KR20090029851A - 인플루엔자 백신 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인플루엔자 질환에 대한 면역화를 위한 일가 인플루엔자 백신 제형 및 백신접종 방법, 의약에서 이들의 용도, 특히 다양한 항원에 대한 면역 반응을 증대시키는 있어서의 이들의 용도 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 범유행성 발생과 관련되거나 범유행성 발생과 관련될 가능성이 있는 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 인플루엔자 항원 또는 이의 항원성 제제를, 대사가능한 오일, 스테롤 또는 토코페롤, 예컨대 알파토코페롤, 및 에멀젼화제를 포함하는 수중유 에멀젼 애주번트와 함께 포함하는 일가 인플루엔자 면역원성 조성물에 관한 것이다.

Description

인플루엔자 백신{INFLUENZA VACCINE}
발명의 분야
본 발명은 인플루엔자 질환에 대해 면역화하는 인플루엔자 백신 제형 및 백신접종 치료법, 이들의 의약에서의 용도, 특히, 다양한 항원에 대한 면역 반응을 강화시키는데 있어서의 이들의 용도, 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 범유행성(pandemic)과 관련되거나 범유행성과 관련될 가능성이 있는 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 적은 양의 인플루엔자 바이러스 항원 또는 이의 항원성 제제를, 수중유 에멀젼 애주번트와 함께 포함하는 일가 인플루엔자 면역원성 조성물에 관한 것이다.
인플루엔자 바이러스는 사람 및 가축 둘 모두에 영향을 주는, 세계적으로 가장 흔하게 존재하는 바이러스 중 하나이다. 인플루엔자는 경제적 부담, 질병 및 사망을 초래하며, 이는 상당하다.
인플루엔자 바이러스는 직경이 약 125nm인 입자 크기를 갖는 RNA 외피(enveloped) 바이러스이다. 인플루엔자 바이러스는 기본적으로 지질 이층 구조 및 외부 당단백질을 갖는 바이러스 외피에 의해 둘러싸인 핵단백질과 결합된 리보핵산(RNA)의 내부 누클레오캡시드 또는 코어로 구성된다. 바이러스 외피의 내층은 주로 기질 단백질로 구성되며, 외층은 대부분 숙주 유래된 지질 물질로 구성된다. 인플루엔자 바이러스는 두 개의 표면 항원인 당단백질 뉴라미니다제(NA) 및 헤마글루티닌(HA)을 포함하며, 이들은 입자의 표면에서 10 내지 12nm 길이의 스파이크(spike)로서 나타난다. 인플루엔자 아형(subtype)의 항원 특이성을 결정하는 것이 바로 이러한 표면 단백질, 특히 헤마글루티닌이다. 바이러스 균주는 기원이 되는 숙주 종, 단리의 지하 부위 및 연도, 일련 번호, 및 인플루엔자 A의 경우, HA 및 NA 아형의 혈청학 특성에 따라 분류된다. 16개의 HA 아형 (H1-H16) 및 9개의 NA 아형 (N1-N9)이 인플루엔자 A 바이러스에 대해 동정되었다 (Webster RG et al. Evolution and ecology of influenza A viruses. Microbiol . Rev. 1992:56:152-179; Fouchier RA et al., Characterization of a Novel Influenza A Virus Hemagglutinin Subtype (H16) Obtained from Black-Headed Gulls. J. Virol. 2005:79:2814-2822). 모든 HA 및 NA 아형의 바이러스는 수생 조류로부터 회수되었으나, 3개의 HA 아형과 (H1, H2 및 H3) 2개의 NA 아형 (N1 및 N2)만이 1918년 이래로 인간 개체군에서 안정한 계통을 확립하였다. 단지 1개의 HA 아형과 1개의 NA 아형이 인플루엔자 B 바이러스에 대해 인식된다.
