CN116375849A - 一种基于p30蛋白单域抗体的非洲猪瘟病毒管式化学发光免疫分析检测试剂盒及应用 - Google Patents

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蒋韬
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Abstract

本发明提供了一种基于p30蛋白单域抗体的非洲猪瘟病毒管式化学发光免疫分析检测试剂盒及其应用，属于体外诊断产品技术领域。本发明提供的试剂盒包括磁微粒混悬液、酶标抗体、稀释液、校准品、质控品、浓缩洗涤液和发光底物。本发明所述试剂盒使用双抗体夹心法检测猪全血、血清、组织处理液中非洲猪瘟病毒抗原含量，配套全自动化学发光免疫分析仪，能实现全自动化、快速、高通量、封闭检测等特点，适合田间大量样本中非洲猪瘟病毒的筛查。

Description

一种基于p30蛋白单域抗体的非洲猪瘟病毒管式化学发光免 疫分析检测试剂盒及应用
技术领域
本发明属于体外诊断产品技术领域，具体涉及一种基于p30蛋白单域抗体的非洲猪瘟病毒管式化学发光免疫分析检测试剂盒及应用。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染猪引起的一种高致病性传染病，致死率可达到100％。目前，ASFV流行颇为广泛，给我国养猪业带来了巨大挑战。因该病尚未研发出安全有效的疫苗及没有针对性的治疗药物和特效的治疗方法，进而高效精准的诊断方法对于该病的防控至关重要。而p30作为一个早期表达蛋白，在病毒感染后2h便可检测到该蛋白，并持续整个感染周期，与其他蛋白相比，具有更高的检测效率，是ASFV诊断的一个良好的靶标蛋白。目前，市面上常见的诊断方法在临床检测中存在着敏感性弱、假阳性多、自动化程度低等诸多不足。
化学发光免疫分析法(chemiluminesecence immunoassay，CLIA)是一种以免疫反应原理为基础，与化学发光技术相结合的超微活性免疫测定方法，具备灵敏度高、特异性强、操作方法简单、自动化程度高、取样量少的特点，现已广泛应用于动物疫病临床检测。然而，有关针对非洲猪瘟CLIA诊断技术的研究报道相对较少。同时，ASF的临床表现与猪瘟(Classical swine fever，CSF)、猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive andrespiratory syndrome，PRRS)等猪的一些高热、出血性疾病极其相似，通过临床检查极难进行鉴别诊断。因此，建立一种全自动化、高特异性、高通量的CLIA快速诊断方法，为今后非洲猪瘟鉴别诊断及防控提供可行性参考和技术手段。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种基于p30蛋白单域抗体的非洲猪瘟病毒管式化学发光免疫分析检测试剂盒，能够使用双抗体夹心法定量检测猪全血、血清、组织处理液中非洲猪瘟病毒抗原，配套全自动化学发光仪，能实现全自动化、快速、高通量、封闭检测等特点，检测结果稳定、可靠，可满足临床检测中使用方便、操作简便的要求；具体包括以下内容：
第一方面，本发明提供了一种非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体，所述非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述编码非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
第二方面，本发明提供了上述第一方面所述的非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体在制备非洲猪瘟病毒检测试剂盒中的应用。
第三方面，本发明提供了一种基于p30蛋白单域抗体的非洲猪瘟病毒管式化学发光免疫分析检测试剂盒，所述检测试剂盒包括磁微粒混悬液、酶标抗体、酶标抗体稀释液、样品稀释液、校准品、质控品、标准品、浓缩洗涤液和发光底物；
