CN110404064B - 一种禽用佐剂组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种禽用佐剂组合物以及含有该佐剂组合物的疫苗，该禽用佐剂组合物包括维生素E和/或HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油和丙烯酸聚合物。该禽用佐剂组合物能在肉鸡体内有效激发免疫反应，其功效与常规油佐剂疫苗相同或相当。使用其制备的疫苗不会产生白油残留，并保证了鸡肉品质。

Description

一种禽用佐剂组合物及其制备方法
技术领域
本发明属于生物制品技术领域，具体涉及佐剂组合物。
背景技术
现有技术中禽用灭活疫苗常使用矿物油作为佐剂，但矿物油带来的食品安全风险不容忽视，陈世豪在“白油对鸡肉品质的影响及其在鸡肉中残留消除规律的研究”(2014)中指出：白油能显著降低甘油三酯的清除和肌内脂肪的蓄积，显著提高肌苷分解为次黄嘌呤的生物过程，某种程度上降低了血清的抗氧化性能，同时在一定程度上劣化了鸡肉品质。为了克服白油残留的影响，现有技术中进行了诸多研究，例如L.A.Th.Hilgers etl在“Effectof various adjuvants on secondary immune response in chickens”中采用了水包油、DDA和聚丙烯酸等作为佐剂制备新城疫疫苗进行试验，但免疫效果均达不到油包水佐剂的效果。此外肉鸡的生长期短，往往只有40天左右，因此佐剂对肉鸡鸡肉品质的影响更为显著。
现有技术已经明示用聚丙烯酸达不到理想的免疫效果，尤其对肉鸡难以形成有效免疫反应：例如中国专利申请CN1171053A，公开了一种利用聚丙烯酸的部分酯化物为禽用的佐剂，但其需要复杂的制备过程，达不到理想的免疫效果，尤其对肉鸡难以形成有效免疫反应。
中国专利CN105879025A公开了一种禽用水佐剂，其含有草分支杆菌培养物和左旋咪唑，虽然克服了白油的残留还可能带来了左旋咪唑残留，另外分支杆菌培养物为弗氏完全佐剂的组成成分，其具有副反应较强烈的问题而现阶段在疫苗制备中已不再使用。
因此，现有技术缺少一种代替矿物油的禽用佐剂，其不含矿物油，且没有药残和副反应，并能够作为制备肉鸡用疫苗使用。
发明内容
为克服现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种禽用佐剂组合物，其中，所述禽用佐剂组合物包括维生素E和/或HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油和丙烯酸聚合物。
本发明所述的禽用免疫佐剂组合物具有与油佐剂相同或相当的增强免疫效力的作用，且均为水佐剂组分，避免了传统油佐剂带来的食品安全风险。
本发明的所述的禽用免疫佐剂组合物制备过程简单，易于在产业上推广。
本发明还涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括抗原和所述佐剂组合物。
本发明的疫苗组合物其不含油佐剂，能保证产品品质，且免疫效力与使用油佐剂的疫苗相同或相当。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
本发明涉及一种禽用佐剂组合物，其中，所述禽用佐剂组合物包括维生素E和/或HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油和丙烯酸聚合物。
术语“佐剂”是指当连同抗原投与时，使受试者对这一抗原的免疫反应增强的化合物。佐剂介导的免疫反应增强可通过所属技术领域中已知的任何方法评估，包括(不限于)以下一种或多种方法：(i)与对单独抗原免疫作用起反应所产生的抗体数相比，对佐剂/抗原组合免疫作用起反应所产生的抗体数增加；(ii)识别抗原或佐剂的T细胞数增加；(iii)一种或多种I型细胞因子的含量增加；和(iv)活激发之后，体内(in vivo)的保护作用。与经单独抗原激发的受试者相比，当受试者经抗原与佐剂激发时，若抗原特异性免疫反应性的任何可测量参数(例如抗体效价或T细胞产生增加至少10％，则认为免疫反应增强。在本发明的某些实施例中，若抗原特异性免疫反应性的任何可测量参数增加至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、至少125％、至少150％、至少175％、至少200％、至少225％、至少250％、至少275％、至少300％、至少350％、至少400％、至少450％、至少500％或至少1000％，则免疫反应增强。
