stimulere det fluorescerende kompleks eller konjugat med monokromatisk lys 25 af en bølgelængde inden for det fluorescerende stofs stimuleringsbølgelængde og måle intensiteten af det udsendte lys ved en bølgelængde inden for det fluorescerende stofs emissionsbølgelængdebånd. Den fluorescerende intensitet af det udsendte lys står i relation til koncentrationen af liganden. Intensi-30 teten af fluorescensen, der udsendes af bestemmelsesopløsningen, kan imidlertid hæmmes, når liganden, der skal bestemmes, danner komplekser med ikke-fluorescerende stoffer såsom proteiner eller phosphater, der findes i prøven, eller når prøven indeholdende liganden, der skal bestemmes, har tilstrækkelig 35 farve til at virke som et filter og derved reducere intensiteten af den udsendte fluorescens. Det er velkendt at for at maksimere følsomheden og specificiteten af en fluorometrisk

DK 161111 B

4 bestemmelse skal disse hæmmende faktorer, hvis de er til stede, overvindes, enten ved fjernelse af de ikke-f1uorescerende interferenser eller farveproducerende materialer før analysen, eller ved at kompensere for tilstedeværelsen af disse faktorer 5 ved at anvende en indre standard sat til en anden portion prøve og udføre hele bestemmelsesmetoden under anvendelse af den portion, der indeholder den indre standard.

US patent nr. 4.345.027 beskriver en fluorometrisk metode til 10 at måle cellemutagenese, der muliggør påvisning af mutagenese i en cellestruktur under anvendelse af en kolorimetrisk farve, som, fordi den reagerer med arter, der kun findes i de normale celler, kun farver de normale celler og ikke de unormale celler. En fluorescerende forbindelse tilføres så, som bindes til 15 alle celler, men da de to farver er valgt således, at den ko-lorimetriske farve absorberer den bølgelængde, som udsendes af den fluorescerende farve, forekommer der kun fluorescens i de unormale celler, og disse celler kan derfor påvises. Opfindelsen ifølge de amerikanske patenter løser problemet med at på-20 vise cellemangler, men den beskrevne fluorometriske metode kan ikke anvendes til forskellige prøvesystemer og kan f.eks. ikke anvendes, når man skal bestemme ligander, herunder klinisk betydningsfulde stoffer, som kan bestemmes kolorimetrisk, turbi-dimetrisk eller nefelometrisk.

25

Opfindelsen ifølge US patent nr. 4.345.027 løser heller ikke problemet om, hvorledes man kvantitativt anvender en fluorescensteknik til at måle tilstedeværelsen af ligand i en prøve med eliminering af bagggrundsf1uorescens.

30

Til forskel herfra angår den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til fluorometrisk at bestemme en ligand i en prøveopløsning, hvilken fremgangsmåde er anvendelig til flere forskellige målesystemer og kan anvendes til at bestemme ligan-35 der, herunder klinisk betydningsfulde stoffer, som kan bestemmes kolorimetrisk, turbidimetrisk eller nefelometrisk. Et formål med opfindelsen er at angive en fremgangsmåde til at be-

DK 161111B

5 stemme en ligand i en prøve, hvor intensiteten af fluorescensen, der udsendes af prøveopløsningen, står i relation til ændringen i transmissionsegenskaberne frembragt af den specifikke reaktion af liganden, som skal bestemmes, med et reagenssy-5 stem, der er i stand til at frembringe en ændring i transmissionsegenskaberne og derfor i den fluorescens, som udsendes af prøveopløsningen i nærværelse af en ligand.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan der specielt fluoro-10 metrisk bestemmes en ligand i en prøveopløsning, hvori ændringen i intensiteten er specifik og proportional med ligandkoncentrationen, og hvor virkningerne af baggrundsfluorescens kan elimineres.

15 Opfindelsen adskiller sig først og fremmest fra den kendte teknik ved at angive en fremgangsmåde til f1uoremetri sk at bestemme en ligand i en prøveopløsning, hvortil der kan anvendes et reagensmateriale, som kan udnyttes til enten spektrofotome-trisk eller fluorometrisk måling af koncentrationen af en li-20 gand i en prøveopløsning.

Opfindelsen adskiller sig også fra det, der kendes fra Clin. Chem. 25/3, 353-361 (1979). Som ovenfor nævnt har det ifølge opfindelsen vist sig, at i en prøveopløsning indeholdende en 25 ligand, et reagenssystem og et f1uoroscerende stof, resulterer ændringen i transmissionsegenskaberne inden for et bølgelængdeområde, der overlapper det fluorescerende stofs stimulerings- og/eller emissionsbølgelængde, og som skyldes reaktionen af liganden og reagenssystemet, også i en proportional æn-30 dring i intensiteten af fluorescensen, som udsendes af bestemmelsesopløsningen. Ændringen i intensiteten af fluorescensen, som udsendes af bestemmelsesopløsningen, er derfor proportional med koncentrationen af liganden. Ændringen i intensiteten af fluorescensen udsendt af en prøveopløsning indeholdende den 35 ligand, som skal bestemmes, reagenssystemet og det fluorescerende stof sammenlignet med intensiteten af fluorescensen udsendt af en prøveopløsning, der kun indeholder reagenssystemet

DK 161111 B

6 og det fluorescerende stof skyldes ændringen i transmissionsegenskaberne fremkaldt ved reaktionen mellem liganden og reagenssystemet. Der er ingen reaktion, hverken kemisk eller immunologisk, mellem det fluorescerende stof og nogen anden 5 komponent, nemlig liganden, der skal bestemmes, eller reagenssystemet i prøveopløsningen.

Det er et formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe en fremgangsmåde til f1uorometrisk at bestemme en li-10 gand i en bestemmelsesopløsning, ved hvilken intensiteten af den af bestemmelsesopløsningen udsendte fluorescens sættes i relation til ændringen i de transmitterende egenskaber frembragt ved reaktion af liganden, der skal bestemmes, og et reagenssystem, som er i stand til at frembringe en ændring i de 15 transmitterende egenskaber af bestemmelsesopløsningen i nærværelse af liganden. Desuden er det et formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe et hidtil ukendt reagensmateriale, der kan anvendes til enten spektrofotometrisk eller fluorometrisk at måle koncentrationen af en ligand i en be-2o stemmelsesopløsning.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til bestemmelse af en ligand i en prøve, der mistænkes for at indeholde liganden, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man 25 til dannelse af en bestemmelsesopløsning forener: Prøven, en effektiv mængde af et fluorescerende stof og en effektiv mængde af et reagenssystem, der i nærværelse af liganden, der skal bestemmes, er i stand til at give en ændring i de transmitterende egenskaber af bestemmelsesopløsningen inden for et bøl-30 gelængdebånd, som overlapper det fluorescerende stofs stimule rings- og/eller emissionsbølgelængdebånd, og at man bestråler bestemmelsesopløsningen med lys, der har en bølgelængde inden for det fluorescerende stofs stimuleringsbølgelængdebånd, og derefter måler intensiteten af fluorescensen, der udsendes af 35 bestemmelsesopløsningen, som et mål for koncentrationen af liganden i prøven.

7

DK 1611 ri B

Den foreliggende opfindelse angår endvidere et hidtil ukendt reagensmateriale til fluorometrisk bestemmelse af en ligand i en prøve, der mistænkes for at indeholde liganden, hvilket reagensmateriale omfatter en effektiv mængde af et reagenssy-5 stem, der er i stand til at give en ændring i de transmitterende egenskaber af en opløsning indehoIdende liganden og en effektiv mængde af et fluorescerende stof, som har et stimulerings- og/eller emissionsbølgelængdebånd, der overlapper det bølgelængdebånd, der står i forbindelse med ændringen i de 10 transmitterende egenskaber af en opløsning indeholdende reagenset og liganden.

I overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge opfindelsen bestemmes en ligand i en biologisk prøve ved i en bestemmelses-15 opløsning at forene prøven, en effektiv mængde af et reagenssystem og en effektiv mængde af et fluorescerende stof. Bestemmelsesopløsningen bestråles med lys, der har en bølgelængde inden for det fluorescerende stofs stimuleringsbølgelængde, og intensiteten af fluorescensen, der udsendes af bestemmel-20 sesopløsningen, måles som en indikation for koncentrationen af liganden i prøven. Intensiteten af fluorescensen, der udsendes af bestemmelsesopløsningen, er proportional med ændringen i de transmitterende egenskaber af bestemmelsesopløsni ngen, som skyldes reaktionen af liganden og reagenssystemet.

25

Som anvendt i den foreliggende beskrivelse, refererer udtrykket "ændring i de transmitterende egenskaber af bestemmelsesopløsningen" til den mængde lys, der absorberes eller spredes af en bestemmelsesopløsning inden for et særligt bølgelængde-30 bånd, når en lysstråle af kendt intensitet går gennem bestemmelsesopløsningen, og afhænger i almindelighed af ændringen i farven eller uklarheden af bestemmelsesopløsningen. Nærmere betegnet refererer ændringen i de transmitterende egenskaber til ændringen i den mængde lys, som absorberes eller spredes 35 af bestemmelsesopløsningen inden for et særligt bølgelængdebånd, hvori ændringen i hovedsagen skyldes reaktionen af liganden og et reagenssystem, som er specifikt for liganden. Æn-

DK 161111B

8 dringen i de transmitterende egenskaber måles i almindelighed ved at lede monokromatisk lys, der har en kendt intensitet, gennem bestemmelsesopløsningen og bestemme forholdet mellem intensiteten af det transmitterede eller spredte lys og inten-5 siteten af det indfaldende lys. Ændringen i de transmitterende egenskaber, dvs. ændringen i den mængde lys, som absorberes eller spredes af bestemmelsesopløsningen inden for et særligt bølgelængdebånd, er proportional med koncentrationen af liganden i bestemmelsesopløsningen. Det har nu vist sig, at i en 10 bestemmelsesopløsning indeholdende en ligand, et reagenssystem og et fluorescerende stof resulterer ændringen i de transmitterende egenskaber inden for et bølgelængdebånd, som overlapper det fluorescerende stofs stimulerings- og/eller emissionsbølgelængdebånd, som skyldes reaktionen af liganden og rea-15 genssystemet, også i en proportional ændring i intensiteten af fluorescensen, som udsendes af bestemmelsesopløsningen. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ændringen i intensiteten af fluorescensen, som udsendes af bestemmelsesopløsningen, derfor proportional med koncentrationen af liganden i bestem-20 melsesopløsningen. Det skal bemærkes, at ifølge fremgangsmåden ifølge opfindelsen skyldes ændringen i intensiteten af fluorescensen, som udsendes af en bestemmelsesopi øsni ng i ndehol-dende liganden, der skal bestemmes, reagenssystem og fluorescerende stof, når den sammenlignes med intensiteten af 25 fluorescensen, som udsendes af en bestemmelsesopløsning, der kun indeholder reagenssystemet og det fluorescerende stof, helt ændringen i de transmitterende egenskaber, som frembringes af reaktionen af liganden og reagenssystemet. Der er ingen reaktion, hverken kemisk eller immunologisk, mellem det fluor-30 escerende stof og nogen anden komponent, nemlig liganden, der skal bestemmes, eller reagenssystemet, i bestemmelsesopløsningen. Intensiteten af fluorescensen, der udsendes af bestemmelsesopløsningen, afhænger derfor ikke af den intermolekylære afstand mellem det fluorescerende stof og eventuelle kromogene 35 stoffer eller suspenderede partikler, som kan være til stede i bestemmelsesopløsningen.

DK 161111B

9

Liganderne, der kan bestemmes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, indbefatter klinisk betydningsfulde stoffer, som kan bestemmes kolorimetrisk, turbidimetrisk eller nefelometrisk.

Det vil sige, at liganden må være i stand til at reagere med 5 et reagenssystem til frembringelse af en påviselig ændring i de transmitterende egenskaber, der står i relation til koncentrationen af liganden i bestemmelsesopløsningen. Repræsentative ligander, der kan bestemmes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, indbefatter f.eks. glucose, urinsyre, cholesterol, 10 creatinin, lactat, 1actatdehydrogenase (LDH), triglycerider, immunog1 obu 1 i ner , cholinesterase, serumg1utamat, oxalactat-transaminase (SGOT), serumgiutamatpyruvattransaminase (SGPT), creatinphosphokinase (CPK), ethanol, total protein, albumin, calcium, bilirubin, blodurinstofnitrogen (BUN), ammoniak, mag-15 nium, phosphor, chlorid og lignende.

Udtrykket "fluorescerende stof" refererer til en forbindelse eller et middel, der har fluorescerende egenskaber, som står i relation til de transmitterende egenskaber af en opløsning in-20 deholdende et reagenssystem og en ligand. Specielt skal stimuleringsbølgelængdebåndet eller emissionsbølgelængdebåndet i forbindelse med fluorescerende stof overlappe bølgelængdebåndet, der står i forbindelse med ændringen i de transmitterende egenskaber af bestemmelsesopløsningen, som skyldes reaktionen 25 af liganden og reagenssystemet. Desuden er der som nævnt ingen kemisk eller immunologisk binding mellem det fluorescerende stof og liganden, som skal bestemmes, eller reagenssystemet. Andre hensyn vedrører pH-værdien af reagenssystemet. Det fluorescerende stof skal fluorescere inden for det pH-interval, 30 der er effektivt for reagenssystemet til reaktion med ligan den, der skal bestemmes, desuden er de fluorescerende stoffer, der er effektive til fremgangsmåden ifølge opfindelsen, fluorescerende i ubundet og ikke-kompleksbundet tilstand. Ved en kolorimetrisk bestemmelse skal stimuleringsbølgelængden eller 35 emissionsbølgelængden, der står i forbindelse med det fluor escerende stof, i det mindste delvis overlappe absorptionsbølgelængdebåndet, der står i forbindelse med reaktionen af li-

DK 161111B

10 ganden og det kromogene reagenssystem. For at opnå maksimal følsomhed af bestemmelsen foretrækkes det, at absorptionsbølgelængdebåndet, der skyldes reaktionen af liganden og det kromogene reagenssystem, overlapper både stimuleringsbølgelængde-5 båndet og emissionsbåndet, der står i forbindelse med det fluorescerende stof. Ved en turbidimetrisk eller nefelometrisk bestemmelse skal stimulerings- eller emissionsbølgelængdebåndet, der står i forbindelse med det fluorescerende stof, i det mindste delvis overlappe det bølgelængdebånd, inden for hvil-10 ket uklarheden af en bestemmelsesopløsning indeholdende liganden og det turbidimetriske eller nefelometriske reagenssystem måles. Som anvendt i den foreliggende beskrivelse, refererer "overlapning" af bølgelængdebåndet, der står i forbindelse med ændringen i de transmitterende egenskaber og stimulerings- og-15 /eller emissionsbølgelængdebåndet for det fluorescerende stof, til enten en delvis eller total overlapning af de respektive bølgelængdebånd.

