CN104248760A - 一种疫苗组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种疫苗组合物，该疫苗组合物包括免疫量的猪圆环病毒抗原，免疫量的猪肺炎支原体抗原，以及左旋咪唑或其衍生物，聚合物。该疫苗组合物不仅可以对两种抗原同时起到免疫增强作用，且具有稳定性，并可用于稀释猪繁殖与呼吸系统综合征活疫苗。

Description

一种疫苗组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种疫苗组合物，具体地说，涉及一种猪圆环病毒和猪肺炎支原体二联苗疫苗组合物。

背景技术

猪圆环病毒（PCV）是迄今发现的一种最小的动物病毒。现已知PCV有两个血清型，即PCV1和PCV2。PCV1为非致病性的病毒。PCV2为致病性的病毒，它是断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原。PMWS的临床特征有消瘦、皮肤苍白、呼吸困难、腹泻、黄疸等。病理变化可见全身淋巴结肿大，特别是腹股沟淋巴结肿大可达5～10倍；肺主要呈弥散性、间质性肺炎变化，质地硬如橡皮，表面一般呈灰褐色的斑驳状外观；肾的变化较多，可见皮质和髓质散在大小不一的白色坏死灶，由于水肿而导致其呈现蜡样外观；脾轻度肿大；大多病猪的肝有不同程度的萎缩、纤维化。

猪气喘病又称猪支原体肺炎或猪地方性流行性肺炎，是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)引起的一种接触性慢性呼吸道传染病，普遍存在于世界各地。患病猪主要表现为咳嗽和气喘，生长迟缓，饲料转化率低，体温基本正常。解剖时以肺部病变为主，尤以两肺心叶，中间叶和尖叶出现胰样变和肉样变为其特征。发病率高，死亡率低。近年的研究发现，猪肺炎支原体与猪繁殖呼吸综合征病毒和其它病原混合感染，使其感染的严重性进一步提高。到目前为止，该病仍是造成养猪经济损失最重要的疾病之一。猪支原体肺炎感染后可引起猪体的免疫抑制，导致猪体的免疫功能下降，对猪的巨噬细胞、T细胞和B细胞的功能均有抑制。因此，猪群一旦发生猪支原体肺炎感染，就很容易与其它病毒和细菌发生混合感染，以猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus type2，PCV2）最为常见。

猪肺炎支原体对培养基的营养条件要求非常苛刻，在一般的培养基中很难生长，是动物支原体中较难培养的一种，现有技术通过使用活疫苗或佐剂提高其免疫效力，但现有技术缺乏针对对圆环病毒和支原体都起到免疫增强作用的有效佐剂疫苗。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供一种猪圆环病毒2型、肺炎支原体二联灭活疫苗疫苗。

本发明的主要目的在于提供一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的猪圆环病毒抗原，免疫量的猪肺炎支原体抗原，以及左旋咪唑或其衍生物，聚合物。

优选地，所述猪圆环病毒抗原为猪圆环病毒全病毒抗原、含有PCV2免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，或含PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成分；以及所述猪肺炎支原体抗原为猪肺炎支原体全病原抗原。

术语“猪圆环病毒2型抗原”是指含有至少一种PCV2抗原形式的任何组合物，所述抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗PCV2感染的免疫应答。所述PCV2抗原可以是PCV2全病毒、如灭活的PCV2全病毒、含有PCV2免疫原性氨基酸序列（如ORF2蛋白）的嵌合病毒，任何其它至少含PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位或其他成分。PCV2抗原还可以包含以下组合物的任一种抗原：如梅里亚公司（Merial）的辉瑞公司（Pfizer）的哈尔滨维科生物技术开发公司的猪圆环病毒2型灭活疫苗（LG株）；福州大北农生物技术有限公司的猪圆环病毒2型灭活疫苗（DBN-SX07株）和基因工程亚单位疫苗（如勃林格殷格翰公司（Boehringer-Ingelheim）的Ingelvac等等）因PCV2基因组大小为1767bp或1768bp，不同毒株之间核苷酸序列同源性较高，均在90%以上，因此PCV2SH株（GenBank登录号为AY686763）、PCV2LG株（GenBank登录号为HM038034）、PCV2DBN-SX07-2（GenBank登录号为HM641752）均在本发明之内。

