CN112630436A - 一种定量检测tex101浓度的荧光试剂条的制备方法及其应用 - Google Patents
一种定量检测tex101浓度的荧光试剂条的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种定量检测TEX101浓度的荧光试剂条的制备方法及其应用，属于体外诊断试剂领域，本发明将荧光免疫层析技术引入TEX101的检测中，制备所得的TEX101的免疫层析试纸条的采用双抗体夹心法，样本垫中的TEX101抗原在层析作用下与标记垫上荧光微球标记的TEX101抗体结合形成复合物，该复合物在层析作用下移动至包被膜的检测线，由于包被膜检测线上包被有识别TEX101抗原的另一表位的抗体，形成双抗体夹心复合物；可检测精液样本中TEX101的浓度，通过免疫荧光分析仪即可得读取检测结果，无需专业操作人员，实现了TEX101的单人份定量检测，具有方便快捷、操作简单、灵敏度高、操作简单、检测成本低等优点。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂领域，具体涉及一种定量检测TEX101浓度的荧光试剂条的制备方法及其应用。
背景技术
无精子症是指在射精过程中完全没有精子，它占男性不育病例的10〜15%，占所有无精子症病例的60%，无精子症分为阻塞性无精子症OA和非阻塞性无精子症NOA，阻塞性无精子症OA和非阻塞性无精子症NOA的治疗对应不同的治疗方法。
目前临床上精子质量的评估主要采用：精液分析和性激素血清学检测。精液分析是最常用的检测方法，但是其分析结果受主观因素影响、精密度低、重复性差，对男性生育力评估和临床应用的价值有限；而性激素血清学检测如FSH、睾酮、抑制素B等则无法预测男性辅助生殖PESA/TESE的结果；并且以上两类检测方法都无法区分梗阻性无精症OA和非梗阻性无精症NOA，无法对症治疗，因此，临床上迫切需要新型的生物标记物，用于客观评估男性生育力，鉴别梗阻性无精症OA和非梗阻性无精症NOA，预测辅助生殖的结局。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中存在的不足和局限，提供一种操作简单、方便快捷、经济、测定准确的TEX101检测试纸条制备方法及其应用。
本发明的技术方案是：一种定量检测TEX101浓度的荧光试剂条的制备方法，该试剂条包括顺次衔接于PVC底板的样品垫、标记垫、包被膜、吸水纸；
标记垫上喷涂有荧光微球标记的第一TEX101单克隆抗体和荧光微球标记的亲和素；
包被膜包含检测线和质控线：检测线与质控线之间的间隔为4〜8nm，所述检测线包被有与所述荧光微球标记的第一TEX101单克隆抗体处于不同表位的第二TEX101单克隆抗体，质控线包被有特异性识别亲和素的兔抗亲和素抗体。
进一步的技术方案，荧光微球标记的第一TEX101单克隆抗体的浓度为0.1〜1.0mg/mL，稀释比例为5%〜20%；所述荧光微球标记的亲和素的浓度为0.1〜1.0mg/mL，稀释比例为0.5%〜5%。
进一步的技术方案，含荧光微球标记的第一TEX101单克隆抗体和荧光微球标记的亲和素的标记垫处理液的喷量为3〜6 μL/cm。
进一步的技术方案，荧光微球的粒径为100〜500nm；所述荧光微球的激发波长为310〜550nm，发射波长为340〜620nm。
进一步的技术方案，检测线上包被的第二TEX101单克隆抗体的浓度为0.5〜2 mg/mL，喷量 0.1〜0.2μL/cm；所述质控线上包被的兔抗亲和素抗体的浓度为0.5〜2 mg/mL，喷量为0.1〜1.0L/mm。
一种用于制备定量检测TEX101浓度的荧光试剂条的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备荧光微球标记蛋白：取一定量的荧光微球，10000〜15000 rpm第一次离心5〜15分钟，第一次离心分离得到的沉淀物用pH为6.0〜7.0的10〜100 mM磷酸盐缓冲液调节至浓度为0.1%〜1%，并超声分散；加入终浓度为0.1〜5 mg/mL的碳二亚胺(EDC)，混匀，再加入终浓度为0.1〜5 mg/mL的N-轻基琥珀酰亚胺(NHS)，混匀；室温孵育20〜40分钟后10000〜15000 rpm第二次离心5〜15分钟，第二次离心分离得到的沉淀物用pH为6.0〜7.0的10〜100mM磷酸盐缓冲液溶解；