인플루엔자 A 바이러스는 지속적으로 항원성의 변화를 전개하고 겪는다 [Wiley D, Skehel J. The structure and the function of the hemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus. Ann . Rev . Biochem. 1987:56:365-394]. 바이러스 RNA 폴리머라아제에 의한 효과적인 교정(proofreading)의 결여는 빠른 속도의 전사 에러를 야기하고, 이것은 표면 당단백질의 아미노산 치환을 초래할 수 있다. 이것이 소위 "항원성 드리프트(drift)"이다. 분절된 바이러스 게놈 은 제2 유형의 항원성 변화를 가능하게 한다. 2개의 인플루엔자 바이러스가 동시에 숙주 세포를 감염시키는 경우, 유전적 재회합(genetic reassortment), 소위 "항원성 드리프트"가 신규한 표면 또는 내부 단백질을 지니는 신규한 바이러스를 생성할 수 있다. '드리프트(drift)' 및 '시프트(shift)'로 불리우는 이러한 항원성 변화는 예측할 수 없으며, 이것들이 궁극적으로는 새로운 인플루엔자 균주의 출현을 유도하고, 이러한 바이러스가 면역 시스템을 벗어날 수 있게 하여 널리 공지된, 거의 매년 발생하는 범유행병을 초래한다는 면역학적 관점에서 볼 때 상당한 영향력을 지닐 수 있다. 이러한 유전적 개질 둘 모두는 인간에서 범유행성의 원인이 되는 신규한 바이러스 변이체를 초래하였다.
HA는 상이한 인플루엔자 균주의 혈청학적 특이성을 정의함에 있어서 가장 중요한 항원이다. 상기 75-80 kD 단백질은 수많은 항원성 결정인자를 함유하며, 이중 몇몇은 상이한 균주에서 서열 변화가 일어난 영역에 존재하며(균주-특이적 결정인자), 다른 것들은 많은 HA 분자에 공통적인 영역에 존재한다(결정인자에 대해 공통적임).
인플루엔자 바이러스는 6주를 초과하는 기간에 걸쳐 40% 정도로 높은 타입 A 또는 B 바이러스의 감염율로 거의 매년 겨울마다 범유행병을 일으킨다. 인플루엔자 감염은, 경도의 상기도 감염을 통한 잠재성 감염으로부터 심각한 바이러스 폐렴까지 여러 질병 상태를 초래한다. 전형적인 인플루엔자 범유행병은 입원 또는 사망율 증가에 의해 목격되는 바와 같은 폐렴 및 하기도 질환(lower respiratory disease)의 발생을 증가시킨다. 이러한 질환의 중증도는 주로 숙주의 연령, 그의 면역 상태 및 감염 부위에 의해 결정된다.
선진국에서 모든 인플루엔자 관련 사망의 80 내지 90%에 이르는 65세 이상의 노인들은 특히 취약하다. 만성 질병이 있는 개인들은 또한 이러한 합병증을 경험할 가능성이 높다. 또한, 영아는 심각한 질병을 앓을 수 있다. 그러므로, 특히 이들 그룹은 보호받아야 한다. 이러한 "위험"군 외에도, 보건 당국에서는 건강한 성인도 백신접종할 것을 권장하고 있다.
백신접종은 해마다 일어나는 인플루엔자 범유행병을 억제하는 데 중요한 역할을 한다. 최근 입수할 수 있는 인플루엔자 백신은 불활성화된 인플루엔자 백신이거나 약독화된 인플루엔자 생백신이다. 불활성화 flu 백신은 세가지 가능한 항원 제제 형태로 구성된다: 불활성화된 전(whole) 바이러스, 정제된 바이러스 입자가 지질 외피를 용해시키는 세척제 또는 그 밖의 시약으로 붕괴된 서브-비리온(sub-virion)(소위 "스플리트(split)" 백신), 또는 정제된 HA 및 NA(서브유닛 백신). 이러한 불활성화된 백신은 근내(i.m.), 피하(s.c.), 또는 비내(i.n.) 제공된다.
모든 종류의 범유행기 사이용의 인플루엔자 백신은 보통 3가 백신이다. 이들 백신은 일반적으로 두 개의 인플루엔자 A 바이러스 균주 및 하나의 인플루엔자 B 균주로부터 유래된 항원을 함유한다. 대부분의 경우에 표준 0.5 ml의 주사가능 용량은 일원 면역 확산법(SRD)(J.M. Wood et al.: An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: adaptation for potency determination of inactivated whole virus and subunit vaccines. J. Biol. Stand. 5(1997) 237-247; J.M. Wood et al., International collaborative study of single radial diffusion and immunoelectrophoresis techniques for the assay of haemagglutinin antigen of infuenza virus. J. Biol. STand. 9(1981) 317-330)에 의해 측정시 각 균주로부터의 15 ㎍의 헤마글루티닌 항원 성분을 (적어도) 함유한다.
