JP3102228B2 - パーオキシダーゼ活性測定用試薬及びそれを用いた測定方法 - Google Patents
パーオキシダーゼ活性測定用試薬及びそれを用いた測定方法Info
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Description
測定用試薬及びその試薬を用いた測定方法に関する。更
に詳しくは、(イ)ルミノールと過酸化水素とからなる
基質と、(ロ)一般式
あり、R3 は水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル
基、水酸基又はアミノ基である。)で表されるピリジン
化合物と一般式
金属である。)で表されるフェノチアジン化合物とから
なる活性増幅物質と、からなるパーオキシダーゼ活性測
定用試薬、及びパーオキシダーゼと、ルミノールと過酸
化水素とからなる基質と、前記一般式(I)で表される
ピリジン化合物と前記一般式(II)で表されるフェノチ
アジン化合物とからなる活性増幅物質とにより発生する
化学発光を測定することからなるパーオキシダーゼ活性
の測定方法である。
測定法として技術開発が行われている。中でも化学発光
基質を用いる測定法は、高感度化の達成のために有力な
手段であり、例えばルミノールを用いた化学発光法では
比色法の10-14 molに比べパーオキシダーゼの検出
感度が10-16 molであるとの報告がなされている
(蛋白質核酸酵素、別冊No.31,p51〜63,1
987年参照)。しかし化学発光法は、発光時間が短い
などの欠点を有しているため汎用されていなかった。そ
こでこの欠点を補う試みがなされ、p−ヨードフェノー
ルを活性増幅物質として用いた化学発光法(H.All
an,J.Microbiology Apr.,63
0〜636,35,(1988)参照)、あるいはイン
ドフェノール誘導体とフェノチアジン誘導体とを組み合
せて活性増幅物質として用いたパーオキシダーゼ活性の
化学発光測定法(特開平2−174694号参照)等が
見い出された。
の活性増幅物質を用いる化学発光法は、持続した発光が
得られ、ある程度の高感度化が達成されたものの、微量
成分の測定には更なる感度が要求されているのが現状で
ある。そして有効な測定方法の出現が久しく期待されて
いた。
度を求めて鋭意研究した結果、化学発光を利用しパーオ
キシダーゼ活性を測定するためルミノールと過酸化水素
とを基質として用いる方法において、前記一般式(I)
で表されるピリジン化合物と前記一般式(II)で表され
るフェノチアジン化合物とがパーオキシダーゼの活性増
幅物質となることを見い出し、本発明を完成した。
物において、R1 及びR2 は水素原子又は低級アルキル
基であり、この低級アルキル基としては炭素数1〜4の
低級アルキル基であり、例えばメチル基、エチル基、プ
ロピル基、イソプロピル基、ブチル基、sec−ブチル
基、t−ブチル基等を挙げることができる。
キル基、水酸基又はアミノ基である。ハロゲン原子とし
ては、例えば塩素、臭素、ヨウ素等を挙げることができ
る。低級アルキル基としては、前記R1 及びR2 と同じ
炭素数1〜4の低級アルキル基の他、アミノ基、ジメチ
ルアミノ基、ピペリジノ基等で置換されたアルキル基を
挙げることができる。またアミノ基としては、無置換の
アミノ基の他、メチルアミノ基、エチルアミノ基、ジメ
チルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジプロピルアミノ
基、1−ピロリジニル基、ピペリジノ基、4−メチルピ
ペリジノ基、4−エチルピペリジノ基、フェニルアミノ
基等の置換アミノ基を挙げることができる。
物としては、例えばピリジン、2−メチルピリジン、3
−メチルピリジン、4−メチルピリジン、4−ヒドロキ
シピリジン、2−ヒドロキシピリジン、4−クロロピリ
ジン、4−アミノピリジン、4−ジメチルアミノピリジ
ン、4−ジエチルアミノピリジン、4−ピペリジノピリ
ジン、4−(2−ピペリジノエチル)ピリジン、4−
(N−メチルアミノ)ピリジン、コリジン等を挙げるこ
とができる。
ン化合物において、Xは水素原子、アルカリ金属又はア
ルカリ土類金属である。アルカリ金属としては、例えば
ナトリウム、カリウム等を、さらにアルカリ土類金属と
してはカルシウム、バリウム等を挙げることができる。
ン化合物としては、例えば3−(10−フェノチアジニ
ル)プロパンスルホン酸、3−(10−フェノチアジニ
ル)プロパンスルホン酸ナトリウム、3−(10−フェ
ノチアジニル)プロパンスルホン酸カリウム等を挙げる
ことができる。
被検液と、ルミノールと過酸化水素とからなるパーオキ
シダーゼの基質と、前記一般式(I)で表されるピリジ
ン化合物及び一般式(II)で表されるフェノチアジン化
合物とからなる活性増幅物質とにより発生する化学発光
を測定することにより行うことができる。
(I)で表されるピリジン化合物及び前記一般式(II)
で表されるフェノチアジン化合物は、それぞれ10〜5
000μM用いることができるが、反応を効率よく行う
ためには100〜1000μM用いることが好ましい。
測定に用いる基質は、ルミノールを100〜1000μ
M、好ましくは200〜400μM用い、さらに過酸化
水素を100〜1000μM、好ましくは200〜50
0μM用いることが経済的にも有利である。
例えばトリシン−水酸化ナトリウム緩衝液、トリス−塩
酸緩衝液、トリス−コハク酸緩衝液、リン酸緩衝液等を
挙げることができる。緩衝液は、pHが7.0〜9.0
のものを用いることができる。測定は、10〜40℃で
行うことができるが、効率よく行うためには20〜30
℃で実施することが好ましい。
ゼを含む被検液と共に前記一般式(I)で表されるピリ
ジン化合物、前記一般式(II)で表されるフェノチアジ
ン化合物および前記基質を含む試験液を入れた試験管を
フォトンカウンターの中に入れ測定を行なうことができ
る。
は、通常測定に用いられるポリスチレンビーズ、磁性粒
子、容器の壁等の固相上にサンドイッチ法、競合法等の
免疫測定法により補足されたパーオキシダーゼ標識体の
活性を上記方法に従い測定することにより達成される。
細に説明する。
スルホン酸ナトリウムを含むトリシン−水酸化ナトリウ
ム増幅物質緩衝液pH=8.3(50mM)、及び1.
