JP2003515340A

JP2003515340A - マイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣの抗原性タンパク質ＬｐｐＱ、その調製および使用

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Publication number: JP2003515340A
Application number: JP2001542536A
Authority: JP
Inventors: フレイ，ヨツト・ジヨウアキム; ニコレ，ジー・ジヤツク; アブド，イー・エル−モスタフア
Original assignee: アクゾ・ノベル・エヌ・ベー
Priority date: 1999-11-29
Filing date: 2000-11-24
Publication date: 2003-05-07
Also published as: WO2001040471A1; ATE315649T1; AU1524001A; AU777145B2; ES2256062T3; DE60025522T2; EP1240328B1; DE60025522D1; EP1240328A1

Abstract

(57)【要約】本発明はマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣのタンパク質ＬｐｐＱ、該タンパク質をコードするＤＮＡ、タンパク質およびＤＮＡの調製方法、ＤＮＡを含んでなるベクター、ベクターを含んでなる宿主細胞、マイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣを検出するための免疫学的方法におけるタンパク質の使用、マイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣを検出するための遺伝学的方法におけるＤＮＡの使用、マイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスに対するワクチンを調製するためのタンパク質およびＤＮＡの使用、マイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣに対向する抗体を免疫学的に検出する方法およびマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣを検出するためのＰＣＲ法、ＬｐｐＱまたはその部分に特異的なモノクローナル抗体並びにマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣでの感染を検出するための診断キットに関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明はおおむね動物用医薬品および家畜の生産の分野にある。より具体的に
は本発明はマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣ（Ｍｙｃｏｐｌａｓ
ｍａｍｙｃｏｉｄｅｓｓｕｂｓｐ．ｍｙｃｏｉｄｅｓＳＣ）のタンパク
質ＬｐｐＱおよび該タンパク質をコードするＤＮＡに関する。本発明はマイコプ
ラズマ・ミコイデス亜種ミコイデス小コロニー型（ＳＣ）感染の血清学的検出、
牛肺疫（ＣＢＰＰ）の病因物質、およびいずれかの型のワクチンの設計、とりわ
けワクチン接種した動物から感染動物を区別するためのマーカーワクチンに関す
る。特異的リポタンパク質ＬｐｐＱ、とりわけそのＮ末端抗原性部分を組換えペ
プチドとして発現し、ＣＢＰＰの血清検出のための特異的抗原として使用する。

【０００２】マイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデス小コロニー型（ＳＣ）により引き
起こされる牛肺疫（ＣＢＰＰ）は蓄牛および野牛に影響する重篤な疾患である。
ＣＢＰＰはその地域に膨大な経済的損失をもたらし、ザ・オフィス・インターナ
ショナル・デス・エピオズーティーズ（ｔｈｅＯｆｆｉｃｅＩｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌｄｅｓＥｐｉｏｚｏｏｔｉｅｓ：ＯＩＥ）により、最も深刻な
伝染性動物疾患（これらの疾患にはその撲滅のために国際的な特別な規制が必要
とされる）が含まれる、リスト「Ａ」の疾患であると明言された。

【０００３】ＣＢＰＰは１９世紀の間にほとんどの大陸で撲滅されたが、アフリカの地域で
は残存した。厳密な衛生制御措置にかかわらず、欧州では１９８０年から再発し
、従って、動物の健康および家畜生産に深刻な脅威と考えられている（ｔｅｒ
Ｌａａｋ（１９９２）：ＮｉｃｈｏｌａｓおよびＢａｓｈｉｒｕｄｄｉｎ（１９
９５）；Ｐｒｏｖｏｓｔら（１９８７）；Ｅｇｗｕら（１９９６））。

【０００４】血清学診断法はＣＢＰＰ制御のための最も重要な手段である。いくつかの血清
学的試験がこの５０年間に報告されており、スライド凝集反応、補体結合反応（
ＣＦ）（ＣａｍｐｈｂｅｌｌおよびＴｕｒｎｅｒ（１９５３））、寒天ゲル沈殿
（ＧｏｕｒｌａｙおよびＳｈｉｆｒｉｎｅ（１９６５））、酵素結合イムノソル
ベントアッセイ、受身赤血球凝集反応、ウェスターンブロットおよびドットブロ
ット（Ｎｉｃｈｏｌａｓら（１９９６））などがある。補体結合反応（ＣＦ）試
験は現在最も広く用いられている血清学診断試験（Ｎｉｃｈｏｌａｓら（１９９
６））であり、疾患の急性期で特異的で鋭敏であると考えられている。しかしな
がら、ＣＦ試験は慢性感染動物の約７０％しか検出されないと報告されており、
感染初期の無症状の動物は検出されないようである（Ｐｒｏｖｏｓｔら（１９８
７））。加えて、ＣＦ試験の特異性に関する問題が経験されている；ＣＢＰＰが
存在しない地域でのウシのモニター観察サンプルの最近の分析から有意数の偽陽
性の結果が認められた（Ｓｔａｒｋら、（１９９５ｂ）；Ｓｔａｒｋら（１９９
５ａ））。最近、マイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣの８０ｋＤａ
の抗原の特異的エピトープを検出するモノクローナル抗体に基づく、マイコプラ
ズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣの血清学診断のための競合ＥＬＩＳＡが開
発された（ＬｅおよびＴｈｉａｕｃｏｕｒｔ（１９９８））。今のところ、マイ
コプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣ感染の血清学検出のためのマイコプ
ラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣ特異的抗原も、簡便な試験、例えば非競
合間接的固相ＥＬＩＳＡ（抗体捕捉）も現在存在しない。間接ＥＬＩＳＡでは、
抗原調製物の品質が試験の特異性および感受性の決め手となる。マイコプラズマ
・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣの全細胞抗原または抽出物は近縁のマイコプラ
ズマと交差反応する多くの抗原を含有し、使用することができない。本発明の一
部は、血清学試験のための抗原としてマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデ
スＳＣの単一の特異的リポタンパク質を使用することからなる。

【０００５】今のところワクチンはマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣの弱毒
化株を基盤とし、生ワクチンとして使用されている。しかしながらこれらのワク
チンでは感染ウシからワクチン接種したウシを識別できず、ワクチン接種を使用
する制御および撲滅プログラムでの主要な妨害となっている。

【０００６】最近Ａｂｄｏら（１９９８）が、ウェスターンブロットおよび補体結合法を用
いてアフリカ株Ａｆａｄｅ（ｔｈｅＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
ｏｆＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅｓ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒ
ｅＳＰ４ＯＪＧ，英国、に寄託、寄託番号：９９０８１０２４）およびヨーロ
ッパ株Ｌ２で実験的に感染させたウシの気管支洗浄液および血清で、マイコプラ
ズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣのマニホールド抗原の一連の免疫反応を分
析した。分子量１１０、９５、８５、８０、７２、６２、４８および３９ｋＤａ
のいくつかの共通の優性な免疫原性抗原が同定された。マイコプラズマ・ミコイ
デス亜種ミコイデスＳＣに非常に近縁であるマイコプラズマの多くの株が公知で
あるので、同定された免疫原性抗原のいくつかはマイコプラズマ・ミコイデス亜
種ミコイデスＳＣに特異的であるか疑問視された。しかしながら、ここで驚くべ
きことに、前記した４８ｋＤａのタンパク質がマイコプラズマ・ミコイデス亜種
ミコイデスＳＣに特異性を有し、後記するように当業者が本発明の態様を開発す
ることが可能になった。