本发明中术语“猪肺炎支原体抗原”是指含有灭活的猪肺炎支原体抗原，所述抗原接种猪可诱导、刺激或增强抵抗猪肺炎支原体感染的免疫应答。猪肺炎支原体包括本领域技术人员熟知的临床分离的野毒株。优选地，所述猪肺炎支原体抗原是完整的猪肺炎支原体，优选为灭活形式，更优选为猪肺炎支原体HN0613株或J株（ATCC登记号25934）。副猪嗜血杆菌抗原还可以包含以下组合物的任一种抗原猪肺炎支原体如勃林格殷格翰公司的M.hyo；哈药集团公司的瑞倍适Respisure和RespisureOne；美国普泰克公司的MycoGard;美国辉瑞公司的RespiFendMH；梅里亚动物保健公司的猪克喘；国内生产的168株活疫苗。

本发明所述圆环病毒2型抗原，优选亚单位抗原或灭活后的全病毒抗原。作为本发明的一种实施方式，全病毒抗原为SH株全病毒抗原，可按照专利申请CN101240264A公开的方法制备，作为本发明的另外一种实施方式，抗原为PCV2ORF2蛋白，可按照专利申请CN103173470A公开的方法制备。

本发明的猪肺炎支原体抗原优选一种猪肺炎支原体菌株，菌株名称为HN0613株，保藏编号为CCTCC M2012230，保藏单位为位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2012年6月13日，公开于专利申请CN103031258A。作为本发明的一种实施方式，全病毒抗原为SH株全病毒抗原，可按照专利申请CN101240264A公开的方法制备，作为本发明的一种实施方式，猪肺炎支原体全支原体抗原为HN0613株全猪肺炎支原体抗原，可按照专利申请CN103031258A公开的方法制备。

优选地，所述猪圆环病毒抗原为≥2μg PCV2ORF2蛋白/剂量，优选2～300μg PCV2ORF2蛋白/剂量，最优选20μg PCV2ORF2蛋白/剂量；以及所述猪肺炎支原体抗原为10⁷～10⁹CCU/剂量，优选2×10⁸CCU/剂量。

优选地，所述圆环病毒2型抗原为PCV2ORF2蛋白，所述PCV2ORF2蛋白为2～300微克/mL，更优选2～60微克/mL，最优选20微克/mL。

优选地，所述猪圆环病毒2型抗原为灭活前≥1×10^5.0TCID₅₀/剂量的灭活的猪圆环病毒2型全病毒抗原，优选≥10^6.0TCID₅₀的灭活的猪圆环病毒2型全病毒抗原；以及所述猪肺炎支原体抗原为10⁷～10⁹CCU/剂量，优选2×10⁸CCU/剂量。

本发明疫苗组合物中，猪肺炎支原体抗原灭活前含量为10⁷～10⁹CCU／头份；更优选地，本发明疫苗组合物中，猪肺炎支原体HN0613株抗原灭活前含量2×10⁸CCU/头份。

圆环病毒的抗原含量，至少包含2微克PCV2ORF2蛋白/剂量，优选2～300微克PCV2ORF2蛋白/剂量，更优选20-150微克PCV2ORF2蛋白/剂量，更优选50-100微克PCV2ORF2蛋白/剂量，更优选20微克PCV2ORF2蛋白/剂量。

全病毒的灭活疫苗灭活前病毒含量述猪圆环病毒抗原为1×10^5.0TCID₅₀/剂量以上，优选10^6.0TCID₅₀/剂量以上。

优选地，左旋咪唑或其衍生物含量为1～10mg/剂量。

优选地，左旋咪唑衍生物为左旋咪唑盐酸盐或磷酸盐，所述左旋咪唑或其衍生物的含量为0.1～10毫克/mL，更优选1.5～3毫克/mL。

术语左旋咪唑为分子式C₁₁H₁₂N₂S化合物，左旋咪唑的衍生物是指左旋咪唑衍生物是其盐酸盐或磷酸盐，使用时按其分子量折算为左旋咪唑的量。

左旋咪唑或衍生物优选0.1毫克～10毫克/剂量，更优选0.5毫克g～5毫克/剂量，更优选1.0毫克～3毫克/剂量，更优选1.5毫克～2毫克/剂量最优选1.5毫克/剂量。