将复溶后的荧光微球超声分散，分为两管并按照含0.1〜1.0 mg/mL荧光微球的比例分别加入第一TEX101单克隆抗体和亲和素，混匀后室温旋转混合反应1.5〜3小时，10000〜15000 rpm第三次离心5〜15分钟，第三次离心分离得到的沉淀物用含10〜40 mM乙醇胺和0.05%〜1%酪蛋白的Tris〜HCl(10〜40mM，pH为7.0〜8.0)复溶，超声分散后旋转混合反应0.5〜1小时；10000〜15000 rpm第四次离心5〜I5分钟，第四次离心分离得到的沉淀物用微球保存液复溶，2〜8℃保存；
(2)预处理样品垫：将样品垫用封闭液浸泡5分钟后，置于湿度小于20%、温度在40〜50℃的烘箱中，烘箱干燥12〜24 小时后于将样品垫放置于2〜30℃的环境中密封保存；其中，封闭液为含0.1〜1%的Tris、0.1〜1%的Tween20、0.1〜1%的酪蛋白、0.1〜2% 的PEG20000、0.005〜0.05%的鼠抗人红细胞；
(3)制备标记垫：将荧光微球标记的第一TEX101单克隆抗体和荧光微球标记的亲和素分别按5%〜20%和0.5%〜5%的稀释比例用标记垫处理液喷涂在标记垫上，喷量为3〜6uL/cm；所述标记垫处理液中含有 0.2〜2%的酪蛋白、5%〜20%的蔗糖、0.1〜1%的Tween-20、0.1〜0.5%的PVP40、0.02〜0.05%的Proclin300、0.01 〜0.05M、7.4的PBS缓冲液；将制备好的标记垫置于湿度小于20%、温度为40〜50℃的烘箱中，烘箱干燥12〜24 h后将标记垫放置于2〜30℃的环境中密封保存；
(4)制备包被膜：分别将检测线包被的第二TEX101单克隆抗体和质控线包被的兔抗亲和素用包被缓冲液调节浓度为0.5〜2 mg/mL，将第二TEX101单克隆抗体喷到包被膜上的检测线，将兔抗亲和素抗体喷到包被膜上的质控线，第二TEX101单克隆抗体和兔抗亲和素抗体的用量按膜包被液量均为0.1〜0.2μL/mm，检测线和质控线间隔4〜8 mm，将包被膜放置于湿度小于20%、温度为40〜50℃的烘箱中，烘箱干燥24〜72 小时后将包被膜放置于2〜30℃的环境中密封保存，备用；
（5）制备试纸条：在PVC底板上顺次相互搭接地黏贴样品垫、标记垫、包被膜和吸水纸得到试纸板，按照切割要求将试纸板切割成3〜4 mm宽度的试纸条。
进一步的技术方案，定量检测TEX101浓度的荧光试剂条的制备方法在精液TEX101的浓度检测中的应用。
本发明的有益效果：
睾丸表达蛋白101（TEX101），一种细胞特异性糖蛋白，以糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白的形式存在干细胞表面。研究表明通过TEX101浓度这一单一指标的检测能够同时鉴别梗阻性无精症OA和非梗阻性无精症NOA，本发明将荧光免疫层析技术引入TEX101的检测中，可检测精液样本中TEX101的浓度，通过免疫荧光分析仪即可得读取检测结果，无需专业操作人员，实现了TEX101的单人份定量检测，具有方便快捷、操作简单、灵敏度高、操作简单、检测成本低等优点。
附图说明
图1为本发明结构示意图，
其中，1、样品垫，2、标记垫，3、包被膜，4、吸水纸，5、检测线，6、质控线，7、PVC底板。
具体实施方式
下面通过非限制性实施例，进一步阐述本发明，理解本发明。
本发明提供了一种定量检测TEX101浓度的荧光试剂条的制备方法，具体制备方法如下：
（1）制备荧光微球标记蛋白：取0.lmL10%的荧光微球，15000 rpm第一次离心15分钟，沉淀物用pH 6.5的50 mM磷酸盐缓冲液调节浓度为1%，并超声分散；加入终浓度为2 mg/mL的碳二亚胺(EDC)，混匀，再加入终浓度为5 mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，混匀；室温孵育20分钟后15000 rpm第二次离心15分钟，沉淀物用pH 6.5的50 mM磷酸盐缓冲液溶解；
将复溶后的焚光微球超声分散，并分两管分别加入0.2 mg的第一TEX101单克隆抗体和0.1mg的亲和素，混匀后室温旋转混合反应2小时，15000 rpm第三次离心15分钟，第三次离心得到的沉淀物用含30 mM乙醇胺和0.5%酪蛋白的Tris〜HCl (20 mM，pH 8.0)复溶，超声分散后旋转混合反应1小时，15000 rpm第四次离心15分钟，沉淀用微球保存液复溶，2〜8℃保存；
