CN101790378A - 包含存于水相中的抗原和佐剂的乳剂疫苗组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明是有关一种含有存于水相中的抗原和佐剂的乳剂疫苗制剂，它是用于动物的疫苗接种，其中所述佐剂是丙烯酸系聚合物和/或二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDA)。所述制剂可通过在乳化剂存在下将含有抗原和佐剂的水相与油相混合来制备。

Description

包含存于水相中的抗原和佐剂的乳剂疫苗组合物
技术领域
本发明是关于油包水型疫苗制剂、制备所述制剂的方法和所述制剂用于动物疫苗接种的用途。
背景技术
很多传染病控制计划的基础是通过用活的微生物或经灭活的微生物或其产物进行疫苗接种来诱导特异性免疫。有效的疫苗接种程序容许在动物中形成针对抗原的免疫记忆状态，从而在日后与抗原接触时在动物中引起快速而强烈的免疫反应。然而，有些抗原仅具有弱免疫原性。这类抗原可能无力诱导在日后激发时足以为动物提供有效保护的免疫反应，或者可能需要投与助增免疫原性以提供有效保护的其它药剂。
将抗原与叫做佐剂的物质呈混合物形式投与可增强抗原的免疫原性，所述叫做佐剂的物质通过直接作用于免疫系统或通过修改抗原的药物动力学特征来增强针对抗原的反应并借此增加后者与免疫系统的相互作用时间。
由水和油形成的乳剂(例如，油包水型、水包油型、水包油包水型乳剂)可在疫苗中用作佐剂。油包水型乳剂一般在动物疫苗(例如家禽疫苗)中用作佐剂。一般来说，为制备油包水型乳剂，在一种或多种乳化剂存在下将水相抗原缓慢加入矿物油载剂中，从而产生由油滴组成的微胞，水相抗原存在于所述油滴内。人们认为，油性组分诱导免疫细胞迁移至注射部位，并且还用于保护抗原并延长免疫细胞处理抗原的时期。最终结果是与仅单独注射抗原相比，免疫反应增强。
由丙烯酸系聚合物组成的佐剂有时替代疫苗制剂中的油基乳剂使用。示范性丙烯酸系聚合物是与聚烯丙基蔗糖交联的丙烯酸的水溶性聚合物，其又称卡伯波(Carbopol)。例如，美国专利第5,026,546号提及使用二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDA)作为疫苗佐剂和添加卡伯波以改良DDA在水中的溶解度。
油基乳剂与丙烯酸系聚合物在疫苗制剂中用作佐剂时均具有独特优点。然而，由于预计丙烯酸系聚合物(诸如卡伯波)与油乳剂结合会具有高反应性，因此已不鼓励将油包水型乳剂与丙烯酸系聚合物组合。举例来说，上述U.S.5,026,546提及使用卡伯波，但未提出在油包水型或水包油型乳剂中使用DDA和/或卡伯波。此外，关于用于某些物种(诸如家禽)的佐剂，丙烯酸系聚合物通常因其已察觉的高反应性而已避免使用。因此，所属技术领域中存在对新颖佐剂的需要，所述新颖佐剂可提供丙烯酸系聚合物与油包水型乳剂的组合优点，而无丙烯酸系聚合物在所接种动物中引起的不利反应性的缺点。
发明内容
本发明部分上是基于以下意外发现：与不包括丙烯酸系聚合物的油基乳剂疫苗组合物相比，将油基乳剂疫苗组合物与存于水相中的丙烯酸系聚合物(诸如卡伯波)一起调配可使疫苗组合物所引起的免疫反应显著增强。此外，通过将丙烯酸系聚合物调配于油包水型乳剂的水相中，可避免所预计的丙烯酸系聚合物在动物中的不利反应性。
因此，本发明提供包含油包水型乳剂的疫苗组合物。本发明的油包水型乳剂包含油性组分和水性组分。水性组分包含至少一种抗原和至少一种选自由丙烯酸系聚合物和二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDA)组成的群组的佐剂。本发明还包括给动物接种疫苗的方法，所述方法包含向动物投与本发明疫苗组合物。
本发明其它方面包括制备包含油包水型乳剂的疫苗组合物的方法。本发明方法包含将油性组分与水性组分一起乳化，其中水性组分包含至少一种抗原和至少一种选自由丙烯酸系聚合物和二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDA)组成的群组的佐剂。
本发明的上述特征和诸多其它附带优点通过参考以下详细说明并配合随图可更好地了解。
附图说明
图1是显示制备本发明乳剂疫苗组合物的示范性方法的流程图。
图2显示火鸡血液的HI(血球凝集抑制)效价，所述火鸡接种了含有灭活H5N3禽流感抗原的油包水型乳剂疫苗制剂。
图3显示对照火鸡和接种火鸡血液的HI效价，所述火鸡接种了含有灭活H5N3禽流感抗原和无佐剂、
Figure G2008800241123D00021
+DDA、CMC、HPMC或Al(OH)3(海曲吉尔
Figure G2008800241123D00023
)的油包水型乳剂疫苗。标记为“放血前”的HI效价水平得自3只未接种疫苗的火鸡。
具体实施方式
本发明提供包含乳剂的疫苗组合物。乳剂包含油性组分和水性组分。水性组分包含至少一种抗原和至少一种佐剂。佐剂可包含丙烯酸系聚合物和/或DDA。
乳剂
用于疫苗制剂中的不同类型乳剂包括油包水型、水包油型和水包油包水型乳剂。在本发明内容中所用的优选类型乳剂是油包水型乳剂。油包水型乳剂可进一步包括一种或多种油溶性表面活性剂、一种或多种水溶性表面活性剂、其它佐剂、其它水相组分、乳化稳定剂，或其组合。油包水型乳剂的制备方法在所属技术领域中已知并且在本文中别处描述。
疫苗组合物
如本文中所使用，“疫苗组合物”是可用于在接受者中诱发保护性免疫的组合物。因此，在受试者已接种抗原之后，疫苗可阻止、延缓或减轻暴露给相同或相关抗原的受试者的疾病发展严重程度(相对于未接种疫苗的受试者)。通过疫苗所提供的保护性免疫可以是体液(抗体介导)免疫或细胞免疫，或两者。例如，疫苗接种可消除或降低病原体或受感染细胞的负荷，或产生任何其它可测量的感染减轻。疫苗接种还可降低已免疫(已接种疫苗)受试者的肿瘤负荷。
如本文中所使用，术语“保护性免疫”是指当受试者已暴露给抗原从而在受试者中引起免疫反应(主动/后天或被动/先天，或两者)时针对抗原所获得的免疫力，从而使抗原失活和/或降低抗原负荷并形成免疫记忆(例如记忆T细胞或B细胞)。
通过疫苗接种所提供的保护性免疫可能是部分的或仅在一部分已接种疫苗的受试者中提供。因此，疫苗可能在一部分免疫群体中诱发保护性免疫，因为有些个体可能无力建立强免疫反应或保护性免疫反应或(在有些情况下)任何免疫反应。此能力不够可能归因于个体的遗传背景或归因于免疫缺乏病状(后天或先天性)或免疫抑制(例如，由于以化学疗法治疗或使用免疫抑制药物，例如为了预防器官排斥反应或抑制自身免疫状况)。向一部分免疫群体提供保护的疫苗仍然适用并且视为有效。