所述磁微粒混悬液为磁微粒偶联上述第一方面所述非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体的混悬液；
所述酶标抗体为酶标记的上述第一方面所述非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体；
所述校准品、质控品、标准品由p30蛋白梯度稀释后获得；
所述样品稀释液用于稀释p30蛋白和待测样品；
所述酶标抗体稀释液用于稀释磁微粒混悬液和酶标抗体；
所述酶标抗体的作用是与结合在磁微粒上的非洲猪瘟病毒抗原结合，形成磁微粒偶联非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体-非洲猪瘟病毒-酶标抗体三元复合物。
优选地，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的上述第一方面所述非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体，所述发光底物为鲁米诺或其衍生物；或所述酶标抗体为碱性磷酸酶标记的上述第一方面所述非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体，所述发光底物为金刚烷胺。
优选地，所述磁微粒为磁性Fe3O4微粒；磁性Fe3O4微粒的表面含有丰富的官能团，例如羟基、羧基、氨基、环氧基或磺酰基，有利于磁珠和抗原/抗体通过化学键偶联，形成稳定结合物。
优选地，所述磁性Fe3O4微粒的粒径为0.1～5μm。
优选地，所述磁性Fe3O4微粒的粒径优选为1～3μm。
优选地，所述磁性Fe3O4微粒的粒径优选为3μm。
优选地，所述磁微粒偶联的非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体中每1mg磁微粒偶联1μg～50μg非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体。
优选地，所述磁微粒偶联的非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体中每1mg磁微粒偶联5μg～30μg非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体。
优选地，所述磁微粒偶联的非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体中每1mg磁微粒偶联10μg非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体。
优选地，所述酶标抗体稀释液为0.1M pH值为7的MOPS缓冲液；
优选地，所述MOPS缓冲液包括：0.1～2％(m/v)BSA、0.01～0.5％(v/v)Tween-20、0.01～0.5％(v/v)ProClin300、0.01～0.5M MgCl2、0.01～0.5M NaCl、0.05～3％(m/v)水解乳蛋白和0.1～1％(m/v)PEG。
优选地，所述浓缩洗涤液为0.01M、pH为7.0、且含有0.1～0.5％(v/v)Tween-20的PBS缓冲液，或0.05M、pH为8.0、且含有0.1～0.5％(v/v)Tween-20的Tris缓冲液。所述浓缩洗涤液在检测过程中洗涤反应体系使用，所述浓缩洗涤液使用时稀释25倍。
优选地，所述样品稀释液为0.1M、pH为7.0，且含有0.1％～1％(m/v)BSA、0.1％～1％(m/v)葡萄糖的PBS缓冲液。
优选地，所述样品稀释液为0.1M、pH为7.0、且含有0.5％(m/v)BSA、0.5％(m/v)葡萄糖的PBS缓冲液。
优选地，所述校准品包括校准品1-3；所述校准品1含27.35ng/mL p30蛋白，校准品2含218.75ng/mL p30蛋白，校准品3含1750ng/mL p30蛋白；
所述质控品包括质控品1-2；所述质控品1含27.35ng/mL p30蛋白，质控品2含109.375ng/mL p30蛋白；
