JPH0353166A - ヒト体液中の抗原および／または抗体の測定方法およびそのための試験キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、抗原／抗体複合体を形成させることによるヒ
ト体妓中の抗原および／または抗体の測定方法であって
、その抗原または抗体の含有量について試験しようとす
る試料を、固形担体に吸着させた、複合体を形戊する抗
体または抗原と各々接触させることからなる方法、およ
びこの方法を行うための試験キットに関するものである
。

ＤＥ−Ｃ−２４２４４６５から、血清中のＢ型肝炎抗原
およびその抗体の同時測定のための方法は知られている
。この検定の原理は阻害反応にあり、これは当然、系の
感度を実質上大きく低下させる。

カナダ国特許第１１４８８５９号は、種々の肝炎の指標
、即ちＢ型肝炎表面抗原およびＢ型肝炎コア抗原に対す
る抗体を同時に検出するための検定方法を記載している
。この方法の欠点は、検定しようとする２種類の物質を
、２種類の全く是なるタイプの反応によって検出しなけ
ればならないことに存する。即ち一方の反応パートナー
は放射活性なアイソトープでラベルしなければな５らず
、他方の反応パートナーは酵素的に検定される。

通常、少なくとも２８）類の免疫反応体を検定する場合
、工程の一定順序を厳密に守らなければならず、これは
当然、誤った測定結果を得る危険性を非常に増大させる
。検定すべき免疫反応体の数が多くなるほど、誤差の供
給源が多くなる。これに加え、複数の物質を検定する場
合、試料をしばしばピペット採取しなければならず、個
々の値の粘度に悪影響を与える。

本発明は、上記の欠点を含まない、放射ラベルしないで
実現し得る、ヒト体液試料中の複数の抗原および／また
は抗体の簡便な測定方法を堤供することを目的とするも
のである。

複数の抗原の同時検定に於いて、この目的は、抗原Ａｇ
ａ，、Ａｇａ，、−　−　−　Ａｇｂ，、Ａｇｌｌｔ、
・・・を含有する、試験しようとする試料を、検出しよ
うとする抗原Ａｇａ，％Ａｇａ，，　　・・・の１部分
に対する抗体Ａｋａ＋、Ａ　ｋａ．，　　・・・で被覆
した微量滴定プレートのウェルに導入し、検出しようと
する抗原Ａｇｂｌ、Ａｇｂｔ、・・・のその他の部分に
対する抗体Ａｋｂ，，　Ａｋｂ！、・・・で被覆した、
好ましくはくし形の１ｇ数の固形担体を試料と接触させ
、複合体形戊が終了した後、ウェルおよび固形担体を洗
浄して、吸着されなかったタンパクを除去し、微ｆｆｉ
ｆｉ定プレートのウェルおよび／または固形担体に吸着
された複合体Ａｋａ，−Ａｇａ＋、・・・および／また
はＡ　ｋｂ．　−　Ａ　ｇｂ，、・・・を、検出しよう
とする抗原ＡｇａＩｓ　Ａｇａｔ、−・−Ａｇｂ，、Ａ
　ｇｂ．、・・・に対するラベルされた抗体酵素Ａ　ｋ
ａ＋　Ｅ　＊、・・・Ａｋｂ．Ｅ＊、・・・の混金物と
共にインキュベートし、複合体に結合した酵素Ａｋａ＋
　　Ａｇａ＋−Ａｋａ．Ｅ＊、−　−　−　Ａｋｂ，−
Ａｇｂ＋−Ａｋｂ，Ｅｔ、・・の活性を、染色性基質と
反応させて光度計により測定することからなる本発明の
方法によって達成される。