(2)预处理样品垫1：将样品垫1用封闭液浸泡5分钟后，置于湿度小于20%的50℃的烘箱，干燥12 h后于20〜30℃的环境中TC密封保存；其中，封闭液含0.1%的Tris、1%的Tween20、0.5%的酪蛋白、1%的PEG20000、0.01%的鼠抗人红细胞；
(3)制备标记垫2：将荧光微球标记的第一TEX101单克隆抗体和荧光微球标记的亲和素分别按10%和1%的稀释比例用标记垫2处理液喷涂在标记垫2上，喷量为4 uL/cm，标记垫2处理液中含有0.5%的酪蛋白、5%的蔗糖、1%的Tween-20、0. 5%的PVP40、0. 03%的Proclin300、pH为7.4的0.05M的PBS缓冲液；将制备好的标记垫2置于湿度小于20%的50℃烘箱中，干燥24 h后放置于于20〜30℃环境中密封保存；
(4)制备包被膜3：包被膜3上设置有检测线5与质控线6，检测线5与质控线6之间的间隔为4〜8nm，分别将检测线5包被的第二TEX101单克隆抗体和质控线6包被的兔抗亲和素用包被缓冲液调节浓度为1.0 mg/mL，将第二TEX101单克隆抗体喷到包被膜3上的检测线5，将兔抗亲和素喷到包被膜3上的质控线6，第二TEX101单克隆抗体和兔抗亲和素的用量按膜包被液量均为0.1μL/mm，检测线5和质控线6之间间隔4 mm，将包被膜3放置于湿度小于20%的50℃烘箱，干燥72 h后将包被膜3放置于20〜30℃环境中密封保存备用；
(5)制备试纸条：如图1所示，在PVC底板7上顺次相互搭接地黏贴样品垫1、标记垫2、包被膜3和吸水纸4得到试纸板，按照切割要求将试纸板切割成3〜4 mm宽度的试纸条。
本发明提供的荧光试剂条用于定量检测TEX101浓度的具体工作过程如下：
(1)绘制标准曲线：将TEX101抗原用阴性血配制成25 ng/mL、10 ng/mL、5 ng/mL、1.0 ng/mL、0.5 ng/mL、 0.1 ng/mL、0 ng/mL，采用用同一批次的试纸和试剂，每个浓度点测试6次；利用免疫荧光分析仪，获取检测线5和质控线6的荧光强度数据，分析数据，以检测线5(T带）、质控线6(C 带)的荧光强度比值为纵坐标，TEX101参考品浓度为横坐标，建立方程并拟合成标准曲线，将标准曲线信息用烧录软件写到ID芯片中；
(2)样品的检测：从试剂盒中取出检测条，撕开铝箔袋包装后，平放检测条，平衡5分钟，取100 uL样本加入加样孔中，室温避光反应15分钟；将ID芯片插入免疫荧光分析仪，将检测卡插入免疫荧光分析仪插卡口，点击“测试”，仪器通过分析软件自动计算出待测样本中TEX101的浓度。
综上所述，本发明中提供的TEX101的免疫层析试纸条的采用双抗体夹心法，样本垫中的TEX101抗原在层析作用下与标记垫2上荧光微球标记的TEX101抗体结合形成复合物，该复合物在层析作用下移动至包被膜3的检测线5，由于包被膜3检测线5上包被有识别TEX101抗原的另一表位的抗体，形成双抗体夹心复合物。复合物聚集在包被膜3的检测线5处，受到光源激发释放出相应波长的发射光，样本中抗原浓度越高，检测线5发射光的强度越高。本发明通过荧光检测系统将光信号转化为数字信号，以浓度点为横坐标，检测线5信号值比质控线6信号值(T/C)为纵坐标绘制标准曲线，从而可准确定量的计算出样本中TEX101的浓度；本发明与现有技术相比，有如下优点：本发明检测线5和质控线6采用独立的反应系统，互不干扰和影响，并采用T/C值的方式进行定标，保证了测试结果的准确度。
Claims (7)
1.一种定量检测TEX101浓度的荧光试剂条的制备方法，其特征在于：所述试剂条包括顺次衔接于PVC底板的样品垫、标记垫、包被膜、吸水纸；
所述标记垫上喷涂有荧光微球标记的第一TEX101单克隆抗体和荧光微球标记的亲和素；
所述包被膜包含检测线和质控线：检测线与质控线之间的间隔为4〜8nm，所述检测线包被有与所述荧光微球标记的第一TEX101单克隆抗体处于不同表位的第二TEX101单克隆抗体，所述质控线包被有特异性识别亲和素的兔抗亲和素抗体。
2.根据权利要求1所述的一种定量检测TEX101浓度的荧光试剂条的制备方法，其特征在于：所述荧光微球标记的第一TEX101单克隆抗体的浓度为0.1〜1.0mg/mL，稀释比例为5%〜20%；所述荧光微球标记的亲和素的浓度为0.1〜1.0mg/mL，稀释比例为0.5%〜5%。