佐剂
如本文中所使用，术语“佐剂”是指当连同抗原投与时，使受试者对这一抗原的免疫反应增强的化合物。
佐剂介导的免疫反应增强可通过所属技术领域中已知的任何方法评估，包括(不限于)以下一种或多种方法：(i)与对单独抗原免疫作用起反应所产生的抗体数相比，对佐剂/抗原组合免疫作用起反应所产生的抗体数增加；(ii)识别抗原或佐剂的T细胞数增加；(iii)一种或多种I型细胞因子的含量增加；和(iv)活激发之后，体内(in vivo)的保护作用。
与经单独抗原激发的受试者相比，当受试者经抗原与佐剂激发时，若抗原特异性免疫反应性的任何可测量参数(例如抗体效价或T细胞产生)增加至少10％，则认为免疫反应增强。在本发明的某些实施例中，若抗原特异性免疫反应性的任何可测量参数增加至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、至少125％、至少150％、至少175％、至少200％、至少225％、至少250％、至少275％、至少300％、至少350％、至少400％、至少450％、至少500％或至少1000％，则免疫反应增强。
佐剂优选是丙烯酸系聚合物、二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDA)，或丙烯酸系聚合物与DDA的组合。佐剂优选是水溶性或水分散性佐剂。
如本文中所使用的丙烯酸系聚合物是含有丙烯酸系部分的任何聚合物或共聚物。示范性丙烯酸系聚合物包括例如聚丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、丙烯酸酯、丙烯腈和聚丙烯酸的烷基酯。丙烯酸系共聚物的实例包括例如聚(丙烯酰胺-共-甲基丙烯酸丁酯)、丙烯酸-甲基丙烯酸、丙烯酸-丙烯酰胺和聚(甲基丙烯酸酯)。市售丙烯酸系聚合物的实例包括卡伯波(古德里奇公司(B.F.Goodrich Co.)，美国俄亥俄州克利夫兰(Cleveland，Ohio))、卡伯赛(Carboset)(古德里奇公司，美国俄亥俄州克利夫兰)、尼奥克(Neocryl)(安万克公司(Avecia，Inc.)，美国特拉华州威尔明顿(Wilmington，Del.))和尤特奇(Eudragit)(罗姆科技公司(Rohm Tech，Inc.)，美国马萨诸塞州马尔登(Malden，Mass.))。特别适用于本发明乳剂中的丙烯酸系聚合物是卡伯波，它是在所属技术领域中通常还指并且已知是与聚烯丙基蔗糖交联的丙烯酸的水溶性聚合物。
可包括在本发明油包水型乳剂的水相中的具体丙烯酸系聚合物包括如美国专利第6,340,464号和其中所引用参考文献中所述的烷基-聚丙烯酸(“烷基-PAA”)聚合物。示范性烷基-PAA聚合物包括癸基-PAA(C10-PAA)、辛基-PAA(C8-PAA)、丁基-PAA(C4-PAA)和甲基-PAA(C1-PAA)。(参见例如美国专利第6,340,464号，表I)。辛基-PAA或者可称为“辛基-烷基-PAA”或“OA-PAA”。
在本发明的某些实施例中，水性组分还包含卵磷脂。在本发明的内容中，卵磷脂可以是可用于形成脂质体的任何卵磷脂，例如卵磷脂类脂质物质，诸如磷脂酰胆碱。磷脂、溶血磷脂、糖脂和中性脂质构成卵磷脂的典型组成。卵磷脂是在完全水解时产生两个脂肪酸分子以及甘油、磷酸和碱性含氮化合物(其通常为胆碱)各一个分子的分子。卵磷脂水解所得的脂肪酸通常是(但不限于)油酸、棕榈酸和硬脂酸。磷酸可在α-位置或β-位置连至甘油，分别形成α-甘油磷酸或β-甘油磷酸，并产生称为α-卵磷脂和β-卵磷脂的相应卵磷脂系列。包含卵磷脂和丙烯酸系聚合物的佐剂实例描述于例如美国专利第6,676,958号中。
在本发明疫苗组合物中，丙烯酸系聚合物和/或DDA可与一种或多种其它佐剂结合使用。其它示范性佐剂包括(但不限于)：弗氏完全佐剂(complete Freund′s adjuvant)、弗氏不完全佐剂(incomplete Freund′s adjuvant)、MF59或SAF；矿物胶，诸如氢氧化铝(矾，例如Al(OH)3海曲吉尔
Figure G2008800241123D00051
可获自美国新泽西州伯克利的雷希斯公司(Reheis，Berkley Heights，NJ)))、铝盐(例如磷酸铝)或钙盐(例如磷酸钙)；微生物来源的佐剂，诸如霍乱毒素(cholera toxin；CT)、百日咳毒素(pertussis toxin)、大肠杆菌不耐热毒素(Escherichia coli heat-labile toxin；LT)、突变体毒素(例如LTK63或LTR72)、卡介苗(BacilleCalmette-Guerin；BCG)、脂多糖(LPS)、分枝杆菌(mycobacteria)、破伤风毒素(tetanustoxin)、短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)、DNA CpG基元、胞壁酰二肽(muramyldipeptide)或单磷酰脂质A；微粒佐剂，诸如免疫刺激性复合物(ISCOM)、脂质体、可生物降解微球体或皂苷(例如QS-21)；细胞因子，诸如IFN-γ、IL-2、IL-12或GM-CSF；合成佐剂，诸如非离子嵌段共聚物或表面活性剂、胞壁酰肽类似物(例如N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺[thr-MDP]、N-乙酰基-降-胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺酰基-L-丙氨酸-2-[1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基]-乙胺)、聚磷腈(polyphosphazene)、合成多核苷酸、表面活性物质，诸如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇(pluronic polyol)、聚阴离子、肽、烃类乳剂或钥孔虫戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin；KLH)。其它佐剂包括CMC(羧甲基纤维素)和HPMC(羟丙基甲基纤维素)。
如本文中提供的实例所说明，与不含佐剂的传统油包水型乳剂疫苗相比，将佐剂(诸如卡伯波、烷基-PAA(例如OA-PAA)和/或DDA)用于油包水型乳剂疫苗的水相中可惊人地改良疫苗的抗原性。
抗原