如本文所述“HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯组合物”：是指蔗糖与脂肪酸经过酯化反应所得的混合物，蔗糖有8个-OH基团，可以与脂肪酸反应形成不同HLB值的蔗糖脂肪酸酯组合物，本发明所述的脂肪酸酯优选碳原子为8-28的脂肪酸，可以举例，辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、硬脂酸、油酸、花生四烯酸。HLB值为5以下的蔗糖脂肪酸酯组合物可以举例商品化的，例如日本三菱Ryoto蔗糖酯，可以选择的型号，L195，蔗糖酯的月桂酸组合物，其HLB值为1，L595，蔗糖酯的月桂酸组合物，其HLB值5；蔗糖酯s170，蔗糖酯的硬脂酸组合物其HLB值为1，中国对应的蔗糖酯型号为SE-1，蔗糖酯s370，蔗糖酯的硬脂酸组合物其HLB值为3s，中国对应的蔗糖酯型号为SE-3，蔗糖酯s570，蔗糖酯的硬脂酸组合物其HLB值为5，中国对应的蔗糖酯型号为SE-5。
术语“HLB值(Hydrophile-Lipophile Balance Number)”称亲水疏水平衡值，也称水油度。表面活性剂为具有亲水基团和亲油基团的两亲分子，HLB值是表面活性剂分子中亲水基和亲油基之间的大小和力量平衡程度的量，也称为表面活性剂的亲水亲油平衡值。
聚氧乙烯氢化蓖麻油又称为氢化蓖麻油聚氧乙烯醚、乙氧基化氢化蓖麻油、PEG-n氢化蓖麻油，包括氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-11、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-20、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-30、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-50、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-60、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-75、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-80、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-100；聚氧乙烯氢化蓖麻油可以举例商品化的，例如BASF的Cremophor RH40、Cremophor RH20或Cremophor RH60其组合，其包括了结构相同但不同商品名的类似物。
“丙烯酸系聚合物”是指含有丙烯酸系部分的任何聚合物或共聚物。示范性丙烯酸系聚合物包括例如聚丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、丙烯酸酯、丙烯腈和聚丙烯酸的烷基酯。丙烯酸系共聚物的实例包括例如聚丙烯酰胺-共-甲基丙烯酸丁酯、丙烯酸-甲基丙烯酸、丙烯酸-丙烯酰胺和聚甲基丙烯酸酯。市售丙烯酸系聚合物的实例包括卡波姆，它是在所属技术领域中通常还指并且已知是与聚烯丙基蔗糖交联的丙烯酸的水溶性聚合物。
本发明的禽用水佐剂，对SPF鸡和商品肉鸡均可以产生免疫反应，克服了现有技术的禽用水佐剂仅对SPF鸡产生免疫反应，而不能有效激发在商品肉鸡中产生有效免疫的缺陷。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的禽用佐剂组合物中，HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯组合物为碳原子为8-28的脂肪酸酯。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的禽用佐剂组合物中，HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯选自蔗糖辛酸酯、蔗糖癸酸酯、蔗糖月桂酸酯、蔗糖肉豆蔻酸酯、蔗糖硬脂酸酯、蔗糖油酸酯、或蔗糖花生四烯酸酯。
作为本发明的一种进一步优选的实施方式，本发明所述的禽用佐剂组合物中，HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯为日本三菱Ryoto蔗糖酯L195、L595、蔗糖酯s170、蔗糖酯SE-1，蔗糖酯s370、蔗糖酯SE-3，蔗糖酯s570、或蔗糖酯SE-5。
