CN105168133A - 一种油乳剂制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种油乳剂制备方法，属于兽用生物制品技术领域。本发明包括以下步骤：油相的制备：将Span-80、甘露醇单油酸酯按照一定体积比例加入到经高压灭菌的药用白油中混合,经37℃水浴充分摇匀；水相的制备：将吐温80、聚氧乙烯40氢化蓖麻油和蔗糖酯按照一定的体积比例溶于抗原溶液；乳化：按油相∶水相＝1.5-2∶1的体积比，先将油相放于胶体磨内，开动电机慢速转动搅拌，同时缓慢加入水相加完后再以8000r/min搅拌10-15分钟，在终止搅拌前加入浓度为1％的硫柳汞溶液，加入后其最终浓度为万分之一；半成品检验；分装：定量分装，并粘贴标签，置2～8℃保存。本发明制备的油乳剂黏度小，从而取得更好的乳化稳定效果，同时降低免疫注射副反应。

Description

一种油乳剂制备方法
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，尤其与一种油乳剂制备方法有关。
背景技术
油乳剂疫苗是目前国内外疫苗市场上产品最多的疫苗，其免疫性能稳定、生物安全性高、使用较小的免疫剂量和较少的免疫次数就能达到延长免疫刺激时间，使机体获得足够的保护性抗体。传统油乳剂疫苗在生产过程中将司班-80加入白油中作为油相，吐温-80、硬脂酸铝加入抗原水溶液中作为水相，二者混合乳化获得的油乳剂疫苗稳定性高，免疫后可获得持久的较高水平的免疫抗体，例如专利公开号为CN102579339A公开了一种肉鸡用油乳剂疫苗，包括油相和水相，油相选自白油、司盘-80、硬脂酸铝，水相选自浓缩的抗原疫苗、吐温-80，适用肉鸡的油乳剂疫苗的抗原为灭活的病毒，包括鸡新城疫病毒和禽流感病毒的一种或组合。但是该油乳剂粘度大，免疫注射引起的应激反应较大，可形成无菌性化脓灶，在接种部位出现肿胀、硬结，或形成肉芽肿，影响免疫效果的同时，对动物肉制品质量也产生了不良的影响。针对该问题，本专利申请人研究开发了一种油乳剂制备方法来解决该问题。
发明内容
本发明的目的旨在克服现有的油乳剂存在的粘度大而导致免疫注射引起的应激反应较大等问题，提供一种油乳剂制备方法。
为此，本发明采用以下技术方案：一种油乳剂制备方法，其特征是，包括以下步骤：
(1)、油相的制备：将Span-80、甘露醇单油酸酯按照一定体积比例加入到经高压灭菌的药用白油中混合,经37℃水浴充分摇匀；
(2)、水相的制备：将吐温80、聚氧乙烯40氢化蓖麻油和蔗糖酯按照一定的体积比例溶于抗原溶液；
(3)乳化：按油相∶水相＝1.5-2∶1的体积比，先将油相放于胶体磨内，开动电机慢速转动搅拌，同时缓慢加入水相加完后再以8000r/min搅拌10-15分钟，在终止搅拌前加入浓度为1％的硫柳汞溶液，加入后其最终浓度为万分之一；
(4)、半成品检验；
(5)、分装：定量分装，并粘贴标签，置2～8℃保存。
作为对上述技术方案的补充和完善，本发明还包括以下技术特征。
所述的Span-80、甘露醇单油酸酯、吐温80、聚氧乙烯40氢化蓖麻油和蔗糖酯占疫苗总体积比例分别为0.1％-3.5％、0.1％-3.5％、0.3％-2％、0.3％-2％和0.1％-0.7％。
作为优选，所述的Span-80、甘露醇单油酸酯、吐温80、聚氧乙烯40氢化蓖麻油和蔗糖酯占疫苗总体积比例分别为0.8％-3.42％、0.8％-3.42％、0.45％-1.85％、0.45％-1.85％和0.2％-0.5％。
抗原为大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、坏死梭杆菌、巴氏杆菌或新城疫病毒，但不限于以上病原。
使用本发明可以达到以下有益效果：本发明采用甘露醇单油酸酯、司班-80、TW-80和聚氧乙烯40氢化蓖麻油进行复配，采用蔗糖酯替代硬脂酸铝作为稳定剂，而且制备的油乳剂黏度小，从而取得更好的乳化稳定效果，同时降低免疫注射副反应。本发明制备工艺相对于传统制备工艺相对没有增加制备工艺流程，操作简单，因此值得运用和推广。
附图说明
图1为本发明的乳化剂复配比例示意图。
图2为实施例1的水乳剂制备好后用LS-POP(6)激光粒度分布仪测定粒径大小示意图。
图3为为实施例2的水乳剂制备好后用LS-POP(6)激光粒度分布仪测定粒径大小示意图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的具体实施方式进行详细描述。
本发明包括包括以下步骤：油相的制备：将Span-80、甘露醇单油酸酯按照一定的体积比例加入到经高压灭菌的药用白油中混合,经37℃水浴充分摇匀；水相的制备：将吐温80、聚氧乙烯40氢化蓖麻油和蔗糖酯按照一定的体积比例溶于抗原溶液；乳化：按油相∶水相＝1.5-2∶1的体积比，先将油相放于胶体磨内，开动电机慢速转动搅拌，同时缓慢加入水相加完后再以8000r/min搅拌10-15分钟，在终止搅拌前加入浓度为1％的硫柳汞溶液，加入后其最终浓度为万分之一；半成品检验；
