CN102813922A

CN102813922A - 一种复方油佐剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN102813922A
Application number: CN2012103324094A
Authority: CN
Inventors: 王金宝; 杜以军; 齐静; 吴家强; 李俊; 黄保华; 丛晓燕; 任素芳; 孙文博; 时建立; 郭立辉; 吕伟
Original assignee: Institute Animal Science and Veterinary Medicine of Shandong AAS
Current assignee: Institute Animal Science and Veterinary Medicine of Shandong AAS
Priority date: 2012-09-11
Filing date: 2012-09-11
Publication date: 2012-12-12
Anticipated expiration: 2032-09-11
Also published as: CN102813922B

Abstract

本发明涉及疫苗佐剂技术领域，特别涉及一种复方油佐剂，由白油、油醇聚氧乙烯醚和聚氧乙烯醚硬脂酸酯三种成分组成。白油占80%-95%，油醇聚氧乙烯醚占1%-10%，聚氧乙烯醚硬脂酸酯占1%-10%。油醇聚氧乙烯醚分子量为400-600，聚氧乙烯醚硬脂酸酯分子量为400-600。分别称取处方量的白油、油醇聚氧乙烯醚和聚氧乙烯醚硬脂酸酯，均匀混合而成。复方油佐剂在制备动物疫苗中的应用。本发明成功解决了W/O/W型乳剂疫苗制备困难的难题，所制备的乳剂疫苗既便于注射又具有良好的免疫原性，而且稳定性比ISA206所制各的W/O/W型乳剂疫苗更好。

Description

一种复方油佐剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及疫苗佐剂技术领域，特别涉及一种复方油佐剂，还涉及所述复方油佐剂的制备方法及应用。

背景技术

油性佐剂疫苗是已公知的可有效强化免疫性的疫苗，是目前国内外疫苗市场上产品最多的类型之一，油乳剂疫苗有三种类型：油包水(W/O)型、水包油(O/W)型和水包油包水（W/O/W）型。

油包水(W/O)型应用最普遍，是分三步骤，首先通过将司本-85加入白油中、吐温-80加入抗原水溶液中，再将二者混合物进行乳化制备而成。其显著优点是可获得高水平持久的免疫增强效果。缺点是较粘稠，注射较困难。同时由于疫苗中白油含量相对较高，常常导致严重的接种副反应、形成无菌性化脓损害和接种部位周围的肉芽肿，可产生外部可见的浮肿、肿胀、硬结和坏死。而且怀疑在接种部位有留存的可能，这便妨碍了疫苗的使用。水包油(O/W)型是为减少乳剂中油含量建立此法，但未普遍应用。该剂型优点是粘度低，易于注射，缺点是免疫原性弱，仅诱导动物体内产生较弱的免疫应答，在人用疫苗应用方面已有商业化应用，如MF59佐剂用于流感疫苗的制作，但是在动物疫苗上尚未推广应用。

水包油包水（W/O/W）剂型兼具有W/O型和O/W型的优点，效果很好。常规的做法是先制备W/O型疫苗，再经第二次分散到水相中制备而成。目的是降低黏度，既便于注射又具有良好的免疫原性。但制备技术上难度较大，疫苗稳定性差，如能克服此缺点，它是最理想的乳剂疫苗。国内外公认的最好此类佐剂为ISA206（法国SEPPIC公司生产）。它通过自乳化技术，直接将ISA206与抗原水溶液混合、乳化，一步法即可制备出W/O/W型乳剂疫苗，解决了W/O/W型乳剂疫苗制备难的问题，而且具有一定的稳定性，在全球范围内得到了广泛应用。其不足之处为所制备的W/O/W型乳剂疫苗稳定性还不太令人满意，而且价格昂贵。专利“一种自乳化疫苗佐剂及其制备方法”（ZL 200510037639.8）公布了一系列W/O/W型乳剂疫苗的制备方法，但是其配方复杂，田间试验时有副反应发生。而且稳定性不足12个月，不能满足生产实际需要，也未见其商品化使用。因此，建立稳定、简便、价廉的W/O/W型乳剂工艺具有极其重要的现实意义和市场价值。

发明内容

为了解决以上油性佐剂疫苗配方复杂、稳定性差、价格昂贵的问题，本发明提供了一种配方简单、稳定性好、价格便宜的复方油佐剂。

本发明的另一个目的是提供所述复方油佐剂的制备方法。

本发明还提供了所述复方油佐剂的应用。

本发明是通过以下措施实现的：

本发明的复方油佐剂，由白油、油醇聚氧乙烯醚（C₁₈H₃₅O（CH₂CH₂O）_n—H）和聚氧乙烯醚硬脂酸酯三种成分组成。其中，白油所占质量比为80%-95%，油醇聚氧乙烯醚所占质量比为1%-10%，聚氧乙烯醚硬脂酸酯所占质量比为1%-10%。油醇聚氧乙烯醚分子量为400-600，聚氧乙烯醚硬脂酸酯分子量为400-600。