作为本发明的一种进一步优选的实施方式，本发明所述的禽用佐剂组合物中，HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯选自HLB为1的蔗糖酯的月桂酸组合物、HLB为5的蔗糖酯的月桂酸组合物、HLB为1的蔗糖酯的硬脂酸组合物、HLB为的蔗糖酯的硬脂酸组合物、或HLB为5的蔗糖酯的硬脂酸组合物。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的禽用佐剂组合物中，聚氧乙烯氢化蓖麻油为氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-11、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-20、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-30、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-50、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-60、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-75、氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-80、或氢化蓖麻油聚氧乙烯醚-100。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的禽用佐剂组合物中，聚氧乙烯氢化蓖麻油为BASF的Cremophor RH40、Cremophor RH20或Cremophor RH60或其组合。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的禽用佐剂组合物中，丙烯酸聚合物为聚丙烯酰胺-共-甲基丙烯酸丁酯、丙烯酸-甲基丙烯酸、丙烯酸-丙烯酰胺或聚甲基丙烯酸酯。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的禽用佐剂组合物中，丙烯酸系聚合物为卡波姆。
HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯组合物的浓度范围为0.25％W/V-10.0％W/V，优选1.0％W/V-5％W/V。蔗糖脂肪酸酯组合物与聚氧乙烯氢化蓖麻油比例为1:0.1-1:1.8，优选1:1-1:1.75。
HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯组合物的浓度可以任意选自0.25％W/V、0.30％W/V、0.35％W/V、0.40％W/V、0.45％W/V、0.50％W/V、0.55％W/V、0.60％W/V、0.65％W/V、0.70％W/V、0.75％W/V、0.80％W/V、0.85％W/V、0.90％W/V、0.95％W/V、1.0％W/V、1.5％W/V、2.0％W/V、2.5％W/V、3.0％W/V、3.5％W/V、4.0％W/V、4.5％W/V、5.0％W/V、5.5％W/V、6.0％W/V、6.5％W/V、7.0％W/V、7.5％W/V、8.0％W/V、8.5％W/V、9.0％W/V、9.5％W/V、10.0％W/V。
蔗糖脂肪酸酯组合物与聚氧乙烯氢化蓖麻油比例可以任意选自1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1、1:1.15、1:1.2、1:1.25、1:1.3、1:1.35、1:1.4、1:1.45、1:1.5、1:1.55、1:1.6、1:1.65、1:1.7、1:1.75、1:1.8。
维生素E的浓度范围为0.25％W/V-10.0％W/V，HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯组合物的浓度范围为0.25％W/V-10.0％W/V优选1.0％W/V-5％W/V维生素E与聚氧乙烯氢化蓖麻油比例为1:0.1-1:1.8，优选1:1-1:1.75。
维生素E的浓度可以任意选自0.25％W/V、0.30％W/V、0.35％W/V、0.40％W/V、0.45％W/V、0.45％W/V、0.50％W/V、0.55％W/V、0.60％W/V、0.65％W/V、0.70％W/V、0.75％W/V、0.80％W/V、0.85％W/V、0.90％W/V、0.95％W/V、1.0％W/V、1.5％W/V、2.0％W/V、2.5％W/V、3.0％W/V、3.5％W/V、4.0％W/V、4.5％W/V、5.0％W/V、5.5％W/V、6.0％W/V、6.5％W/V、7.0％W/V、7.5％W/V、8.0％W/V、8.5％W/V、9.0％W/V、9.5％W/V、10.0％W/V。