【０００７】本発明はマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣに特異的であるＬｐ
ｐＱと称するリポタンパク質抗原の発見および、例えば非競合性間接的固相ＥＬ
ＩＳＡまたはいずれかのその他の血清学的試験方法における特異的抗原としてペ
プチドを使用することによりマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣ感
染を血清学的に検出するための特異的抗原としてのその使用またはこのタンパク
質の一部、とりわけ、ペプチドのＮ末端ハーフの使用である。本発明は抗原の発
現のための、またはマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣの遺伝学的
同定または検出における使用のための、またはマイコプラズマ・ミコイデス亜種
ミコイデスＳＣに対するいずれかの型のワクチンの設計および製造のためのｌｐ
ｐＱの遺伝子配列を包含する。これはＬｐｐＱ生合成を欠くマイコプラズマ・ミ
コイデス亜種ミコイデスＳＣ株の構築によるマーカーワクチンの設計、成分とし
てＬｐｐＱを用いるワクチンの形成、およびｌｐｐＱの遺伝子配列を用いるワク
チン接種方法（例えばＤＮＡワクチン）を包含する。

【０００８】本発明はマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣのメンバーの特異的
タンパク質およびその対応する遺伝子、並びにマイコプラズマ・ミコイデス亜種
ミコイデスＳＣで感染した動物の特異的血清学的検出のための遺伝子配列データ
を提供する。ＬｐｐＱと称するタンパク質はマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミ
コイデスＳＣのリポタンパク質である。その対応する遺伝子ｌｐｐＱはマイコプ
ラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣのＡｆａｄｅ株からクローン化された。

【０００９】ｌｐｐＱの遺伝子配列およびタンパク質ＬｐｐＱの対応するアミノ酸配列を表
５に示す。

【００１０】遺伝子ｌｐｐＱは、ＰＧ１型株中に存在し、またＰＣＲにより決定されるよう
に、ヨーロッパおよびアフリカのマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳ
Ｃの試験されたすべての単離株中に存在する（表１参照）。

【００１１】組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株およびその他の遺伝子発現系でｌｐｐＱを発
現するために、遺伝子配列を変異させてＵＧＡをＵＧＧ_ｔｒｐに変化させた。点
変異誘発により全部で９個のＵＧＡコドンがＵＧＧ_ｔｒｐに変化しなければなら
なかった。３個の合成遺伝子を構築した。

【００１２】 ●全ｌｐｐＱ遺伝子をコードするが、大腸菌およびその他の遺伝子発現のため
の宿主により容易に読み取られるユニバーサル遺伝子コードを含有するｌｐｐＱ ^＊（表６）。ｌｐｐＱ^＊遺伝子を含有するプラスミドはｐＪＦＦｍａＬＰ４８−
ＭｕＨｉｓ１（ｔｈｅＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＣｅ
ｌｌＣｕｌｔｕｒｅｓ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＷｈｉｔｓｈｉｒｅＳＰ４Ｏ
ＪＧ，英国、に寄託、寄託番号：９９０８１０２５）である。

【００１３】 ●ＬｐｐＱの、Ｎ’末端の、抗原性の部分ＬｐｐＱＮ’をコードするｌｐｐＱ ^＊Ｎ’。ｌｐｐＱ^＊Ｎ’はユニバーサル遺伝子コードを含有する（表８）。ｌｐ
ｐＱ^＊Ｎ’遺伝子を含有するプラスミドはｐＪＦＦＬＰ４８−１１である。

【００１４】 ●ＬｐｐＱの、Ｃ’末端部分ＬｐｐＱＣ’をコードするｌｐｐＱ^＊Ｃ’。ｌｐ
ｐＱ^＊Ｃ’はユニバーサル遺伝子コードを含有する（表１０）。ｌｐｐＱ^＊Ｃ’
を含有するプラスミドはｐＪＦＦｍａＬｐｐＱ−Ｃｔｅｒｍである。

【００１５】前記したプラスミドに存在する３個の合成遺伝子の発現は発現ベクターｐＥＴ
ＨＩＳ−１を用いて達成された。プラスミドｐＥＴＨＩＳ−１はジーンバンク／
ＥＭＢＬ受け入れ番号ＡＦ０１２９１１にて利用可能である。プラスミドｐＥＴ
ＨＩＳ１を構築し、誘導可能なＴ_７−ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有する特殊
化大腸菌宿主細胞、例えば大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｆ−,ｏｍｐＴ,ｒ−（
Ｂ）,ｍ−（Ｂ）,ｌａｍｂｄａＤＥ３，ｉ２１，ｌａｃｌ，ｌａｃＵＶ５ｌａ
ｃＺ，Ｔ_７−ＲＮＡ−ｐｏｌ．（溶原性），ｉｎｔ⁻）、におけるＮ末端ヒスチ
ジンヘキサマーおよび／またはＣ末端ヒスチジンデカマーとの融合タンパク質の
発現を可能にした。ポリヒスチジンテール化ＬｐｐＱ−ＨｉｓペプチドをＮｉキ
レートクロマトグラフィーにより精製した。

【００１６】ＬｐｐＱのＮ’末端部分はこのリポタンパク質の抗原性部分である。これはイ
ムノブロット実験により示され、その結果を表１２に示す。組換えＬｐｐＱ−Ｈ
ｉｓ全長に対するウサギ抗血清は組換えＮ末端ＬｐｐＱＮ’−Ｈｉｓおよび組換
えＣ末端ＬｐｐＱＣ’−Ｈｉｓの双方並びに全長ＬｐｐＱ−Ｈｉｓタンパク質を
認識した（表１２、パネル１）。１９９２年からイタリアで発生したＣＢＢＰの
マイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣに感染した雌ウシの血清は、こ
のタンパク質の組換えＮ末端ペプチド、ＬｐｐＱＮ’−Ｈｉｓおよび全長Ｌｐｐ
Ｑ−Ｈｉｓと強く反応したが、Ｃ末端部分ＬｐｐＱＣ’−Ｈｉｓとは反応しなか
った（表１２、パネル２）。実験的感染からの血清を用いて同じ観察結果が得ら
れた。感染初期の血清（表１２、パネル４）および後期の血清によりＬｐｐＱＮ
’に対する強い反応が示された（表１２、パネル５）。感染前の動物から採集さ
れた対照血清では反応は認められなかった（表１２、パネル３）。

【００１７】ＬｐｐＱ、とりわけこのタンパク質のＮ末端部分ＬｐｐＱＮ’はマイコプラズ
マ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣ感染の初期のおよび持続性のある抗原マーカ
ーである。これはマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣ２つの異なる
株、アフリカ株Ａｆａｄｅおよびヨーロッパ株Ｌ２で対照実験感染させたウシの
血清を用いたイムノブロット実験により示される（Ａｂｄｏら（１９９８））。
実験的に接触感染した動物の血清ではＬｐｐＱＮ’−Ｈｉｓに対して初期の、強
い、持続性のある応答が示された（表１３）。ヨーロッパ株Ｌ２で接触感染した
雌ウシの典型的な血清は、ＬｐｐＱＮ’−Ｈｉｓを含有するイムノブロットで、
同時に標準ＣＦ試験の最初の陽性タイターを伴って、接触感染後９２日から始ま
り、接触感染後２２４日まで持続する明確なシグナルを示した（表１３、パート
Ａ）。このとき、標準ＣＦ試験のタイターは２ヶ月以上検出限界を下回っていた
（Ａｂｄｏら（１９９８））。アフリカ株Ａｆａｄｅで感染した雌ウシの典型的
な血清は、同時に最初の明確な陽性ＣＦ力価を伴って、接触感染後２８日に強い
シグナルを示し、接触感染後１３４日まで持続した（表１３、パートＢ）。この
とき標準ＣＦ試験の力価は３週間以上検出限界を下回っていた（Ａｂｄｏら（１
９９８））。

