CN102908613A - 一种猪用免疫增强剂il-12b(p40)及其制备方法 - Google Patents
一种猪用免疫增强剂il-12b(p40)及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102908613A CN102908613A CN2011102232940A CN201110223294A CN102908613A CN 102908613 A CN102908613 A CN 102908613A CN 2011102232940 A CN2011102232940 A CN 2011102232940A CN 201110223294 A CN201110223294 A CN 201110223294A CN 102908613 A CN102908613 A CN 102908613A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- immuno
- enhancer
- porcine
- gst
- fusion protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及一种猪用免疫增强剂IL-12B(P40)及其制备方法，猪用免疫增强剂IL-12B(P40)是一种含有猪IL-12的P40亚基(IL-12B(P40)的主要氨基酸序列的基因重组蛋白，通过RT-PCR合成IL-12B(P40)的cDNA，经过纯化、酶切，将该基因克隆进原核表达载体pGEX-6p-1，该重组质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，经IPTG诱导的表达产物为GST-IL-12B(P40)融合蛋白，该融合蛋白经纯化后，纯度较高，将纯化的GST-IL-12B(P40)融合蛋白与化学合成的猪瘟病毒T细胞表位E290多肽(KHKVRNEVMVHWFDD)混匀，免疫猪后，能诱发机体显著的T细胞免疫反应。本发明的有益效果为：重组GST-IL-12B(P40)融合蛋白可作为一种免疫增强剂应用于猪病原体(如猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒等)感染的预防及治疗。
Description
技术领域
本发明涉及基因重组技术领域，尤其涉及一种猪用免疫增强剂IL-12B(P40)及其制备方法。
背景技术
白介素12(IL-12)，又名细胞毒淋巴细胞成熟因子(cytotoxic lymphocytematuration factor，CLMF)，或称细胞刺激因子(natural killer cell stimulation factor，NKSF)。它是一种由分子量为40kDa和35kDa的两个亚基组成的异源二聚体的细胞因子，主要由树突状细胞(DC)、巨噬细胞(MФ)、B淋巴细胞以及其他一些抗原提呈细胞(APC)产生，它能促进分化的CD4+T辅助细胞1(Th1)的增殖，诱导NK细胞和T细胞产生细胞因子(主要是γ干扰素)，提高NK细胞的细胞毒性，促进细胞毒性T细胞的形成等等。IL-12在机体早期的非特异性免疫和随后的抗原特异性的适应性免疫过程均扮演了极重要的角色。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪用免疫增强剂IL-12B(P40)及其制备方法，应用于猪病原体(如猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒等)感染的预防及治疗。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现：
一种猪用免疫增强剂IL-12B(P40)，是一种基因重组蛋白，该蛋白含有猪IL-12的P40亚基[IL-12B(P40)]的主要氨基酸序列。
一种猪用免疫增强剂IL-12B(P40)的制备方法，包括以下步骤：
1)以IL-12B(P40)特异性的上下游引物，通过RT-PCR合成包含EcoRI和XhoI两个酶切位点的IL-12B(P40)cDNA，经过纯化酶切，重组至原核表达载体pGEX-6p-1；
2)该重组质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，经IPTG诱导的表达产物为GST-IL-12B(P40)融合蛋白；
3)将纯化的GST-IL-12B(P40)融合蛋白与化学合成的猪瘟病毒T细胞表位E290多肽(KHKVRNEVMVHWFDD)混匀，免疫猪后，通过淋巴细胞增殖实验检测机体的T细胞免疫反应。。
本发明的有益效果为：重组融合蛋白可作为一种免疫增强剂，与猪病原体(如猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒等)的一些T细胞表位(如猪瘟病毒T细胞表位E290多肽：KHKVRNEVMVHWFDD)联合免疫动物，增强机体的细胞免疫水平，应用于猪病的预防及治疗。
具体实施方式
本发明实施例所述的一种猪用免疫增强剂IL-12B(P40)，是一种基因重组蛋白，该蛋白含有猪IL-12的P40亚基[IL-12B(P40)]的主要氨基酸序列。
实施例1：IL-12B(P40)基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1
1、设计IL-12B(P40)基因引物
参考猪源IL-12B(P40)基因序列(GenBank号：NM_214013)设计扩增IL-12B(P40)基因引物如下，引入酶切位点为EcoRI和Xho I(用斜体表示)：