维生素E与聚氧乙烯氢化蓖麻油比例可以任意选自1:0.1、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5、1:0.6、1:0.7、1:0.8、1:0.9、1:1.0、1:1.1、1:1.15、1:1.2、1:1.25、1:1.3、1:1.35、1:1.4、1:1.45、1:1.5、1:1.55、1:1.6、1:1.65、1:1.7、1:1.75、1.8。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的禽用佐剂组合物中，维生素E、HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯组合物的浓度范围分别为0.25％W/V-10.0％W/V；维生素E与聚氧乙烯氢化蓖麻油比例为1:0.1-1:1.8，优选为1:1-1:1.75；或HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯组合物与聚氧乙烯氢化蓖麻油比例为1:0.1-1:1.8，优选为1:1-1:1.75；丙烯酸聚合物浓度为0.4％-2％W/V。
丙烯酸聚合物浓度可以任意选自0.40％W/V、0.41％W/V、0.42％W/V、0.43％W/V、0.44％W/V、0.45％W/V、0.46％W/V、0.47％W/V、0.48％W/V、0.49％W/V、0.50％W/V、0.55％W/V、0.60％W/V、0.65％W/V、0.70％W/V、0.75％W/V、0.80％W/V、0.85％W/V、0.90％W/V、0.95％W/V、1.0％W/V、1.1％W/V、1.2％W/V、1.3％W/V、1.4％W/V、1.5％W/V、1.6％W/V、1.7％W/V、1.8％W/V、1.9％W/V、2.0％W/V。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的禽用佐剂组合物中，维生素E、HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯组合物的浓度范围分别为1.0％W/V-10％W/V；维生素E与聚氧乙烯氢化蓖麻油比例为1:1-1:1.8，优选为1:1-1:1.75；或HLB值为5以下蔗糖脂肪酸酯组合物与聚氧乙烯氢化蓖麻油比例为1:1-1:1.8，优选为1:1-1:1.75。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的禽用佐剂组合物中，所述禽用佐剂组合物包括10％w/v维生素E、2％w/v的卡波姆934、维生素E与聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40比例为1:1.2。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的禽用佐剂组合物中，所述禽用佐剂组合物包括6％w/v RyotoL195、2％w/v的卡波姆934、RyotoL195与聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40比例为1:1.33。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的禽用佐剂组合物中，所述禽用佐剂组合物包括8％w/v维生素E、8％w/v RyotoL195、2％w/v的卡波姆934、维生素E与聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40比例为1:1.75。
本发明还涉及所述佐剂组合物的制备方法：
a)丙烯酸聚合物在水中溶解制备成丙烯酸聚合物溶液，制备成丙烯酸水溶液A；
b)维生素E、聚氧乙烯氢化蓖麻油混合均匀，制备成B溶液；
c)将A溶液加入到B溶液中。
本发明还涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括抗原和所述佐剂组合物，所述的佐剂组合物的量为30％W/V-70％W/V。
术语“疫苗组合物”是可用于在接受者中诱发保护性免疫的组合物。因此，在受试者已接种抗原之后，疫苗可阻止、延缓或减轻暴露给相同或相关抗原的受试者的疾病发展严重程度(相对于未接种疫苗的受试者)。通过疫苗所提供的保护性免疫可以是体液(抗体介导)免疫或细胞免疫，或两者均能产生。