如本文中所使用，术语“抗原”是指当引入受试者中时，可由宿主的免疫系统识别并且能够诱发免疫反应和产生保护性免疫的药剂。抗原包括(不限于)在病原体的表面或受感染细胞的表面或肿瘤细胞的表面上天然表达的“表面抗原”。
在本发明的某些实施例中，抗原是传染体。传染体可以是活传染体或其可以是经杀死或灭活的传染体。可在本发明疫苗组合物中用作抗原的示范性传染体包括例如病毒、细菌、真菌、寄生虫或其它微生物。抗原还可以是来源于病毒、细菌、真菌、寄生虫或其它微生物的组分或产物。或者，抗原可以是通过化学合成所获得的产物、蛋白质、多肽、肽、多糖、糖蛋白、糖脂、核酸或其组合。所属领域的技术人员了解，当将核酸抗原引入动物中时，其最终会引起例如肽或蛋白质的产生，转而诱发免疫反应。
当向受试者投与时，抗原与免疫系统的抗原识别分子(诸如免疫球蛋白(抗体)或T细胞抗原受体(TCR))特异性相互作用以诱发免疫反应，从而形成记忆细胞(例如记忆B细胞和T细胞)和保护性免疫。有些抗原需要与佐剂或载剂共投与来诱发免疫反应。
除抗原外疫苗还可含有，或替代抗原含有产生抗原的组分(例如载体)。术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”表示媒剂，通过其可将核酸序列(例如外来基因)引入宿主细胞内，以便使宿主转化并促进所引入抗原序列的表达(例如转录和/或翻译)。载体包括质粒、噬菌体和病毒(例如RNA病毒，诸如逆转录病毒和慢病毒)。
在抗原是传染体的本发明某些实施例中，传染体可以是能够传染动物的药剂。举例来说，传染体能够传染人类、禽类(例如鸡、火鸡、鸭、鸽子等)、犬科、猫科、牛科、猪科或马科动物。
抗原可诱发保护性免疫的疾病病原体和/或病状的非限制性实例为流感病毒、新城鸡瘟病毒(Newcastle disease virus)、传染性支气管炎病毒、鼻病毒属(rhinovirus)、副流感病毒、细小病毒属(parvovirus)(例如鸭细小病毒)、腺病毒属(adenovirus)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobaccilus pleuropneumoniae)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、禽类白血病、传染性法氏囊病(infectious bursal disease)、呼肠孤病毒属(reovirus)、痘病毒(pox)、喉气管炎、马立克氏病(Marek′s disease)、破伤风、B型肝炎、疟疾、肺炎球菌肺炎、轮状病毒属(rotavirus)、细小病毒属、冠状病毒属(caronavirus)、大肠杆菌、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、耶尔森菌属(Yersinia)、弯曲菌属(Campylobactor)、梭菌属(Clostridium)、弧菌属(Vibrio)和贾第虫属(Giardia)、内阿米巴属(Entamoeba)和隐孢子虫属(Cryptosporidium)。抗原还可诱发针对恶性肿瘤(例如实体或血液肿瘤，诸如肉瘤、癌瘤、神经胶质瘤、胚细胞瘤、胰腺癌、乳房癌、卵巢癌、前列腺癌、淋巴瘤、白血病和黑色素瘤)的保护性免疫。
在某些实施例中，抗原是流感病毒，例如经灭活的流感病毒。经灭活的流感病毒可通过传统方法或通过所谓的“反向遗传学”技术获得。可用于制得供本发明疫苗组合物使用的流感病毒抗原的示范性反向遗传学方法揭示于以下文献中：例如，美国专利第6,951,754号、第5,578,473号、第5,820,871号、第6,887,699号、第6,544,785号，和美国专利申请公开案第2003/0035814号、第2006/0134138号、第2006/0057116号、第2005/0037487号、第2005/0003349号、第2006/0166321号和第2004/0142003号。上述专利和专利申请公开案的全部内容以引用方式并入本文中。
在本发明内容中可使用任何经灭活的流感病毒，包括任何经灭活的流感A病毒株(例如禽流感病毒株)。流感病毒可以是通过传统蛋基(egg-based)方法或通过上文中所提及的反向遗传学技术制得的重组流感病毒。重组病毒可具有血球凝集素(HA)与神经氨酸酶(NA)亚型的任何组合。可在本发明内容中用作抗原的示范性灭活流感病毒包括具有H1、H5、H7或H9血球凝集素与N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9中任一者组合的病毒。一般来说，抗原的血球凝集素亚型是基于通过循环传染性流感病毒株所呈现的血球凝集素亚型加以选择。
当抗原是灭活流感病毒(诸如H5N3或H5N9)时，疫苗组合物中抗原的量通常根据每剂量的血球凝集单位(HAU)来表示。举例来说，在本发明的某些实施例中，抗原是灭活流感病毒并且以每剂量50至1000HAU的量存在于疫苗组合物中。在特定实施例中，每剂量的疫苗组合物含有约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95、约100、约105、约110、约115、约120、约125、约130、约135、约140、约145、约150、约155、约160、约165、约170、约175、约180、约185、约190、约195、约200、约205、约210、约215、约220、约225、约230、约235、约240、约245、约250、约255、约260、约265、约270、约275、约280、约285、约290、约295、约300、约305、约310、约315、约320、约325、约330、约335、约340、约345、约350、约355、约360、约365、约370、约375、约380、约385、约390、约395、约400、约405、约410、约415、约420、约425、约430、约435、约440、约445、约450、约455、约460、约465、约470、约475、约480、约485、约490、约495、约500、约505、约510、约515、约520、约525、约530、约535、约540、约545、约550、约555、约560、约565、约570、约575、约580、约585、约590、约595、约600、约605、约610、约615、约620、约625、约630、约635、约640、约645、约650、约655、约660、约665、约670、约675、约680、约685、约690、约695、约700、约705、约710、约715、约720、约725、约730、约735、约740、约745、约750、约755、约760、约765、约770、约775、约780、约785、约790、约795、约800、约805、约810、约815、约820、约825、约830、约835、约840、约845、约850、约855、约860、约865、约870、约875、约880、约885、约890、约895、约900、约905、约910、约915、约920、约925、约930、约935、约940、约945、约950、约955、约960、约965、约970、约975、约980、约985、约990、约995或约1000HAU。