Mange forskellige fluorescerende stoffer kan anvendes til 20 fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Som allerede nævnt vil valget af det fluorescerende stof afhænge af den særlige ligand, der skal bestemmes, og det anvendte reagenssystem. Repræsentative klasser af fluorescerende stoffer, der kan anvendes til fremgangsmåden ifølge opfindelsen, indbefatter f.eks. fluor-25 esceiner, rhodaminer, flaviner, coumariner, naphthalener, acridiner, anthracener, flerkernede kondenserede hydrocarbo-ner, stilbener, anthrani1 syrer, aminostyrylpyridiner, quino-liner, salicylsyrer, cyaniner, oxonoler, phenanthidiner, f1uorescaminer samt derivater og salte deraf. Illustrerende 30 for særlige fluorescerende stoffer, der kan anvendes, er f.eks. eosin, rhodamin, aminonaphthalensulfonat, acriflavin, fluorescein, dihydroxybenzoesyre, hydroxyquinol in, NADH, riboflavin, brilliant sulfaflavin, quinin, naphtholsulfonsyre, thioflavin, coumarin, acridin-orange, 8-ani1ino-l-naphthalen-35 sulfonsyre, oxazin, umbelliferon, acridin, resorufin og derivater og salte deraf. Valget af et fluorescerende stof, der er effektivt til fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan let gøres

IX

DK 161111 B

af en fagmand. Udtrykket "effektiv mængde af et fluorescerende stof", som anvendt i den foreliggende beskrivelse, refererer til en koncentration af fluorescerende stof i en bestemmelsesopløsning, som er tilstrækkelig til at fremkalde en påviselig 5 ændring i intensiteten af fluorescensen, som udsendes af bestemmelsesopløsningen, når en ligand og et reagenssystem, som er specifikt for liganden, sættes til bestemmelsesopløsningen. Disse effektive mængder konstateres i almindelighed af fagmanden og afhænger af en eller flere faktorer, såsom f.eks. det 10 særlige reagenssystem, liganden, der skal bestemmes, det særlige fluorescerende stof eller instrumenterne, der anvendes til at måle intensiteten af fluorescensen.

Udtrykket "reagenssystem", som anvendt i den foreliggende be~ 15 skrivelse, refererer til et kemisk system indeholdende et eller flere reagenser, som i nærværelse af liganden, der har interesse, frembringer en ændring i de transmitterende egenskaber af en bestemmelsesopløsning inden for et bølgelængdebånd, som overlapper et fluorescerende stofs stimulerings- og/eller 20 emissionsbølgelængdebånd. Reagenssystemer, der er effektive til fremgangsmåden ifølge opfindelsen, afhænger af den særlige ligand, der skal bestemmes, og af, om ændringen i de transmitterende egenskaber, der skal måles, skyldes ændringen i farven eller uklarheden af bestemmelsesopløsningen. Ved en kolorime-25 tri sk bestemmelse, dvs. hvor ændri ngen i farven af bestemmelsesopløsningen står i relation til ændringen i de transmitterende egenskaber af bestemmelsesopløsningen, anvendes et kro-mogent reagenssystem som reagenssystem. Ved en turbidimetrisk eller nefelometrisk bestemmelse, hvor uklarheden, dvs. den 30 mængde lys, der blokeres eller spredes af en suspension af partikler, står i relation til ændringen i de transmitterende egenskaber af bestemmelsesopløsningen, anvendes et turbidime-trisk reagenssystem henholdsvis et nefelometrisk reagenssystem .

Udtrykket "kromogent reagenssystem", som anvendt i den foreliggende beskrivelse, refererer til et kemisk system indehol- 35

DK 161111 B

12 dende et eller flere reagenser, som vil reagere efter en specifik reaktionssekvens med liganden, der skal bestemmes, til frembringelse af en påviselig ændring i de transmitterende egenskaber, især de kolorimetriske egenskaber af en bestemmel-5 sesopløsning inden for et bølgelængdebånd, som overlapper det fluorescerende stofs stimulerings- og/eller emissionsbølgelængdebånd. Til den foreliggende opfindelses formål kan de forskellige reagenser omfattende sådanne kromogene reagenssystemer tilsættes individuelt eller i enhver kombination til 10 bestemmelsesopløsningen, med mindre tilsætningsrækkefølgen er begrænset af den særlige reaktionsrækkefølge. De kromogene reagenssystemer, der anvendes til kolorimetrisk bestemmelse af ligander er velkendt, f.eks. Henry m.fl., Clinical Chemistry, Principles and Techniques, New York, Hoeber Medical Division, 15 Harper & Row (1964), Tietz, Fundamentals of Clinical Chemi stry, W.B. Saunders Company (1970). Forskelligt bestemmelsesudstyr og reagenssystemer findes i handelen og anvender standardteknik og reagenser. I almindelighed er de kolorimetriske fremgangsmåder baseret på det princip, at en ligand vil reage-20 fe med et kromogent reagenssystem indeholdende et farveprodu-cerende reagens til frembringelse af en påviselig farveændring i bestemmelsesopløsningen. Repræsentative kromogene reagenssystemer indbefatter f.eks. oxidasereaktionssystemer, herunder slutpunktsbestemmelser og kinetiske bestemmelser, og NADH/NAD-25 reaktionssystemer. Et oxidasereakti onssystem udnytter f.eks.

oxidative enzymer til at reagere med liganden til frigørelse af hydrogenperoxid, som derefter reagerer med et farvestof i nærværelse af peroxidase til frembringelse af en ændring i de kolorimetriske egenskaber af bestemmelsesopløsningen som en in-30 dikation for mængden af ligand i prøven. Et NADH/NAD-reakti-onssystem er baseret på reduktion af NAD til NADH eller oxidation af NADH til NAD og påfølgende reaktion med et farvestofsystem til frembringelse af en ændring i de kolorimetriske egenskaber af bestemmelsesopløsningen som et mål for koncen-35 trationen af ligand i prøven. Udtrykket "effektiv mængde rea-genssystem", som anvendt i den foreliggende beskrivelse, refererer til en mængde reagenssystem, som er tilstrækkelig i nær-

DK 161111B

13 værelse af en ligand til at frembringe en påviselig ændring i de kolorimetriske egenskaber af bestemmelsesopløsningen. Sådanne effektive mængder konstateres let af en fagmand.

5 Det følgende tjener til at illustrere nogle af de forskellige kromogene reagenssystemer og reaktionsrækkefølger, der kan anvendes til fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Der anvendes følgende forkortelser: jO DHBS 3,5-dichlor-2-hydroxybenzennatriumsulfonat AAP 4-aminoantipyrin HRPO peberrodperoxidase NAD oxideret nikotinamid-adenindinukleotid NADH reduceret nikotinamid-adenindinukleotid 15 LDH lactatdehydrogenase SGOT serumglutaminoxaeddikesyretransaminase SGPT se rumglutamxnpy rodr uesyre transamina se CPK creatinphosphokinase INT 2-(p-jodphenyl)-2-(p-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium-20 chlorid ATP adenosintriphosphat ADP adenosindiphosphat EGTA ethylenglycol-bis(β-aminoethylenether)-N,N'-tetra-eddikesyre.

25 På grund af usikkerheden om den særlige struktur af produktet i nogle af de følgende reaktionsrækkefølger bliver et produkt fra en særlig reaktionsrækkefølge, som frembringer farven af bestemmelsesopløsningen og måles ved en spektrofotometrisk be-30 stemmelse, i almindelighed omtalt som et "kromogen", med mindre det er konkret identificeret. I reaktionsrækkefølgen 11-16, der illustrerer NADH/NAD-systemer, er produktet, som frembringer farven af bestemmelsesopløsningen, formazin. I reaktionsrækkefølgen 21, som illustrerer en bestemmele af blodurinstof-35 nitrogen, er produktet, som frembringer farven af bestemmelsesopløsningen, indophenol. I reaktionsrækkefølgen 24, der illustrerer en bestemmelse af chlorid, er produktet, som frembringer farven af bestemmelsesopløsningen, fer ri thi ocyanat.