F-E：GC
ATGCACCTTCAGCAGCTG，
R-X：GC
CTAATTGCAGGACACAGATG。
2、提取猪外周血单核淋巴细胞(PBMC)的总RNA
根据invitrogen公司的RNA提取试剂盒，从猪PBMC中提取总RNA。
3、IL-12B(P40)基因的反转录及PCR
根据invitrogen公司的RT-PCR试剂盒进行反转录，获得IL-12B(P40)-mRNA的cDNA。然后根据上述引物为PCR扩增IL-12B(P40)基因。
PCR反应条件如下：94℃4分钟；94℃40秒，55℃40秒，72℃75秒；共30循环；72℃10分钟。结果得PCR产物约为975bp的目的片段。
4、阳性重组质粒pGEX-6p-1-IL-12B(P40)的获取
1％琼脂糖凝胶电泳后，回收目的条带，按下列体系用EcoR I和Xho I双酶切回收PCR产物及载体pGEX-6p-1质粒：
37℃酶切反应2小时后，电泳回收目的条带，按下列体系连接载体与PCR片段：
16℃反应5小时后，转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取阳性单克隆进行基因测序，将测序表明含有IL-12B(P40)基因的载体命名为pGEX-6p-1-IL-12B(P40)。
实施例2：IL-12B(P40)蛋白的诱导表达及纯化
将pGEX-6p-1-IL-12B(P40)阳性重组质粒转化表达菌株-大肠杆菌BL21(DE3)，获得的含有pGEX-6p-1-IL-12B(P40)的阳性克隆命名为BL21-pGEX-6p-1-IL-12B(P40)。
扩增培养工程菌BL21-pGEX-6p-1-IL-12B(P40)，37℃，200转/分(旋转半径为13mm)振摇培养菌液OD600至1.0，在16℃下加入IPTG(0.25mM)诱导10～14小时。培养结束后，进行如下处理：10000g、离心10分钟收集菌体经PBS重悬，超声破菌，进行SDS-PAGE电泳检测，检测结果显示，分别在64kDa左右处出现一条蛋白条带(GST的26kDa+p40的38kDa)，与GST-IL-12B(p40)蛋白大小相符，表明重组GST-IL-12B(p40)蛋白在大肠杆菌中正确表达。另将沉淀进行一系列纯化后，SDS-PAGE电泳检测，检测结果显示，条带单一，表明获得纯度极高的重组GST-IL-12B(p40)蛋白，可以进行下一步的动物免疫试验。
实施例3：合成E290多肽
化学合成猪瘟病毒T细胞表位E290多肽：KHKVRNEVMVHWFDD。
实施例4：动物实验-免疫猪
选取20头4周龄猪瘟病毒阴性和抗体阴性小猪作为实验动物，随机均分为如下4组：
将各组蛋白与弗氏佐剂(第一次为弗氏完全佐剂，第二、三次为弗氏不完全佐剂)混合乳化后，按上面的方法免疫小猪。1～4组在免疫了2次后的第14天采集全血15ml，分离PBMC。
实施例5：细胞免疫水平检测实验-外周血单核淋巴细胞(PBMC)增殖实验
采集2免后第14天的猪血，分离外周血单核淋巴细胞(PBMC)，做淋巴细胞增殖实验，检测机体的细胞免疫水平。
结果显示，单独的E290多肽免疫不足以产生特异性细胞免疫，E290多肽+IL-12B(p40)混合物能诱发机体产生特异性细胞免疫，说明IL-12B(p40)能作为一种免疫增强剂诱发机体的细胞免疫。
Claims (2)
1.一种猪用免疫增强剂IL-12B(P40)，其特征在于，其含有猪IL-12的P40亚基的主要氨基酸序列，该氨基酸序列为：MHLQQLVVSWFSLVWLASPIVAIWELEKNVYVVELDWYPNAPGEMVVLTCNTPEEDGITWTSDQSSEVLGTGKTLTIHVKEFGDAGQYTCRKGGAVLSQSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKSFLKCEAKNYSGRFTCWWLTAISTDLKFSVKSSRGSTDPRGVTCGTATLSEDLGEYKKYRVECQEGSACPAAEESLPIEVVLEAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLNPLKNSRHVEISWEYPDTWSTPHSYFSLMFGVQVQGKNKREKKDKLFTDQISAKVTCHKDANIRVQARDRYYSSSWSEWASVSCN。
2.权利要求1所述的猪用免疫增强剂IL-12B(P40)的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以IL-12B(P40)特异性的上下游引物，通过RT-PCR合成包含EcoRI和XhoI两个酶切位点的IL-12B(P40)cDNA，经过纯化酶切，重组至原核表达载体pGEX-6p-1；
2)该重组质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，经IPTG诱导的表达产物为GST-IL-12B(P40)融合蛋白；
3)将纯化的GST-IL-12B(P40)融合蛋白与化学合成的猪瘟病毒T细胞表位E290多肽(KHKVRNEVMVHWFDD)混匀。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011102232940A CN102908613A (zh) | 2011-08-04 | 2011-08-04 | 一种猪用免疫增强剂il-12b(p40)及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011102232940A CN102908613A (zh) | 2011-08-04 | 2011-08-04 | 一种猪用免疫增强剂il-12b(p40)及其制备方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102908613A true CN102908613A (zh) | 2013-02-06 |