所述标准品包括标准品1～6，所述标准品1～6分别含非洲猪瘟p30蛋白为0ng/mL、27.34ng/mL、109.375ng/mL、437.5ng/mL、1750ng/mL、7000ng/mL；
第四方面，本发明提供了上述第三方面所述的检测试剂盒在非诊断目的的检测非洲猪瘟病毒抗原含量中的应用。
优选地，所述检测非洲猪瘟病毒抗原含量，包括以下步骤：
(1)将待测样本与偶联有上述第一方面所述非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体的磁微粒混悬液混合孵育；所述待测样本包括全血、血清、组织处理液；
(2)在步骤(1)孵育后磁分离，洗涤固相后与酶标抗体孵育；
(3)在步骤(2)孵育后磁分离，洗涤固相后与发光底物孵育，读取发光值，将发光值带入标准曲线中，计算非洲猪瘟病毒含量，根据非洲猪瘟病毒含量判断待测样本是否感染非洲猪瘟；
其中，检测样本结果C＞65ng/mL，报告为非洲猪瘟病毒阳性；检测样本结果C＜45ng/mL，判为非洲猪瘟病毒阴性；如果检测样本结果45ng/mL≤C≤65ng/mL，判为非洲猪瘟病毒可疑，若重新检测2次结果均为阴性，则判定为非洲猪瘟病毒阴性；其他结果则均判为非洲猪瘟病毒阳性。
优选地，所述标准曲线制备：以标准品p30蛋白含量(ng/mL)为横坐标，发光度(RLU)为纵坐标制作标准曲线。
优选地，在检测样本时，使用校准品对标准曲线校准，使用质控品进行质控，质控合格后检测样本，检测结果代入标准曲线，计算出待检样本中非洲猪瘟病毒的含量。
本发明的有益效果是：本发明首先提供了一种非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体，所述作为抗体用于非洲猪瘟病毒抗原检测时，相较于鼠单克隆抗体、兔多克隆抗体，本申请所述的非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体作为检测抗体具有更高的检测敏感性；其次，本发明提供了一种基于p30蛋白单域抗体的非洲猪瘟病毒管式化学发光免疫分析检测试剂盒，利用磁微粒偶联本申请所述的非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体，酶标记本申请所述的非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体，建立管式化学发光免疫分析检测方法，使得非洲猪瘟病毒和磁微粒偶联的p30蛋白单域抗体发生特异性反应，同时配套自动化化学发光免疫分析仪、标准曲线，可实现高敏感性、高特异性的精准定量、全自动化检测；检测过程有快速、高通量、封闭等特点，检测结果稳定、可靠；采用所述试剂盒通过全自动化学发光免疫分析仪定量检测非洲猪瘟病毒含量，检测20份阳性样本，阳性检出率为100％，检测不同病原样本和健康组织、血样30份，无交叉反应，阴性检出率为100％，本试剂盒特异性高；本试剂盒和目前使用的检测方法、试剂盒相比，能实现自动化、高敏感性、高重复性检测，其检测步骤少、使用方便、操作简单，可供临床大量样本非洲猪瘟病毒抗原的筛查。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的一种基于p30蛋白单域抗体的非洲猪瘟病毒管式化学发光免疫分析检测试剂盒的检测标准曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细的阐述，但本发明的保护范围并不限于以下实施例，任何本领域的技术人员在本发明的基础上，结合本领域公知常识所能想到的技术方案，都属于本发明的保护范围。
本发明所述的磁性Fe3O4微粒购自JSR公司；
所述非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体的重组表达是利用原核表达系统制备，所述非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述磁微粒偶联非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体的制备方法，优选参照中国专利ZL201910646270.2(一种口蹄疫O、A、Asia I型抗体多重管式化学发光检测试剂盒)制备；