14

DK 161111B

1. Ligand; glucose

Chromogent Reagens-System; glucose-oxidase

DHBS

5 AAP

HRPO

•Reaktions-rækkefølge; glucose D-glucose + 02 + H20 —oxid — D-gluconsyre + H202 HRPO v 2H202 + DHBS + AAP ---chromogen 15 2. Ligand: urinsyre

Chromogent Reagens-System; uricase 20 DHBS

AAP

HRPO

Reaktions-rækkefølge: 25

Urinsyre + 02 + 2H20 —uricase-allantoin + C02 + H202 2H202 + DHBS + AAP —chromogen 30 35 15

DK 161111B

3. Ligand; Cholesterol (Cholesterol og Cholesterol-Estere)

Chromogent Reagens-System; cholesterol-esterase cholesterol-oxidase

5 DHBS

AAP

HRPO

Reaktions-rækkefølge; 10

Cholesterol

Cholesterol-estere -esterase-^ cholesterol

Cholesterol

Cholesterol + 02 —oxidase-cj^0]_esteron + H202 15 2H2° 2 + DHBS + AAP -^ chromogen 2 4. Ligand; Creatinin

Chromocent. Reagens-System: creatininase creatinase sarcosin -oxidase 25

DHBS

AAP

HRPO

Reaktions-rækkefølge; 30 . . . , ττ Λ creatininase \__

Creatxnin + H20 --=-^ creatxn creatin + H~0 -creatinase-\ sarcosin + urinstof

1 . Q

sarcosxn II

35 . „ n , n oxidase v glycin + HCH + H-0« sarcosxn + H20 + Q2 -v J 2 1 2h202 + DHBS + AAP -chromogen

DK 161111B

16 5, Ligand: Lactat

Chromogent Reagens-System: NAD

LDH

pyruvat -oxidase

DHBS

AAP

HRPO

Reaktions-rækkefølge: 10 LDH ^

Lactat + NAD - pyruvat + NADH

pyruvat Λ y "i Λ 3 ς» Λ pyruvat + O2 -^ acetylphosphat + C02 + H202 15 2H202 + DHBS + AAP -chromogen 2 0 6. Ligand: Triglycerider

Chromogent Reagens-System: lipase glycerol-kinase glycerol-phosphat -oxidase 2 5

DHBS

AAP

HRPO

30 Reaktions-rækkefølge;

Triglycerid + 3H20 ——p-s-e glycerol + fedtsyrer

glycerol + ATP —^--er--- ·—n-^e-> glycerol- 3^phosphat + ADP

3 5 glycerol phosphat . , „ , , oxidase glycerol-3-phosphat--^ dihydroxyacetonephosphat + H202 HRPO w 2H2a2 + DHBS + AAP ----- - p» chromogen 17

DK 161111 B

7, Ligand; Cholinesterase

Chromogent Reagens-System: acetylcholinesterase

cholin -oxidase DHBS

5 AAP

HRPO

Reaktions-rækkefølge: 10 Acetylcholin -^Cholinesterase > choUn + acetat cholin cholin + 02 -—-^ 2E202 WP.PO n.

15 2H202 + DHBS + AAP -chromogen

8, Ligand; SGOT

2

Chromocent Reacens-System; asparat a-ketoglutarat oxaloacetat -decarboxylase pyruvat- oxidase

25 DHBS

AAP

HRPO

30 Reaktions-rækkefølge:

Asparat + α-rketoglutarat S-G0?~-~> glutamat + oxaloacetat oxaloacetat oxaloacetat decarboxylase > pyruvat + ^ 36 pyruvat + 02 -> H202 + acetylphosphat + C02 1ΙΌΡΟ 2H202 + DHBS + AAP ---^ chromogen

9, Ligand: SGPT

18

DK 161111B

Chromogent Reagens-SystemiL-alanin a-ketoglutarat ® pyruvat -oxidase

DHBS

AAP

HRPO

Reaktions-rækkefølge:

SGPT

Alanin + a-ketoglutarat -^ glutamat + pyruvat pyruvat pyruvat + 0-· °xl^?se- acetylphosphat + H-jOj + C02 15 2 WPPO ^ 21^2 + DHBS + AAP - — ->> chromogen

XO. Ligand: CPK

2.

Chrcnogent Reagens-System: Creatin - phosphat creatinase sarcosin-oxidase

DHBS

25

AAP

HRPO

Reaktions-rækkefølge: . CPK n.

Creatin—phasphat + ADP -:-^ creatin + ATP

creatin + H20 -ereatinase-^ sarcosin + urinstof sarcosin 0 3(. sarcosin + H20 + 02 ——d——-glycin + HCH + H202 2^2 + DHBS + AAP -^ chromogen 19

DK 161111B

11, Ligand; Ethanol

Chromooent Reagens-System: NAD

alk ohol-dehydrogenase 5 INT

diaphorase

Reaktions-rækkefølge; alcohol

Ethanol + NAD -dehydrogenase_ ^ NADH + acetaidehyd NADH + INT —diaphorase-^ NAD + formazin 15

12. Ligand; SGOT

Chroroogent Reagens-System; asparatat a-ketoglutarat 20

NAD

glutamat -dehydrogenase diaphorase

INT

25

Reaktions-rækkefølge; SGOT v

Asparat + a-ketoglutarat -glutamat + oxaloacetat glutamat 30 NAD+glutamat +H20 dg-hydro?enase > NADH + 2-oxoglutarat + NH3 NADH + INT —d:L-aS—a5-e ·$> NAD + formazin 35

13« Ligand: SGPT

20

DK 161111 B

Chromogent Reagens-System: L-alanin o-ketoglutarat 5

NAD

glutarat -dehydrogenase diaphorase

INT

10

Reaktions-rækkefølge: SGPT ^

Alanin + a-ketoglutarat --- ~> glutamat + pyruvat giutamat glutamat +NAD+1^0 dehydrogenase NADH + 2-oxoglutarat + NH^ NADH + INT - diaphorase^. ^ + £ormazin 2o 14« Ligand; Glucose

Chromogent Reagens-System: ATP

hexokinase

NAD

25 glucose-6-phosphat -dehydrogenase

INT

diaphorase

Reaktions-rækkefølge;

Glucose + ATP hexofeinase glucose-S^phosphat + ADP

glucose-6- pbosphat glucose-6-phosphat + NAD —^hydrogenase ^ + gluoonat -6-phosphat NADH + INT —diapharose_ y NAD + formazin 35

15, Ligand; CPK

21

DK 161111B

Chromogent Reagens-Sy s tein: Creatin - phosphat

ADP

_ glucose 9 hexokinase

NAD

glucose-6-phosphat - dehydrogenase INT

j0 diaphorase

Reaktions-rækkefølge;

CPK

CreatLn-phosphat + ADP -creatin + ATP

15

glucose + ATP —hexokinase—^ glucose-6-phosphat + ADP

glucose-6- phosphat gluæse-6-pbosphat + NAD —d^ydrogenase.^> NADH + gluoonat -6-phosphat 20 NADH + INT —diap-°ra5e NAD + formazin 16: Ligand; LDH 25

Chromogent Reagens-System: L-lactat

NAD

INT

diaphorase 30

Reaktions-rækkefølge; LDH X.