优选地，聚合物包括DEAE葡聚糖、聚乙二醇和聚丙烯酸，以及聚甲基丙烯酸；优选地，聚合物为卡波姆；以及所述聚合物的量为0.1毫克～500毫克/剂量，优选2mg/剂量。

优选地，所述疫苗组合物进一步包括聚合物，所述聚合物包括DEAE葡聚糖、聚乙二醇、聚丙烯酸，以及聚甲基丙烯酸，优选聚丙烯酸，更优选卡波姆，所述聚合物含量为0.1～500毫克/mL，更优选2毫克/mL。

疫苗组合物还可包括一或多种聚合物，诸如，例如：DEAE葡聚糖、聚乙二醇和聚丙烯酸，以及聚甲基丙烯酸。这类物质可自市场购得。适合用于佐剂组合物中的聚合物的量取决于所使用的聚合物的性质。优选地，本发明所述聚合物为聚丙烯酸；更优选地，所述聚合物为商品名为卡波姆（Carbomer）的聚丙烯酸；

本发明所述聚合物的量为0.1毫克～500毫克/剂量，优选1毫克～20毫克剂量,更优选5毫克～10毫克/剂量，更优选1毫克～3毫克剂量，最优选2mg/剂量。

优选地，所述疫苗组合物还包括DDA，DDA含量为1～5000微克/mL，优选50～150微克/mL。

优选地，所述疫苗组合物进一步包括DDA，DDA含量为1～5000微克/mL，更优选50～150微克/mL。

作为本发明的另一种实施方式，组合物中还含有DDA，所述DDA为双十八烷基二甲基溴化铵的简称。通常为每剂量约1微克至约5000微克。其使用量亦可为每剂量约1微克至约4000微克、每剂量约1微克至约3000微克、每剂量约1微克至约2000微克及每剂量约1微克至约1000微克。其使用量亦可为每剂量约5微克至约750微克、每剂量约5微克至约500微克、每剂量约5微克至约200微克、每剂量约5微克至约100微克、每剂量约15微克至约100微克及每剂量约30微克至约75微克。

优选地，所述疫苗组合物还包括药学上可以接受的载体，所述药学上可以接受的载体包括任何可用的溶剂、分散介质、稳定剂、等渗剂、稀释剂、或防腐剂。

优选地，所述疫苗组合物进一步包括药学上可以接受的载体，所述药学上可以接受的载体包括任何可用的溶剂、分散介质、稳定剂、等渗剂、稀释剂、或防腐剂。

术语“药学上可以接受的载体包括任何所用溶剂、等渗剂、分散介质、稳定剂、稀释剂、防腐剂。如稀释剂包括但不限于水、磷酸盐缓冲溶液，盐水、乙醇、甘油，等渗剂包括但不限于氯化钠、右旋糖苷、葡萄糖；稳定剂包括蛋白或乙二胺四乙酸二钠，由于蛋白可以和蛋白酶结合，因此具有稳定作用。

组合物中还可以含有抗生素或防腐剂，包括，例如：庆大霉素、硫柳汞、或氯甲酚；本领域技术人员公知可以选用不同类别的抗生素或防腐剂。

优选地，所述疫苗组合物包括20μg PCV2ORF2蛋白/剂量，灭活前2×10⁸CCU/剂量的猪肺炎支原体抗原全病原抗原，2mg/剂量的卡波姆，1.5mg/剂量的左旋咪唑以及100微克/mL的DDA。

本发明的PH优选6.9-7.5。

本发明的另一目的在于提供一种制备所述疫苗组合物的方法，所述方法包括：

1）表达PCV2ORF2蛋白或培养增殖PCV2病毒，灭活；2）培养增殖猪肺炎支原体，灭活；3）将表达的所述PCV2ORF2蛋白或灭活的PCV2病毒抗原、灭活的猪肺炎支原体抗原，加入左旋咪唑，混匀。

本发明的再一目的在于提供所述疫苗组合物在制备治疗和预防猪圆环病毒和猪肺炎支原体感染的疾病的药物中的应用。

由上可以看出，本发明的用于治疗或预防猪感染性疾病的疫苗佐剂组合物至少有以下优点：

1.可以对两种抗原同时起到免疫增强作用。

2.可以实现一针注射免疫，猪肺炎支原体持续期6个月，猪PCV2免疫持续期为120天。

3.经长期实验证明，本发明的疫苗组合物具有稳定性,并可用于稀释猪繁殖与呼吸系统综合征活疫苗。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本实施例中所用的剂量也成“免疫量”又称“头份”，是指提供针对PCV-2免疫剂量，主要取决于以下因素：被免疫动物的物种、品种、年龄、重量大小、健康状态以及动物之前是否接受过对抗同样病毒的疫苗。