在某些其它实施例中，每剂量的疫苗组合物含有约182HAU、256HAU或512HAU。
油性组分
本发明疫苗组合物还包括油性组分。可包括在油性组分中的油类实例包括(不限于)：萜类油类，诸如角鲨烷和角鲨烯；植物油类，诸如豆油、橄榄油、玉米油、荷荷芭油(jojobaoil)、花生油、棉籽油、向日葵油、红花油、芝麻油、杏仁油、鳄梨油、小麦胚芽油、芥花籽油(canola oil)、亚麻籽油和扁桃油；鱼油类，诸如鲨鱼油、深海鱼油(orange roughyoil)、鲱油(Menhaden oil)和鳕鱼肝油；动物油类，诸如貂油、猪油和鸡脂油；和合成油类，诸如油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、米格来奥
Figure G2008800241123D00081
840(沙索北美公司(Sasol NorthAmerica Inc.)，美国德克萨斯州休斯顿(Houston，TX))和盖普特克
Figure G2008800241123D00082
300(阿比泰克公司(Abitec Corp.)，美国俄亥俄州哥伦布(Columbus，Ohio))，以及矿物油(可获自西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，美国密苏里州圣路易斯(St.Louis，MO))、甘油三酯油、丙二醇衍生物和降植烷(pristane)。油相中的优选油是矿物油。还可使用所述油类的组合。
其它组分
在本发明的某些实施例中，疫苗组合物可包括一种或多种其它组分，诸如表面活性剂、缓冲剂和稳定化合物(stabilizing compound)。
油溶性表面活性剂包括阿拉塞
Figure G2008800241123D00083
83(脱水山梨醇倍半油酸酯，可获自有利凯玛公司(Uniquema)，美国特拉华州纽卡斯尔(New Castle，DE))、阿拉塞A(二缩甘露醇单油酸酯，可获自美国特拉华州纽卡斯尔的有利凯玛公司)、阿拉塞80(可获自美国特拉华州纽卡斯尔的有利凯玛公司)、斯潘
Figure G2008800241123D00084
80(脱水山梨醇单油酸酯；美国密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司)、L121泊洛沙姆(poloxamer)401(普朗尼克
Figure G2008800241123D00085
L121；巴斯夫公司(BASF Corp.)，美国新泽西州弗伦翰公园(Florham Park，NJ))。一种优选油溶性表面活性剂是阿拉塞83。
水溶性表面活性剂包括吐温
Figure G2008800241123D00086
80(聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯；美国密苏里州圣路易斯的西格玛-奥德里奇公司)。一种优选水溶性表面活性剂是吐温80。
水相可包括pH缓冲组分(诸如PBS(磷酸盐缓冲生理盐水))、防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)、调味剂、着色剂和甜味剂。
乳剂可通过包含一种或多种稳定剂化合物来达成稳定。稳定剂的类别包括聚合物稳定剂和低分子量稳定剂。聚合物稳定剂在界面处形成本体相凝胶或其它结构并且使一个或多个相或界面的粘度增加。聚合物稳定剂包括(不限于)蛋白质、淀粉、树胶、纤维素制品、聚乙烯醇、聚丙烯酸和聚乙烯吡咯烷酮。这些物质通过共价键或通过静电和疏水性相互作用结合于界面。它们形成“界面络合物”，界面络合物定义为两个或两个以上表面活性分子以任一本体相中不存在的关系在界面处结合。低分子量稳定剂的实例为(不限于)胆固醇和二价阳离子的脂肪酸盐，诸如硬脂酸铝。
本发明疫苗组合物的制备方法
本发明还包括制备疫苗组合物的方法。在一个实施例中，本发明方法包含将油性组分与水性组分一起乳化。如上文所详述，疫苗组合物的水性组分包含至少一种抗原和至少一种选自由丙烯酸系聚合物和DDA组成的群组的佐剂。本发明方法中可使用任何油性组分、抗原、佐剂和本文中别处描述的其变化形式。
在特定实施例中，提供一种制备疫苗组合物的方法，其中所述方法包含：(a)将抗原水溶液与至少一种选自由丙烯酸系聚合物和DDA组成的群组的佐剂组合形成抗原/佐剂混合物；(b)将(a)的抗原/佐剂混合物与油性组分和乳化剂组合形成抗原/佐剂/油性组分混合物；和(c)将(b)的抗原/佐剂/油性组分混合物乳化形成油包水型乳剂，从而形成疫苗组合物。
本发明方法包含将油性组分与水性组分一起乳化形成例如油包水型(WO)乳剂。制备疫苗组合物的油包水型乳剂的方法在所属技术领域中众所周知。参见例如美国专利第5,109,026号和第5,744,137号。一般来说，制备水相(任选地包括表面活性剂)和油相(任选地包括表面活性剂)并使其混合形成油包水型乳剂。
举例来说，卡伯波或卡伯波+DDA的油包水型乳剂可如下制备：将一种或多种抗原任选地与卡伯波或卡伯波+DDA依序混合或同时混合于水溶液中形成均匀混合物，从而制备水相。任选地，可将水溶性表面活性剂与含有抗原的水相混合物混合。可将包括其它佐剂的其它水性组分加入水相中。说明一种制备本发明疫苗制剂的示范性方法的流程图阐明于图1中。
每剂量的疫苗组合物总体积可以是例如0.05mL至2.0mL。举例来说，在某些实施例中，每剂量的疫苗组合物体积是约0.05mL、约0.10mL、约0.15mL、约0.20mL、约0.25mL、约0.30mL、约0.35mL、约0.40mL、约0.45mL、约0.50mL、约0.55mL、约0.60mL、约0.65mL、约0.70mL、约0.75mL、约0.80mL、约0.85mL、约0.90mL、约0.95mL或约1.0mL。
在本发明疫苗组合物的制备中，可使用如下表1中所阐明的水性组分(例如与佐剂组合的水溶液形式抗原)与油性组分的不同比例：