所用原料的重量百分比优选白油88-92%，油醇聚氧乙烯醚5-9%，聚氧乙烯醚硬脂酸酯1-5%。

所述的复方油佐剂，更优选白油90%，油醇聚氧乙烯醚7%，聚氧乙烯醚硬脂酸酯3%。

本发明复方油佐剂的制备方法：分别称取处方量的白油、油醇聚氧乙烯醚和聚氧乙烯醚硬脂酸酯，均匀混合而成。

所述的复方油佐剂在制备动物疫苗中的应用。

所述的应用，将复方油佐剂预热，与抗原溶液混合，乳化均匀。

所述的应用，优选复方油佐剂与抗原溶液按质量比1～1.5:1混合。

所述抗原溶液优选为猪圆环病毒液，灭活前每毫升病毒液病毒含量≥10^5.5TCID₅₀。

所述抗原溶液为优选为猪口蹄疫抗原水溶液，灭活前每0.2毫升病毒液病毒含量≥10^7.0LD₅₀。

本发明复方油佐剂的使用方法：本发明对抗原的种类没有限制，对乳化的装置也没有限制。通用W/O/W型乳剂疫苗的制备方法是，将本发明复方油佐剂预热25℃以上，与抗原水溶液（室温）按质量比1～1.5:1进行混合，乳化5～30分钟即可。

本发明的有益效果：本发明应用自乳化原理，开发了一种新复方油佐剂，该复方油佐剂与抗原水溶液经过手摇、磁力搅拌或机械挤压乳化等乳化工艺均可制作成稳定的W/O/W型乳剂疫苗，成功解决了W/O/W型乳剂疫苗制备困难的难题，所制备的乳剂疫苗既便于注射又具有良好的免疫原性，而且稳定性比ISA206所制各的W/O/W型乳剂疫苗更好。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细解释，但下述实施例并不对本发明进行任何的限制。

实施例1 复方油佐剂在猪口蹄疫疫苗中的应用

（1）复方油佐剂的制备

分别称取白油17.4g，油醇聚氧乙烯醚1.6g和聚氧乙烯醚硬脂酸酯1.0g（三者的质量分数分别为87%、8%和5%），放入100mL洁净玻璃瓶中、摇匀。115℃、20min灭菌后，室温保存备用。

（2）猪口蹄疫病毒液的制备

按照《兽用生物质量质量标准汇编》（2006-2008），相关要求制备灭活的猪口蹄疫抗原水溶液，灭活前每0.2毫升病毒液病毒含量应≥10^7.0LD₅₀。

（3）猪口蹄疫疫苗的制备

在无菌操作情况下，将上述（1）中制备的复方油佐剂加热至30℃，取15g放入50mL的烧杯中，另取（2）中制备的猪口蹄疫灭活病毒液15g也放入该烧杯中，同时加入磁力转子置磁力搅拌器（含加热功能）上进行搅拌乳化，转速为2000转每分钟，温度保持30℃，搅拌30分钟，即成，命名疫苗1。

同法用法国SEPPIC公司生产的ISA206佐剂替代本发明的复方油佐剂，制备对照疫苗，命名对照疫苗A。

（4）疫苗物理性状和免疫活性的比较见表1。

表1 疫苗1和对照疫苗A的比较

项目	疫苗1	对照疫苗A
			外观	粉红色的均匀乳状液	粉红色的均匀乳状液
剂型	W/O/W型，将少许疫苗滴于清洁冷水表面，呈云雾状扩散	W/O/W型，将少许疫苗滴于清洁冷水表面，呈云雾状扩散
			离心稳定性	3000转/分离心15分钟，无水相析出	3000转/分离心15分钟，有0.2mL的水相析出
2-8℃稳定性	14个月稳定	12个月稳定
			黏度	3.6秒/0.4mL	3.7秒/0.4mL
抗体测定	小鼠免疫后4周抗体阳性率90%	小鼠免疫后4周抗体阳性率75%

实施例2 猪圆环病毒疫苗的应用

（1）复方油佐剂的制备

a、分别称取白油90.0g，油醇聚氧乙烯醚7.0g和聚氧乙烯醚硬脂酸酯3.0g（三者的质量分数分别为90%、7%和3%），放入100mL洁净玻璃瓶中、摇匀。115℃、20min灭菌后，室温保存备用。

b、分别称取白油80.0g，油醇聚氧乙烯醚10.0g和聚氧乙烯醚硬脂酸酯10.0g（三者的质量分数分别为80%、10%和10%），放入100mL洁净玻璃瓶中、摇匀。115℃、20min灭菌后，室温保存备用。

c、分别称取白油95.0g，油醇聚氧乙烯醚3.0g和聚氧乙烯醚硬脂酸酯2.0g（三者的质量分数分别为95%、3%和2%），放入100mL洁净玻璃瓶中、摇匀。115℃、20min灭菌后，室温保存备用。