L-lactat + NAD - NADH + pyruvat 35 NADH + INT —diaphorase—^ NAD + formazin 22

DK 161111 B

17. Ligand; Total Protein

Chromogent Reagens-System: kobbertartrat natriumtartrat 5 lithiumacetat

Reaktions-rækkefølge;

Protein + kobberta rtrat + natriumtartrat + lithiumhydroxid^· chranogen 18. Ligand; Albumin 15

Chromogent Reagens-System: Bromcreosolgrønt

Reaktions-rækkefølge;

Albumin + bromcreosolgrønt -^ chromogen 19. Ligand: Calcium 25

Chromogent Reagens-System: o-cresolphthalein-complexon 8-quinolin-sulfat

Reaktions-rækkefølge:

3C

15 Calcium + o-cresolphthalein + 8-quinolinol sulfat -^ chromogen 35

DK 161111B

?3 20. Ligand: Bilirubin

Chromoqent Reagens-System; diazonium-salt af 2,4-di- chloranilin methanol 5 sulfaminsyre

Reaktions-rækkefølge:

Bilirubin + diazonium-salt af 2,4-dichloranilin chxonpgen 10 21. Ligand: Blodurinstof-nitrogen (urinstof) 15 Chromoqent Reagens-System: urease natriumhypochlorit phenol natriumhydroxid nitroprussidnatrium 20

Reaktions-rækkefølge:

Urinstof———^-> 2NH3 + C02

25 2NH3 + 2NaC10 -^ 2NH2C1 + 2NaOH

2NH2C1 + 2 phenol + 2NaOH -^ 2g-aminophenol + 2NaCl + 2H20 2£-aminophenol + 2 phenol + 02 -^ 2 indophenol + 2H20 35

DK 161111 B

24 22, Ligand: Magnium

Chromoqent Reagens-System: kaliumchlorid

calmagit kaliumcyanid kaliumhydroxid EGT A

Reaktions-rækkefølge:

10 TCOIT

Magnium + KC1 + calmagit + KCN —chromogen 23, Ligand; Phosphor' 15 -

Chromoqent Reagens-Svstem: molybd.ænsyre svovlsyre katalysator 20

Reaktions-rækkefølge:

Phosphat + molybdænsyre + svovlsyre jSgtalys^tor;^ chromogen 25 24, Ligand: Chlorid

Chromogent Reagens-System: urinstof kaliumthiocyanat 3q mercurichlorid perchlorsyre mercuriperchlorat ferriperchlorat

Reaktions-rækkefølge: 35

2 Cr + HgCSCN)2 -^ HgCl2 + 2 SC*T

3 scif + Fe++ -^ Fe CSCN).3

DK 161111 B

25

Udtrykket "turbidimetrisk reagenssystem", som anvendt i den foreliggende beskrivelse, refererer til et kemisk system indeholdende et eller flere reagenser, som vil reagere efter en særlig fremgangsmåde med liganden, der skal bestemmes, til 5 frembringelse af en påviselig ændring i transmitterende egenskaber, især uklarheden af en bestemmelsesopløsning inden for et bølgelængdebånd, som overlapper et f1uorescerende stofs stimulerings- og/eller emissionsbølgelængdebånd. Til den foreliggende opfindelses formål kan de forskellige reagenser i et 10 turbidimetrisk reagenssystem tilsættes individuelt eller i enhver kombination til bestemmelsesopløsningen, med mindre tilsætningsrækkefølgen er begrænset af den særlige reaktionsrækkefølge. Forskellige turbidimetriske reagenssystemer er velkendt. En vigtig klasse bestemmelser, der udnytter et turbidi-15 metrisk reagenssystem, indbefatter bestemmelser til turbidimetrisk måling af humane immunoglobuliner. Princippet i sådanne bestemmelser er baseret på dannelsen af et specifikt kompleks bestående af en suspension af partikler som følge af reaktionen af et turbidimetrisk reagenssystem bestående af antiserum 20 specifik for det immunoglobulin, som skal bestemmes, og det immunoglobulin, der har interesse. Suspensionen af partikler, der skyldes dannelsen af et antiserum-immunoglobulinkompleks, frembringer en ændring i uklarheden af bestemmelsesopløsningen. Hvis et overskud af antiserum ud over human immunoglobu-25 lin anvendes i bestemmelsesopløsningen, falder lyset, som transmitteres gennem suspensionen, derfor, når koncentrationen af immunoglobulin i prøven vokser. Udtrykket "nefelometrisk reagenssystem", som anvendt i den foreliggende beskrivelse, refererer til et kemisk system indeholdende et eller flere re-30 agenser, som vil reagere i henhold til en speciel fremgangsmåde med liganden, der skal bestemmes, til frembringelse af en påviselig ændring i de transmitterende egenskaber, især uklarheden, af bestemmelsesopløsningen inden for et bølgelængdebånd, som overlapper det fluorescerende stofs stimulerings-35 og/eller emissionsbånd. Nefelometriske bestemmelser er baseret på samme principper som turbidimetriske bestemmelser med undtagelse af, at nefelometriske målinger af en bestemme!sesop- 26

DK 161111 B

løsning i modsætning til turbidimetriske målinger måler det spredte lys i en vinkel med det indfaldende lys. Talrige turbidimetriske og nefelometriske bestemmelser er kendt, og reagenssystemer til anvendelse i sådanne bestemmelser konstateres 5 let af en fagmand.

Ved udførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen indføres bestemmelsesopløsningen i en fTuorometercelle. Valget af stimuleringsbølgelængde afhænger af det fluorescerende stof, 1 i -10 ganden og det anvendte reagenssystem. Den særlige bølgelængde eller det særlige bølgelængdebånd, som måles for emissionsspektret, vil i almindelighed afhænge af emissionsmaksimet. Ved at bestemme emissionsspektret under anvendelse af en lyskilde med konstant intensitet og iagttage emissionsintensite-15 ten ved en bestemt bølgelængde eller et særligt bølgelængdebånd kan dette resultat stilles i relation til kendte standarder. Ved at udføre bestemmelsesmetoden ifølge opfindelsen med en ukendt i hovedsagen på samme måde som med standarder indeholdende kendte mængder af liganden, som skal bestemmes, kan 20 der fås en kvalitativ eller kvantitativ bestemmelse af mængden af ligand, som findes i den ukendte prøve.

Selv om koncentrationen af ligand, som skal bestemmes ved fremgangsmåderne ifølge opfindelsen, i vidt omfang afhænger af 25 det særligt anvendte fluorometer og de særligt anvendte reagenssystemer, er der blevet bestemt prøver indeholdende ligander i et koncentrationsinterval så lavt som fra 0,01 til 0,1 mM.

30 pH-værdien af bestemmelsesopløsningen afhænger i almindelighed af det særligt anvendte reagenssystem. pH-værdien af reagenssystemet vil være en faktor ved valget af et fluorescerende stof, idet det er nødvendigt, at det fluorescerende stof udsender f1uorescerens inden for reagenssystemets pH-interval.

Med visse ligander og fluorescerende stoffer kan der være små, men ubetydelige mængder uspecifik binding af ligander og 35

DK 161111 B

η fluorescerende stoffer til proteiner. Hvis protein-interferens er en faktor, foretrækkes det, at proteinkoncentrationen af bestemmelsesopløsningen formindskes ved forudgående behandling af prøven ved ultrafiltrering, ge1fi 1 trer ing, udfældning, dia-5 lyse og lignende. Desuden kan uspecifik binding af liganderne eller de fluorescerende stoffer til proteiner formindskes ved tilsætning af et overfladeaktivt middel, såsom Triton X-100 eller lignende, til bestemmelsesopløsningen.

10 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres almindeligt i et temperaturinterval på ca. 15 - 40°C og fortrinsvis fra ca. 25 til 40eC. Det foretrækkes også, at bestemmelsen udføres ved konstant temperatur.