Family
ID=47607345
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2011102232940A Pending CN102908613A (zh) | 2011-08-04 | 2011-08-04 | 一种猪用免疫增强剂il-12b(p40)及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102908613A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103954772A (zh) * | 2014-04-30 | 2014-07-30 | 广东海大畜牧兽医研究院有限公司 | 一种猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、伪狂犬病毒抗体的三联金标检测试纸条 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2323929A1 (en) * | 1998-04-03 | 1999-10-14 | University Of Iowa Research Foundation | Methods and products for stimulating the immune system using immunotherapeutic oligonucleotides and cytokines |
| CN1555271A (zh) * | 2001-09-17 | 2004-12-15 | 白细胞介素-12作为兽医疫苗佐剂 | |
| CN1797619A (zh) * | 2004-12-28 | 2006-07-05 | 张明德 | 一种开口式卷绕铁芯及其制造方法 |
| WO2007008918A2 (en) * | 2005-07-08 | 2007-01-18 | Wayne State University | Virus vaccines comprising envelope-bound immunomodulatory proteins and methods of use thereof |
| WO2008052770A2 (en) * | 2006-10-31 | 2008-05-08 | Curevac Gmbh | (base-)modified rna for increasing the expression of a protein |
| CN101468202A (zh) * | 2007-12-29 | 2009-07-01 | 邵峰 | 猪疫苗使用的pIL-12基因佐剂及制备方法 |
-
2011
- 2011-08-04 CN CN2011102232940A patent/CN102908613A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2323929A1 (en) * | 1998-04-03 | 1999-10-14 | University Of Iowa Research Foundation | Methods and products for stimulating the immune system using immunotherapeutic oligonucleotides and cytokines |
| CN1555271A (zh) * | 2001-09-17 | 2004-12-15 | 白细胞介素-12作为兽医疫苗佐剂 | |
| CN1797619A (zh) * | 2004-12-28 | 2006-07-05 | 张明德 | 一种开口式卷绕铁芯及其制造方法 |
| WO2007008918A2 (en) * | 2005-07-08 | 2007-01-18 | Wayne State University | Virus vaccines comprising envelope-bound immunomodulatory proteins and methods of use thereof |
| WO2008052770A2 (en) * | 2006-10-31 | 2008-05-08 | Curevac Gmbh | (base-)modified rna for increasing the expression of a protein |
| CN101468202A (zh) * | 2007-12-29 | 2009-07-01 | 邵峰 | 猪疫苗使用的pIL-12基因佐剂及制备方法 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103954772A (zh) * | 2014-04-30 | 2014-07-30 | 广东海大畜牧兽医研究院有限公司 | 一种猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、伪狂犬病毒抗体的三联金标检测试纸条 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102666575A (zh) | 分枝杆菌疫苗 | |