検定しようとする試料中に含有されている複数の抗体Ａ
ｋａ＋ＳＡｋａｔ、・−・Ａｋｂ，、Ａ　ｋｂ，、・・
・を同時に測定するためには、検出しようとする抗一体
Ａｋａ，，八ｋａｔ、・・・の１部分に相補的な抗原Ａ
４ａ．、Ａｇａｔｓ　　・・・で彼覆した微量滴定プレ
ートのウェルに試料を導入し、検出しようとする抗体Ａ
ｋｂ，，　Ａｋｂ．、・・・のその他の部分に相補的な
抗原Ａｇｂ＋，　Ａｇｂ＊、・・・で破覆した、好まし
くはくし形の複数の固形担体を試料と接触させ、複合体
形成が終了した後、ウェルおよび固形担体を洗浄して、
吸着されなかったタンパクを除去し、微量滴定プレート
のウェルおよび／または固形担体に吸着した複合体Ａｇ
ａ＋　　Ａｋａ（、・・・および／またはＡｇｂ，　　
Ａｋｂ＋、・・・を、検出しようとする抗体Ａｋａ＋、
Ａ　ｋａｔ、・・・Ａｋｂ１、Ａ　ｋｂ，、・・・に相
補的なラベルされた抗原酵素Ａ　ｇａ３　Ｅ　＊、・・
・Ａｇｂ＋Ｅ＊の混合物と共にインキュベートし、酵素
Ａｇａ＋−Ａｋａ＋−Ａｇａ＋Ｅ＊、”　’　Ａｇｂ．
−Ａｋｂ，−ＡｇｂｔＥ＊、・・・の活性を、染色性基
質と反応させて光度計により測定する。

本発明の方法によれば、使用する微ｆｆｉ！定プレート
のウェルおよび使用する固形担体を被覆し、検出しよう
とする抗体Ａｋａ，、・・・または抗原Ａｇｂ＋、・・
・各々に相補的な抗原Ａｇａ，、・・・または抗体Ａｋ
ｂ，を用いることによって、少なくとも１種類の抗体Ａ
ｋａ＋、・・・および少なくとも１種類の抗原Ａｇｂ＋
、・・・を同時に検出することも可能である。

即ち、本発明の方法は、試料を１回だけビベット採取し
、その１つの試料中で複数の抗体および／または抗原を
検定することを可能にする。従って、通常の操作におい
て直面するピペット採取の際の誤差の危険性は、本発明
の方法で最小限度にされる。

本発明は更に、微量滴定プレート、および微量滴定プレ
ートのウェルに適合した、とりわけくし形担体である固
形担体からなる、本方法を行うための試験キットであっ
て、？＆滑滴定プレートのウェルおよび固形担体が、検
出しようとする抗原および／または抗体と各々ｔｆＪ合
体を形成するｌまたは数種の抗原八ｇａｌｓ八ｇｂｌ１
　　・・・、またはｌまたは数種の抗体Ａｋａ．、Ａｋ
ｂ．、・・・で被覆されていることを特徴とする試験キ
ットに関するものである。

抗原および抗体の同時放射免疫化学的検定のための微量
滴定プレートおよびくし形担体からなるキットは、米国
特許第４，　２　７　８，　２　５　９号から知られて
いる。

本発明を、以下の実施例によって更に詳細に説明する。

Ｘ奥図ユ　生物学的液体中のアボリボタンパクＡ＋（ア
ンチアテローム性動脈硬化症ＨＤリボタンパク）および
アボタンパクＢ（アテローム性硬化症ＬＤリポタンパク
）の同時検定 微量滴定プレートのウェルを、アフィニティ精製したヒ
ツジ抗アボ八抗体の０．１ＩＩＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．
４）中、１　ｍｙｇ／ｙｔ（ｌの抗体濃度の溶液２００
ｓｙ４（１ウェル当たり）で室温にて１２時間処理し、
抗体で被覆した。この後、ウェルを、Ｏ．０５％ツィー
ン２０含有ＰＢＳ緩衝液２５０ｍｙｌで少なくとも３回
洗浄した。ウェルのポリスチレン壁上に飽和されていな
い桔合部位があれば、それをＰＢＳ緩衝液中０．２％ｗ
／ｖアルブミン溶岐を室温にて２時間加えることによっ
て飽和させ、その後、プレートを更に洗浄し、減圧下に
乾燥させた。プレートをシリカゲル下で維持した。

同様にして、試験用くし状体のプレートを、アフィニテ
ィ精製した抗アポＢ抗体で被覆した。

検定しようとする試ネ［および対照をＰＢＳツィーン緩
衝液中１　：　５００に予め希釈し、試験用くし状体を
押入して微ｍｔａ定プレート中、室温で２時間インキュ
ベートした。試料の容量は２００ＩＩｌｙ１であった。