【００１８】ＬｐｐＱのＮ末端部分（ＬｐｐＱＮ’）はマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミ
コイデスＳＣの特異的抗原である。マイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデス
ＳＣのＰＧ１型株の全細胞で免疫したウサギの血清はイムノブロットでＬｐｐＱ
Ｎ’と強く反応したが、マイコプラズマの近縁であるマイコプラズマ・ミコイデ
スクラスタまたはマイコプラズマ・プトレファシエンスの全細胞で免疫したウサ
ギの血清は同一条件下でＬｐｐＱＮ’−Ｈｉｓとの反応は示さなかった。加えて
、マイコプラズマ・ボビスに陽性であるがＣＢＰＰではないスイス・ウシの血清
はＬｐｐＱＮ’−Ｈｉｓとの反応を示さなかった（表１４）。

【００１９】ＬｐｐＱのＮ末端部分（ＬｐｐＱＮ’−Ｈｉｓ）は、大腸菌ＪＦ１９７９株［
ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｆ−,ｏｍｐＴ,ｒ−（Ｂ）,ｍ−（Ｂ）,ｌａｍｂｄａＤ
Ｅ３，ｉ２１，ｌａｃｌ，ｌａｃＵＶ５ｌａｃＺ，Ｔ_７−ＲＮＡ−ｐｏｌ．（溶
原性），ｉｎｔ⁻）／ｐＪＦＦＬＰ４８−１１Ａｐ^Ｒ］に存在するプラスミドｐ
ＪＦＦＬＰ４８−１１から多量に製造される。ＬｐｐＱＮ’−ＨｉｓをＮｉキレ
ートクロマトグラフィーにより塩酸グアニジウム可溶化細胞から直接精製する。
ＪＦ１９７９株の培養物５０ｍｌから２ｍｇの精製ＬｐｐＱＮ’−Ｈｉｓタンパ
ク質が得られた。ＬｐｐＱＮ’ペプチドまたはその誘導体を製造するためにその
他の発現系を用いることができる。

【００２０】ＣＢＰＰについてマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣのキャリア
ーについて動物をスクリーニングするのに有用な、マイコプラズマ・ミコイデス
亜種ミコイデスＳＣ感染について血清学的試験キット、例えばイムノブロットま
たは非競合間接的固相ＥＬＩＳＡまたはいずれかその他の抗体検出法、の作製に
本発明を適用する。

【００２１】「免疫学的検出系」とは動物の血清中のマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコ
イデスＳＣの特異的成分に対する抗体を検出する方法を意味し、例えばイムノブ
ロット（表１２参照）およびＥＬＩＳＡ（表２参照）などがある。これらの方法
をマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣ感染の血清診断に用いる。Ｌ
ｐｐＱＮ’−Ｈｉｓで被覆したマイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ試
験の例を表２に示す。ＬｐｐＱＮ’−Ｈｉｓで被覆したマイクロタイタープレー
トに基づくＥＬＩＳＡは、とりわけ感染後後期に採集した血清ではＣＦ試験より
も著明に鋭敏であった（表２の結果を参照）。

【００２２】ｌｐｐＱ遺伝子を用いてマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣの遺
伝子検出のための系を設計することができる。マイコプラズマ・ミコイデス亜種
ミコイデスＳＣに対するｌｐｐＱ遺伝子の特異性を表１に示すが、これはｌｐｐ
Ｑが異なる大陸および国から並びに異なる時代に単離されたマイコプラズマ・ミ
コイデス亜種ミコイデスＳＣ株全てに存在したことを示している。このｌｐｐＱ
遺伝子は、その他のマイコプラズマ、とりわけ表現型的および抗原的に極めて近
縁の動物マイコプラズマでは見出されなかった。

【００２３】本発明をより明確に説明するために、本発明のいくつかの態様のリストを以下
に提示する。このリストは、本発明をこれらの態様のみに制限するものではない
。

【００２４】Ａ．本発明の1つの態様は、表５（ＬｐｐＱ前駆体、配列番号：２５）に示す
アミノ酸配列を含んでなるマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣのタ
ンパク質またはその部分であり、ここでその部分は表７（成熟ＬｐｐＱ、配列番
号：２７）または表９（ＬｐｐＱＮ’、配列番号：２９）に示すアミノ酸配列に
より特徴づけられるのが好ましい。また本発明の態様はＬｐｐＱ前駆体、成熟Ｌ
ｐｐＱタンパク質およびＬｐｐＱのＮ末端ハーフ（ＬｐｐＱＮ’）である。

【００２５】Ｂ．本発明の別の態様は、Ａ項記載のタンパク質の配列が２ないし１２個のヒ
スチジン残基で先行および／または後続され、好ましくは各々、６個のヒスチジ
ン残基で先行され、および／または１０個のヒスチジン残基で後続されたＡ項で
記載するタンパク質である。

【００２６】Ｃ．本発明のさらなる態様は、リポタンパク質である、Ａ項で記載されたタン
パク質である。本発明の別の態様は、糖タンパク質である、Ａ項で記載されたタ
ンパク質である。かかる糖タンパク質はＤ項で記載されるＤＮＡを真核細胞宿主
で発現させて得ることができる。

【００２７】Ｄ．Ａ、ＢまたはＣ項で記載されるタンパク質をコードするＤＮＡもまた本発
明の態様であり、表５（ｌｐｐＱ前駆体遺伝子、配列番号：２４）、表６（ｌｐ
ｐＱ^＊、配列番号：２６）、または表８（ｌｐｐＱ^＊Ｎ’、配列番号：２８）に
示されるＤＮＡ配列により特徴づけられるのが好ましい。ＤＮＡはゲノムＤＮＡ
、ｃＤＮＡまたは人工ＤＮＡでよい。

【００２８】Ｅ．本発明の1つの態様は、マイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣ
を直接的または間接的に検出するための診断法におけるＡ、ＢまたはＣ項に記載
のタンパク質の使用であって、ここで診断法は免疫学的方法であり、イムノブロ
ッティング、血清学的試験およびＥＬＩＳＡなる群から選択されるのが好ましい
。

【００２９】Ｆ．本発明の別の態様は、マイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣに
よる感染に対するワクチンの調製のためのＡ、ＢまたはＣ項に記載のタンパク質
、またはＤ項に記載のＤＮＡの使用であり、ワクチンそのものであり、およびマ
ーカーワクチンとして使用するためのマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデ
スＳＣの生、弱毒化または不活性化細胞を調製するためのＤ項に記載のＤＮＡの
使用であって、ここで該細胞はＬｐｐＱリポタンパク質を合成する能力を欠いて
いる。

【００３０】Ｇ．マイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣの検出法におけるＤ項に
記載のＤＮＡもまた本発明の態様であって、ここで検出法はＰＣＲおよびハイブ
リダイゼーション法からなる群から選択されるのが好ましい。

【００３１】Ｈ．本発明のさらなる態様は、Ａ、ＢまたはＣ項に記載のタンパク質を発現す
るための、Ｄ項に記載のＤＮＡ、該ＤＮＡを含んでなるベクター、および該ベク
ターまたは該ＤＮＡを含んでなる宿主細胞の使用である。

【００３２】Ｉ．本発明のさらなる態様は、（ａ）Ｄ項に記載のＤＮＡを含んでなるベクターを適当な宿主細胞に導入する
；（ｂ）該タンパク質の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養する；および（ｃ）工程（ｃ）のタンパク質を宿主細胞または上澄から単離する、Ａ、Ｂま
たはＣ項に記載のタンパク質を調製するための方法である。

【００３３】Ｊ．表５のＤＮＡ配列（配列番号：２５）により特徴づけられたＤＮＡの調製
方法もまた本発明の態様であって、ここで、（ａ）マイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣのゲノムＤＮＡのＤＮ
Ａライブラリーを適当なファージにクローン化する；（ｂ）工程（ａ）のファージを用いて適当な宿主細胞を感染させる；（ｃ）宿主細胞をマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣに感染した
哺乳動物の血清でスクリーニングする；（ｄ）陽性クローンを選別し、精製する；および（ｅ）工程（ｄ）のファージのゲノムＤＮＡを単離する。