所述过氧化物酶、碱性磷酸酶均购自sigma公司。
本发明提供了所述检测试剂盒在非诊断目的的检测非洲猪瘟病毒中的应用。
在本发明中，所述非洲猪瘟病毒样本为非洲猪瘟感染全血、血清、组织处理液等样本，本试剂盒检测范围为0ng/mL～7000ng/mL，超出检测范围需稀释样本浓度到检测范围内，再进行检测。
实施例1非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体的制备
1.非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体的筛选
利用非洲猪瘟病毒p30重组蛋白免疫骆驼，经5次免疫后采集骆驼外周抗凝血，分离淋巴细胞，提取RNA并反转录为cDNA，经PCR扩增获得重链抗体可变区基因，将其克隆到噬菌体载体，转化大肠杆菌TG1感受态细胞，构建噬菌体展示单域抗体文库。利用噬菌体展示技术，经过3轮固相淘洗筛选后富集获得具有p30蛋白结合活性的重组噬菌体。挑选噬菌体单克隆，经Phage ELISA和测序鉴定，获得针对p30蛋白的单域抗体Nb40(氨基酸序列如SEQID NO.1所示)。
2.非洲猪瘟p30蛋白单域抗体的原核表达
从重组噬菌体上扩增获得p30蛋白单域抗体Nb40的基因序列(如SEQ ID NO.2所示)，将其克隆到pET-30a原核表达载体，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，经测序鉴定正确后构建p30蛋白单域抗体Nb40表达的重组菌株BL21-p30-Nb40；将BL21-p30-Nb40重组菌株的菌液按1：100比例接种LB培养液(含100μg/mL卡那霉素)，在37℃条件下，以220r/min振摇至OD600nm值为0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度0.1mmol/L，37℃条件下诱导表达5h后收集菌液。将收集的菌液置2～8℃、以8 000r/min离心15min，收集菌体，PBS重悬洗涤3次后，置冰浴进行超声破碎，以悬液趋于透明，吹吸时无明显凝块为度。将上述裂解物置2～8℃、12 000r/min离心10min，收集上清。
使用Ni亲和层析柱纯化表达的p30蛋白单域抗体Nb40，将上述制备的上清液穿过预处理的树脂柱，加入20mmol/L的咪唑，吹打混匀后，打开柱子阀门，流出液体，重复3次；然后加入50mmol/L的咪唑，同样的方法洗脱3次，除去杂蛋白；加入1mL浓度为200mmol/L的咪唑，混匀后冰浴5min，打开阀门，收集洗脱液，共洗脱10次，经SDS-PAGE电泳分析，收集含有单域抗体Nb40的洗脱液即为纯化的单域抗体Nb40，-70℃以下备用。
实施例2基于p30蛋白单域抗体的非洲猪瘟病毒管式化学发光免疫分析检测试剂盒的制备1.非洲猪瘟病毒p30蛋白的表达、纯化
从非洲猪瘟病毒基因II型毒株的基因组上扩增获得p30基因序列(如SEQ ID NO.3所示)，将其克隆到pET-28a原核表达载体，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，经测序鉴定正确后构建p30蛋白表达的重组菌株BL21-ASFV-p30；将BL21-ASFV-p30重组菌株的菌液按1：100比例接种LB培养液(含100μg/ml卡那霉素)，在37℃条件下，以220r/min振摇至OD600nm值为0.6～0.8时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，37℃条件下诱导表达7小时后收集菌液。菌液置2～8℃、以8 000r/min离心15min收集菌体，PBS重悬洗涤3次后，置冰浴进行超声破碎，以悬液趋于透明，吹吸时无明显凝块为度。将上述裂解物置2～8℃、12 000r/min离心10min，收集沉淀。沉淀包涵体用0.1倍体积的1×IB Wash buffer洗涤液洗涤3次，加入裂解液重悬，4℃过夜裂解。
