JPH01304900A - 血液中の特異的結合性物質の検出方法及び該方法実施用の試験キット - Google Patents

血液中の特異的結合性物質の検出方法及び該方法実施用の試験キット

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JPH01304900A
JPH01304900A JP1087836A JP8783689A JPH01304900A JP H01304900 A JPH01304900 A JP H01304900A JP 1087836 A JP1087836 A JP 1087836A JP 8783689 A JP8783689 A JP 8783689A JP H01304900 A JPH01304900 A JP H01304900A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、特異的結合性物質とその対応反応性物質との
間の結合親和性を利用して血液または血液由来分画中の
特異的結合性物質を定量的及び/または定性的に検出す
る方法に係る。ペルオキシダーゼ活性をもつ反応性成分
を使用し、特、異的結合性物質とその対応反応性物質と
を含有する反応混合物をイン□キュベートする二′とに
よって該反応混合物または反応混合物由来分画中のペル
オキシダーゼ活性を測定する。ペルオキシダーゼ活性が
特異的結合性物質の量及び/または存在の尺度となる0
本発明はまた該方法を実施するための試験キットを提供
する。この種のペルオキシダーゼ活性を明示する方法は
既にオランダ特許第154,600号に明示されている
前記方法においてはしばしばノ抗体を結合させ゛たマイ
クロタイタープレートの小ウェルの榊が担体材料として
使用される。検査すべき血液または血液由来分画例えば
血清をマイクロタイタープレートの小つェ゛ルに導入す
る。小ウェルの壁ム結合させておいた抗体が血液または
血液由来分画中に存在する抗散と反応し、その結果とし
て該抗原が結合する。免疫化学的反応の有無を検出する
ために、検出すべき抗原に対する標識抗体を使用し得る
。この標識抗体は固゛相に既に形成されている抗体−抗
原複合体と反応する:標識抗体は酵素好ましくはへ、ル
オキシダーゼ酵素と結合させておく。
次の段階で無色溶液(基質十色原体)を添加する。
この溶液は酵素によって有色化合物に変換される。
有色化合物の色の濃さは酵素の量に依存し、酵素の量は
結合した抗原の量に比例する。停止薬を加えて色を変え
ることも可能である。この方法では血液または血液由来
分画中の抗原を検出するなめにサンドイツチ法を使用し
ている。その他の免疫化学的方法、例えば阻害反応及び
競合反応を使用することi可能である。特゛に適当な酵
素の例は、アルカリホスフーアターゼ、→゛レアーゼび
前記のペルオキシダーゼ好ましくは西洋クサビペルオキ
シダーゼ(HRP)である、Hf1Pは水中で基質如ち
ペルオキシダーゼ好の変換を触媒す□る。この反応に必
要な電子はテトラメ□チルベンジジン(TMB)のご゛
とき発色物質によって供給される。TMBは有色複合体
に変換されこれが酵素反応の指標となぁ、呈色を視覚的
に観察してもよくまたは酵素反応を分析的に適当な方法
で検□出して−もよい。
血液中の抗原または抗体の存在を検出する場合、一般に
は検出を行なう以前に”検出すべき抗原または抗体を含
有する血清を血球゛から分離する。
実際には、特に酵素としてベル牙キシダー゛ゼを使用し
てエンザイムイムノアッセイ(El^)を行なう場合に
は、異常に濃い呈色という好ましくない結果がし、ばし
ば生じる。同様の現象はまた部分呈色として現れること
もある。
このような部分呈色現象が好ましくない結果及び結論に
導くことは明らかであろう、特に、所謂エイズの抗体“
検査の場合にはこのような現象が不利゛に作用する。即
ちエイズの抗体検査では、供血者の血清中でエイズウィ
ルスに対する抗体の存在゛を検査するためにエンザイム
イムノアッセイの定型手順を用いるからである。
従って本発明の特徴は、第四アンモニウム塩の存在下に
゛ペルオキシダーゼ活性の測定を行なうことにあ・る、
   ゛ 使用できる第四アンモニウム塩は例えば、ドデシル−ト
リメチルアンモニウムプロミド、ヘキサデシルトリメチ
ルアンモニウムプロミド、テトラデシルトリメチルアン
モニウムプロミド、アルキルジメチルベンジルアンモニ
ウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド、ベンジルジ
メチルヘキサデシルアンモニウムクロリド、セチルジメ
チルエチルアンモニウムプロミド、セチルピリジニウム
プロミド、セチルピリジニウムクロリド、ジメチルジオ
クタデシルアンモニウムプロミド及びメチルベンズエト
ニウムクロリドである。特に好ましい第四アンモニウム
塩は、ドデシルトリメチルアンモニウムプロミド(DT