分装：定量分装，并粘贴标签，置2～8℃保存。
进一步地，如图1所示，Span-80、甘露醇单油酸酯、吐温80、聚氧乙烯40氢化蓖麻油和蔗糖酯占疫苗总体积比例分别为0.1％-3.5％、0.1％-3.5％、0.3％-2％、0.3％-2％和0.1％-0.7％。
作为优选，如图1所示，所述的Span-80、甘露醇单油酸酯、吐温80、聚氧乙烯40氢化蓖麻油和蔗糖酯占疫苗总体积比例分别为0.8％-3.42％、0.8％-3.42％、0.45％-1.85％、0.45％-1.85％和0.2％-0.5％。
抗原为大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、坏死梭杆菌、巴氏杆菌或新城疫病毒，但不限于以上病原。
成品检验物理性状：外观：乳白色乳剂。剂型：油包水型；取一只清洁的吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，其余均不扩散。稳定性：吸取疫苗10ml加入尖底离心管中，以4000r/min分钟离心15分钟，管底析出的水相应≤0.5ml。在4℃、室温、37℃环境观察其破乳情况，其中2～8℃保存12个月后无破乳,稳定性良好。黏度：用1ml吸管(下口内径为1.2mm,上口内径为2.7mm)，吸取25℃左右疫苗1ml，令其垂直自然流出，0.4ml所需要时间不超过8秒；粒径测试:将油乳剂制备好后用LS-POP(6)激光粒度分布仪测定粒径大小，粒径小于500um，符合油乳剂粒径要求。
蔗糖酯是蔗糖脂肪酸酯的简称，是由蔗糖与C8～C22等食用脂肪酸合成的一类的非离子表面活性剂，蔗糖酯的乳化作用是由具有高亲水性的蔗糖分子和具有亲油性的脂肪酸基团所致。作为蔗糖酯亲水基的蔗糖部分，兼备出色的亲水性及高疏油性，可以在油水界面形成强固稳定的乳化效果，另外，蔗糖酯还有抑制耐热性芽孢菌的作用，这对产品的贮存也是很有利的。聚氧乙烯蓖麻油衍生物是由不同量环氧乙烷和蓖麻油或氢化蓖麻油反应得到的一系列物质。两种主要衍生物为聚氧乙烯35蓖麻油(EL-35)和聚氧乙烯40氢化蓖麻油(RH-40),主要应用于水不溶性药物或其他脂溶性药物的增溶剂和乳化剂，可防止溶血，并能很快通过尿液排泄,中国药典未收载,收录于欧洲药典和美国药典。TW-80作为增溶剂、乳化剂和稳定剂已收入多国药典。在相近的生产成本的条件下，本发明采用甘露醇单油酸酯、司班-80、TW-80和聚氧乙烯40氢化蓖麻油进行复配，采用蔗糖酯替代硬脂酸铝作为稳定剂，取得更好的乳化稳定效果，同时降低免疫注射副反应。
实施例1:
抗原制备：用鸡新城疫病毒弱毒LaSota株接种9-10日龄易感鸡胚培养，收获感染鸡胚液，要求病毒胚液HA效价≧1:160,每羽份疫苗中含灭活的鸡新城疫病毒LaSota株≥108.5EID50，经甲醛溶液灭活后4℃保存备用。
油相制备：将Span-80、甘露醇单油酸酯加入高压灭菌的药用白油混合,使其终浓度分别为2.9％和2.5％，37℃水浴片刻,充分摇匀。
水相制备：将一定比例的吐温80、聚氧乙烯40氢化蓖麻油和蔗糖酯溶于抗原溶液，使其占水相比例分别为2.4％、2％和1.25％。
乳化:取油相1.5份放于胶体磨内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，加完后再以8000r/min搅拌10-15分钟，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其最终浓度为万分之一。
半成品检验:按现行《中国兽药典》附录进行，应无菌生长。
物理性状：
外观乳白色乳剂。
剂型油包水型。取一只清洁的吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，其余均不扩散。
稳定性吸取疫苗10ml加入尖底离心管中，以4000r/min分钟离心15分钟，管底析出的水相应≤0.5ml，试验结果为0.05ml。将油乳剂放置在4℃、室温、37℃环境观察其破乳情况见下表。
油乳剂稳定性观察
黏度用1ml吸管(下口内径为1.2mm,上口内径为2.7mm)，吸取25℃左右疫苗1ml，令其垂直自然流出，3组流出0.4ml所需要时间分别为5.0秒、4.9秒、4.8秒。
用NDJ-5S旋转粘度计测油乳剂粘度，平均值为40，粘度低。
粒径测试
将水乳剂制备好后用LS-POP(6)激光粒度分布仪测定粒径大小，结果如图2所示，粒径小于500um，符合油乳剂粒径要求。