术语“抗原”是指当引入受试者中时，可由宿主的免疫系统识别并且能够诱发免疫反应和产生保护性免疫的药剂。抗原包括(不限于)在病原体的表面或受感染细胞的表面或肿瘤细胞的表面上天然表达的“表面抗原”。抗原可诱发保护性免疫的疾病病原体和/或病状的非限制性实例为流感病毒、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、传染性支气管炎病毒、鼻病毒属(rhinovirus)、副流感病毒、细小病毒属(parvovirus)(例如鸭细小病毒)、腺病毒属(adenovirus)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobaccilus pleuropneumoniae)、禽类白血病、传染性法氏囊病(infectious bursal disease)、呼肠孤病毒属(reovirus)、痘病毒(pox)、喉气管炎、马立克氏病(Marek′s disease)、破伤风、B型肝炎、疟疾、肺炎球菌肺炎、轮状病毒属(rotavirus)、细小病毒属、冠状病毒属(caronavirus)、大肠杆菌、沙门氏菌属(Salmonella)。
在某些实施例中，抗原是流感病毒，例如经灭活的流感病毒在本发明内容中可使用任何经灭活的流感病毒，包括任何经灭活的流感A病毒株(例如禽流感病毒株)。
在某些实施例中，抗原是新城疫病毒，例如经灭活的新城疫病毒La Sota株或基因改造后新城疫基因VII型毒株。
可在本发明内容中用作抗原的示范性灭活流感病毒包括具有H1、H5、H7或H9血球凝集素与N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9中任一者组合的病毒。一般来说，抗原的血球凝集素亚型是基于通过循环传染性流感病毒株所呈现的血球凝集素亚型加以选择。
本发明制备的灭活疫苗在禽类中不会产生白油残留，保证了产品的品质。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述抗原选自流感病毒抗原、新城疫病毒抗原、传染性支气管炎病毒抗原、鼻病毒属抗原、副流感病毒抗原、细小病毒属抗原、腺病毒属抗原、胸膜肺炎放线杆菌抗原、禽类白血病抗原、传染性法氏囊病病毒抗原、呼肠孤病毒属抗原、痘病毒抗原、喉气管炎病毒抗原、马立克氏病抗原、破伤风菌抗原、B型肝炎病毒抗原、疟疾病毒抗原、肺炎球菌抗原、轮状病毒属病毒抗原、细小病毒属病毒抗原、冠状病毒属病毒抗原、大肠杆菌抗原、和/或沙门氏菌属抗原。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述抗原为新城疫病毒灭活抗原、和/或禽流感病毒灭活抗原。
在本发明的某些实施例中，疫苗组合物可包括一种或多种其它组分，诸如表面活性剂、缓冲剂和稳定化合物。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述疫苗组合物进一步包括表面活性剂、缓冲剂和稳定化合物。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1、制备卡波姆溶液
卡波姆934 1g加入到50ml水中，搅拌使其溶解，再加入1.5g氯化钠溶液，用氢氧化钠调PH至7.0。
实施例2、佐剂的制备
试验例1称取维生素E 5g、聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40 6.0g、搅拌均匀，加入实施例1制备的卡波姆溶液50ml，制备佐剂A。
试验例2称取蔗糖酯(日本三菱RyotoL195)3g聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40 4.0g搅拌均匀，加入实施例1制备的卡波姆溶液50ml，制备佐剂B。
试验例3称取维生素E 4g、蔗糖酯(日本三菱RyotoL195)4g、聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40 7.0g搅拌均匀，加入实施例1制备的卡波姆溶液50ml，制备佐剂C。
对比佐剂1
按照中国专利申请CN 1171053A制备聚丙烯酸丁醇酯，制备成1％浓度的水佐剂
对比佐剂2
卡波姆934溶液，制备成2％浓度的水佐剂
对比佐剂3
CN105879025A疫苗6佐剂处方
对比佐剂4
称取维生素E 5g聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40 6.0g搅拌均匀
实施例3、制备疫苗
取新城疫抗原和禽流感H9抗原(按照中国专利CN103789272A实施例5制备)与实施例2制备的佐剂组合物按照体积比3:7混合均匀，制备成佐剂组合物，使用同样抗原按照CN103789272A实施例5的方法制备油佐剂的对照疫苗。