15 De følgende eksempler tjener til at illustrere fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Koncentrationen af reagenser og andre variable parametre er kun vist for at eksemplificere fremgangsmåden ifølge opfindelsen og skal ikke anses for at begrænse denne. Bestemmelser, der anvender i handelen værende udstyr, 20 dvs. Abbott A-Gent® kliniske kemiske reagenser, benyttes i almindelighed som reagenssystemer i overensstemmelse med de pakninger, der leveres med udstyret. Det eneste yderligere reagens, som tilsættes, er det særligt anvendte fluorescerende stof. I de følgende eksempler måles fluorescensintensiteten 25 (Fj) af hver bestemmelsesopløsning under anvendelse af en Abbott TDX analysator ved en bølgelængde på 485 nm for stimulering og 525 nm for emission. I de følgende eksempler kan der udfærdiges en standardkurve ved at afsætte fluorescens-intensiteten målt for hver standardopløsning som funktion af kon-30 centrationen af standardopløsningen. Hvis der ønskes en lige linie som standardkurve, afsætter man desuden den negative logaritme af fluorescens-intensiteten målt for hver standardopløsning som funktion af koncentrationen af standardopløsnin-gen.

35 EKSEMPEL 1.

28

DK 161111 B

Glucosebestemmelse.

5 Til 5 μΐ af en prøve indeholdende en ukendt eller glucosestan-dard blev sat 2,05 ml phosphatstødpude sammen med oksegamma-globulin (pH 7,5) indeholdende 25 μΐ af en opløsning indeholdende 2200 enheder/ml glucoseoxidase, 25 μΐ af en opløsning indeholdende 0,2 M DHBS og 10-5 fluorescin og 25 μΐ af en op-10 løsning indeholdende 0,1% 4-aminoantipyren og 400 enheder/ml peberrodperoxidase. Den fremstillede bestemmelsesopløsning fik lov at reagere ved 35*C, indtil farveproduktionen var maksimal. Absorbansen og den f1uorometriske intensitet blev målt, og resultaterne, der blev opnået for standarder indeholdende 15 fra 0 til 500 mg/dl glucose, er vist i følgende tabel.

Absorbans (1 cm vejlængde). Fluorescens-Bølgelængde . intensitet (F-j.) 20

Glucose- koncentration 485 nm 500 run 525 nm 525 nm (mg/dl) 0 0,026 0,016 0,003 55.129 50 u,117 0,129 0,119 43.035 25 100 0,205 0,236 0,227 34.141 200 0,392 0,469 0,465 21.010 300 0,577 0,697 0,695 13.106 500 0,836 1,016 1,019 5.960 30 Af disse resultater kan fremstilles en standardkurve, hvoraf giucosekoncentrationen i en ukendt prøve kan bestemmes.

35 EKSEMPEL 2.

DK 161111B

29

Urinsyrebestemmelse.

5 Til 20 μΐ af en prøve indeholdende en ukendt eller urinsyrestandard blev sat 2,05 ml af en phosphatstødpude med oksegam-maglobulin (pH 7,5) indeholdende 25 μΐ af en opløsning indeholdende 10 enheder/ml uricase, 25 μΐ af en opløsning indeholdende 0,2 M DHBS og 10“5M fluorescein og 25 μΐ af en opløsning 10 indeholdende 0,1% 4-aminoantipyren og 400 enheder/ml peberrod-peroxidase. Den fremstillede bestemmelsesopløsning fik lov at inkubere ved 35°C i 5 minutter, og f 1 uorescensi ntens i teten af bestemmelsesopløsningen blev målt. Resultaterne opnået med prøver indeholdende fra 0 til 9 mg/dl urinsyre er vist i føl-15 gende tabel.

Urinsyrekoncentration FT

(mg/dl) 0 57.588 20 2 54.440 4 52.431 5 51. 426 6 50.774 9 47. 767 25 ------------------------------------

Af disse resultater kan fremstilles en standardkurve, hvoraf urinsyrekoncentrationen i ukendte prøver kan bestemmes.

30 Følgende tabel viser koncentrationen af urinsyre bestemt for Dade Moni-Trol I og II kemikontrolprøver under anvendelse af en standardkurve fremstillet af resultaterne i ovenstående tabel .

35 30

DK 161111 B

Bestemt

Rapporteret koncentration kontrolværdi af urinsyre

Prøve nr. (mg/dl) (mg/dl)

Moni-Trol I 4,1 4,0 5 Moni-Trol II 9,5 8,4 EKSEMPEL 3.

10 Cholesterolbestemmelse.

Til 10 μΐ af en prøve indeholdende en ukendt eller choleste-rolstandard blev sat 2,05 ml af en opløsning i ndeho Idende phosphatstødpude med oksegammaglobulin, pH 7,5, der også inde-15 holdt 25 μΐ af en opløsning indeholdende 1100 enheder/ml cho-lesterolesterase, 100 enheder/ml cholesterol-oxidase, 20¾ Triton X-100 og 0,2 M cholat, 25 μΐ af en opløsning i ndeho1 dende 1 x 10-5M fluorescein og 0,2 M DHBS, 25 μΐ af en opløsning indeholdende 0,1¾ 4-aminoanti pyren og 400 μ/ml peberrodperoxi-20 dase.

Den fremkomne bestemmelsesopløsning fik lov at inkubere ved 35°C i 5 minutter. Resultaterne opnået med standarder indeholdende 0 - 400 mg/dl cholesterol er vist i følgende tabel.

25

Cholesterol- F-j.

koncentration (mg/dl) _____________________________ 0 65. 175 50 56. 909 30 100 49.998 200 38 404 300 29 149 400 22 273

Af disse resultater kan fremstilles star.dardkurve, hvoraf cholesterol koncentrat i onen i ukendte prøver kan bestemmes.

35

DK 161111B

31 Følgende tabel viser koncentrationen af cholesterol bestemt for Dade Moni-Trol I og II kemikontrolprøver under anvendelse af en standardkurve fremstillet af resultaterne i ovenstående tabel.

5

Bestemt

Rapporteret koncentration kontrolværdi af cholesterol

Prøve nr. (mg/dl) (mg/dl)

Moni-Trol I 116 110 10 Moni-Trol II 220 212 EKSEMPEL 4.

15 Bestemmelse af total protein.

Til 3 ml rekonstitueret Abbott A-Gent® totalprotein-reagens, som var indstillet til at indeholde 1,5 x 10“7 f1uorescein, blev sat 50 μΐ af en prøve indeholdende en ukendt eller stan-20 dard. Reagenset og prøven blev blandet og fik lov at inkubere ved 20eC i mindst 10 minutter. Fluorescens-intensiteten af bestemmelsesopløsningen blev målt, og resultaterne opnået for standarder indeholdende fra 0 til 8 g/dl protein er vist i følgende tabe 1.

25

Proteinkoncentration Fj (g/dl) o 54.068 4 37.383 30 6 32.760 8 27.792

Af disse resultater kan fremstilles en standardkurve, hvoraf 35 den totale proteinkoncentration i ukendte prøver kan bestemmes.

EKSEMPEL 5.

DK 161111B

32 LDH-bestemmelse.

5 Til 20 μΐ af en prøve indeholdende en ukendt eller standard blev sat 2,0 x 5 ml af en phosphatstødpude med oksegammag1obu-lin (pH 7,5) indeholdende 25 μΐ af en opløsning indeholdende 250 mg/ml 1 ithium-L-lactat og 125 mg/ml NAD, 25 μ! af en opløsning indeholdende 25 mg/ml INT og 1 x 10-5M fluorescein i 10 50% ethanol og 25 μΐ af 100 enheder/ml diaphorase i 50% glyce rin. Prøven og reagensopløsningen blev blandet, og den fremstillede bestemmelsesopløsning fik lov at inkubere i 14 minutter ved 35°C. Fluorescens-intensiteten af bestemmelsesopløsningen blev målt. Resultaterne opnået for standarder inde-15 holdende fra 0 til 500 enheder/1 LDH er vist i følgende tabel.