3.根据权利要求2所述的一种定量检测TEX101浓度的荧光试剂条的制备方法，其特征在于：所述含荧光微球标记的第一TEX101单克隆抗体和荧光微球标记的亲和素的标记垫处理液的喷量为3〜6μL/cm。
4.根据权利要求1所述的一种定量检测TEX101浓度的荧光试剂条的制备方法，其特征在于：所述荧光微球的粒径为100〜500nm；所述荧光微球的激发波长为310〜550nm，发射波长为340〜620nm。
5.根据权利要求1所述的一种定量检测TEX101浓度的荧光试剂条的制备方法，其特征在于：所述检测线上包被的第二TEX101单克隆抗体的浓度为0.5〜2 mg/mL，喷量 0.1〜0.2μL/cm；所述质控线上包被的兔抗亲和素抗体的浓度为0.5〜2 mg/mL，喷量为0.1〜1.0L/mm。
6.根据权利要求1所述的一种定量检测TEX101浓度的荧光试剂条的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)制备荧光微球标记蛋白：取一定量的荧光微球，10000〜15000 rpm第一次离心5〜15分钟，第一次离心分离得到的沉淀物用pH为6.0〜7.0的10〜100 mM磷酸盐缓冲液调节至浓度为0.1%〜1%，并超声分散；加入终浓度为0.1〜5 mg/mL的碳二亚胺(EDC)，混匀，再加入终浓度为0.1〜5 mg/mL的N-轻基琥珀酰亚胺(NHS)，混匀；室温孵育20〜40分钟后10000〜15000 rpm第二次离心5〜15分钟，第二次离心分离得到的沉淀物用pH值6.0〜7.0的10〜100mM磷酸盐缓冲液溶解；
将复溶后的荧光微球超声分散，分为两管并按照含0.1〜1.0 mg/mL荧光微球的比例分别加入第一TEX101单克隆抗体和亲和素，混匀后室温旋转混合反应1.5〜3小时，10000〜15000 rpm第三次离心5〜15分钟，第三次离心分离得到的沉淀物用含10〜40 mM乙醇胺和0.05%〜1%酪蛋白的Tris〜HCl(10〜40mM，pH值7.0〜8.0)复溶，超声分散后旋转混合反应0.5〜1小时；10000〜15000 rpm第四次离心5〜I5分钟，第四次离心分离得到的沉淀物用微球保存液复溶，2〜8℃保存；
(2)预处理样品垫：将样品垫用封闭液浸泡5分钟后，置于湿度小于20%、温度在40〜50℃的烘箱中，烘箱干燥12〜24小时后于将样品垫放置于2〜30℃的环境中密封保存；其中，封闭液为含0.1〜1%的Tris、0.1〜1%的Tween20、0.1〜1%的酪蛋白、0.1〜2% 的PEG20000、0.005〜0.05%的鼠抗人红细胞；
(3)制备标记垫：将荧光微球标记的第一TEX101单克隆抗体和荧光微球标记的亲和素分别按5%〜20%和0.5%〜5%的稀释比例用标记垫处理液喷涂在标记垫上，喷量为3〜6 uL/cm；所述标记垫处理液中含有 0.2〜2%的酪蛋白、5%〜20%的蔗糖、0.1〜1%的Tween-20、0.1〜0.5%的PVP40、0.02〜0.05%的Proclin300、0.01 〜0.05M、7.4的PBS缓冲液；将制备好的标记垫置于湿度小于20%、温度为40〜50℃的烘箱中，烘箱干燥12〜24小时后将标记垫放置于2〜30℃的环境中密封保存；
(4)制备包被膜：分别将检测线包被的第二TEX101单克隆抗体和质控线包被的兔抗亲和素用包被缓冲液调节浓度为0.5〜2 mg/mL，将第二TEX101单克隆抗体喷到包被膜上的检测线，将兔抗亲和素抗体喷到包被膜上的质控线，第二TEX101单克隆抗体和兔抗亲和素抗体的用量按膜包被液量均为0.1〜0.2μL/mm，检测线和质控线间隔4〜8mm，将包被膜放置于湿度小于20%、温度为40〜50℃的烘箱中，烘箱干燥24〜72小时后将包被膜放置于2〜30℃的环境中密封保存，备用；
（5）制备试纸条：在PVC底板上顺次相互搭接地黏贴样品垫、标记垫、包被膜和吸水纸得到试纸板，按照切割要求将试纸板切割成3〜4mm宽度的试纸条。
7.根据权利要求1-6任一所述的定量检测TEX101浓度的荧光试剂条的制备方法在精液TEX101的浓度检测中的应用。
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