以2倍体积的3M盐酸胍(28.7g盐酸胍、0.082g醋酸钠、0.37g EDTA·2Na，加去离子水溶解，定容至100mL，PH值4.0)稀释包涵体蛋白溶液，在4℃环境下使用注射器逐滴加入到200mL复性液(0.077g氧化型谷胱甘肽GSSH、0.385g还原型谷胱甘肽GSH、0.186g EDTA·2Na、17.42g精氨酸、3.03g Tris，定容至250mL，pH值8.0)中，转速调节至最大，搅拌24h；降低转速，搅拌24h；取包涵体蛋白溶液于透析袋中，以PEG20000浓缩体积至50～100mL；4℃以PBS缓冲液透析过夜；取包涵体蛋白溶液，以PEG20000浓缩体积至2～4mL；4℃以PBS缓冲液透析过夜。
使用Ni亲和层析柱纯化表达的目的蛋白，取2mL树脂加入到层析柱中，用10mL裂解液平衡柱子，平衡3次，加入复性的包涵体溶液，将柱子放置在混匀仪上4℃混匀4h，加入10mL 20mM/L的咪唑，吹打混匀后，打开柱子阀门，流出液体，重复三次；然后加入10mL50mM/L的咪唑，同样的方法洗脱3次，除掉杂蛋白；加入1mL浓度为200mM/L的咪唑，混匀后冰浴5min，打开阀门，收集洗脱液，共洗脱10次，作SDS-PAGE电泳分析，收集含有p30蛋白的洗脱液即为纯化的p30蛋白，-70℃以下保存备用。
2.磁微粒偶联p30蛋白单域抗体工作液的制备方法
2.1磁微粒活化
取1mg磁珠，分别用pH 5.0、0.1M的2-吗啉乙磺酸(MES)稀释至10mg/mL，用磁铁充分吸附磁珠，弃去上清液，进行清洗，重复清洗1次。再加入100μL 0.1M MES(pH5.0)，混匀磁珠。
从-20℃取出1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，恢复至室温。称取EDC、NHS。分别用0.1M MES(pH5.0)溶解，配制成10mg/mL。
分别向磁珠中加入NHS溶液10μL、EDC溶液10μL，常温混匀反应30min。清洗磁珠：用磁铁充分吸附磁珠，弃去上清液，再加入100μL 0.1M MES(pH值5.0)，混匀磁珠。制得活化磁微粒。
2.2磁微粒偶联p30蛋白单域抗体
在2.1中所述活化磁微粒溶液中加入非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体10μg，混匀，常温震荡包被3h。加入10μL封闭液，常温震荡封闭3h。用洗涤液(1×洗液)清洗3次，用4mL保存液分散为磁微粒工作液，4℃储存。
3.酶标抗体工作液的制备方法
3.1AP酶活化：
配制高碘酸钠(NaIO4)15mg/mL，AP 10mg/mL，以m:m为1.5:1混震荡混匀，37℃反应30min；再加入等体积乙二醇(1％)，4℃45min，AP活化完成。
3.2 AP酶标记非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体
用pH9.6、0.5M碳酸盐缓冲液将非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体透析过夜，加入到上述活化AP酶液中，AP:Ab为2:1(m:m)，置于pH值9.6、0.5M碳酸盐缓冲液中透析，4℃过夜。
在上述混合液中按每1mg碱性磷酸酶加入80μL的NaBH4(2mg/mL)，4℃，2h，使用超滤管5000r/min，离心10min，换液浓缩标记物，用含甘油50％的PBS溶解，用酶标抗体稀释液1：4000稀释为酶标抗体工作液，4℃备用。
4.标准品、校准品、质控品的制备与标定
使用样品稀释液梯度稀释1中制备的p30蛋白，稀释倍数分别从1:100～1:25600，蛋白浓度分别为27.3438ng/mL～7000ng/mL。使用本试剂盒进行检测，检测结果如表1所示，从低浓度到高浓度，化学发光值按梯度增加，选择0ng/mL、27.34ng/mL、109.375ng/mL、437.5ng/mL、1750ng/mL、7000ng/mL为分别为标准品1-6；1750ng/mL、218.75ng/mL、27.3438ng/mL为校准品1-3；109.375ng/mL、27.3438ng/mL为质控品1-2。
表1 p30蛋白浓度及发光值(做标准曲线数值)
序号 稀释倍数 浓度(ng/mL) RLU
1 1:100 7000 2673784 标准品6