LDH-aktivitet (enheder/ml F-j.

omtrentligt) 0 45.797 20 50 43.170 100 41.470 200 38.484 300 35.909 500 28 021 25 -----------------------------------

Af disse resultater kan fremstilles en standardkurve, hvoraf LDH-koncentrationen i ukendte prøver kan bestemmes.

30 EKSEMPEL 6.

Creati ni nbestemmel se.

Til 20 ml af en vandig opløsning indeholdende 5,5 ml picrin-35 syre og 1,1 ml 2,5 N natriumhydroxid blev sat 200 μΐ 10~5m fluorescein til dannelse af en reagensopløsning indeholdende lO^M fluorescein. Til 2 ml af den ovenfor fremstillede rea-

DK 161111 B

33 gensopløsning blev sat 100 μΐ af en prøve indeholdende en ukendt eller en standard. Den fremstillede bestemmelsesopløsning blev inkuberet ved 35°C i ca. 15 minutter, og fluorescensintensiteten af bestemmelsesopløsningen blev målt. Resultater-5 ne opnået for standarder indeholdende fra 0 til 10 mg/dl crea- 1.1 nin er vist i følgende tabel

Creatinin- F

koncentration I

(mg/dl) 10 0 8.282 2 7.665 6 6.159 10 4.972

IS

Af disse resultater kan frems1iltes en standardkurve, hvoraf creatini nkoncentrat ionen i ukendte prøver kan bestemmes.

EKSEMPEL 7.

20 BUN-bestemmelse.

Til 20 μΐ af en prøve indeholdende en ukendt eller standard blev sat 2,050 ml af en reagensopløsning omfattende 0,1 M ka-25 liumphosphat (pH 7,5) stødpude, oksegammaglobulin, 0,1% natri-umazid, 25 μΐ af en 5% glycerinopløsning indeholdende 130 en-heder/ml urease, 25 μΐ af en 10“5M fluoresceinopløsning fremstillet ved at sætte 300 mg nitroprussidnatrium i 1 ml vand til 5 ml phenol, 1 ml glycerin og 1 ml ethanol og tilstrække-30 lig meget fluorescein til at give en slutkoncentration på 10"5m fluorescein, og 25 μΐ af en opløsning fremstillet ved at sætte 25 g natriumhydroxid til 50 ml opløsning indeholdende 5,7% natriumhydrochlorit. Prøven og reagensopløsningen blev blandet, og den fremstillede bestemmelsesopløsning fik lov at 35 inkubere i ca. 5 minutter ved 35°C. F1 uorescens-i ntens i teten af bestemmelsesopløsningen blev målt. Resultaterne opnået for standarder indeholdende fra 0 til 100 mg/dl urinstof er vist i følgende tabel:

DK 161111 B

34

Urinstof-koncentrat ion (mg/dl) 0 31.847 6,25 28.713 12,5 25.745 25 20.962 50 15.538 100 8.798 10

Af disse resultater kan fremstilles en standardkurve, hvoraf urinstofkoncentrationen i ukendte prøver kan bestemmes.

EKSEMPEL 8.

15

Bi 1 i rubi nbestemmelse.

Til 2 ml rekonstituteret Abbott A-Gent® bi 1 i rubi nreagens, som var indstillet til at indeholde 10-7m fluorescein, blev sat 50 20 Ml af en prøve indeholdende en ukendt eller standard. Reagenset og prøven blev blandet og fik lov at inkubere ved 37°C i ca. 10 minutter. F1uorescens-i ntens i teten af den fremstillede bestemmelsesopløsning blev målt, og resultaterne opnået for standarder indeholdende fra 0 til 20,2 mg/dl bilirubin er vist 25 i følgende tabel.

Bilirubin- koncentration F j (mg/dl) 0 65.256 30 4 59.371 10.1 50.353 20.2 32.740 35 ; disse resultater kan fremstiller en standardkurve, hvoraf b11 i rubi nkoncentrat ionen i ukendte prøver kan bestemmes.

35 Følgende tabel viser koncentrationen af bilirubin bestemt for Dade Moni-Trol I og II kemikontrol prøver under anvendelse af en standardkurve fremstillet af resultaterne i ovenstående tabel .

Bestemt 5 Rapporteret koncentration kontrolværdi af bilirubin

Prøve nr. (mg/ml) (mg/ml)

Moni-Trol I 1,2 1,1 10 Moni-Trol IX 4,0 4,5 EKSEMPEL 9.

Calciumbestemmelse.

15

Til 3 ml rekonstitueret Abbott A-Gent® calciumreagens, som var indstillet til at indeholde 1,5 x 10_7M fluorescein, blev sat 100 μΐ af en prøve indeholdende en ukendt eller calciumstandard. Reagens og prøve blev blandet og fik lov at inkubere ved 20 20°C i ca. 10 minutter. Fluorescens-intensiteten af bestemmel sesopløsningen blev målt, og resultaterne opnået for standarder indeholdende fra 0 til 12 mg/dl calcium er vist i følgende tabel.

Calcium- F

25 koncentration I

(mg/dl) 0 41.881 8 30.762 10 29.029 30 12 26.416

Af disse resultater kan fremstilles en standardkurve, hvoraf calciumkoncentrationer i ukendte prøver kan bestemmes.

35 EKSEMPEL 10.

DK 161111B

36

Albumi nbestemmel se.

5 Til 2 ml rekonstitueret Abbott A-Gent® albuminreagens, som var indstillet til at indeholde 5 x 10-5M brilliant sulfaflavin, blev sat 10 μΐ af en prøve indeholdende en ukendt eller standard. Reagenset og prøven blev blandet og fik lov til at inkubere i 5 minutter ved 20°C. Fluorescens-intensiteten af den 10 fremkomne bestemmelsesopløsning blev målt, og resultaterne opnået for standarder indeholdende fra 0 til 8 g/dl albumin er vist i følgende tabel.

Albumin- F

koncentration 15 (g/dl) 0 2.888 3 2.430 8 2.056 20

Af disse resultater kan fremstilles en standardkurve, hvoraf albuminkoncentrationen i ukendte prøver kan bestemmes.

EKSEMPEL 11.

25

Ch1 or idbestemme1 se .

Til 2 ml Harleco® Chloride Developing Reagent, som var indstillet til at indeholde 5 x 10_5M brilliant sulfaflavin, blev 30 sat 20 μΐ af en prøve indeholdende en ukendt eller standard. Til den fremkomne blanding blev sat en dråbe af en 0,2 M mer-curiperchloratopløsning, og fluorescens-intensiteten af den fremkomne bestemmelsesopløsning blev målt. Resultaterne opnået for standarder indeholdende fra 0 til 200 meq/1 chlorid er 35 vist i følgende tabel.

DK 161111B

37

Chlorid- p

koncentration I

(meq/1) 0 54.047 5 50 48.959 100 23.900 200 10.368

Af disse resultater kan fremstilles en standardkurve, hvoraf 10 chloridkoncentrationen i ukendte prøver kan bestemmes.

Følgende tabel viser chloridkoncentrationen bestemt for Dade Moni-Trol I og II kemikontrolprøver under anvendelse af en standardkurve fremstillet af resultaterne i ovenstående tabel.

*5 Rapporteret Chlorid- kontrolværdi koncentration

Prøve nr. (meq/1) (meq/1)

Moni-Trol I 112 110

Moni-Trol II 96 85 2o ----------------------------------------------------------- EKSEMPEL 12.