表1
  水性组分   油性组分
  5％   95％
  10％   90％
  15％   85％
  20％   80％
  25％   75％
  30％   70％
  35％   65％
  40％   60％
  水性组分   油性组分
  45％   55％
  50％   50％
  55％   45％
  60％   40％
  65％   35％
  70％   30％
  75％   25％
  80％   20％
  85％   15％
  90％   10％
  95％   5％
一种制备油包水型乳剂的方法是将水相加入油相中。接着将此混合物手动振荡15至20秒，使用高剪切探头(布林克曼(Brinkman)均质机，布林克曼仪器公司(BrinkmanInstruments)，美国纽约州韦斯特伯里(Westbury，N.Y.))普利朗(Polytron)10/35乳化20秒，涡旋，或使用所属领域技术人员所熟知的技术进行类似混合。
对于工业制备含有表面活性剂组合物的油包水型乳剂疫苗，可用西沃松(Silverson)均质机将油相与含有表面活性剂的水相混合。
所属领域技术人员应了解，可调整含有抗原的水相、油相和表面活性剂的相对量，以获得具有所要具体粘度特性的乳剂。
给动物接种疫苗的方法
本发明还包括给动物接种疫苗的方法。本发明方法包含向动物投与本文中别处描述的任何疫苗组合物。
本发明疫苗组合物可投与任何动物，包括例如人类、禽类、犬科、猫科、牛科、猪科或马科动物。示范性禽类动物包括例如驯养或野生的禽类动物，和尤其商业上饲养用于产肉或产蛋的那些动物。示范性禽类包括(不限于)鸡、火鸡、鹅、鸭、雉鸡和诸如此类。
疫苗制剂可通过(不限于)以下途径投与：经皮传递或经粘膜投与，包括(但不限于)经口、颊、鼻内、眼、阴道、直肠、大脑内、真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下途径；经由刺破(例如，使用分叉针划破皮肤外层)；吸入(经肺)或吹入(经由口或鼻)；或离体(ex vivo)投与给抗原呈递细胞(诸如树突状细胞(DC))，随后将细胞投与给受试者；或任何其它标准免疫途径。
优选地，本发明疫苗组合物可通过直接注射(经由例如快速注射、连续输注或基因枪(例如，以将载体疫苗(诸如裸露DNA或RNA)投与给受试者))来不经肠传递，即，静脉内(i.v.)、皮下(s.c.)、腹膜内(i.p.)、肌肉内(i.m.)、真皮下(s.d.)或真皮内(i.d.)投与。注射制剂可与添加的防腐剂一起以单位剂型呈递于例如安瓿或多剂量容器中。
对于吸入投药，本发明治疗剂可借助于适当推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适当气体)以加压包或喷雾器所呈递的气溶胶喷雾形式方便地传递。在加压气溶胶的情况下，可通过提供传递定量(metered amount)的阀来确定剂量单位。用于吸入器或吹入器的(例如)明胶的胶囊和药筒(cartridge)可调配成含有化合物与适当粉末基质(诸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
本发明组合物还可调配成直肠组合物形式，诸如栓剂或保留灌肠剂。
根据本发明方法，本文中所述的疫苗组合物优选以具有最小毒性的治疗有效剂量投与给受试者。
应用于术语剂量或量的术语“治疗有效”是指在对需要化合物、医药组合物或疫苗的动物投药时足以引起所要活性的化合物或医药组合物或疫苗的量。如本文中关于含有佐剂和含有抗原的组合物或疫苗所使用，术语“治疗有效量/剂量”与术语“致免疫有效量/剂量”可互换使用，并且是指在投与给动物时足以产生有效免疫反应的化合物(例如抗原和/或佐剂)或医药组合物或疫苗的量/剂量。
短语“医药学上可接受”是指在投与给人类时生理上可忍受并且通常不产生不良反应的所述组合物中的分子实体和其它成分。如本文中所使用，术语“医药学上可接受”优选是指经联邦政府或州政府的管制部门批准，或美国药典或用于哺乳动物并且更具体来说用于人类的其它公认药典中所列。
可使用所属技术领域中熟知的方法，从剂量-反应曲线确定治疗有效剂量。剂量-反应曲线的实例描述于(不限于)以下实例4中。
疫苗组合物中佐剂、抗原和其它组分的剂量应为使得连续或间歇投与的抗原剂量不会超过根据测试动物的结果和受试者的个别状况所考虑的一定量的量。
具体给药方案将取决于以下因素：给药程序、患者或受试动物的状况(诸如年龄、体重、性别、过敏、进食)、给药周期、组合使用的药物、疾病严重程度。在一定条件下，适当剂量和给药次数可由从业者根据每个患者的情况和根据标准临床技术确定。
含有佐剂的免疫原组合物的毒性和治疗功效可在实验动物中通过标准医药程序来确定，例如通过测定LD50(致群体50％死亡的剂量)和ED50(群体的50％治疗有效的剂量)。中毒效应与治疗效应的剂量比是治疗指数并且可由比率LD50/ED50表示。表现高治疗指数的组合物是优选的。虽然可使用表现毒性副作用的治疗剂(例如，当治疗严重形式的癌症或危急生命的感染时)，但应谨慎设计使所述免疫原组合物靶向具体部位(例如介导免疫反应的淋巴组织、肿瘤或支持传染体复制的器官)的传递系统，以便将对其它组织和器官的潜在损害降至最低并借此降低副作用。
包含构成疫苗组合物的各组分的试剂盒
在某些实施例中，本发明提供一种药包或试剂盒，其包含一个或多个装有免疫原制剂的一种或多种成分的容器。在优选实施例中，用于制备医药组合物或疫苗组合物的试剂盒包含至少一种抗原、佐剂(例如或
Figure G2008800241123D00122
+DDA)、油相和水相，所述试剂盒包含存于不同容器中的各组分和任选地包含指示混合各组分和/或投与组合物的说明书。试剂盒的每个容器任选地还可包括一种或多种生理学上可接受的载剂和/或赋形剂和/或辅助物质。这些容器中可配合使用由管制医药或生物产品的制造、使用或销售的政府部门所规定的形式的通知书，所述通知书反映所述管制制造、使用或销售的部门批准用于人类投药。
必要时，疫苗组合物可用药包或分配装置呈递，所述药包或分配装置可含有一个或多个含有活性成分(即抗原和/或佐剂)的单位剂型。例如，药包可包含金属或塑料箔，诸如发泡包装。药包或分配装置可附有投药说明书。还可制备调配于相容医药载剂中的组合物，将其置于适当容器中，并标明是针对指定病原体和/或病状的疫苗接种。
分子生物学定义