각 시즌의 인플루엔자 백신에 함유되어 있는 범유행기 사이의 인플루엔자 바이러스 균주는 국립 건강국 및 백신 제조자들과 협력하여 세계 보건 기구에 의해 결정된다. 범유행기 사이의 인플루엔자 백신은 현재 모든 연령 군에서 안전한 것으로 간주된다[참조: De Donato et al. 1999, Vaccine, 17, 3094-3101]. 그러나, 현 인플루엔자 백신이 2세 미만의 소아에게 효력이 있는 지에 대해서는 입증된 바가 거의 없다. 또한, 전형적인 확인된 인플루엔자 병의 예방에 대해 보고된 백신 효율은 노인에 대해 23-72%인데, 이는 청년층에 대해 보고된 60 내지 90% 효율에 비해 상당히 낮은 것이다[참조: Govaert, 1994, J. Am. Med. Assoc, 21, 166-1665; Gross, 1995, Ann Intern. Med. 123, 523-527]. 인플루엔자 백신의 효능은 바이러스 균주에 대한 헤마글루틴화 억제(HI) 항체의 혈청 역가와 상관관계가 있는 것으로 나타났으며, 여러 연구에서 노인이 청년층에 비해 인플루엔자 면역화 후 더 낮은 HI 역가를 나타낸 것으로 밝혀졌다[참조: Murasko, 2002, Experimental gerontology, 37, 427-439].
수중유 에멀젼 형태의, 애주번트 MF59로 애주번트 첨가된 서브유닛 백신은 노인 및 위험 개체군을 위하여 통상적으로 입수할 수 있으며, 이러한 백신은 애주 번트 비첨가 서브유닛 백신으로 얻어지는 것보다 높은 항체 역가를 유도할 수 있는 것으로 입증되었다[참조: De Donato et al. 1999, Vaccine, 17, 3094-3101]. 그러나, 이후 공개에서, 동일한 백신은 애주번트 비첨가 스플리트 백신과 비교하여 개선된 프로필이 입증되지 않았다[참조: Puig-Barbera et al., 2004, Vaccine 23, 283-289].
배경기술로서, 범유행기 사이의 기간 동안, 이전의 범유행병으로부터의 것들과 관련된 인플루엔자 바이러스가 순환된다. 바이러스는 인생에 있어서 초기 감염으로부터 면역성의 수준을 변화시키며 사람들 사이에 퍼진다. 일반적으로 2-3년의 기간에 걸친 이러한 순환은 일반 집단에서 범유행성을 다시 야기시킬 정도로 충분히 변화된 신규한 균주의 선택을 촉진한다: 이 과정을 '항원성 드리프트'라고 한다. '드리프트 변이체'는, 비록 이들의 전체적인 영향력이 종종 수 년에 걸쳐 유사하긴 하나, 상이한 공동체, 지역, 국가 또는 대륙에서 임의로 1년간 상이한 영향을 미칠 수 있다. 바꾸어 말해, 인플루엔자 범유행성이, 인간 개체군이 면역성을 지니지 않는 신규한 인플루엔자 바이러스가 발생할 때 생기게 된다. 통상적인 인플루엔자 범유행성은 폐렴 및 하기도 질환의 발생을 증가시키고, 이것은 입원률 또는 사망률의 증가에 의해 입증된다. 노인 또는 만성 질병이 있는 사람들이 가장 많이 이러한 합병증을 경험하나, 어린 유아도 심각한 질병을 걸릴 수 있다.
예측할 수 없는 간격으로, 신규한 인플루엔자 바이러스가 이전 시즌에 순환된 균주와 전혀 다른 아형의 중요한 표면 항원인 헤마글루티닌을 지니며 출현한다. 여기서, 생성된 항원은 인간에서 이전에 순환된 균주의 상응하는 단백질로부터 20% 내지 50% 변화될 수 있다. 이것은 '집단 면역'을 벗어나서 범유행성을 확립하는 바이러스를 초래할 수 있다. 이러한 현상을 '항원성 시프트(antigenic shift)'라 한다. 상이한 종으로부터의 인플루엔자 바이러스, 예를 들어 조류 또는 돼지 인플루엔자 바이러스가 종 장벽을 넘는 경우, 적어도 과거의 범유행병이 발생했다고 생각된다. 이러한 바이러스가 사람에서 사람으로 퍼질 가능성을 갖는 경우, 이는 수개월 내지 수년내에 전세계로 퍼져 범유행병을 초래할 수 있다. 예를 들어, 1957년에(아시아 Flu 범유행병), H2N2 아형의 바이러스는 바이러스가 최초 단리된 적어도 1918년 이래로 사람 집단에 순환하는 H1N1 바이러스를 대신하였다. H2 HA 및 N2 NA는 HA가 H3N2 인플루엔자 아형의 출현에 의해 1968년(홍콩 Flu 범유행병)에 대체될 까지 1957년에서 1968년 사이에 항원성 드리프트를 겪었으며, 이후 N2 NA는 H3 HA를 따라 계속 드리프트된다 [Nakajima et al., 1991, Epidemiol. Infect. 106, 383-395].