2 1:200 3500 1498648
3 1:1400 1750 782679 标准品5
4 1:800 875 375508
5 1:1600 437.5 193676 标准品4
6 1:3200 218.75 88331
7 1:6400 109.375 31407 标准品3
8 1:12800 54.6875 18940
9 1:25600 27.3438 14071 标准品2
10 0 0 7853 标准品1
5.标准曲线的制备
非洲猪瘟抗原标准品含量分别是0ng/mL、27.34ng/mL、109.375ng/mL、437.5ng/mL、1750ng/mL、7000ng/mL，分别取上述不同浓度的标准品不小于300μL于1.5mL尖底离心管，置于专用样品架，放入全自动化学发光仪样品仓中，按要求设置全自动化学发光仪各项参数，开始检测检测反应步骤如下(为仪器全自动)：
(1)取30μL标准品加入反应杯中；
(2)加入25μL磁性微粒工作液、100μL稀释液，37℃孵育10分钟；
(3)清洗4次，加入150μL酶标抗体工作液，37℃孵育10分钟；
(4)清洗4次，加入100μL化学发光底物，37℃孵育3分钟；
(5)标准曲线制作：读取发光值，以p30抗原浓度为横坐标，发光值(RLU)为纵坐标，绘制四参数标准曲线y＝a+(b-a)/(1+(x/c)d)，标准曲线如图1所示。
6.检测试剂盒成分及组装
取上述制备的磁性微粒工作液，浓度为0.5mg/mL。
酶标抗体溶液，浓度为1:4000。
样品稀释液，主要成分为含有质量百分含量0.5％ BSA、质量百分含量0.5％葡萄糖的0.1M、pH值为7.0的PBS缓冲液。
按不同规格分别分装至试剂船磁珠瓶和试剂瓶中，安装于试剂船架上，组成“非洲猪瘟病毒管式化学发光检测试剂船”；
配制浓缩液为25×PBST；
发光底物(武汉瀚海新酶生物科技有限公司，HH3605)分装100mL/瓶；
分装浓度为0ng/mL、27.34ng/mL、109.375ng/mL、437.5ng/mL、1750ng/mL、7000ng/mL的p30蛋白溶液为标准品1～标准品6；
分装浓度为27.35ng/mL、218.75ng/mL、1750ng/mL的p30蛋白溶液为校准品1、校准品2、校准品3；
分装浓度为27.35ng/mL、109.375ng/mL的p30蛋白溶液为质控品1、质控品2；
按相应规格需求组装非洲猪瘟病毒管式化学发光检测试剂盒。
实施例3基于p30蛋白单域抗体的非洲猪瘟病毒管式化学发光检测试剂盒的检测步骤1.检测前准备
1.1样本处理
(1)全血样品：12000r/min，离心2min，取上清。
(2)组织样本：将样品用生理盐水1：10(M/V)稀释，用组织研磨器或其他工具研磨混匀，12000r/min，离心2min，取上清。
(3)若样品中存在沉淀或絮状物等杂质，应离心去除杂质，应避免出现泡沫。
(4)取上述样本放于1.5mL尖底离心管中，体积应大于300μL，待检。
1.2磁微粒试剂重新悬浮
第一次装机前，需要混合磁微粒试剂，使运输过程中沉淀下来的磁微粒重新悬浮。首次装载磁微粒试剂后，无需进一步混合。
1.3溶液配制
洗液(1×洗液)：将本试剂盒配备的25×浓缩洗液用无离子水或蒸馏水做1:25稀释；1.4仪器准备
阅读仪器说明书，按已经确定的条件设置好仪器参数，放置相关试剂、样本、所需耗材，开始检测。(具体设置方式参考仪器说明书)。
2.标准曲线校准
取校准品1～校准品3，抗体含量分别为27.35ng/mL、218.75ng/mL、1750ng/mL，按仪器说明书对标准曲线进行校准，校准后标准曲线R2≥0.99时，可进行质控品检测。
3.质控
需要时检测质控品，检测值必须在参考范围内，方可继续样品检测，如下情况需检测质控品：
a.每次试剂盒批号改变或校准后；
b.至少24小时内需检测1次。
4.样品检测
a.取30μL待检样品、标准品、质控品，加入反应杯中；
b.加入25μL磁性微粒工作液、100μL稀释液，37℃孵育10分钟；
c.清洗4次，加入150μL酶标抗体工作液，37℃孵育10分钟；
d.清洗4次，加入100μL化学发光底物，37℃孵育孵育3分钟；