根据本发明，可使用所属领域技能范围内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术已众所周知并且在文献中有充分阐述。参见例如萨姆布鲁克(Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和曼尼阿蒂斯(Maniatis)，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)，第2版(1989)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress)，美国纽约冷泉港(Cold Spring Harbor，New York)；DNA克隆：实用方法(DNACloning：A Practical Approach)，第1和II卷，(格洛弗(D.N.Glover)编，1985)；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(盖特(M.J.Gait)编，1984)；核酸杂交(Nucleic AcidHybridization)[汉姆斯和希金斯(B.D.Hames & S.J.Higgins)编，(1985)]；转录与翻译(Transcription And Translation)[汉姆斯和希金斯(B.D.Hames & S.J.Higgins)编，(1984)]；动物细胞培养(Animal Cell Culture)[弗雷谢尼(R.I.Freshney)编，(1986)]；固定化细胞和酶(Immobilized Cells And Enzymes)[IRL出版社(IRL Press)，(1986)]；皮耶巴尔(B.Perbal)，分子克隆实用指南(A Practical Guide To Molecular Cloning)(1984)；和奥苏伯尔(F.M.Ausubel)等人(编)，现代分子生物学实验技术(Current Protocols in Molecular Biology)，约翰威立国际出版公司(John Wiley & Sons，Inc.)(1994)。
“核酸分子”(或者“核酸”)是指呈单股形式或双股螺旋的核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷：“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷：“DNA分子”)的磷酸酯聚合物形式，或其任何磷酸酯类似物，诸如硫代磷酸酯和硫酯。所定义的术语包括寡核苷酸(具有少于100个核苷酸构成单元)或多核苷酸，以及双股DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋。例如，此术语包括特别见于直链DNA分子(例如限制性片段)或环状DNA分子、质粒和染色体中的双股DNA。在论述特定双股DNA分子的结构时，本文中根据以5′至3′方向沿DNA非转录股(即序列与mRNA同源的股)产生唯一序列的正常约定来描述序列。“重组DNA分子”是已经历过分子生物学操纵的DNA分子。
如本文中所使用，术语“多肽”是指基于氨基酸的聚合物，其可通过核酸编码或合成制备。多肽可以是蛋白质、蛋白质片段、嵌合蛋白等。通常，术语“蛋白质”是指在细胞中内源性表达的多肽。通常，编码特定蛋白质或酶的DNA序列经“转录”成mRNA的相应序列。mRNA序列又经“翻译”成形成蛋白质的氨基酸序列。“氨基酸序列”是两个或两个以上氨基酸的任何链。术语“肽”通常用于具有少于100个氨基酸构成单元的基于氨基酸的聚合物，而术语“多肽”用于具有至少100个所述单元的聚合物。然而，“多肽”在本文中是通用术语。
以下实例说明本发明方法和组合物，但不受其限制。就本案而言，对分子生物学和化学中常见的各种条件和参数的其它适当改变和修改属于本发明的精神和范围内，所述改变和修改对于所属领域的技术人员显而易见。
实例
实例1
制备对照油包水型乳剂疫苗制剂
将经灭活的反向遗传学H5N3禽流感病毒(刘(Liu)等人，病毒学(Virology)314：580-590(2003))加入无菌生理盐水中。搅拌混合物形成均匀混合物。将80(7.2mL)加入混合物中，随后混合形成均匀水性混合物。
为形成油包水型乳剂，将水性混合物缓慢加入矿物油/
Figure G2008800241123D00132
83V混合物(720mL)中，以致水性混合物占总体积的40％而油性混合物占总体积的60％。
实例2
制备含有存于水相中的佐剂的油包水型乳剂疫苗
基本上如实例1中所述来制备含有存于水相中的佐剂的油包水型乳剂。将经灭活的H5N3禽流感病毒和表2的5种佐剂之一加入无菌生理盐水中，达总体积197mL。搅拌混合物形成均匀混合物。将(3.0mL)加入混合物中，随后混合形成均匀水性混合物。
为形成油包水型乳剂，将水性混合物缓慢加入矿物油/
Figure G2008800241123D00141
83V混合物(300mL)中，以致水性混合物占总体积的40％而油性混合物占总体积的60％。由此，用5种不同佐剂制备5种乳剂疫苗。
表2：加入油包水型乳剂疫苗制剂中的佐剂
Figure G2008800241123D00142
实例3
火鸡接种剂量测定
使火鸡接种如实例1中所述的不含佐剂的128、256或512HAU(血球凝集单位)/0.5mL疫苗。接种之后3、6和9周，测量接种火鸡血液的HI(血球凝集抑制)效价。用血球凝集抑制(HI)试验(世界卫生组织关于动物流感诊断和监测的手册(World Health0rganization Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance)，WHO/CDS/CSR/NCS/2002.5)测试样品。结果示于图2中。尽管每次给药起初得到相当良好的血清学反应，但之后不久HI效价大幅下降。
实例4
用含有存于水相中的佐剂的油包水型乳剂疫苗接种火鸡
使火鸡接种如实例2中所述的含有存于水相中的佐剂的疫苗。使10只1周龄火鸡接种0.5mL疫苗(256HAU/剂量)。作为对照，使10只火鸡接种实例1中所述的制剂并且10只火鸡不接种。在第一次疫苗接种之后3周，使接种火鸡接受第二次疫苗接种加强剂0.5mL疫苗(256HAU/剂量)。在火鸡的4、7和10周龄采集血清样品并且使用与实例4中所用相同的血球凝集抑制试验进行测试。表3提供如上所述实验方案的表格化说明。
表3：含有存于水相中的佐剂的油包水型乳剂疫苗制剂的功效测试方案
  火鸡年龄   行为
  1周   将所有火鸡放血。使指定用于疫苗接种的火鸡接种疫苗
  4周   将所有火鸡放血。使指定用于疫苗接种的火鸡再接种疫苗
  7周   将所有火鸡放血。