0mM過酸化水素と0.75mMルミノールとを含むト
リシン−水酸化ナトリウム基質緩衝液pH=8.3(5
0mM)をそれぞれ作成した。
キシダーゼ(1ng/ml)10μlを加え、更に参考
例1で作成した基質緩衝液135μlを加え、5秒間の
発光を添加直後(0分)から2分おきに10分までクリ
ニルーマット(ベルトールド社製フォトンカウンター)
で測定した。その結果を図1に示す。
スルホン酸ナトリウムを含むトリシン−水酸化ナトリウ
ム増幅物質緩衝液に表1に示すピリジン化合物1.0m
Mを加え増幅物質緩衝液を作成した。この増幅物質緩衝
液200μlにパーオキシダーゼ(1ng/ml)10
μlを加え、更に参考例1で作成した基質緩衝液135
μlを加え、6分後クリニルーマットで5秒間の発光を
測定した。ピリジン化合物を添加しない増幅物質緩衝液
を用いて測定を行った結果を基準としてその相対活性を
求めた。その結果を表1に示す。
た増幅物質緩衝液200μlにパーオキシダーゼ(1n
g/ml)10μlを加え、更に参考例1で作成した基
質緩衝液135μlを加え、5秒間の発光を添加直後
(0分)から2分おきに10分までクリニルーマットで
測定した。その結果を図2に示す。
ル、1.0mM過酸化水素を含むトリシン−水酸化ナト
リウム緩衝液200μlを4本の試験管に入れ、パーオ
キシダーゼ(0ng/ml,1ng/ml,0.1ng
/ml,0.01ng/ml)をそれぞれ10μlづつ
加え、更に参考例1で作成した基質緩衝液135μlを
加え6分後の5秒間の発光をクリニルーマットで測定し
た。その結果を図3に示す。
ロパンスルホン酸ナトリウム及び4−ジメチルアミノピ
リジンを含む増幅物質緩衝液200μlを4本の試験管
に入れ、パーオキシダーゼ(0ng/ml,1ng/m
l,0.1ng/ml,0.01ng/ml)各10μ
lを加え、更に参考例1で作成した基質緩衝液135μ
lを加え6分後5秒間の発光をクリニルーマットで測定
した。その結果を図4に示す。
スルホン酸ナトリウム、0.067mMフェノールイン
ドフェノールを含むトリシン−水酸化ナトリウム増幅物
質緩衝液に表2に示すピリジン化合物1.0mMを加え
た増幅物質緩衝液200μlにパーオキシダーゼ(0.
1ng/ml)10μlを加え、さらに参考例1で作成
した基質緩衝液135μlを加え、6分後5秒間の発光
をクリニルーマットで測定した。その結果を表2に示
す。
発光量又は発光信号(シグナル)/バックグラウンド比
を大きくする。そこで本発明の活性増幅物質を用いるこ
とにより、今まで測定することができなかった極微量の
パーオキシダーゼの活性を測定することができる。さら
に本発明をEIAに用いると従来の測定法に比べ高感度
な測定が可能である。
ホン酸ナトリウムを増幅物質として用い、発光を測定し
た図である。
ェノチアジニル)プロパンスルホン酸ナトリウムとを増
幅物質として用い、発光を測定した図である。
て用いたときのパーオキシダーゼの検量線である。
ェノチアジニル)プロパンスルホン酸ナトリウムを増幅
物質として用いたときのパーオキシダーゼの検量線であ
る。
Claims (2)
- 【請求項1】 (イ)ルミノールと過酸化水素とからな
る基質と、 (ロ)一般式 【化1】 で表されるピリジン化合物(式中、R1 及びR2 は水素
原子又は低級アルキル基であり、R3 は水素原子、ハロ
ゲン原子、低級アルキル基、水酸基又はアミノ基であ
る。)と一般式 【化2】 で表されるフェノチアジン化合物(式中、Xは水素原
子、アルカリ金属又はアルカリ土類金属である。)とか
らなる活性増幅物質と、からなるパーオキシダーゼ活性
測定用試薬。 - 【請求項2】 パーオキシダーゼと、ルミノールと過酸
化水素とからなる基質と、一般式 【化3】 で表されるピリジン化合物と一般式 【化4】 で表されるフェノチアジン化合物とからなる活性増幅物
質とにより発生する化学発光を測定することからなるパ
ーオキシダーゼ活性の測定方法(式中、R1 及びR2 は
水素原子又は低級アルキル基、R3 は水素原子、ハロゲ
ン原子、低級アルキル基、水酸基又はアミノ基であり、
Xは水素原子、アルカリ金属又はアルカリ土類金属であ
る。)。
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Publications (2)
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JPH0799996A JPH0799996A (ja) | 1995-04-18 |
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-
1993
- 1993-10-01 JP JP05267813A patent/JP3102228B2/ja not_active Expired - Fee Related
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