【００３４】Ｋ．本発明のさらなる態様は、（ａ）表５（配列番号：２４）のＤＮＡ配列により特徴づけられるＤＮＡおよ
び表３（配列番号：１ないし４および６ないし２１）による適当なプライマーセ
ットを重複伸長ＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎＰＣＲ：ＯＥ−
ＰＣＲ）に適用して第１のＰＣＲ産物を得る；（ｂ）工程（ａ）のＯＥ−ＰＣＲの第１のＰＣＲ産物を、望ましい変異数に要
求されるように１回またはそれ以上のＯＥ−ＰＣＲに適用し、最終ＰＣＲ産物を
得る；および（ｃ）最終ＰＣＲ産物を単離する、表６（ｌｐｐＱ^＊、配列番号：２６）、ま
たは表８（ｌｐｐＱ^＊Ｎ’、配列番号：２８）のＤＮＡ配列で特徴づけられるＤ
ＮＡの調製方法である。

【００３５】Ｌ．動物の体液中のＡ、ＢまたはＣ項に記載のタンパク質に対する抗体を検出
する方法もまた本発明の1つの態様であり、ここで、（ａ）Ａ、ＢまたはＣ項に記載のタンパク質を適当な膜にブロッティングする
；（ｂ）膜を該体液と共にインキュベートする；（ｃ）膜を標識したコンジュゲートと共にインキュベートする；（ｄ）コンジュゲートの抗体とおよびこのタンパク質に対する体液からの抗体
との複合体を検出するために呈色反応を開始する。好ましくは、ここで体液を血
清および気管支液から選択し、膜はニトロセルロースまたはナイロン膜であり、
コンジュゲートはアルカリ性ホスファターゼで標識されている。

【００３６】Ｍ．本発明の別の態様は、（ａ）マイクロタイタープレートをＡ、ＢまたはＣ項に記載のタンパク質でコ
ーティングする；（ｂ）マイクロタイタープレートを該体液と共にインキュベートする；（ｃ）マイクロタイタープレートを標識したコンジュゲートと共にインキュベ
ートする；および（ｄ）コンジュゲートの抗体およびタンパク質に対して指向する体液からの抗
体の複合体を検出するために呈色反応を開始する、動物の体液中のＡ、Ｂまたは
Ｃ項に記載のタンパク質に対する抗体の検出方法である。好ましくは、ここで体
液を血清および気管支液から選択し、膜はニトロセルロースまたはナイロン膜で
あり、コンジュゲートはアルカリ性ホスファターゼで標識されている。

【００３７】Ｎ．さらに、本発明の態様は、（ａ）表５（ＬｐｐＱ前駆体、配列番号：２４）に示すＤＮＡを検出するため
の適当なＰＣＲプライマー対を試験すべきサンプルと共にＰＣＲ反応において使
用する；および（ｂ）ＰＣＲ後、予想されるＰＣＲ産物の存在を適当なＰＣＴプライマー対で
検査する、マイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣを検出する方法であ
る。好ましくは、ここで、適当なＰＣＲプライマー対を表３に示すプライマーＭ
ＭＭＳＣＯ５−７（配列番号：２２）およびＭＭＭＳＣＯ５−６（配列番号：２
３）からなる群から選択する。

【００３８】Ｏ．本発明のさらなる態様は、Ａ、ＢまたはＣ項に記載のタンパク質に特異的
なモノクローナル抗体である。

【００３９】Ｐ．本発明の別の態様は、Ａ、ＢまたはＣ項に記載のタンパク質および／また
は少なくとも１つのＯ項に記載の抗体が適当な容器に含まれている診断キットで
ある。

【００４０】前記で列挙した本発明のいくつかの態様を以下でさらに詳細に記載する。

【００４１】本発明はまたＬｐｐＱフラグメントおよび変種をも包含する。慣用される逆遺
伝子技術により、すなわちアミノ酸配列に基づいて遺伝子配列を設計するかまた
は慣用される遺伝子スプライシング技術により、本発明に従ってＬｐｐＱ変種と
みなされるポリペプチドを製造できる。例えば位置指定変異誘発またはオリゴヌ
クレオチド指定変異誘発に関係する技術によりＬｐｐＱ変種を製造できる。「ク
ローン化ＤＮＡの変異誘発」、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭ
ｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，８．０．３．以下参照（Ａｕｓｕｂｅｌら
、編（１９８９））（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）。

【００４２】本発明に含まれるその他のＬｐｐＱ変種は、ＬｐｐＱの一部、またはそのフラ
グメントに対応する分子、または、ＬｐｐＱの一部を含んでなるが、天然のポリ
ペプチドと一致しない、単独で存在する場合も、また別にキャリアーに結合して
いる場合も、双方共にＬｐｐＱの免疫原性活性を示す分子である。この種のＬｐ
ｐＱ変種は天然の分子の実際のフラグメントを表すか、またはデノボもしくは組
換え的に合成されたポリペプチドであり得る。

【００４３】さらに別の態様では、このタンパク質のアミノ酸配列変種を調製する。これら
は、例えば、このタンパク質が同定された微生物の集団内の天然の変化により生
じるタンパク質のマイナー配列変種であり得、または別の微生物に見出されるこ
のタンパク質のホモログであり得る。これらは、また、タンパク質中で天然では
生じないが、これらは宿主に投与されたとき免疫応答を引き出すのに十分に類似
している配列でもあり得る。配列変種を位置指定変異誘発の標準的な方法により
調製することができる。

【００４４】このタンパク質のアミノ酸配列変種は置換、挿入、または欠失変種でよい。欠
失変種は免疫原活性に必須ではないもともとのタンパク質の１つまたはそれ以上
の残基を欠損している。別の一般的な型の欠失変種は分泌シグナル配列、または
タンパク質に細胞の特定の部分に結合するように指示するシグナル配列を欠損す
る変種である。

【００４５】置換変種は、典型的には、タンパク質内の１つまたはそれ以上の部位において
あるアミノ酸が別のアミノ酸に置換されており、１つまたはそれ以上のタンパク
質の特性、例えばタンパク質分解性切断に対する安定性、を調節するように設計
されている。置換は保存的であるのが好ましく、すなわち、あるアミノ酸が類似
の形態および荷電のあるアミノ酸と置換される。保存置換は当該分野で公知であ
り、例えば：アラニンをセリンに；アルギニンをリジンに；アスパラギンをグル
タミンまたはヒスチジンに；アスパラギン酸をグルタミン酸に；システインをセ
リンに；グルタミンをアスパラギンに；グルタミン酸をアスパラギン酸に；グリ
シンをプロリンに；ヒスチジンをアスパラギンまたはグルタミンに；イソロイシ
ンをロイシンまたはバリンに；ロイシンをバリンまたはイソロイシンに；リジン
をアルギニン、グルタミン、またはグルタミン酸に；メチオニンをロイシンまた
はイソロイシンに；フェニルアラニンをチロシン、ロイシンまたはメチオニンに
；セリンをスレオニンに；スレオニンをセリンに；トリプトファンをチロシンに
；チロシンをトリプトファンまたはフェニルアラニンに；およびバリンをイソロ
イシンまたはロイシンに置換することが含まれる。

【００４６】挿入変種には、融合タンパク質、例えばタンパク質の迅速な精製を可能にする
ために使用されるものなどが含まれる。その他の挿入変種には、別のアミノ酸が
タンパク質のコード配列内に導入されているものなどが含まれ得る。これらは、
典型的には、前記した融合タンパク質よりも小さい挿入であり、例えばプロテア
ーゼ切断部位を壊すために導入される。