“TCID50”是指“组织培养感染剂量”，且定义为感染50％指定批次的经接种的细胞培养物时所需要的病毒稀释量。可使用多种方法来计算TCID50，包括本说明书全文中所使用的斯皮尔曼-卡伯法(Spearman-Karber method)。斯皮尔曼-卡伯法的描B.W.Mahy&H.O.Kangro，Virology Methods Manual，p.25-46(1996）。

本发明中所述的“PBS”是指磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Saline）的英文缩写，本发明中使用的是0.01mM的pH7.4的PBS，按《分子克隆》第三版所述配制。

除非另有说明实施例的PCVORF2抗原按照专利申请CN103031258A公开的方法制备，猪肺炎支原体抗原按照CN101240264A公开的方法制备

实施例1盐酸左旋咪唑溶液

将盐酸左旋咪唑，溶解在去离子水中，制备成100毫克/毫升的储备溶液，用0.2微米过滤器过滤。

实施例2.DDA溶液

将二甲基双十八烷基溴化铵(DDA；Fluka Analytical)溶解在乙醇中，制备15毫克/毫升的储备溶液，用0.2微米滤器过滤DDA储备溶液。

实施例3.卡波姆溶液

将卡波姆溶解在去离子水中，制备500毫克/毫升的储备溶液。

实施例4.DDA/卡波姆溶液

依实施例2制备DDA储备溶液。依实施例3制备500毫克/毫升的卡波姆储备溶液，将溶液混合以取得所需的最终浓度。

实施例5.左旋咪唑/卡波姆溶液

将实施例1制备的左旋咪唑溶液中加入实施例3制备的卡波姆溶液以取得所需的最终浓度，以NaOH或HCl调整该溶液的pH值以取得所需的最终pH(通常在6.9至7.5的范围内)。

实施例6左旋咪唑/DDA/卡波姆溶液

将实施例l制备的盐酸左旋咪唑溶液中缓慢加入实施例2制备的DDA溶液，然后加入实施例3制备的卡波姆溶液加入以取得所需的最终浓度。以NaOH或HCl调整该溶液的pH值以取得所需的最终pH(通常在6.9至7.5的范围内)。

实施例7：本试验用于验证左旋咪唑佐剂对猪圆环病毒、猪支原体肺炎二联疫苗中圆环病毒产生的中和抗体促进作用

1.疫苗的配制按照表1的量，在pH=7.4的磷酸盐缓冲液中加入PCV2ORF2蛋白，和猪肺炎支原体抗原然后加入左旋咪唑卡波姆的混合溶液，用pH=7.4的磷酸盐缓冲定容至体积。

表1：组合物的配制表

2.中和抗体试验

将35头30日龄左右的PCV2阴性健康仔猪，随机分为7组，每组5头。将上述6种疫苗分别注射第1～6组仔猪，1mL/头；第7组注射等量的生理盐水作为空白对照组。免疫后4周测定其中和抗体效价。

中和抗体的检测法如下：不同稀释度灭活血清与病毒混合，37℃水浴作用1h，取出后加入已长满细胞单层的PK-15细胞，每孔100μL，每个血清稀释度接种4孔，同时设定只接种病毒PCV2的阳性对照孔、正常细胞阴性对照孔和阴性血清对照孔。病毒终浓度为1000TCID₅₀/mL。24h后用300mmol/L的D-氨基葡萄糖处理，然后再培养48h，进行间接免疫荧光试验。以减少70%或更多荧光的血清最高稀释度的倒数为中和抗体效价。

2.仔猪后中和抗体水平

1-4组中和抗体效价在1:220～1:250之间，1～4组中组与组之间差异不显著，5组、6组和7组为1:110～1:120，5～7组各组之间差异不显著，1-4组跟5-7组差异显著。