e.读取发光值，计算浓度。
5.结果
检测完成后，按仪器说明查样品非洲猪瘟病毒含量，判断样品非洲猪瘟病毒阴阳性。
6.结果判定依据
检测样本结果C＞65ng/mL，报告为非洲猪瘟病毒阳性；检测样本结果C＜45ng/mL，判为非洲猪瘟病毒阴性；如果检测样本结果45ng/mL≤C≤65ng/mL，判为非洲猪瘟病毒可疑，若重新检测2次结果均为阴性，则判定为非洲猪瘟病毒阴性；其他结果则均判为非洲猪瘟病毒阳性。
实施例4基于p30蛋白单域抗体的非洲猪瘟病毒管式化学发光检测试剂盒特性
1.试剂盒的敏感性与最低检测量
(1)阳性检出率
阳性样本为：西班牙食品与农业技术研究院动物健康研究中心(CISA-INIA，欧盟、FAO非洲猪瘟参考实验室)提供非洲猪瘟病毒全病毒抗原11份；国家非洲猪瘟区域实验室(兰州)提供的非洲猪瘟病毒阳性猪肉组织9份，共计阳性样本20份。
使用三个不同批次的试剂盒分别对以上样本进行检测，每份样本每个试剂盒重复检测3次，计算每份样本检测结果的平均值，判定阴阳性，与背景比较，计算平均阳性样本检出率。检测结果如表1所示，三批试剂盒的阳性检出均为20/20，阳性检出率为100％，完全符合样本背景，本试剂盒敏感性高。
表2 20份阳性样本检测结果
Figure BDA0004143388280000101
(2)最低检出量
选取猪瘟病毒灭活培养物3份；口蹄疫O型扁桃体、肝、心脏各1份，口蹄疫O型病毒灭活抗原2份；猪繁殖与呼吸综合征病毒灭活培养物3份；猪细小病毒灭活培养物3份；伪狂犬病毒灭活培养物3份；圆环病毒灭活培养物3份；健康猪脾脏3份、淋巴2份；健康猪全血5份；共计30份样本，使用三个不同批次的试剂盒分别进行检测，每份样本每个试剂盒重复检测3次，计算30份样本检测结果的平均值和标准偏差(SD)，以“平均值+3SD”为最低检测量。
对30份样本检测结果的分析如表2所示：由表可知，三批次试剂盒检测30份阴性样本的“平均值+3SD”分别是45.21ng/mL、46.29ng/mL、42.42ng/mL，则平均最低检出量为44.64ng/mL，故本试剂盒检测结果的最低检测量为44.64ng/mL。
表2最低检出量统计计算结果
Figure BDA0004143388280000111
2.试剂盒的特异性
分别选取不同病原血清，包括猪瘟病毒灭活培养物3份；口蹄疫O型扁桃体、肝、心脏各1份，口蹄疫O型病毒灭活抗原2份；猪繁殖与呼吸综合征病毒灭活培养物3份；猪细小病毒灭活培养物3份；伪狂犬病毒灭活培养物3份；圆环病毒灭活培养物3份；健康猪脾脏3份、淋巴2份；健康猪全血5份，共计30份样本，使用本试剂盒进行检测，结果如表3所示，所有样本均为阴性，阴性检出率为100％，故本试剂盒特异性很好。
表3特异性样本检测结果
Figure BDA0004143388280000112
Figure BDA0004143388280000121
3.检测重复性
选取非洲猪瘟病毒全病毒抗原1份；阳性猪肉组织1份；灭活培养物1份；口蹄疫O型样本1份；猪繁殖与呼吸综合征病毒灭活培养物1份；猪细小病毒灭活培养物1份；伪狂犬病毒灭活培养物1份；圆环病毒灭活培养物1份；健康猪组织1份；健康猪全血1份；共计10份样本。
使用三个不同批次的试剂盒检测，每份样本检测10次，测3d，计算平均变异系数(CV值)，评估试剂盒的重复性。检测结果统计如表4所示:试剂盒不同批次20190313143、20190326143、20190409143的批内差异C.V值分别是5.61％、5.40％、4.90％，批间差异C.V值是5.30％，说明本试剂盒批间批内无显著性差异，本试剂盒重复性较好。
表4重复性统计结果
Figure BDA0004143388280000122
Figure BDA0004143388280000131
本发明所述试剂盒采用磁微粒化学发光法，通过全自动化学发光仪定量检测样本中非洲猪瘟病毒含量，用于检测非洲猪瘟病毒抗原，适用于非洲猪瘟检测、诊断及流行病学调查。本试剂盒最低检测量为44.64ng/mL，批内批间重复性≤15％，32min出检测结果，与商品化试剂盒的符合率可达到100％，可实现高通量、自动化、高敏感性、高特异性、高重复性、宽检测限检测。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体在制备非洲猪瘟病毒检测试剂盒中的应用。