【００４７】別の態様では、タンパク質をコードする遺伝子の部分を組換え宿主において発
現させる実験的手法によりタンパク質の主要な抗原決定基を同定し、得られたタ
ンパク質を宿主動物を免疫誘発から保護する能力に関して試験する。例えば、Ｐ
ＣＲを用いてタンパク質のＣ末端の連続した長いフラグメントを欠損した様々な
タンパク質を調製できる。次いでこれらのタンパク質の各々の免疫活性から、こ
の活性に必須であるこのタンパク質のフラグメントまたはドメインを同定する。
次いで各々の反復で少数のアミノ酸しか除去しないさらなる実験により、タンパ
ク質の抗原決定基の位置決定が可能になる。

【００４８】本発明のタンパク質を調製するための別の態様はペプチドミミックの使用であ
る。このミミックは、タンパク質の２次構造のエレメントを擬似するペプチド含
有分子である。例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９３）を参照。ペプチドミミッ
クの使用を支持する原理は、タンパク質のペプチドバックボーンが、主に分子相
互作用、例えば抗体および抗原の相互作用を可能にするようにアミノ酸側鎖が位
置するように存在することである。本発明のペプチドミミックタンパク質を宿主
に投与した場合、もともとの宿主細胞タンパク質の認識に至る免疫応答を引き出
すであろう。

【００４９】従って、成功するようなペプチドミミックの概念の適用は、非常に抗原性が高
いことが知られているタンパク質内のβターンの擬似に主に主眼がおかれる。本
発明のタンパク質内の適当なβターン構造は前記のようなコンピューターに基づ
くアルゴリズムにより予測できよう。Ｊｏｈｎｓｏｎら（前出）に報告されたよ
うに、ひとたびこのターンのアミノ酸構成成分が決定されると、アミノ酸側鎖の
必須エレメントの類似の空間配向を達成するようにミミックを構築することがで
きる。次いでワクチンとして使用するようにミミックをキャリアータンパク質と
コンジュゲート形成することができる。

【００５０】別の態様では、コンピューター配列分析を用いて組換えタンパク質の予測され
る主要抗原決定エピトープの位置が決定される。この分析を実施できるソフトウ
ェアは市販により容易に入手でき、例えばＭａｃＶｅｃｔｏｒ（ＩＢＩＮｅｗ
Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）などがある。ソフトウェアは典型的には、タンパク質の表
面に特徴的に見出され、従って抗原決定基として作用する可能性がある親水性配
列を位置決定するための標準的なアルゴリズム例えばＫｙｔｅ／Ｄｏｏｌｉｔｔ
ｌｅまたはＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ法を使用する。ひとたびこの分析が行われると
、少なくとも抗原決定基の必須の特徴を含み、ワクチンで使用できるポリペプチ
ドを調製できる。標準的な方法により、例えばＰＣＲクローニング法を用いてこ
れらの抗原決定基をコードする遺伝子を構築し、発現ベクターに挿入することが
できる。

【００５１】組換えポリペプチドの代替として、抗原決定基に対応する合成ペプチドを調製
することができる。かかるペプチドは少なくとも６個のアミノ酸残基長であり、
およそ３５個の残基を含むことができ、これは自動ペプチド合成器、例えばＡｐ
ｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）より入手
できる合成器のほぼ上限の長さである。ワクチンにおいてこのように小さなペプ
チドを使用する場合は、典型的にはペプチドを免疫原性キャリアータンパク質、
例えばＢ型肝炎表面抗原とコンジュゲート形成させる必要がある。このコンジュ
ゲート形成を行う方法は当該分野で公知である。

【００５２】本発明はまたワクチンにも関する。とりわけ好ましい態様では、ワクチンはＡ
、Ｂ、またはＣ項に記載されるタンパク質またはそのフラグメントを、担体また
はアジュバント、この場合マイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣに対
してウシを免疫するための適当な補助物質と組み合わせて含んでなる。

【００５３】しかしながら、より一般的には、本発明のワクチンは感受性の哺乳動物を免疫
することを意図している。ウシの種に加えてマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミ
コイデスＳＣに感受性の哺乳動物には、小型および大型の反芻動物などがある。

【００５４】この抗原は、許容される程度に精製した後（一般的には全ペプチドまたはタン
パク質の５０％を超える）、次いでワクチンの形態で投与され得る。本発明の好
ましい態様では、免疫される動物はウシである。適切であるときには、全細胞を
ワクチンに使用できる。例えば組換え抗原を発現するＳｆ９細胞またはＣＨＯ細
胞を直接生または死菌の形態で使用して抗原を宿主動物に投与できる。また別に
、本発明の抗原をコードする核酸配列を含有する生ウイルスをワクチンにおいて
使用することができる。

【００５５】このワクチンは、アジュバントと称する多くの異なる物質のいずれかを含むこ
とができ、これはワクチン接種された動物の免疫系の適当な部分を刺激すること
が知られている。動物のワクチン接種に適したアジュバントには、非限定例とし
ては油乳濁液、例えばフロイント完全または不完全アジュバント（家畜での使用
には適していない）、Ｍａｒｃｏｌ５２：Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ８８８（Ｍａ
ｒｃｏｌはＥｓｓｏの商標であり、ＭｏｎｔａｎｉｄｅはＳＥＰＰＩＣ、Ｐａｒ
ｉｓの商標である）、スクアランまたはスクアレン、Ａｄｊｕｖａｎｔ６５（
ピーナッツ油、モノオレイン酸マンナイドおよびモノステアリン酸アルミニウム
を含有する）、鉱物ゲル、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リ
ン酸カルシウムおよびミョウバン、界面活性剤、例えばヘキサデシルアミン、オ
クタデシルアミン、リゾレシチン、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、
Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−プロパン
ジアミン、メトキシヘキサデシルグリセロールおよびプルロニック・ポリオール
、ポリアニオン、例えばピラン、硫酸デキストラン、ポリアクリル酸およびカル
ボポール、ペプチドおよびアミノ酸、例えばムラミルジペプチド、ジメチルグリ
シン、タフトシンおよびトレハロース・ジミコレートなどがある。

【００５６】本発明の抗原、発現産物および／または合成ポリペプチドをリポソームもしく
はその他のマイクロキャリアーに組み込んだ後、または多糖類、タンパク質また
はポリマーとコンジュゲトー形成した後、またはＱｕｉｌ−Ａと組み合わせて「
Ｉｓｏｃｏｍｅｓ」（免疫刺激複合体）を形成して投与することもできる。

【００５７】投与経路、投与量、および注射頻度は全て当該分野の通常の技術を用いて最適
化できる因子である。典型的には、初回ワクチン接種の数週間後、１回またはそ
れ以上の「ブースター」ワクチン接種を行う。その基本的な効果は活発な細胞性
および体液性免疫応答の産生である。

【００５８】ＣＢＰＰに対して哺乳動物を免疫する方法は、有効量の上記免疫原を哺乳動物
に投与することからなる。投与は当該分野で公知のいずれかの方法がある。本発
明に従って、適当な免疫応答を産生するよう企図され得るまたは示し得るいずれ
かの免疫経路を用いることができるが、皮下投与が好ましい。適当な投与形態に
は、非経口、皮内もしくは筋肉内注射または経口、鼻腔もしくは直腸内投与があ
る。

【００５９】本発明はまた天然ＬｐｐＱ、ＬｐｐＱフラグメント、組み換えＬｐｐＱ、また
はＬｐｐＱ変種に対する抗体および抗血清にも関する。適当な宿主において標準
的なワクチン接種計画を用いてかかる抗体および抗血清を上昇させる。アジュバ
ントを伴なうまたは伴わない少なくとも１つの本発明の抗原またはワクチンで宿
主をワクチン接種させて免疫応答を生じさせる。例えば産生された抗体のレベル
を測定することにより、標準的なＥＬＩＳＡ法を用いて免疫応答をモニター観察
できる。