实施例4、本发明的佐剂在SPF鸡上进行试验
SPF鸡购自斯帕法斯家禽有限公司，采用血清学方法进行效力检验。用7日龄SPF鸡85只，未免疫对照组5只，疫苗试验组每组10只。试验组每只鸡肌肉注射实施例3制备的疫苗每只鸡免疫20μ1。结果详见表1。
表1 疫苗组合物的鸡新城疫部分效力检验
Figure BDA0001644403800000101
Figure BDA0001644403800000111
注：表中HI抗体效价为几何平均值
采用血清学方法进行禽流感(H9亚型)部分效力检验。用30日龄左右SPF鸡85只，未免疫对照组5只，疫苗试验组每组10只。试验组每只鸡各肌肉注射实施例3制备的疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4、疫苗5、疫苗组6、疫苗7各0.3ml。结果详见表2。
表2 疫苗组合物的鸡禽流感部分效力检验
Figure BDA0001644403800000112
Figure BDA0001644403800000121
注：表中HI抗体效价为几何平均值
从表1和表2结果可以看出，在SPF鸡上进行试验，疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4、疫苗5、疫苗6和对照疫苗新城疫和流感效力均合格，而疫苗7组产生很微弱的免疫反应，这说明本发明佐剂组合物中三种成分互相促进，显著刺激免疫系统。
实施例5、本发明的佐剂在AA肉鸡试验
采用血清学方法进行效力检验。用7日龄AA肉鸡85只，未免疫对照组5只，疫苗试验组每组10只。试验组每只鸡肌肉注射实施例3制备的疫苗，每只鸡免疫20μl。结果详见表3。
表3 疫苗组合物的鸡新城疫部分效力检验
Figure BDA0001644403800000122
Figure BDA0001644403800000131
注：表中HI抗体效价为几何平均值
采用血清学方法进行禽流感(H9亚型)部分效力检验。用30日龄左右AA肉鸡85只，未免疫对照组5只，疫苗试验组每组10只。试验组每只鸡分别肌肉注射实施例3制备的疫苗1、疫苗2、疫苗3、疫苗4、疫苗5、疫苗组6、疫苗7 0.3ml。结果详见表4。
表4 疫苗组合物的鸡禽流感部分效力检验
Figure BDA0001644403800000132
Figure BDA0001644403800000141
注：表中HI抗体效价为几何平均值
从表3和表4结果可以看出，在SPF鸡上进行试验，疫苗1、疫苗2、疫苗3和对照疫苗新城疫和流感效力均合格，而疫苗4、疫苗5疫苗6和疫苗7组产生基本不能产生免疫反应。本发明的佐剂组合物其增强免疫效力的功效能达到常规油佐剂的程度，而现有技术中的水佐剂则无此效果。
实施例6、本发明的佐剂在AA肉鸡上的鸡肉品质试验
用7日龄AA肉鸡85只，未免疫对照组5只，疫苗试验组每组10只。试验组每只鸡肌肉注射实施例3制备的各疫苗，每只鸡免疫20μ1。测定每组鸡的胸肌、腿鸡鸡肉剪切力，胸肌、腿肌PH，胸肌肌肉脂肪，并计算平均值，评价鸡肉品质。结果详见表5和表6。
(1)胸肌、腿肌肌肉剪切力测定
分别剪取长约1.5cm，宽约1.0cm，厚约0.5cm的胸肌和腿肌小块，采用数显式嫩度仪测定；
(2)胸肌、腿肌pH测定
分别取胸肌、腿肌，用绞肉机绞碎之后，插入酸度计测定pH，重复测定三次，求三次的平均值；
(3)胸肌肌肉脂肪的测定
将脂肪提取器的接受瓶洗净之后，103℃烘干2h以上，直至其重量没有变化为止，用分析天平感量准确称量烘干后接受瓶的重量(W1)；取绞碎之后的胸肌肉样1g左右，准确称量肉样重量(W2)，用海沙混匀肉样之后，用定量滤纸包裹，将纸包分摊在干净的搪瓷盘中，103℃烘干1小时；将烘干后的纸包放入抽提瓶中，倒入约2/3接受瓶体积的无水乙酸，按设定的程序进行抽提；抽提程序结束后取下接受瓶，放在在干净的搪瓷盘中，在通风橱中放置30分钟，使乙酸充分挥发之后，103℃烘干2小时以上，直到其重量没有变化为止，称量烘干后接受瓶的重量(W3)。
肌内脂肪含量(％)＝(W3-W1)/W2×100％。
(4)胸肌肌苷酸的测定
因肌苷酸易受温度和时间等因素的影响，因此采用校正肌苷酸(IMPC)进行测定分析，校正肌苷酸含量等于单磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)、肌苷酸(IMP)、次黄嘌呤(HYP)和肌苷(INO)测定值分别除以各自分子量后的总和再乘以IMP的分子量。