この後、微量滴定プレートのウェルおよび試験用くし状
体をＰＢＳツィーン緩衝液中で十分洗浄し、ホースラデ
ィッシュペルオキシダーゼ標識した精製抗アボＡ＋およ
び抗アポＢ抗体の混合物２００ｍｙｌをピペットにてウ
ェルに移した。試験用くし状体を挿入し、このキットを
室温で１時間インキュベートした。更に洗浄した後、テ
トラメチルベンジジン含有基質２　０　０　ｍｙｌヲ、
抗アポＡ＋で肢蕩した微量滴定プレートおよび肢葭して
いない箪２の微ｍ滴定プレートに各々ビベットにて移し
た。

試験用くし状体を笛２の微量滴定プレートにＩｌｒＩ人
し、２個のプレートを室温で３０分間インキュベートし
た。この後、２個のプレートにおける酵素的基質反応を
、４ｎ硫酸５０ｍｙｌの添加によって停止させた。光度
計によって、２個のプレート中の各試料の吸光度を４５
ＯｎＩｌ＋で測定し、試料中のアボＡｌおよびアボＢの
濃度を、使用した対照との比較によって評価した。

本発明の方法によって、医療上診断および予後に適切な
、各試料の濃度の指標を組み立てることも可能である。

実施例２　抗ＴＢＥ（ダニ媒介脳炎）ＩｇＭ抗体、抗Ｔ
ＢＥ　　ＩｇＧ抗体および抗ボレリア・ブルグドルフェ
リエ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｒａｒｉｅ）
抗体の同時検定 微量滴定プレートのウェルを、実施例ｌと同様にしてＴ
ＢＥ抗原の精製ウイルス懸濁液で被覆し、くし状体の層
板をボレリア・ブルグドルフェリエ抗原の懸濁液で被覆
した。試料のｌ：５０希釈液２００ｍｙｌを微量滴定プ
レートに導入し、試験用くし状体を押入し、このキット
を４５℃で２時間インキコベートした。微量滴定プレー
トのウェルおよび試験用くし状体を洗浄し、被覆した微
量滴定プレートに、アルカリホスファターゼ（酵素１）
で標識した抗ヒト１ｇＧおよびホースラディッシュペル
オキシダーゼ（酊素２）で標識したＴ．ＢＥ抗原の混合
物をビペノトにて移した。

第２の被覆していない微量滴定プレートに、酵素１で標
識した抗ヒトｌｇＧを同様に負荷し、試験用くし状体を
ｔｉｌｉ人した。両プレートを４５℃で１時間インキュ
ベートし、プレートおよび試験用くし状体を再び洗浄し
、被覆した微量滴定プレートに０−フェニレンジアミン
およびｐ−ニトロフエニルホスフエー｝（ＰＮＰＰ）の
適切にＨ　衝化された溶液中混合物をビペノトにて移し
た。

ＰＮＰＰを第２のプレートに導入し、試験用くし状体を
押入した。両プレートを室温で３０分間インキエベート
し、次いで試験用くし状体を捨てた。プレート２で起こ
った反応を４ｎ硫酸５０ｍｙｌの添加によって停止させ
た。プレートｌについて、各ウェルにおける吸光度を適
当な光度計によって測定した（４０５ｎａにおける酵素
ｌの酊素基質吸光度の測定：この後、４ｎ硫酸５０ｍｙ
ｌを加え、酵素２のΔ夢素基質吸光度を４９２ｎｍで１
１１１１定した）。

＾夢素基質Ｎｏ．１の吸光度は試料の抗ＴＢＥ　　Ｉｇ
Ｇ含有量に対応し、酵素基質Ｎｏ．２の吸光度は試料の
抗ＴＢＥＩｇＭ含有量に対応する。

次の工程で、プレート２の吸光度の測定をｉｔ素１に適
切な波長（４０５ｎｍ）で行った。プレート２では、測
定された吸光度は抗ボレリア・ブルグドルフェリエＩｇ
Ｇ抗体の含有量に対応する。