八へ)、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムプロミド
(CTAB)またはアルキルジメチルベンジルアンモニ
ウムクロリド(ベンズアルコニウムクロリド)である、
その他の洗浄剤、特に第四ホスホニウム塩のごときカチ
オン性洗浄剤またはN−ラウロイルサルコシン、ラウリ
ル硫酸ナトリウムもしくはドデシル硫酸ナトリウムのご
ときアニオン性洗浄剤を任意に使用してもよい。
意外にも、前記のごとき第四アンモニウム塩を添加する
ことによって部分呈色を有意に抑制しながらペルオキシ
ダーゼ活性を測定することが可能なことが判明した。所
望の場合、希釈または非希釈の全血を標本として使用し
ペルオキシダーゼ活性の測定以前に赤血球をできるだけ
除去する。第四アンモニウム塩は第四アンモニウム塩含
有溶液の形態または固体化合物の形態で試験標本に添加
され得る。
第四アンモニウム塩を基質または色原体または基質7色
原体と共に試験標本に添加してもよい。
本発明はまた、ペルオキシダーゼ酵素結合体のごとき成
分と第四アンモニウム塩とを含む本発明方法を実施する
ための試験キットに係る。
血液または血液由来分画中の特異的結合性物質を定量的
及び/または定性的に検出するための本発明の方法は、
特異的結合性物質とその対応反応性物質との結合がペル
オキシダーゼ活性をもつ反応性成分で測定できるような
いがなる反応において使用されてもよい。ペルオキシダ
ーゼ活性の測定は特異的結合性物質の量及び/または存
在の尺度となる。
例えば、前記のごときサンドイッチ反応、阻害反応また
は競合反応のいずれの使用も可能である。
「特異的結合性物質」は、例えばハブテン、抗原もしく
はそのフラグメント、抗体もしくはそのフラグメント、
プロティンA、DNAまたはRNAを意味すると理解さ
れたい。
「その対応反応性物質」は、特異的結合性物質に結合親
和性をもつ物質、例えばハブテン、抗原もしくはそのフ
ラグメント、抗体もしくはそのフラグメント、プロティ
ンA、DNAまたはRN八を意味すると理解されたい、
この対応反応性物質は任意に担体材料に結合されてもよ
い。
「反応性成分」は、ペルオキシダーゼ活性をもち。
固体担体1こ結合される必要がなく、また固体形態、凍
結乾燥形態または溶液形態で使用され得る物質、例えば
ハブテン、抗原もしくはそのフラグメント、抗体もしく
はそのフラグメント、プロティンA、DNAまたはRN
Aを意味すると理解されたい。
本発明方法を使用しサンドイッチ反応で抗原を検出する
場合、該抗原を、測定すべき該抗原に対する抗体を予め
結合させた担体材料と共にインキュベートする。担体と
しては例えばガラスまたはプラスチックから成る試験管
、マイクロタイタープレート、棒、ビーズまたは円板、
等を使用し得る。
固体担体に結合させた抗体と測定すべき抗原との間の複
合体の形成を検出するために、次に酵素標識した第2抗
体を添加する。
酵素は特に反応性と安定性とに基づいて選択される。好
ましい酵素はアルカリホスファターゼ、ウレアーゼ、グ
ルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及び
ペルオキシダーゼであり、特にペルオキシダーゼ類が好
ましい。これらの酵素は、有色成分が関与するペルオキ
シド基質の変換を触媒する。ペルオキシダーゼ類のうち
でも特に、安定性がよく廉価なHRPが好ましい、この
酵素反応に必要な電子供与物質は例えば色原体である。
適当な色原体は例えば、テトラメチルベンジジン、0−
フ二二レンジアミン、5−アミノサリチル酸、2.2°
−アジノージ−[3−エチルベンゾチアゾリン−6−ス
ルフォネート]であり、テトラメチルベンジジン(TM
B)が特に好ましい、 TMBは反応中に有色複合体に
変換され、これによって酵素反応が検出され、測定すべ
き抗原の定性的及び/または定量的尺度を与える。
次に本発明を実施例に基づいて説明する。
え1匠 ゞ のHBsABl  二     のHasΔg陰性
の血清プールを検査した。
^・(1 1、被覆されたマイクロタイタープレート免疫化学にお
いて公知の方法を用いポリスチレンマイクロタイタープ
レートの小ウェルの内面をHBsA1?に対するモノク
ローナル抗体で被覆した。
2、結合体 免疫化学において公知の方法を用いHBsAyに対する
抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)との結合
体を調製した。
3、基質7色原体 基質として尿素ペルオキシダーゼ溶液を使用し色原体と
してTMB溶液(ジメチルスルホキシドに溶解したテト
ラメチルベンジジン)を使用した。基質7色原体溶液を
等容の2つの部分に分け、一方の部分に濃度0.2g/
lのの第四アンモニウム塩(CTAB)を添加しくグル
ープA)、他方の部分には第四アンモニウム塩を導入し
ながった(グループB)。
−L111 被覆したマイクロタイタープレートの各小ウェルに0.