【００６０】好ましい態様では、宿主としてウシを用いてポリクローナル抗血清の産生を行
う。宿主を定期的に出血させ、標準的な方法により、例えばプロテインＡおよび
プロテインＧクロマトグラフィーにより血液から抗体分画を精製する。また別の
態様では、宿主はマウスであり、標準的な手段によりモノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマを調製する。ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎら、２．５．章（１９９１）参照。次いで標準
的な手段によりハイブリドーマ細胞からモノクローナル抗体を調製する。

【００６１】本発明はまた適当な容器にＡ、ＢまたはＣ項に記載のタンパク質および好まし
くは前記した抗体の少なくとも１つが含まれる診断キットにも関する。

【００６２】マイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣを検出するための診断キット
は、既知濃度の本発明の抗原の陽性対照標準と一緒に、少なくとも１つの前記で
調製した抗体を提供することにより調製される。1つの態様では、抗原陽性対照
は組換えＬｐｐＱまたはＬｐｐＱＮ’である。キット様式は標準的な診断様式、
例えばＥＬＩＳＡ様式に適合させる。

【００６３】ここで本発明のいくつかの具体例を実施例の助けでより詳細に説明するが、こ
れらに制限するものではない。

【００６４】実施例１：ＬｐｐＱの同定マイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣで感染したウシにおける体液
および気管支免疫応答を調べるために、アフリカ株Ａｆｅｄｅまたはヨーロッパ
株Ｌ２に実験的に接触感染したウシの連続収集した血清および気管支洗浄液をイ
ムノブロッティングにより分析した（Ａｂｄｏら（１９９８））。分子量１１０
、９５、８５、８０、７２、６２、４８および３９ｋＤａのいくつかの共通の優
性な免疫原性抗原を同定した。この実験により、マイコプラズマ・ミコイデス亜
種ミコイデスＳＣのアフリカクラスタの参考株であるＡｆａｄｅ株（Ｃｈｅｎｇ
ら（１９９５））、またはヨーロッパクラスタの参考株であるＬ２株（Ｃｈｅｎ
ｇら（１９９５））のいずれかで感染したウシの血清および気管支洗浄液で、そ
の他の免疫反応の中でも、４８ｋＤａのタンパク質に対する初期および持続性免
疫反応が示された。これにより、同一の血清を用いて、遺伝的および抗原的に最
もマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣに近縁であるマイコプラズマ
の抗原のイムノブロット分析により、４８ｋＤａがマイコプラズマ・ミコイデス
亜種ミコイデスＳＣに特異的であることが示される（表１）。従って牛肺疫（Ｃ
ＢＰＰ）の血清検出のための本開発および／またはＣＢＰＰに対するワクチン成
分の開発のための、特異的で、優性で持続性のある抗原の候補物質として４８ｋ
Ｄａ抗原を選択する。

【００６５】実施例２：ｌｐｐＱ遺伝子の同定およびクローニング λＺＡＰ−ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ
Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）中にクローン化したマイコプラズマ・ミコイデス亜
種ミコイデスＳＣの、Ｓａｕ３ＡＩ消化したゲノムＤＮＡを用いて作製した遺伝
子ライブラリーを構築することによりリポタンパク質をコードするｌｐｐＱ遺伝
子をクローン化し、続いて「Ｇｉｇａｐａｃｋｇｏｌｄ」パッケージングキッ
ト（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、組換
えファージに適合し得る大腸菌株をインビトロパッケージングおよび感染させた
。遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための標準的な方法（Ａｕｓｂｅｌ
ら（１９９０））を用いてマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣＡ
ｆａｄｅ株で実験的に感染させたウシの血清でファージプラークをスクリーニン
グした（Ａｂｄｏら（１９９８））。λＺＡＰ−ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）ベクタ
ー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の製造者のプロトコルに従って、ｆ１ヘルパーファ
ージを用いていくつかのファージクローンをファグミドに形質転換した。ＡＢＩ
Ｐｒｉｓｍ３１０型遺伝子分析器（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
／Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．ＵＳＡ
）およびＤＮＡ配列アセンブリ・ソフトウェアＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ３．０（
ＧｅｎｅＣｏｄｅ，ＡｎｎＡｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ）を用いていくつかのク
ローンのＤＮＡ配列を決定し、隣接配列を得た。１個のクローン、プラスミド
ｐＪＦＦｍａ５が記載された（Ｈａｙａｓｈｉ（１９９０））パラメーターによ
り決定される４８ｋＤａの特徴的なリポタンパク質をコードするＯＲＦを示した
。４８ｋＤａをコードする遺伝子をＬｐｐＱと称した（表５）。

【００６６】実施例３：ｌｐｐＱ遺伝子の９個のコドンの変異誘発マイコプラズマ特異的ＵＧＡ_ｔｒｐコドンをユニバーサルＵＧＧ_ｔｒｐコドン
と交換するために、Ｕｒｂａｎら（１９９７）により記載される方法により、表
３に列挙するオリゴヌクレオチドプライマーおよび鋳型としてプラスミドｐＪＦ
Ｆｍａ５のクローン化ｌｐｐＱ遺伝子を用いてｌｐｐＱ遺伝子の位置指定変異誘
発を行った。ＵＧＧ_ｔｒｐコドンで変異誘発した遺伝子をｌｐｐＱ^＊と称する（
表６）。

【００６７】実施例４：ポリヒスチジンテイル化ＬｐｐＱペプチドを発現するプラスミドの
構築ポリヒスチジンテイル化ＬｐｐＱ（ＬｐｐＱ−Ｈｉｓと称する）を発現するプ
ラスミドｐＪＦＦｍａＬＰ４８−ＭｕＨｉｓ１を以下のように構築した。前記し
たように得られた変異誘発されたｌｐｐＱ^＊遺伝子（表６）を、オリゴヌクレオ
チドプライマーＰ４８ＥｃｏＲ１およびＰ４８Ｂ７ｒ（表３）並びにＰｗｏポリ
メラーゼを用いるＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。増幅された遺伝子を
ＥｃｏＲ１およびＢａｍＨ１を用いる制限酵素消化に供し、続いて対応する消化
されたクローニング／発現ベクターｐＥＴＨＩＳ−１に連結した。ＬｐｐＱＮ’
−Ｈｉｓと称する、ＬｐｐＱのポリヒスチジンテイル化Ｎ’−末端ハーフを発現
するプラスミドｐＪＦＦＬＰ４８−１１を以下のように構築した：前記のように
得られた変異誘発されたｌｐｐＱ＊遺伝子（表６）をオリゴヌクレオチドプライ
マーＭＭＭＬＰ４８１およびＭＭＭＬＰ４８４（表３）並びにＰｗｏポリメラー
ゼを用いるＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。増幅された遺伝子フラグメ
ントｌｐｐＱ^＊Ｎ’（表８）を制限酵素Ｎｄｅ１およびＢａｍＨ１で消化し、続
いて発現ベクターｐＥＴＨＩＳ−１の対応するクローニング部位に連結した。

【００６８】ＬｐｐＱＣ’−Ｈｉｓと称する、ＬｐｐＱのポリヒスチジンテイル化Ｃ末端ハ
ーフを発現するプラスミドｐＪＦＦｍａＬｐｐＱ−Ｃｔｅｒｍを以下のように構
築した。前記したように得られた変異誘発されたｌｐｐＱ^＊遺伝子（表６）をオ
リゴヌクレオチドプライマーＰ４８Ｂ１ｆおよびＰ４８Ｂ７ｒ（表３）並びにＰ
ｗｏポリメラーゼを用いるＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。ｌｐｐＱ^＊Ｃ’と称する増幅された遺伝子をＥｃｏＲ１およびＢａｍＨ１を用いる制限酵素
消化に供し、続いてＥｃｏＲ１およびＢａｍＨ１消化された発現ベクターｐＥＴ
ＨＩＳ−１の対応するクローニング部位に連結した。