このように、ＴＢＥおよび／またはボレリア・プルグド
ルフエリエによって起こり得る感染を１回の検定で知る
ことが可能である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、抗原／抗体複合体を形成させることによってヒト体
   液中の抗原を測定する方法であって、試験しようとする
   試料中に含有されている複数の抗原を同時に測定するた
   めに、 検出しようとする抗原の第１の部分に対する第１の抗体
   で被覆されたウェルを有する微量滴定プレートを用意し
   、 該微量滴定プレートに、試験しようとする試料を導入し
   、 検出しようとする抗原の第２の部分に対する第２の抗体
   で被覆された複数の固形担体を加え、該複数の固形担体
   と該試験しようとする試料を接触させて、該微量滴定プ
   レートのウェルおよび該固形担体の少なくとも一方に複
   合体を吸着させ、該ウェルおよび該固形担体を洗浄して
   、吸着されなかったタンパク質を除去し、 検出しようとする該第１および該第２の抗原の各々に対
   するラベルされた抗体酵素の混合物を用意し、 該複合体を該混合物と共にインキュベートして、該ラベ
   ルされた抗体酵素を該複合体に結合させ、該複合体に結
   合した該酵素の活性を、染色性基質と反応させて光度計
   により測定することからなる方法。 ２、抗体／抗原複合体を形成させることによってヒト体
   液中の抗体を測定する方法であって、試験しようとする
   試料中に含有されている複数の抗体を同時に測定するた
   めに、 検出しようとする抗体の第１の部分に相補的な第１の抗
   原で被覆されたウェルを有する微量滴定プレートを用意
   し、 該微量滴定プレートに、試験しようとする試料を導入し
   、 検出しようとする抗体の第２の部分に相補的な第２の抗
   原で被覆された複数の固形担体を加え、該複数の固形担
   体と試験しようとする試料を接触させて、該微量滴定プ
   レートのウェルおよび該固形担体の少なくとも一方に複
   合体を吸着させ、該ウェルおよび該固形担体を洗浄して
   、吸着されなかったタンパク質を除去し、 検出しようとする該第１および該第２の抗体の各々に相
   補的なラベルされた抗原酵素の混合物を用意し、 該複合体を該混合物と共にインキュベートして、該ラベ
   ルされた抗原酵素を該複合体に結合させ、該複合体に結
   合した該酵素の活性を、染色性基質と反応させて光度計
   により測定することからなる方法。 ３、該固形担体がくし形である請求項１または２に記載
   の方法。 ４、該微量滴定プレートの該ウェルを、該少なくとも１
   種の第１の抗原および該少なくとも１種の第１の抗体の
   いずれかで被覆し、該固形担体を、検出しようとする該
   少なくとも１種の第１の抗体および該少なくとも１種の
   第１の抗原に相補的な該少なくとも１種の第２の抗原お
   よび該少なくとも１種の第２の抗体の各々で被覆するこ
   とからなる、請求項１または２に記載の、試料中に含有
   されている少なくとも１種の抗体および少なくとも１種
   の抗原を同時に試験するための方法。 ５、複数のウェルを含む微量滴定プレートおよび該ウェ
   ルに適合した固形担体からなる、請求項１または２に記
   載の方法を行うための試験キットであって、該微量滴定
   プレートの該ウェルおよび該固形担体が、検出しようと
   する少なくとも１種の抗原および少なくとも１種の抗体
   と複合体を形成するのに適した少なくとも１種の抗原お
   よび少なくとも１種の抗体で被覆されている試験キット
   。 ６、該固形担体がくし形にデザインされている請求項５
   に記載の試験キット。 ７、複数のウェルを含む微量滴定プレートおよび該ウェ
   ルに適合した固形担体からなる、請求項４に記載の方法
   を行うための試験キットであって、該微量滴定プレート
   の該ウェルおよび該固形担体が、検出しようとする少な
   くとも１種の抗原および少なくとも１種の抗体と複合体
   を形成するのに適した少なくとも１種の抗原および少な
   くとも１種の抗体で被覆されている試験キット。 ８、該固形担体がくし形にデザインされている請求項７
   に記載の試験キット。