Magni umbestemmel se.

25

Til 1,0 ml af et magniumfarvestofreagens (P.L.Biochemicals, Inc.), der var indstillet til at indeholde 5 x 10-?M fluorescein, blev sat 1,0 ml magniumgrundreagens (P.L.Biochemicals, Inc.) og 20 μΐ af en prøve indeholdende en ukendt eller stan-30 dard. Den fremstillede bestemmelsesopløsning fik lov at henstå i mindst 1 minut ved 20eC, og fluorescens-intensiteten af bestemmelsesopløsningen blev målt. Resultaterne opnået for standarder indeholdende fra 0 til 6,0 meq/1 magnium er vist i følgende tabel.

35

DK 161111B

38

Magnium- F

koncentration £ I

(meg/1) 0 31.612 5 2,0 22.510 4.0 17.330 6.0 12.802

Af disse resultater kan fremstilles en standardkurve, hvoraf 10 magniumkoncentrationen i ukendte prøver kan bestemmes.

Følgende tabel viser koncentrationen af magnium bestemt for en Dade Moni-Trol I kemi kontrol prøve under anvendelse af en stan-dr-rdkurve fremstillet af resultaterne i ovenstående tabel.

15

Rapporteret Magniumkontrolværdi koncentration

Prøve nr. (meg/1) (meg/1)

Moni-Trol I 2,1 2,2 20 EKSEMPEL 13.

Glucosebestemmelse.

25 Til 5 μΐ af en prøve indeholdende en ukendt eller glucosestan-dard blev sat 2,05 ml af en phosphatstødpude med oksegammaglo-bulin (pH 7,0) indeholdende 25 μΐ af en opløsning indeholdende 2200 enheder/ml glucose-oxidase, 0,025 mg/ml thimersol og 1,5 M ammoniumsulfat, 25 μΐ af en opløsning indeholdende 0,2 M 30 DHBS, 0,1% kaliumferricyanid, 0,1% 4-amino-antipyren, 0,1% Triton X-100, 0,025 mg/ml thimersol og 5,633 x 10~4 mol/1 riboflavin i 0,1 M phosphatstødpude og 25 μΐ af en opløsning indeholdende 400 enheder/ml peberrodperoxidase, 10% kalveserum, 0,6 mM EDTA, 0,1% ANS, 1% Triton X-100, 2000 enheder/ml lipa-35 se, 0,025 g/ml thimersol i 0,1 M phosphatstødpude. Den fremstillede bestemmelsesopløsning fik lov at reagere ved 35°C, indtil farveproduktionen var maksimal. Adsorbansen og den 39

DK 161111 B

f 1 uorometri ske intensitet blev målt, og resultaterne, der fremkom for standarder indeholdende fra 0 til 500 mg/dl glucose, er vist i følgende tabe1 _ Glucose- C ]J1

koncentration I

(mg/dl) 0 37.432 50 28.731 10 100 22.019 200 12.547 300 7.291 500 2.269 15 EKSEMPEL 14.

Immunoglobulin G(IgG)bestemmelse.

Til 2,5 ml af et antiserum-arbejdsreagens fremstillet ved at 20 blande 400 μΐ gede-ant i-human IgG antiserum med 11,6 ml af en saltopløsning med phosphatstødpude indeholdende 4% polyethy-lenglycol under anvendelse af reagenserne leveret i Abbott A-Gent® Immunoglobulin G klinisk, kemisk, diagnostisk udstyr, blev sat 100 μΐ standardopløsninger fremstillet ifølge in-25 struktionerne i Abbott A-Gent® Immunoglobulin G klinisk, kemisk, diagnostisk udstyr under anvendelse af standardleverancerne med udstyret. Til blandingen blev sat 25 μΐ af en 10"5M fluoresceinopløsning, og fluorescens-intensiteten af bestem melsesopløsningen blev målt, og resultaterne opnået med stan-30 darder indeholdende fra 382 til 6093 ng/dl immunoglobulin G er vist i følgende tabel.

35

DK 161111B

40

IgG-koncentration F

(ng/dl) 1 382 10.556 761 10.262 5 1526 10.132 3046 9.397 6093 8.849

Som vist i de foregående eksempler, kan fremgangsmåden ifølge 10 opfindelsen tilpasses mange forskellige bestemmelsessystemer. Foruden at give mulighed for f1uorometrisk bestemmelse af en ukendt ligand under anvendelse af kendte kromogene reagenssystemer forøger fremgangsmåden ifølge opfindelsen lineariteten af en bestemmelse, der anvender kromogene reagenssystemer.

15 Især forøger fremgangsmåden ifølge opfindelsen 1 i near itetsin-tervallet af bestemmelser ved høje absorbansværdier. Det er velkendt, at på grund af begrænsninger, som instrumenterne giver, falder lineariteten af kolorimetriske bestemmelser væsentligt ved kromogenkoncentrationer, der har absorbansværdier 20 større end 2,0. Under anvendelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen er det muligt at forlænge lineariteten af en bestemmelse under anvendelse af koncentrationer af reagenssystem og ligand, som resulterer i en kromogenkoncentration, der har en absorbansværdi større end 2,0.

25

Som tidligere nævnt angår opfindelsen hidtil ukendte reagensmaterialer, der kan anvendes til enten spektrofotometri sk eller fluorometrisk måling af koncentrationerne af en ligand i en bestemmelsesopløsning. Disse reagensmaterialer omfatter en 30 effektiv mængde af et reagenssystem, der er specifikt for liganden, dvs. et reagenssystem, som er i stand til at give en ændring i de transmitterende egenskaber af en opløsning indeholdende liganden, der skal bestemmes, og en effektiv mængde af et fluorescerende stof, som har et stimulerings- og/eller 35 bølgelængdebånd, der overlapper det bølgelængdebånd, der står i forbindelse med ændringen i de transmitterende egenskaber af en opløsning indeholdende reagenssystemet og liganden, der

Claims

1. Fremgangsmåde til bestemmelse af en ligand i en prøve, der mistænkes for at indeholde liganden, kendetegnet ved, at a) der til dannelse af en bestemmelsesopløsning forenes 25 i) prøven, ii) en effektiv mængde af et fluorescerende stof, iii) en effektiv mængde af et reagenssystem, som i nærværelse af liganden, der skal bestemmes, er i stand til at give en ændring i de transmitterende egenskaber af be-30 stemmelsesopløsningen inden for et bølgelængdebånd, som overlapper det fluorescerende stofs stimulerings- og/eller emissionsbølgelængdebånd, og b) bestemmelsesopløsningen bestråles med lys, der har en bølgelængde inden for det fluorescerende stofs stimuleringsbølge- 35 længdebånd, og c) intensiteten af fluorescensen udsendt af bestemmelsesopløsningen måles som et mål for koncentrationen af liganden i prøven . DK 161111 B

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at reagenssystemet er et chromogent reagenssystem eller et turbidimetrisk reagenssystem.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at reagenssystemet er et chromogent reagenssystem.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at absorptionsbølgelængdebåndet, der står i forbindelse med 10 ændringen i de transmitterende egenskaber af bestemmelsesop løsningen, overlapper det fluorescerende stofs stimulerings-bølgelængdebånd.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, 15 at absorptionsbølgelængdebåndet, der står i forbindelse med ændringen i de transmitterende egenskaber af bestemmelsesop løsningen, overlapper det fluorescerende stofs emissionsbølgelængdebånd .

6. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at absorptionsbølgelængdebåndet, der står i forbindelse med ændringen i de transmitterende egenskaber af bestemmelsesop løsningen, overlapper det fluorescerende stofs stimulerings-og emissionsbølgelængdebånd. 25 30 35