범유행병 발병을 야기할 가능성을 제공하는 인플루엔자 바이러스 균주의 특징은 하기와 같다: 현재 순환하는 균주에서 헤마글루티닌과 비교하여 신규한 헤마글루티닌을 함유하며, 이는 뉴라미니다제 아형의 변화를 수반하거나 수반하지 않을 수 있다; 사람 집단에서 수평으로 전달될 수 있다; 사람에 대해 병원성이다. 신규한 헤마글루티닌은 연장된 기간, 아마도 수 십년 동안, H2와 같이 인간 개체군에서 분명하지 않은 것일 수 있다. 또는, 예를 들어 조류에서 발견된 H5, H9, H7 또는 H6과 같이, 이전에 사람 개체군에서 순환되지 않았던 헤마글루티닌일 수 있다. 이러한 경우에, 대부분, 또는 적어도 큰 부분, 또는 심지어 전체 개체군은 이전에 그 항원을 만난 적이 없으며 이에 대해 면역학적으로 경험한 바가 없다(naive).
프라이밍되지 않은 개체군에서 비-순환된 H2N2 또는 H9N2 균주와 같은 범유행성 균주를 함유하는 일가 후보 백신을 이용하여 안전성 및 면역원성을 평가하기 위해 여러 가지 임상 연구가 수행되었다. 상기 연구들에서 명반(alum) 애주번트를 이용하거나 이용하지 않고, 다양한 HA 농도 (용량 당 1.9, 3.8, 7.5 또는 15 ㎍ HA)의 스플리트 또는 전(whole) 바이러스 제형을 조사하였다. H2N2 아형의 인플루엔자 바이러스는 1957년부터 이들이 '홍콩 범유행기' 동안 H3N2 균주로 교체된 1968년까지 순환되었다. 오늘날, 1968년 이후 태어난 개체들은 H2N2 균주를 면역학적으로 경험한 바가 없다. 이러한 백신 후보는 면역원성이며 충분히 관용성인 것으로 나타났다. 이 결과가 문헌[Hehme, N et al. 2002, Med. Microbiol. Immunol. 191, 203-208; in Hehme N et al. 2004, Virus Research 103, 163-171]에 보고되어 있고 H5N1을 이용한 두 연구가 보고되었다 [Bresson JL et al. The Lancet. 2006: 367 (9523): 1657-1664; Treanor JJ et al. N Engl J Med. 2006; 354:1343-1351]. 다른 연구들은 MF59 애주번트 첨가된 인플루엔자 백신을 이용한 결과를 보고하였다. 한 연구는 MF59로 애주번트 첨가된 두 용량의 H5N3 인플루엔자 백신이 프라이밍된 개체군에서 인플루엔자 H5N1에 대해 면역성을 부스팅한다고 보고하였고 (Stephenson et al., Vaccine 2003, 21, 1687-1693) 또 다른 연구는 MF59-애주번트 첨가된 인플루엔자 H5N3 백신의 3회 투여 후에 수득된 H5N1 바이러스에 대한 교차-반응성 항체 반응을 보고하였다 (Stephenson et al., J. Infect. Diseases 2005, 191, 1210-1215).
인플루엔자 범유행기에 위험한 사람은 시즌 인플루엔자로 인한 합병증에 대해 정의된 위험-그룹에 따라 상이할 수 있다. WHO에 따르면, 조류 인플루엔자 균주 H5N1에 의해 야기된 인간에서의 경우 중 50%가 20세 미만의 사람에게서 발생하고, 90%가 40세 미만의 사람들에게서 발생하였다 (WHO, weekly epidemiological record, 30 June 2006).
범유행기 동안, 항바이러스 약물은 요구를 충족하기에 충분하지 않을 수 있고 인플루엔자가 위험할 다수의 개체들은 범유행기 사이에서 보다 많을 것이므로, 다량으로 생성될 수 있고 효과적인 분포 및 투여 가능성을 지니는 적합한 백신의 개발이 필수적이다. 이러한 이유로 삼가 백신 대신 일가 백신이 백신 부피를 감소시키기 위한 시도에서 범유행기 용도로 개발되고 있는데, 이는 두 용량의 백신이 면역학적으로 나이브인 수용체에서 보호 항체 수준을 달성하기 위해 필요할 수 있기 때문이다 (Wood JM et al. Med Microbiol Immunol. 2002; 191: 197-201. Wood JM et al. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2001; 356: 1953-1960).