1zi’の被検血清を入れプレートを50℃で30分間
インキュベートした。
次に小ウェルを除液し洗浄バッファ(PBS/Twee
n(登録商標))で4回洗浄し再度除液した。
次に各小つェールにO,flの結合体を導入した。50
℃で30分間インキュベートし小ウェルの除液、洗浄、
除液を繰り返しな。
次にマイクロタイタープレートを2つのグループ、グル
ープAとグループBとに分けた。グループAのプレート
の小ウェルに0.1mlの基質7色原体混合物をCTA
Bと共に添加した。グループBのプレートの小ウェルに
CTABを加えない基質7色原体混合物を添加した。
25℃で30分間インキュベートし、0.1mlの硫酸
溶液(2M)を各小ウェルに添加して酵素反応を停止さ
せた。
−ILL 双方のグループについて得られた結果を表に示す。
ルス・タレメンス・カ  ル・40 アイペルス 0発 明 者  ベトルス・アドリアヌ  オランダ国
、ス・レオナルトウス・  デ・218 ホーセンス

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)血液または血液由来分画中の特異的結合性物質を
    定量的及び/または定性的に検出するために、該特異的
    結合性物質とその対応反応性物質との間の結合親和性を
    利用し、ペルオキシダーゼ活性をもつ反応性成分を添加
    して特異的結合性物質とその対応反応性物質とを含む反
    応混合物をインキュベートし、前記反応混合物または反
    応混合物由来分画中のペルオキシダーゼ活性を測定し、
    該ペルオキシダーゼ活性が特異的結合性物質の定量及び
    /または存在の尺度を与える方法において、ペルオキシ
    ダーゼ活性の測定を第四アンモニウム塩の存在下に行な
    うことを特徴とする方法。
  2. (2)第四アンモニウム塩を基質と共に添加することを
    特徴とする請求項1に記載の血液または血液由来分画中
    の特異的結合性物質の定量的及び/または定性的検出方
    法。
  3. (3)第四アンモニウム塩を色原体と共に添加すること
    を特徴とする請求項1に記載の血液または血液由来分画
    中の特異的結合性物質の定量的及び/または定性的検出
    方法。
  4. (4)第四アンモニウム塩を基質/色原体と共に添加す
    ることを特徴とする請求項1に記載の血液または血液由
    来分画中の特異的結合性物質の定量的及び/または定性
    的検出方法、
  5. (5)第四アンモニウム塩としてドデシルトリメチルア
    ンモニウムプロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニ
    ウムプロミドまたはアルキルジメチルベンジルアンモニ
    ウムクロリドを使用することを特徴とする請求項1から
    4のいずれかに記載の血液または血液由来分画中の特異
    的結合性物質の定量的及び/または定性的検出方法。
  6. (6)−ペルオキシダーゼと、 −ペルオキシダーゼの基質と、 −色原体と、 −第四アンモニウム塩とを含むことを特徴とする請求項
    1から4に記載の方法実施用の試験キット。
JP1087836A 1988-04-06 1989-04-06 血液中の特異的結合性物質の検出方法及び該方法実施用の試験キット Expired - Lifetime JP2763910B2 (ja)

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DK (1) DK160689A (ja)
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