【００６９】実施例５：特殊化された大腸菌におけるポリヒスチジンタグ化タンパク質の発
現上記３個のポリヒスチジンテイル化ＬｐｐＱペプチドを発現するために、大腸
菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をプラスミドｐＪＦＦｍａＬ
Ｐ４８−ＭｕＨｉｓ１、ｐＪＦＦＬＰ４８−１１、またはｐＪＦＦｍａＬｐｐＱ
−Ｃｔｅｒｍ（表４）で形質転換した。指数増殖期の中間で細胞培養物をＩＰＴ
Ｇで誘導、およびＢｒａｕｎら（１９９９）により詳細に記載されたＮｉ^２＋キ
レートクロマトグラフィーを用いて精製により、ポリヒスチジンテイル化ペプチ
ドの発現および続いて精製が行われた。

【００７０】実施例６：イムノブロットのプロトコルＡｕｓｂｅｌら（１９９０）に記載されるようにイムノブロットを実施した。
記載されたように（Ａｂｄｏら（１９９８））実験的に感染させた動物の血清お
よび気管支洗浄液を用いた。精製した組換えタンパク質（２００μｇ／ｍｌ）を
等容量のＳＤＳサンプルバッファー（０．０６ＭＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ６．
８、２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、２％β−メルカプトエタノール。０．０
２５％ブロムフェノールブルー）と混合し、５分間煮沸した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
ポリアクリルアミドゲルにより、５ないし１５％のグラジエントポリアクリルア
ミドゲルを用いて抗原を分離し、次いで孔径０．２μｍのニトロセルロース膜（
Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にブロッティングした。次いでミルクバッファーを用いて室温
（ｒ．ｔ．）で１時間膜をブロックし、乾燥し、細片に切断した。細片を血清サ
ンプルと共に室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳ（１００ｍＭＴｒｉｓ
ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭＮａＣｌ）で３回洗浄した。次いで細片をア
ルカリ性ホスファターゼ標識コンジュゲートと共に室温で１時間インキュベート
し、これをミルクバッファーで希釈した。使用したコンジュゲートはａ）１：５
０００に希釈したモノクローナル抗体（Ｍａｂ）抗ウシＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ＃
Ａ７５５４）、ｂ）１：２０００に希釈したポリクローナルＡｂ抗ウサギまたは
抗マウスＩｇＧ（ＫｉｒｋｅｇａａｒｄａｎｄＰｅｒｒｙＧａｉｔｈｅｒ
ｓｂｅｒｇ，ＭＤ，米国）であった。全ての細片をＴＢＳバッファーで３回洗浄
した。アルカリ性バッファー中０．３ｍｇ／ｍｌＮｉｔｒｏｂｌｕｅｔｅｔ
ｒａｚｏｌｉｕｍ（ＮＢＴ）（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ，Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）、０．１５ｍｇ５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リルホスフェート（ＢＣＩＰ）（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）で
呈色反応を開始し、蒸留水で停止した。

【００７１】実施例７：マイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣを検出するための
特異的な系としての、遺伝子ｌｐｐＱに基づくＰＣＲ法ｌｐｐＱ遺伝子に基づくマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣ生物
の同定を可能にする特異的ＰＣＲ法を開発した。特異的プライマーＭＭＭＳＣＯ
５−７およびＭＭＭＳＣＯ５−６（表３）を開発した。特異的ＰＣＲパラメータ
ーは：変性９４℃、３０秒間；アニーリング４８℃、３０秒間；伸長７２℃、１
分間；３５サイクルである。このＰＣＲは全世界で最も離れた場所で生じた、試
験したマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣの全ての株から特異的１
３０４ｂｐフラグメントを増幅した。その他の近縁のマイコプラズマ生物では（
表１）同一条件下で増幅は観察されなかった。

【００７２】実施例８：免疫学的検出系精製された組換えＬｐｐＱＮ’−Ｈｉｓ（Ｎ末端ペプチド）をＪＦ１９７９株
から製造し、続いてＮｉキレートクロマトグラフィーにより精製した（図６）。
精製したＬｐｐＱＮ’−Ｈｉｓをマイクロタイタープレートを被覆するために用
いた。被覆は、標準的な方法（ＮｉｃｏｌｅｔおよびＭａｒｔｅｌ（１９９６）
）により、被覆炭酸塩バッファー（０．１ＭＮａ_２ＣＯ_３／ＮａＨＣＯ_３，ｐ
Ｈ９．６）中１０μｇ／ｍｌＬｐｐＱ１００μｌを用いて行った。被覆した
マイクロタイタープレート（ウェルあたり１μｇのＬＰＰＱＮ’を含有）を用い
て、異なる国のＣＢＰＰを有するウシを含む数匹のウシの血清、健常ウシの血清
、実験的に感染させたウシの血清、および標準的なＣＦ試験で偽陽性の結果が得
られた血清を含む健常ウシの血清で間接的ＥＬＩＳＡを実施した。このＥＬＩＳ
Ａの予備的データを表２に示す。このデータには、ＬｐｐＱＮ’−Ｈｉｓに基づ
くＥＬＩＳＡ試験がＣＢＰＰの動物またはマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコ
イデスＳＣに感染した動物の特異的で感受性のある血清診断に適していることが
示されている。