| Xie et al. | Recombinant α-actinin subunit antigens of Trichomonas vaginalis as potential vaccine candidates in protecting against trichomoniasis | |
| EP2765137A1 (en) | Induction of cross-reactive cellular response against rhinovirus antigens | |
| Lu et al. | DNA vaccine ROP 29 from Toxoplasma gondii containing R848 enhances protective immunity in mice | |
| Choi et al. | A recombinant 47-kDa outer membrane protein induces an immune response against Orientia tsutsugamushi strain Boryong | |
| CN109942693B (zh) | 一种微小隐孢子虫的ctl表位多肽及其应用和疫苗 | |
| CN114426981A (zh) | 非洲猪瘟病毒抗原蛋白重组表达载体、重组植物乳酸菌及其制备方法和应用 | |
| CN102178950B (zh) | 一种亚单位疫苗免疫佐剂及应用 | |
| Toida et al. | Oral immunization with the saliva-binding region of Streptococcus mutans AgI/II genetically coupled to the cholera toxin B subunit elicits T-helper-cell responses in gut-associated lymphoid tissues | |
| CN102908613A (zh) | 一种猪用免疫增强剂il-12b(p40)及其制备方法 | |
| CN102558306A (zh) | 用于防治旋毛虫病的抗原表位、其组合物及用途 | |
| Medaglini et al. | In vivo activation of naive CD4+ T cells in nasal mucosa-associated lymphoid tissue following intranasal immunization with recombinant Streptococcus gordonii | |
| CN109206519B (zh) | 一种抗尿素酶b亚单位的纳米抗体及核酸分子和应用 | |
| CN107033245A (zh) | 一种鸡caspase‑1多克隆抗体的制备方法和用途 | |
| Qiu et al. | Dominant antigen of grass carp Reovirus and immunity assessment with DNA vaccine for grass carp | |
| Shiau et al. | Enhancement of humoral and cellular immune responses by an oral Salmonella choleraesuis vaccine expressing porcine prothymosin α | |
| GB2455650A (en) | Brucella melitensis ABC transporter proteins for generating an immune response | |
| CN102154306A (zh) | 密码子优化的猪cd40l基因及表达其编码蛋白的重组杆状病毒的制备方法 | |
| Xu et al. | Mucosal and cellular immune responses elicited by nasal and intramuscular inoculation with ASFV candidate immunogens | |
| Park et al. | Immunization with porcine epidemic diarrhea virus harbouring Fc domain of IgG enhances antibody production in pigs | |
| CN101780272A (zh) | 一种含有TGF β1自体疫苗制剂的应用 | |
| CN1944644B (zh) | HIV-1gp120与人γ干扰素融合蛋白的制备方法 | |
| CN102908617A (zh) | 一种猪繁殖与呼吸综合症病毒m蛋白与cd40l融合疫苗及制备方法 | |
| US9175049B2 (en) | Recombinant mycobacterium avium subsp. paratuberculosis proteins induce immunity and protect against infection | |
| CN116496362B (zh) | 一种猪轮状病毒的抗原组合及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130206 |