  10周   将所有火鸡放血。
对照疫苗接种和实验疫苗接种的结果提供于表4和图3中。结果证明了包含卡伯波或卡伯波+DDA佐剂的疫苗的有效性。
表4：经水相中有或无佐剂的油包水型乳剂疫苗制剂接种的11周龄火鸡的HI效价
  组   256HAU   卡伯波   卡伯波+DDA   无佐剂疫苗   CMC   HPMC   AIOH3海曲吉尔
  HI GMT   120   222.5   232.5   133   97.14   140   82.5
(HI GMT＝血球凝集抑制几何平均效价)
实例5
使用含有卡伯波和DDA的油包水型疫苗组合物获得火鸡的增强免疫反应
在本实例中，使用含有存于油包水型乳剂中的禽流感抗原并且具有或不具有卡伯波或卡伯波+DDA的疫苗组合物来使火鸡接种疫苗，并且评估对流感抗原的免疫反应。
用于本实例中的疫苗组合物基本上使用图1中所说明的一般方法制备。简单来说，在0.2％卡伯波或0.2％卡伯波+0.5g/mL DDA存在或不存在下，将包含禽流感H5N9灭活病毒的水溶液与乳化剂组合。将所得混合物缓慢加入矿物油中并接着进行乳化/匀化以制备“标准乳剂”(无卡伯波和DDA)或“卡伯波乳剂”或“卡伯波+DDA乳剂”。最终乳剂中灭活H5N9的量为每0.5mL剂量512HAU(如通过测试灭活前的病毒备料所测量)。
本实例中使用四组火鸡，各组由20只1周龄市售白色火鸡组成。实验设计总结于下表5中：
表5
  治疗组   疫苗组合物   火鸡数/途径/体积
  1   标准乳剂   20/IM/0.5mL
  2   卡伯波乳剂   20/IM/0.5mL
  3   卡伯波+DDA乳剂   20/IM/0.5mL
  4   未接种疫苗的对照组   20/n.a./n.a.
IM＝肌肉内投药(在火鸡的胸部肌肉内接种疫苗)。
第1、2和3组的鸟在1周龄时投与相应疫苗组合物，随后在4周龄时进行加强剂疫苗接种。在初次接种疫苗时和在加强剂疫苗接种时和之后以三周时间间隔(即在7、10、13、16和19周龄)采集血样。用血球凝集抑制(HI)试验(世界卫生组织关于动物流感诊断和监测的手册，WHO/CDS/CSR/NCS/2002.5)测试样品。使用β-丙内酯(BPL)灭活H5N9抗原备料执行HI试验。
HI试验的结果(用几何平均效价(GMT)表示)示于下表6中：
表6
Figure G2008800241123D00161
wpv1＝疫苗接种后第1周；wpv2＝疫苗接种后第2周。
**为计算GMT，指定在1∶10(所测试的最低稀释度)时为负数的个别鸟效价的值为5。
与经单独H5N9抗原标准乳剂接种的鸟(第1组)相比，经H5N9抗原+卡伯波乳剂接种的火鸡(第2组)或经H5N9抗原+卡伯波+DDA乳剂接种的火鸡(第3组)呈现较高HIGMT。此外，投与包括卡伯波在内的乳剂的火鸡的较高水平血清学反应在研究期间持续直到加强剂疫苗接种(火鸡在19周龄时)之后15周。
在本实例中，在投与包括存于水相中的卡伯波或卡伯波+DDA的油包水型疫苗乳剂的火鸡中观测到对禽流感的血清学反应普遍增强。常规的低病原性H5N9分离株出现此增强反应，与使用反向遗传学来源的低病原性H5N3分离株(实例4)所观测到的结果相似。因此，免疫反应增强可归功于佐剂并且显然适用于多种抗原。
实例6
使用含有卡伯波的油包水型疫苗组合物获得鸭的增强免疫反应
在本实例中，使用含有存于油包水型乳剂中的禽流感抗原并且具有或不具有存于水相中的卡伯波的疫苗组合物来使四种不同品种的鸭接种疫苗，并且评估对流感抗原的免疫反应。
用于本实例中的疫苗组合物基本上使用图1中所说明的一般方法制备。简单来说，在0.2％卡伯波存在或不存在下，将包含反向遗传学禽流感H5N3灭活病毒(“rg-H5N3”，参见实例1)的水溶液与乳化剂组合。将所得混合物缓慢加入矿物油中并接着进行乳化/匀化以制备“标准乳剂”(无卡伯波)或“卡伯波乳剂”(含有存于水相中的0.2％卡伯波)。最终乳剂中rg-H5N3的量为每0.5mL剂量256HAU。
在本实例中，使用四种不同品种的鸭：北京鸭(Pekin)、绿头鸭(Mallard)、卡基-康贝尔鸭(Khaki Campbell)和Golden杂交种300。将各品种的鸭再分成如下表7中所示的三个不同治疗组：
表7
Figure G2008800241123D00171
在实验开始当天(at day of age)(“初次疫苗接种”)，将0.2mL总体积的相应乳剂疫苗组合物皮下接种于治疗组1和2中鸭的颈背部。在三周龄时，将0.5mL相同疫苗皮下接种于鸭颈背部来强化。
在初次疫苗接种时和之后以三周时间间隔(即，在初次疫苗接种之后3周(“3WPV1”)和在加强剂疫苗接种之后3、6、9和12周(“3WPV2”、“6WPV2”、“9WPV2”和“12WPV2”))采集血样。用血球凝集抑制(HI)试验(世界卫生组织关于动物流感诊断和监测的手册，WHO/CDS/CSR/NCS/2002.5)测试样品。使用β-丙内酯(BPL)灭活H5N3抗原备料来执行HI试验。
在实验开始当天(疫苗接种之前)从各品种的代表性鸭采集的血清不含抗禽流感的HI可检测抗体。(数据未显示)。其余时点的HI试验结果(用几何平均效价(GMT)表示)示于下表8中：
表8
Figure G2008800241123D00181
WPV1＝疫苗接种后第1周；WPV2＝疫苗接种后第2周。
Figure G2008800241123D00182
怀疑Golden杂交种300鸭的′标准乳剂′结果和′卡伯波′结果在实验期间的有些点无意中发生转变。
**为计算GMT，指定在1∶10(所测试的最低稀释度)时为负数的个别鸟效价的值为5。
上述结果表明，与不用存于水相中的卡伯波调配成的油包水型疫苗组合物相比，用存于水相中的卡伯波调配成的油包水型疫苗组合物在所测试的大部分品种的鸭中产生明显增强的免疫反应。这些结果进一步证明，与常规油包水型疫苗组合物相比，包含存于水相中的丙烯酸系聚合物(例如卡伯波)的油包水型疫苗组合物提供优良免疫反应。
虽然为透彻理解起见，本发明已通过说明和实例加以详述，但本发明不限于所揭示的特定实施例，而是希望涵盖属于如随附权利要求书所限定的本发明精神和范围内的所有修改和改变。
本说明书中所提及的全部公开案和专利表示本发明所属领域技术人员的技能水平。所有公开案和专利均以引用方式并入本文中，其并入程度如同具体并且单独地指明各个别公开案或专利申请案以引用方式并入一般。

Claims (36)

1.一种包含油包水型乳剂的疫苗组合物，
其中所述乳剂包含油性组分和水性组分；并且