이러한 문제는, 항원 함량(항원 스페어링)을 감소시킬 수 있도록 백신의 면역원성을 증가시켜 이용가능한 백신 용량의 수를 증가시키는 것이 목적인 애주번트 첨가에 반할 수 있다. 애주번트의 이용은 나이브 개체군에서 항원의 잠재적인 약한 면역원성도 극복할 수 있다. 상기의 예가 알루미늄 염으로 애주번트 첨가된 전(whole) 불활성화된 H2N2 또는 H9N2 바이러스를 이용하여 제시되었다 (N. Hehme et al. Virus Research 2004, 103, 163-171). 플레인(plain) 서브비리온 H5N1 백신 또는 수산화알루미늄 애주번트 첨가된 스플리트 바이러스 H5N1 백신을 이용한 임상 연구가 이미 수행되었다. 이러한 임상 결과는, 플레인 및 애주번트 첨가된 H5N1 바이러스 백신 둘 모두가 90 ㎍의 항원 용량까지 안전함을 나타낸다 (플레인 서브비리온 백신으로만 시험함)(Bresson JL et al. The Lancet. 2006:367 (9523): 1657-1664; Treanor JJ et al. N Engl J Med. 2006; 354: 1343-1351).
따라서, 특히 약하거나 비-면역원성인 범유행성 균주에 대해 또는 고령 집단과 같은 면역약화된 개체들을 위해, 개선된 면역원성을 지니는 신규한 백신이 여전히 요구된다. 교차-보호 가능성을 지니는 신규한 백신도 요구되는데, 이들은 범유행성의 선언 이전 또는 선언시에 범유행성 균주에 대해 면역학적으로 경험한 바가 없는 개체군을 프라이밍 하기 위한 전(pre)-범유행성 또는 비축성(stockpiling) 백신으로서 이용될 수 있었다. 유력한 애주번트를 이용한 백신 항원의 제형은 서브비리온 항원에 대한 면역 반응을 개선시키기 위해 가능한 접근법이다. 본원에서 모든 연령군에 충분한 보호를 제공할 항원 스페어링 제형을 가능하게 하는 신규한 애주번트 제형이 제공된다 (보호성인 것으로 고려되는 HI 역가에 대해 이전에 혈청음성인 피검체의 혈청전환, 1:40 또는 역가의 4배 증가).
발명의 설명
본 발명의 첫 번째 측면에서, 본 발명은 범유행성과 관련되거나 범유행성과 관련될 가능성이 있는 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 적은 양의 인플루엔자 바이러스 항원 또는 이의 항원성 제제를 애주번트와 함께 포함하는 인플루엔자 면역원성 조성물, 특히 백신을 제공하며, 여기서 적은 양은 용량 당 15 ㎍을 초과하지 않는 헤마글루티닌 (HA)이고, 애주번트는 대사 가능한 오일, 알파 코토페롤과 같은 스테롤 또는 토코페롤, 및 에멀젼화제를 포함하는 수중유 에멀젼이다. 적합하게는, 백신 조성물이 일가 조성물이다.
명세서 전반에 걸쳐, 범유행성 균주는 범유행성 인플루엔자 A 균주와 같이, 인플루엔자 질병의 발생과 관련되거나 관련될 수 있는 인플루엔자 균주로서 언급될 것이다. 적합한 범유행성 균주로는 H5N1, H9N2, H7N7, H2N2, H7N1 및 H1N1가 있으나 이로 제한되지 않는다. 인간에서의 다른 적합한 범유행성 균주로는 H7N3 (캐나다에서 보고된 두 경우), H10N7 (이집트에서 보고된 두 경우) 및 H5N2 (일본에서 보고된 한 경우)가 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 범유행성과 관련되거나 범유행성과 관련될 가능성이 있는 단일 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 인플루엔자 바이러스 항원 또는 이의 항원성 제제를 상기 본원에 정의된 수중유 에멀젼 애주번트와 혼합시키고, 용량 당 15 ㎍ 이하의 인플루엔자 헤마글루티닌 항원을 함유하는 백신 유닛을 생성하는 것을 포함하여, 범유행성 상태 또는 범유행성-전 상태에서, 인플루엔자 면역원성 조성물, 특히 백신을 제조하는 방법을 제공한다. 인플루엔자 바이러스는 달걀-유래, 식물-유래, 세포-배양 유래일 수 있거나 재조합에 의해 생성될 수 있다. 적합하게는, 인플루엔자 바이러스 항원이 달걀-유래이거나 세포-배양 유래이다.