疫苗效力检验：取15只1月龄鸡(HI效价≦1:4)，其中10只皮下注射0.2ml疫苗，另5只注射0.2ml生理盐水做对照。免疫后4周，每只鸡肌肉注射105.0EID50的强毒，观察14天，结果：对照组5只全部死亡，疫苗组10只存活9只，保护率90％。
免疫抗体检测：50只的肉种鸡，10日龄每只皮下注射新城疫油乳剂灭活疫苗0.2ml，分别在免疫前和免疫后2周、3周、4周、2个月、4个月和6个月采20只鸡血清，进行HI抗体效价(log2)检测。结果：HI抗体平均效价分别为3.8、4.7、7.5、8.2、7.6、7.0和6.4。免疫保护期可达6个月以上。
实施例2：
抗原制备：种毒为本单位分离鉴定的EDS-76病毒株。尿囊腔接种9-11日龄易感鸭胚，收获72-120小时死亡胚和120小时有病变活胚胚液，要求病毒胚液HA效价≧1012以上，经甲醛溶液灭活后4℃保存备用。
油相制备：将Span-80、甘露醇单油酸酯加入高压灭菌的药用白油混合,使其终浓度分别为2.4％和2.5％，37℃水浴片刻,充分摇匀。
水相制备：将一定比例的吐温80、聚氧乙烯40氢化蓖麻油和蔗糖酯溶于抗原溶液，使其占水相比例分别为2.6％、2.6％和1.5％。
乳化:取油相2份放于胶体磨内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，加完后再以8000r/min搅拌10-15分钟，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，使其最终浓度为万分之一，每羽份疫苗中减蛋综合征病毒含量≥2000HA单位。。
半成品检验按现行《中国兽药典》附录进行，应无菌生长。
物理性状：
外观乳白色乳剂。
剂型油包水型。取一只清洁的吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第1滴外，其余均不扩散。
稳定性吸取疫苗10ml加入尖底离心管中，以4000r/min分钟离心15分钟，管底析出的水相应≤0.5ml，试验结果为0.05ml。将油乳剂放置在4℃、室温、37℃环境观察其破乳情况见下表。
油乳剂稳定性观察
黏度用1ml吸管(下口内径为1.2mm,上口内径为2.7mm)，吸取25℃左右疫苗1ml，令其垂直自然流出，3组流出0.4ml所需要时间分别为4.7秒、4.8秒、4.7秒。
用NDJ-5S旋转粘度计测油乳剂粘度，平均值为39，粘度低。
粒径测试
将水乳剂制备好后用LS-POP(6)激光粒度分布仪测定粒径大小，结果如图3所示，粒径小于500um，符合油乳剂粒径要求。
疫苗免疫抗体检测：一群约100只的蛋鸡，120日龄每只皮下注射鸡减蛋综合征油乳剂灭活疫苗0.5ml，分别在免疫前和免疫后1周、2周、3周、4周、2个月、4个月、6个月、8个月、12个月采20只鸡血清，进行HI抗体效价(log2)检测。结果：HI抗体平均效价分别为0、1.4、5.5、8.5、10.2、9.4、8.7、8.1、7.6和6.1。免疫保护期可达12个月以上。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (4)

1.一种油乳剂制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)、油相的制备：将Span-80、甘露醇单油酸酯按照体积按一定体积比例加入到经高压灭菌的药用白油中混合,经37℃水浴充分摇匀；
(2)、水相的制备：将吐温80、聚氧乙烯40氢化蓖麻油和蔗糖酯按照一定的体积比例溶于抗原溶液；
(3)乳化：按油相∶水相＝1.5-2∶1的体积比，先将油相放于胶体磨内，开动电机慢速转动搅拌，同时缓慢加入水相，加完后再以8000r/min搅拌10-15分钟，在终止搅拌前加入浓度为1％的硫柳汞溶液，加入后其最终浓度为万分之一；
(4)、半成品检验；
(5)、分装：定量分装，并粘贴标签，置2～8℃保存。
2.根据权利要求1所述的一种油乳剂制备方法，其特征在于：所述的Span-80、甘露醇单油酸酯、吐温80、聚氧乙烯40氢化蓖麻油和蔗糖酯占疫苗总体积比例分别为0.1％-3.5％、0.1％-3.5％、0.3％-2％、0.3％-2％和0.1％-0.7％。
3.根据权利要求2所述的一种油乳剂制备方法，其特征在于：所述的Span-80、甘露醇单油酸酯、吐温80、聚氧乙烯40氢化蓖麻油和蔗糖酯占疫苗总体积比例分别为0.8％-3.42％、0.8％-3.42％、0.45％-1.85％、0.45％-1.85％和0.2％-0.5％。
4.根据权利要求1所述的一种油乳剂制备方法，其特征在于：抗原为大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌、坏死梭杆菌、巴氏杆菌或新城疫病毒，但不限于以上病原。
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