其中所述水性组分包含至少一种抗原和至少一种选自由丙烯酸系聚合物和二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDA)组成的群组的佐剂。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述至少一种佐剂是丙烯酸系聚合物。
3.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中所述丙烯酸系聚合物是丙烯酸与聚烯丙基蔗糖交联的聚合物。
4.根据权利要求2所述的疫苗组合物，其中所述丙烯酸系聚合物是烷基-聚丙烯酸(“烷基-PAA”)佐剂。
5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其中所述烷基-PAA佐剂选自由癸基-PAA、辛基-PAA、丁基-PAA和甲基-PAA组成的群组。
6.根据权利要求5所述的疫苗组合物，其中所述烷基-PAA佐剂是辛基-PAA。
7.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述至少一种佐剂是二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDA)。
8.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述水性组分包含丙烯酸系聚合物与二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDA)二者。
9.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其中所述丙烯酸系聚合物是丙烯酸与聚烯丙基蔗糖交联的聚合物。
10.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述至少一种抗原是传染体。
11.根据权利要求10所述的疫苗组合物，其中所述传染体是活传染体。
12.根据权利要求10所述的疫苗组合物，其中所述传染体是经杀死或经灭活的传染体。
13.根据权利要求10所述的疫苗组合物，其中所述传染体是病毒、细菌、真菌或寄生虫。
14.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述至少一种抗原是肽、多肽或核酸。
15.根据权利要求10所述的疫苗组合物，其中所述传染体是病毒。
16.根据权利要求10所述的疫苗组合物，其中所述传染体是能够传染禽类、犬科、猫科、牛科、猪科或马科动物的传染体。
17.根据权利要求16所述的疫苗组合物，其中所述传染体是能够传染禽类动物的药剂。
18.根据权利要求15所述的疫苗组合物，其中所述病毒是流感病毒。
19.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述油性组分包含矿物油。
20.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述组合物进一步包含一种或多种乳化剂。
21.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述水性组分进一步包含卵磷脂。
22.一种给动物接种疫苗的方法，所述方法包含向所述动物投与根据权利要求1所述的疫苗组合物。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述动物是禽类、犬科、猫科、牛科、猪科或马科动物。
24.一种制备疫苗组合物的方法，所述方法包含将油性组分与水性组分一起乳化，其中所述水性组分包含至少一种抗原和至少一种选自由丙烯酸系聚合物和二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDA)组成的群组的佐剂。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述至少一种佐剂是丙烯酸系聚合物。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述丙烯酸系聚合物是丙烯酸与聚烯丙基蔗糖交联的聚合物。
27.根据权利要求24所述的方法，其中所述至少一种佐剂是二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDA)。
28.根据权利要求24所述的方法，其中所述水性组分包含丙烯酸系聚合物与二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDA)二者。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述丙烯酸系聚合物是丙烯酸与聚烯丙基蔗糖交联的聚合物。
30.一种制备疫苗组合物的方法，所述方法包含：
(a)将抗原的水溶液与至少一种选自由丙烯酸系聚合物和二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDA)组成的群组的佐剂组合形成抗原/佐剂混合物；
(b)将(a)的所述抗原/佐剂混合物与油性组分和乳化剂组合形成抗原/佐剂/油性组分混合物；和
(c)将(b)的所述抗原/佐剂/油性组分混合物乳化形成油包水型乳剂，从而形成疫苗组合物。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述至少一种佐剂是丙烯酸系聚合物。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述丙烯酸系聚合物是丙烯酸与聚烯丙基蔗糖交联的聚合物。
33.根据权利要求30所述的方法，其中所述至少一种佐剂是二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDA)。
34.根据权利要求30所述的方法，其中在(a)中，将所述抗原的所述水溶液与丙烯酸系聚合物和二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDA)二者组合。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述丙烯酸系聚合物是丙烯酸与聚烯丙基蔗糖交联的聚合物。
36.根据权利要求30所述的方法，其中所述油性组分包含矿物油。
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