按照GB/T 19676-2005进行样品前处理，然后通过Agilent Eclipse XDB-C18液相色谱柱进行分离，流动相：0.05mol/L磷酸三乙胺水溶液和甲醇溶液，比例为95:1，流量1mL/min，检测器波长254nm，进样量10μL，按照外标法定量，计算肌苷酸及其代谢物含量。
表5 疫苗组合物对鸡肉品质的影响
Figure BDA0001644403800000161
表6 疫苗组合物对肉鸡肌苷酸及代谢物含量的影响
Figure BDA0001644403800000171
肌肉的pH的高低能够影响肉色、肉的收缩、烹煮损失与嫩度，是鉴定肌肉品质的重要依据之一。肌肉脂肪也是反映肉品质和风味的重要指标之一，肌肉脂肪含量越高，肉品的质量、嫩度和风味就越好。从表5的结果可以看出，施用包含油佐剂的对照疫苗组的胸肌和腿肌pH显著小于空白对照组和疫苗1-7组(P<0.05)。胸、腿肌剪切力各组之间均无差异显著性(P>0.05)，但趋势上可以看出对照疫苗组高于空白对照组和疫苗1-7组。另外，对照疫苗组的胸肌鸡肉脂肪含量显著小于空白对照组和疫苗1-7组(P<0.05)。从以上的结果可以分析，油佐剂的使用使胸肌和腿肌pH显著降低，肌肉含量也有显著降低。
肌苷酸(IMPc)含量是衡量鸡肉肉质鲜味的重要指标之一，肌肉中次黄嘌呤(HYP)的积累能使肌肉产生明显不愉快的味道，而肌苷酸及其他代谢产物均能使鸡肉滋味鲜美。由表6的结果可得，对照疫苗组的次黄嘌呤(HYP)含量显著高于空白对照组和疫苗1-7组的含量(P<0.05)，而肌苷(INO)的含量显著低于空白对照组和疫苗1-7组的含量(P<0.05)。说明本发明的疫苗组合物免疫肉鸡后不会影响肌肉品质，而油佐剂的使用会影响。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (6)

1.一种禽用佐剂组合物，其中，所述禽用佐剂组合物为维生素E和/或日本三菱Ryoto蔗糖酯L195、聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40以及卡波姆934，溶剂为水；
其中，维生素E和/或日本三菱Ryoto蔗糖酯L195的含量为0.25％W/V-10.0％W/V，维生素E与聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40比例为1:0.1-1:1.8，日本三菱Ryoto蔗糖酯L195与聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40比例为1:0.1-1:1.8，卡波姆934的含量为0.4％-2％W/V。
2.根据权利要求1所述的禽用佐剂组合物，其中，维生素E和/或日本三菱Ryoto蔗糖酯L195的含量为1.0％W/V-5％W/V；维生素E与聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40比例为1:1-1:1.75，日本三菱Ryoto蔗糖酯L195与聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40比例为1:1-1:1.75。
3.根据权利要求1所述的禽用佐剂组合物，其中，所述禽用佐剂组合物为10％w/v维生素E、2％w/v的卡波姆934、以及维生素E与聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40比例为1:1.2；或
所述禽用佐剂组合物为6％w/v日本三菱Ryoto蔗糖酯L195、2％w/v的卡波姆934、以及日本三菱Ryoto蔗糖酯L195与聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40比例为1:1.33；或
所述禽用佐剂组合物为8％w/v维生素E、8％w/v日本三菱Ryoto蔗糖酯L195、2％w/v的卡波姆934、以及维生素E与聚氧乙烯氢化蓖麻油RH40比例为1:1.75。
4.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括抗原和权利要求1～3任一项所述禽用佐剂组合物，所述的禽用佐剂组合物的量为30％W/V-70％W/V；
所述抗原选自流感病毒抗原和/或新城疫病毒抗原。
5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其中，所述抗原为新城疫病毒灭活抗原和/或禽流感病毒灭活抗原。
6.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物进一步包括表面活性剂、缓冲剂和稳定化合物。
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