表2各试验组的中和抗体

组别	1	2	3	4	5	6	7
								中和抗体	1：250	1:240	1:240	1:220	1:110	1:120	1:110

试验的结果显示，左旋咪唑的浓度在一定范围内产生免疫增强作用，且没有明显的量效关系，超出一定剂量（1～10mg）反而不发生免疫增强作用，而且不受加入支原体抗原的影响。

实施例8：组合物的的PCV2免疫攻毒试验

1.疫苗的配制

按照表3的量，在pH=7.4的磷酸盐缓冲液中加入PCV2ORF2蛋白和猪肺炎支原体抗原，然后加入左旋咪唑、DDA卡波姆的混合溶液，用pH=7.4的磷酸盐缓冲液定容至体积。

表3：组合物的配制表

猪体攻毒保护试验

将35头35日龄左右的PCV2阴性健康仔猪，随机分为6组，每组5头。将上述5种疫苗分别注射第1～5组仔猪，1mL／头；第6组注射等量的生理盐水作为空白对照组。免疫后4周测定其中和抗体效价，并PCV攻毒：m后35d，各试验组和对照组仔猪各用PCV2SH株（含106.0TCID₅₀/ml）滴鼻1ml/头、肌肉注射2ml/头，攻毒后第4、7日，分别在每头攻毒猪的两侧腋下及两侧臀部共4个点对所有猪接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH/ICFA，0.5mg/ml），每个点接种1ml（4ml/头），同时腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头；攻毒后第11、19日再次腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头。攻毒后连续观察25日，于攻毒后第25日称重后扑杀，剖检。根据体温、相对日增重和病毒抗原检测结果进行判定，体温变化情况见表3，疫苗A、疫苗B和疫苗C免疫组仔猪没有出现体温升高现象，而疫苗D和疫苗E仅有2个猪只出现一过性体温升高现象，体温升高一天后很快恢复正常，无其它临床症状；对照组猪只攻毒后所有猪只体温升高40.5℃以上，持续3～5天，食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓。

攻毒后发病及保护情况见表4、5。疫苗A、B、C免疫仔猪攻毒后未出现明显临床症状，未观察到特异性病理变化，抗原PCR检测均为阴性，保护效果达5/5；疫苗D、疫苗E免疫仔猪攻毒后，均有1头猪发病，保护效果达4/5。而对照组仔猪全部发病，临床症状，病理变化明显，病原PCR检测均为阳性。但至攻毒观察结束，疫苗A、疫苗B和疫苗C疫苗D免疫仔猪平均日增重无显著差异，与对照组相比，各疫苗组仔猪平均日增重均极显著高于对照组。

表4PCV2攻毒后各组试验猪体温超40.5℃的天数比较

表5PCV攻毒后各组试验动物发病判定结果

PCV攻毒后符合以下3项中的任何2项，即可判为发病。

A.临床症状：仔猪体温升高（≥40℃），应至少持续3日，出现明显食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓；

B.病理变化：腹股沟和气管淋巴结水肿、肺脏轻度水肿，肾脏发黄或有点状坏死。组织学病变为淋巴结有明显淋巴细胞侵入，或有多核巨细胞；

C.病毒检测：用PCR检测淋巴结组织，检测到PCV2。

表6免疫仔猪PCV攻毒后保护情况

仔猪后中和抗体水平

各试验组的中和抗体水平见表7，由表7结果可知A-C组中和抗体效价在1:260～1:280之间，三组之间差异不显著，E组为1:130，与A-C组差异显著，D组低于A-C组中和抗体水平，但显著高于E组。

表7各试验组的中和抗体

组别	A	B	C	D	E
						中和抗体	1：280	1:260	1:270	1:220	1:130

实施例8组合物对猪肺炎支原体的保护试验

试验用疫苗免疫仔猪

按实施例7所述方法制备的猪圆环病毒2型猪肺炎支原体的二联灭活疫苗（表3中疫苗A、疫苗B、疫苗C、疫苗D、疫苗E、疫苗F）并经过无菌等检验合格后用于试验。选14～21日龄仔猪35头，共8组，5头/组。免疫组分为7组，分别免疫疫苗A、疫苗B、疫苗C、疫苗D、疫苗E和疫苗F，余下1组5头作为对照组（表8）每头猪分别颈部肌肉注射相应的灭活疫苗1ml；对照组不免疫，健康对照组不免疫不攻毒。