（2）猪圆环病毒液的制备

按照《兽用生物质量质量标准汇编》（2006-2008），相关要求制备灭活的猪圆环病毒液，灭活前每毫升病毒液病毒含量应≥10^5.5TCID₅₀。

（3）猪圆环病毒疫苗的制备

在无菌操作情况下，将上述（1）中制备的复方油佐剂分别加热至30℃，分别取30g放入100mL的玻璃瓶中，另分别取（2）中制备的猪圆环病毒灭活液30g也放入玻璃瓶中，用杆状匀浆器，12000转/分钟，乳化3分钟即可，命名疫苗2、疫苗3和疫苗4。

同法用法国SEPPIC公司生产的ISA206佐剂替代本发明的复方油佐剂，制备对照疫苗，命名对照疫苗B。

（4）疫苗物理性状和免疫活性的比较

表2 得到的疫苗和对照疫苗B的比较

项目	疫苗2	疫苗3	疫苗4	对照疫苗B
					外观	淡粉红色的均匀乳状液	淡粉红色的均匀乳状液	淡粉红色的均匀乳状液	淡粉红色的均匀乳状液
剂型	W/O/W型，将少许疫苗滴于清洁冷水表面，呈云雾状扩散	W/O/W型，将少许疫苗滴于清洁冷水表面，呈云雾状扩散	W/O/W型，将少许疫苗滴于清洁冷水表面，呈云雾状扩散	W/O/W型，将少许疫苗滴于清洁冷水表面，呈云雾状扩散
					离心稳定性	3000转/分离心15分钟，无水相析出	3000转/分离心15分钟，无水相析出	3000转/分离心15分钟，无水相析出	3000转/分离心15分钟，有0.1mL的水相析出
2-8℃稳定性	14个月稳定	14个月稳定	14个月稳定	12个月稳定
					黏度	3.9秒/0.4mL	3.8秒/0.4mL	4.0秒/0.4mL	4.0秒/0.4mL
抗体测定	小鼠免疫后5周抗体效价高于1:1600为80%	小鼠免疫后5周抗体效价高于1:1600为75%	小鼠免疫后5周抗体效价高于1:1600为75%	小鼠免疫后5周抗体效价高于1:1600为60%

实施例3 猪圆环病毒疫苗的应用

取实施例2中步骤a得到的复方油佐剂，与实施例2制备得到的灭活的猪圆环病毒液分别按照重量比例1.2：1,1.5：1制备得到猪圆环病毒疫苗，分别命名为疫苗5、疫苗6。疫苗物理性状和免疫活性的比较见表3。

表3

项目	疫苗2	疫苗5	疫苗6
				外观	淡粉红色的均匀乳状液	淡粉红色的均匀乳状液	淡粉红色的均匀乳状液
剂型	W/O/W型，将少许疫苗滴于清洁冷水表面，呈云雾状扩散	W/O/W型，将少许疫苗滴于清洁冷水表面，呈云雾状扩散	W/O/W型，将少许疫苗滴于清洁冷水表面，呈云雾状扩散
				离心稳定性	3000转/分离心15分钟，无水相析出	3000转/分离心15分钟，无水相析出	3000转/分离心15分钟，无水相析出
2-8℃稳定性	14个月稳定	14个月稳定	14个月稳定
				黏度	3.9秒/0.4mL	4.0秒/0.4ml	4.1秒/0.4ml
抗体测定	小鼠免疫后5周抗体效价高于1:1600为80%	小鼠免疫后5周抗体效价高于1:1600为80%	小鼠免疫后5周抗体效价高于1:1600为80%

Claims

1.一种复方油佐剂，其特征是所用原料的重量百分比如下：

白油 80-95%，

油醇聚氧乙烯醚 1-10%，

聚氧乙烯醚硬脂酸酯 1-10%；

所述油醇聚氧乙烯醚分子量为400-600，所述聚氧乙烯醚硬脂酸酯分子量为400-600。

2.根据权利要求1所述的复方油佐剂，其特征是所用原料的重量百分比如下：

白油 88-92%，

油醇聚氧乙烯醚 5-9%，

聚氧乙烯醚硬脂酸酯 1-5%。

3.根据权利要求1所述的复方油佐剂，其特征是所用原料的重量百分比如下：

白油 90%，

油醇聚氧乙烯醚 7%，

聚氧乙烯醚硬脂酸酯 3%。

4.一种权利要求1-3中任一项所述的复方油佐剂的制备方法，其特征是将原料混合均匀。

5.一种权利要求1-3中任一项所述的复方油佐剂在制备动物疫苗中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征是将复方油佐剂预热，与抗原溶液混合，乳化均匀。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征是复方油佐剂与抗原溶液按质量比1～1.5:1混合。

8.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于所述抗原溶液为猪圆环病毒液，灭活前每毫升病毒液病毒含量≥10^5.5TCID₅₀。

9.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于所述抗原溶液为猪口蹄疫抗原水溶液，灭活前每0.2毫升病毒液病毒含量≥10^7.0LD₅₀。