【００７３】

【表１】

【００７４】

【表２】１ｐｐＱをＰＣＲにより、および／またはブロットハイブリダイゼーションによ
り測定した。

【００７５】

【表３】

【００７６】

【表４】

【００７７】

【表５】

【００７８】

【表６】

【００７９】

【表７】

【００８０】

【表８】

【００８１】

【表９】

【００８２】

【表１０】

【００８３】

【表１１】

【００８４】

【表１２】

【００８５】

【表１３】

【００８６】

【表１４】

【００８７】

【表１５】

【配列表】

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年１２月７日（２００１．１２．７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/30 Ｃ０７Ｋ 16/12 ４Ｃ０８４ 16/12 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｃ０８５Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 ４Ｃ０８６ 1/19 1/21 ４Ｈ０４５ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/48 ＺＣ１２Ｐ 21/02 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/48 Ｚ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＭＧ０１Ｎ 33/53 Ｎ 33/566 33/569 Ｆ 33/566 33/577 Ｂ 33/569 33/58 Ｚ 33/577 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/58 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 ＡＦターム(参考） 2G045 AA28 BB20 CA26 CB21 DA12 DA13 DA14 DA20 DA36 FB01 FB02 FB03 FB04 FB07 HA16 4B024 AA01 AA11 AA13 BA31 CA03 HA01 HA14 HA15 4B063 QA18 QA19 QQ03 QQ43 QR08 QR32 QR62 QS25 QS33 QS34 4B064 AG27 AG31 CA19 CC24 DA01 DA13 DA15 4B065 AB01 BA02 CA45 CA46 4C084 AA13 MA52 MA59 MA60 MA66 NA14 ZB352 4C085 AA03 AA08 BA48 BB11 BB23 CC07 EE01 GG03 GG04 GG05 GG08 GG10 4C086 AA01 AA02 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB35 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA55 CA11 DA76 DA86 EA31 EA50 EA52 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】表５に示すアミノ酸配列（ＬｐｐＱ前駆体、配列番号：２５
）またはその部分を含んでなるマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣ
のタンパク質。
【請求項２】表５に示すアミノ酸配列（配列番号：２５）により特徴づけ
られるマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣのＬｐｐＱ前駆体タンパ
ク質。
【請求項３】その部分が表７（成熟ＬｐｐＱ、配列番号：２７）または表
９（ＬｐｐＱＮ’、配列番号：２９）に示すアミノ酸配列により特徴づけられる
請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】表７で示すアミノ酸配列（配列番号：２７）により特徴づけ
られるマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣの成熟ＬｐｐＱタンパク
質。
【請求項５】表９に示すアミノ酸配列（ＬｐｐＱＮ’；配列番号：２９）
により特徴づけられるマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣの成熟Ｌ
ｐｐＱタンパク質のＮ末端ハーフ。
【請求項６】該配列が２ないし１２個のヒスチジン残基により先行および
／または後続される請求項１ないし５のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７】タンパク質がリポタンパク質である請求項１ないし６のいず
れか一項に記載のタンパク質。
【請求項８】請求項１ないし７のいずれかに記載のタンパク質をコードす
るＤＮＡ。
【請求項９】表５（ｌｐｐＱ前駆体遺伝子、配列番号：２４）、表６（ｌ
ｐｐＱ^＊、配列番号：２６）、または表８（ｌｐｐＱ^＊Ｎ’、配列番号：２８）
に示すＤＮＡ配列により特徴づけられる請求項８に記載のＤＮＡ。
【請求項１０】マイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣの直接的
または間接的に検出するための診断方法における請求項１ないし７のいずれかに
記載のタンパク質の使用。
【請求項１１】診断方法が免疫学的方法であって、イムノブロッティング
、血清学的試験およびＥＬＩＳＡからなる群から選択される請求項１０に記載の
使用。
【請求項１２】マイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣに対する
ワクチンの調製のための請求項１ないし７のいずれかに記載のタンパク質、また
は請求項８または９のいずれかに記載のＤＮＡの使用。
【請求項１３】マーカーワクチンとして使用するための、細胞がＬｐｐＱ
タンパク質の合成能を欠く、マイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣの
生、弱毒化または不活性化細胞の調製のための請求項８または９のいずれかに記
載のＤＮＡの使用。
【請求項１４】マイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣの検出方
法における請求項８または９のいずれか一項に記載のＤＮＡの使用。
【請求項１５】検出方法がＰＣＲ法およびハイブリダイゼーション法から
なる群から選択される請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】請求項１ないし７のいずれかに記載のタンパク質を発現す
るための請求項８または９のいずれか一項に記載のＤＮＡの使用。
【請求項１７】請求項８または９のいずれかに記載のＤＮＡを含んでなる
ベクター、とりわけｐＪＦＦｍａＬＰ４８−ＭｕＨｉｓ１（ｔｈｅＥｕｒｏｐ
ｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅｓ，Ｓａｌｉ
ｓｂｕｒｙ，ＷｉｌｔｓｈｉｒｅＳＰ４０ＪＧ．英国、に寄託、寄託番号：９
９０８１０２５）。
【請求項１８】請求項１７に記載のベクターまたは請求項８または９のい
ずれかに記載のＤＮＡを含んでなる宿主細胞。
【請求項１９】（ａ）請求項１７に記載のベクターを適当な宿主細胞に導入する；（ｂ）請求項１ないし７のいずれかに記載のタンパク質の発現を可能にする条
件下で宿主細胞を培養する；および（ｃ）工程（ｂ）のタンパク質を宿主細胞または上澄から単離する請求項１な
いし７のいずれかに記載のタンパク質の調製方法。
【請求項２０】（ａ）マイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣのゲノムＤＮＡのＤＮ
Ａライブラリーを適当なファージにクローン化する；（ｂ）工程（ａ）のファージを用いて適当な宿主細胞を感染させる；（ｃ）宿主細胞をマイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣに感染した
哺乳動物の血清でスクリーニングする；（ｄ）陽性クローンを選別し、精製する；および（ｅ）工程（ｄ）のファージのゲノムＤＮＡを単離する、表５のＤＮＡ配列（
配列番号：２５）により特徴づけられたＤＮＡの調製方法。
【請求項２１】（ａ）表５（配列番号：２４）のＤＮＡ配列に示す特徴づけられるＤＮＡおよ
び表３（配列番号：１ないし４および６ないし２１）に示す適当なプライマーセ
ットを重複伸長ＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎＰＣＲ：ＯＥ−
ＰＣＲ）に適用して第１のＰＣＲ産物を得る；（ｂ）工程（ａ）のＯＥ−ＰＣＲの第１のＰＣＲ産物を、望ましい変異数のた
めに要求される１回またはそれ以上のＯＥ−ＰＣＲに適用し、最終ＰＣＲ産物を
得る；および（ｃ）最終ＰＣＲ産物を単離する、表６（ｌｐｐＱ^＊、配列番号：２６）、ま
たは表８（ｌｐｐＱ^＊Ｎ’、配列番号：２８）のＤＮＡ配列で特徴づけられるＤ
ＮＡの調製方法。
【請求項２２】（ａ）請求項１ないし７のいずれか一項に記載のタンパク質を適当な膜にブロ
ッティングする；（ｂ）膜を該体液と共にインキュベートする；（ｃ）膜を標識したコンジュゲートと共にインキュベートする；（ｄ）コンジュゲートの抗体とおよび請求項１ないし５および７のいずれかに
記載のタンパク質に対する体液からの抗体との複合体を検出するために呈色反応
を開始する、動物の体液中の請求項１ないし５および７のいずれか一項に記載の
タンパク質に対する抗体を検出する方法。
【請求項２３】体液が血清および気管支液からなる群から選択され、膜が
ニトロセルロースまたはナイロン膜であり、コンジュゲートがアルカリ性ホスフ
ァターゼで標識されている請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】（ａ）マイクロタイタープレートを請求項１ないし７のいずれかに記載のタン
パク質で被覆する；（ｂ）マイクロタイタープレートを該体液と共にインキュベートする；（ｃ）マイクロタイタープレートを標識したコンジュゲートと共にインキュベ
ートする；および（ｄ）コンジュゲートの抗体とおよび請求項１ないし５および７のいずれかに
記載のタンパク質に対する体液からの抗体との複合体を検出するために呈色反応
を開始する、動物の体液中の請求項１ないし５および７のいずれかに記載のタン
パク質に対する抗体の検出方法。
【請求項２５】体液が血清および気管支液からなる群から選択され、コン
ジュゲートがアルカリ性ホスファターゼで標識されている請求項２４に記載の方
法。
【請求項２６】（ａ）表５（ＬｐｐＱ前駆体遺伝子、配列番号：２４）に記載のＤＮＡを検出
するための適当なＰＣＲプライマー対を試験すべきサンプルと共にＰＣＲ反応に
おいて使用する；および（ｂ）ＰＣＲ反応後、予想されるＰＣＲ産物の存在を上記適当なＰＣＴプライ
マー対で検査する、マイコプラズマ・ミコイデス亜種ミコイデスＳＣを検出する
方法。
【請求項２７】適当なＰＣＲプライマー対が表３に示すプライマーＭＭＭ
ＳＣＯ５−７（配列番号：２２）およびＭＭＭＳＣＯ５−６（配列番号：２３）
からなる群から選択される請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】請求項１ないし７のいずれかに記載のタンパク質に特異的
なモノクローナル抗体。
【請求項２９】請求項１ないし７のいずれかに記載のタンパク質および／
または少なくとも１つの請求項２８に記載の抗体が適当な容器に含まれている診
断キット。
【請求項３０】請求項１ないし７のいずれかに記載のタンパク質または請
求項８または９のいずれかに記載のＤＮＡを含んでなるマイコプラズマ・ミコイ
デス亜種ミコイデスＳＣによる感染に対するワクチン。