仔猪免疫后攻毒

猪肺炎支原体攻毒：在首次免疫后70d，进行猪肺炎支原体进行攻毒试验，6组免疫组和对照组仔猪用CVCC354株（购自中国兽医药品监察所）气管注射5ml/头（100MID），攻毒后观察30天，剖杀试验猪，根据猪支原体肺炎肺病变指数记分标准对试验猪的肺病变进行记分。免疫组与对照组进行肺病变指数差异分析。

攻毒后结果

猪肺炎支原体攻毒后肺病变指数结果见表8。结果表明，各个试验则预防猪肺炎支原体引起的肺病变均有明显的效果，尤其加入左旋咪唑、卡波姆和DDA佐剂后疫苗免疫效果令人意外。

表8猪肺炎支原体攻毒各试验组猪肺损伤得分情况

组别	仔猪头数	平均肺病变指数
			疫苗A	5	1.10±0.35Bd
疫苗B	5	1.280±0.47Bd
			疫苗C	5	1.360±0.51Bd
疫苗D	5	3.80±0.56Bc
			疫苗E	5	4.70±0.55Bb
疫苗F	5	5.30±0.53Bb
			对照组	5	15.90±0.63Aa

注:差异性统计分析中，组间比较，字母相同者表示差异不显著，大写字母不同者表示差异极显著（P＜0.01），小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）

实施例9二联灭活疫苗的免疫持续期试验

2、猪圆环病毒部分

将14-21日龄初生不吃初乳的健康易感仔猪60头，随机分为12组，每组5头。第1-4组颈部肌肉注射实施例7制备的PCV2亚单位疫苗A组1ml，第5-8组不免疫只攻毒，作为攻毒对照，第9-12组不免疫不攻毒作为空白对照。免疫日及免疫后7d、14d、21d、28d各采血，分离血清。免疫后28日（第1组、第5组和第9组）、60日（第2组、第6组和第10组）、90日（第3组、第7组和第11组）和120日（第4组、第8组和第12组）分别攻毒。每次攻毒用PCV2SH株（含106.0TCID50/ml）滴鼻2.5ml、肌肉注射2.5ml。攻毒前3日，对所有猪只分别两侧腋下及两侧臀部共4个点接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH/ICFA，0.5mg/ml），每个点接种1ml（4ml/头）。攻毒前称重，攻毒后第4、7日，对所有猪再次分别两侧腋下及两侧臀部共4个点接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白（KLH/ICFA，0.5mg/ml），每个点接种1ml（4ml/头）。攻毒后7、14、21、28日对所有猪只采血。攻毒后连续观察28日，每日测量体温及记录临床症状，于第28日称重，剖杀，观察病理变化并取新鲜组织（扁桃体、肺脏、肠系膜淋巴结、气管支气管淋巴结及腹股沟淋巴结）一份置-20℃保存，一份用10%福尔马林固定。对新鲜组织和福尔马林固定组织分别进行PCV2PCR检测（普通PCR及荧光定量PCR检测）和IHC检测，对采集的血清进行PCV2PCR检测（普通PCR及荧光定量PCR检测）和PCV2抗体检测（ELISA和IFA）。根据增重情况和PCV2抗原检测结果来评估保护效果。

表9.仔猪分组及处理

组别	数量	免疫方式及剂量	内容
				1	5头	颈部肌肉注射疫苗A1ml	免疫后28日攻毒
2	5头	颈部肌肉注射疫苗A1ml	免疫后60日攻毒
				3	5头	颈部肌肉注射疫苗A1ml	免疫后90日攻毒
4	5头	颈部肌肉注射疫苗A1ml	免疫后120日攻毒
				5	5头	非免疫，攻毒	免疫后28日攻毒
6	5头	非免疫，攻毒	免疫后60日攻毒
				7	5头	非免疫，攻毒	免疫后90日攻毒
8	5头	非免疫，攻毒	免疫后120日攻毒
				9	5头	非免疫，非攻毒	与第1、5组同时剖杀
10	5头	非免疫，非攻毒	与第2、6组同时剖杀
				11	5头	非免疫，非攻毒	与第3、7组同时剖杀
12	5头	非免疫，非攻毒	与第4、8组同时剖杀