3.一种基于p30蛋白单域抗体的非洲猪瘟病毒管式化学发光免疫分析检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括磁微粒混悬液、酶标抗体、酶标抗体稀释液、样品稀释液、校准品、质控品、标准品、浓缩洗涤液和发光底物；
所述磁微粒混悬液为磁微粒偶联权利要求1所述非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体的混悬液；
所述酶标抗体为酶标记的权利要求1所述非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体；
所述校准品、质控品、标准品由p30蛋白梯度稀释后获得；
所述样品稀释液用于稀释p30蛋白和待测样品；
所述酶标抗体稀释液用于稀释磁微粒混悬液和酶标抗体。
4.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的权利要求1所述非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体，所述发光底物为鲁米诺或其衍生物；或所述酶标抗体为当酶为碱性磷酸酶标记的权利要求1所述非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体，所述发光底物为金刚烷胺。
5.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述磁微粒为磁性Fe3O4微粒。
6.如权利要求5所述检测试剂盒，其特征在于，所述磁微粒偶联的非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体中每1mg磁微粒偶联1μg～50μg非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体。
7.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体稀释液为0.1M pH值为7的MOPS缓冲液；所述MOPS缓冲液包括：0.1～2％(m/v)BSA、0.01～0.5％(v/v)Tween-20、0.01～0.5％(v/v)ProClin300、0.01～0.5M MgCl2、0.01～0.5M NaCl、0.05～3％(m/v)水解乳蛋白和0.1～1％(m/v)PEG。
8.如权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液为0.01M、pH为7.0、且含有0.1～0.5％(v/v)Tween-20的PBS缓冲液，或0.05M、pH为8.0、且含有0.1～0.5％(v/v)Tween-20的Tris缓冲液；
所述样品稀释液为0.1M、pH为7.0，且含有0.1％～1％(m/v)BSA、0.1％～1％(m/v)葡萄糖的PBS缓冲液。
9.权利要求3-8任一所述的检测试剂盒在非诊断目的的检测非洲猪瘟病毒抗原含量中的应用。
10.如权利要求9所述应用，其特征在于，所述检测非洲猪瘟病毒抗原含量，包括以下步骤：
(1)将待测样本与偶联有权利要求1所述非洲猪瘟病毒p30蛋白单域抗体的磁微粒混悬液混合孵育；所述待测样本包括全血、血清、组织处理液；
(2)在步骤(1)孵育后磁分离，洗涤固相后与酶标抗体孵育；
(3)在步骤(2)孵育后磁分离，洗涤固相后与发光底物孵育，读取发光值，将发光值带入标准曲线中，计算非洲猪瘟病毒含量，根据非洲猪瘟病毒含量判断待测样本是否感染非洲猪瘟；
其中，检测样本结果C＞65ng/mL，报告为非洲猪瘟病毒阳性；检测样本结果C＜45ng/mL，判为非洲猪瘟病毒阴性；如果检测样本结果45ng/mL≤C≤65ng/mL，判为非洲猪瘟病毒可疑，若重新检测2次结果均为阴性，则判定为非洲猪瘟病毒阴性；其他结果则均判为非洲猪瘟病毒阳性。
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