平均每日体重增量（ADWG）结果显示，不免疫不攻毒阴性对照组（第9组-第12组）其ADWG为1.12+0.20kg/日左右，免疫疫苗A的组别（第1组-第4组）其ADWG为1.17+0.17kg/日左右，不免疫的组别（第5组-第8组）其ADWG为0.40+0.34kg/日左右。由此可见，免疫疫苗A后，可刺激机体产生有效的保护力，消除强毒攻击带来的不良影响，保证仔猪健康生长。更值得一提的是，免疫疫苗A后，其产生的有效保护力可持续120日，从而保证仔猪经过1次免疫，在整个育肥阶段均可防止强毒攻击。

表10.组间平均每日体重增量（ADWG）结果比较

PCV2抗原检测结果攻毒前所有组别仔猪血清PCV2抗原检测均为阴性。攻毒后第14日，不免疫，不攻毒阴性对照组（第9组-第12组）PCV2抗原检测为阴性，不免疫，攻毒组（第5组-第8组）PCV2抗原检出量最高，为2.85×10⁶copy/ml左右，免疫疫苗A的组别（第1组-第4组）PCV2抗原为2.19×10²copy/ml左右。攻毒后第28日，不免疫，不攻毒阴性对照组（第9组-第12组）和免疫疫苗A的组别（第1组-第4组）PCV2抗原检测为阴性，不免疫攻毒组（第5组-第8组）PCV2抗原检出为5.89×10⁹copy/ml左右。由此可见，免疫疫苗A后，机体产生的抗体可迅速中和攻击强毒，预防仔猪发病。更值得一提的是，免疫疫苗A后，其产生的中和抗体可持续120日，从而保证仔猪经过1次免疫，在整个育肥阶段均可防止强毒攻击。

PCV2抗体检测。在免疫0日所有血清都是PCV2抗体阴性，免疫后第14日，免疫疫苗A的组别（第1组-第4组）PCV2抗体效价最高，为2560左右，不免疫不攻毒阴性对照组（第9组-第12组）PCV2抗体为阴性。免疫后第28日，免疫疫苗A的组别（第1组-第4组）效价最高，为18000左右，不免疫不攻毒阴性对照组（第9组-第12组）PCV2抗体为阴性。攻毒后14日，不免疫不攻毒阴性对照组（第9组-第12组）PCV2抗体为阴性，免疫疫苗A的组别（第1组-第4组）效价最高，为16800左右。攻毒后第28日，不免疫不攻毒阴性对照组（第9组-第12组）PCV2抗体为阴性，免疫疫苗A的组别（第1组-第4组）效价最高，为20160左右。由此可见，免疫疫苗A（后，可刺激机体迅速产生抗体，抵抗强毒攻击，预防仔猪发病。更值得一提的是，免疫疫苗A后，其产生的有效保护力可持续120日，从而保证仔猪经过1次免疫，在整个育肥阶段均可防止强毒攻击。

攻毒前所有猪只没有出现任何明显的临床症状，不免疫攻毒组（第5组-第8组）猪只出现连续体温超过40℃现象，并出现死亡现象，不免疫，不攻毒阴性对照组（第9组-第12组）和免疫疫苗V1的组别（第1组-第4组）仔猪一切正常。剖杀后通过免疫组化检测PCV2抗原，不免疫，攻毒组（第5组-第8组）仔猪脏器检出率为100%，不免疫，不攻毒阴性对照组（第9组-第12组）检出率为0%，免疫疫苗V1的组别（第1组-第4组）检出率为0%。详细结果见表11。

表11组间PCV2临床症状及剖检症状比较

猪支原体肺炎部分：

用14～21日龄健康易感仔猪40头，随机分为4组，每组10头。第1、2组各颈部肌肉注射实施例7制备的疫苗A和疫苗F；第3组接种安慰剂（按照实施例7疫苗A不加抗原只有佐剂），作为攻毒对照组，隔离饲养。免疫后6个月，仔猪用CVCC354株（购自中国兽医药品监察所）气管注射5ml/头（100MID，。观察期结束进行扑杀、剖检，计算肺炎病变减少率。

结果：

免疫猪PCV2免疫攻毒保护试验结果如表12。

表12免疫猪肺炎支原体免疫攻毒保护试验结果

组别	疫苗	攻毒时间	结果（头）	平均肺变
					1	颈部肌肉注射疫苗A1ml	免疫后6个月	10/10保护	3.2
2	颈部肌肉注射疫苗F1ml	免疫后6个月	3/10保护	7.6
					5	非免疫，攻毒	免疫后6个月	8/10发病	11.4
6	非免疫，不攻毒	免疫后6个月	10/10

试验结果表明，疫苗A可以单针注射维持6个月的免疫保护期。

实施例10、本实施例研究本发明疫苗组合物的稳定性。

实施例7制备的疫苗A、疫苗B和疫苗C置于2～8℃保存1个月、6个月、12个月、18个月、24个月和27个月，取出后分别进行物理性状监察，均无沉淀出现，对仔猪的免疫效力测定均与0天刚配制时无差异。

由于DDA不溶于水，而左旋咪唑在中性和碱性条件下不稳定，容易分解和沉淀，但令人意外的是本发明的组合物具有稳定性，保存1个月、6个月、12个月、18个月、24个月和27个月，取出后分别进行物理性状监察，均无沉淀出现，但只加DDA，和左旋咪唑组配制过程基本不能溶解。

经长期实验证明，本发明实施例7制备的疫苗A、疫苗B和疫苗C疫苗组合物具有稳定性。

实施例11疫苗相容性检验

取猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（JXA1-R株）（普莱柯生物工程股份有限公司，批号1202031），用实施例7制备的疫苗A～D以及全病毒灭活疫苗和参考稀释液（无菌注射用水），按照使用说明，灭活疫苗部分1头份/瓶（2ml）复原。20±3℃放置2h，依照猪繁殖与呼吸综合征活疫苗滴定方法检验。通过与参考稀释液的比较，评估待检稀释液对病毒活性组分的影响，病毒组分的滴定结果如表13，差值均不超过0.7log10（欧洲兽用疫苗标准）。本发明的疫苗可以用作冻干的活病毒抗原的稀释剂。

表13疫苗相容性检验结果

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (11)

1.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量的猪圆环病毒抗原，免疫量的猪肺炎支原体抗原，以及左旋咪唑或其衍生物，聚合物。

2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述猪圆环病毒抗原为猪圆环病毒全病毒抗原、含有PCV2免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，或含PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亚单位成分；以及

所述猪肺炎支原体抗原为猪肺炎支原体全病原抗原。

3.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述猪圆环病毒抗原为≥2μg PCV2ORF2蛋白/剂量，优选2～300μg PCV2ORF2蛋白/剂量，最优选20μg PCV2ORF2蛋白/剂量；以及

所述猪肺炎支原体抗原为10⁷～10⁹CCU/剂量，优选2×10⁸CCU/剂量。

4.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述猪圆环病毒2型抗原为灭活前≥1×10^5.0TCID₅₀/剂量的灭活的猪圆环病毒2型全病毒抗原，优选≥10^6.0TCID₅₀的灭活的猪圆环病毒2型全病毒抗原；以及

所述猪肺炎支原体抗原为10⁷～10⁹CCU/剂量，优选2×10⁸CCU/剂量。

5.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，左旋咪唑或其衍生物含量为1～10mg/剂量。

6.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，聚合物包括DEAE葡聚糖、聚乙二醇和聚丙烯酸，以及聚甲基丙烯酸；优选地，聚合物为卡波姆；以及

所述聚合物的量为0.1毫克～500毫克/剂量，优选2mg/剂量。

7.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物还包括DDA，DDA含量为1～5000微克/mL，优选50～150微克/mL。

8.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物还包括药学上可以接受的载体，所述药学上可以接受的载体包括任何可用的溶剂、分散介质、稳定剂、等渗剂、稀释剂、或防腐剂。

9.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括20μg PCV2ORF2蛋白/剂量，灭活前2×10⁸CCU/剂量的猪肺炎支原体抗原全病原抗原，2mg/剂量的卡波姆，1.5mg/剂量的左旋咪唑以及100微克/mL的DDA。

10.一种制备权利要求1所述疫苗组合物的方法，所述方法包括：

1）表达PCV2ORF2蛋白或培养增殖PCV2病毒，灭活；

2）培养增殖猪肺炎支原体，灭活；

3）将表达的所述PCV2ORF2蛋白或灭活的PCV2病毒抗原、灭活的猪肺炎支原体抗原，加入左旋咪唑，混匀。

11.根据权利要求1～9所述的疫苗组合物在准备治疗和预防猪圆环病毒和猪肺炎支原体感染的疾病的药物中的应用。