세 번째 측면에서, 본 발명은 약제로서 사용되는 본원에 정의된 면역원성 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 면역원성 조성물 또는 키트 제조시에, 인간에서 상기 바이러스 항원 또는 항원성 조성물에 대하여 i) 개선된 CD4 T-세포 면역 반응, ii) 개선된 B 세포 기억 반응, iii) 개선된 체액 반응 중 하나 이상을 유도하기 위한 (a) 범유행성과 관련되거나 범유행성과 관련될 가능성이 있는 인플루엔자의 단일 균주로부터의 본원에 정의된 적은 양의 인플루엔자 바이러스 항원 또는 이의 항원성 제제, 및 (b) 수중유 에멀젼 애주번트의 용도를 제공한다. 상기 면역 반응은 고위험 성인 또는 노인과 같은 면역-약화된 개체 또는 개체군에서 특히 유도된다. 적합하게는 면역원성 조성물이 본원에 정의된 바와 같다.
본 발명은 또한 인플루엔자에 대해 노인을 백신접종하기 위한 본원에 정의된 면역원성 조성물의 제조시에 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제제 및 수중유 에멀젼 애주번트의 용도를 제공한다.
특정 구체예에서, 면역원성 조성물은 애주번트 비첨가 항원 또는 항원성 조성물로 수득된 것에 비해 개선된 CD4 T-세포 면역 반응 및 개선된 B-기억 세포 반응 둘 모두를 유도할 수 있다. 또 다른 특정 구체예에서, 면역원성 조성물은 애주번트 비첨가 항원 또는 항원성 조성물로 수득된 것에 비해 개선된 CD4 T-세포 면역 반응 및 개선된 체액 반응 둘 모두를 유도할 수 있다. 특히, 상기 체액 면역 반응 또는 보호는 인플루엔자 백신 효능에 대한 적어도 하나, 적합하게는 둘, 통상적으로 3개 모두의 EU 또는 FDA 관리 기준을 충족한다. 바람직하게는, 상기 면역 반응(들) 또는 보호가 백신의 1회, 적합하게는 2회 투여 후 수득된다. 구체적으로, 면역 반응(들) 또는 보호는 애주번트 첨가된 백신의 1회 투여 후 인플루엔자 백신 효능에 대한 적어도 하나, 적합하게는 둘, 또는 3개 모두의 EU 또는 FDA 관리 기준을 충족한다. 구체적으로, 적어도 하나, 적합하게는 두 개의 FDA 또는 EU 기준은 단 1회의 백신 투여로 충족된다. 본 발명에 따른 조성물에 대한 효능 기준은 하기에 추가로 상세하게 기술된다 (표 1 및 하기 "효능 기준" 참조). 적합하게는, 상기 조성물이 비경구로, 특히 근내 또는 피하 경로를 통해 투여된다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 범유행성과 관련되거나 범유행성과 관련될 가능성이 있는 단일 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 인플루엔자 항원 또는 이의 항원성 제제를 본원에 정의된 수중유 에멀젼 애주번트와 함께 포함하는 일가 인플루엔자 면역원성 조성물로 이미 백신접종된 사람을 재백신접종하기 위한 면역원성 조성물의 제조시에 적은 양의 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제제의 용도를 제공한다.
특정 구체예에서, 재백신접종에 이용되는 조성물은 애주번트 비첨가될 수 있거나 애주번트, 특히 수중유 에멀젼 애주번트를 함유할 수 있다. 또 다른 특정 구체예에서, 재백신접종을 위한 면역원성 조성물은 일차 백신접종에 사용된 인플루엔자 바이러스 또는 이의 바이러스 항원성 제제와 공통되는 CD4 T-세포 에피토프를 공유하는 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제제를 함유한다. 재백신접종을 위한 면역원성 조성물은 전통적인 양 (예컨대, 약 15 ㎍의 HA)의 상기 변이체 범유행성 균주를 함유할 수 있다.
적합하게는, 재백신접종이 이전 시즌에 인플루엔자에 대해 백신접종된 피검체에서 수행된다. 바람직하게는, 재백신접종은 일차 백신접종에 이용된 것 (예컨대, H5N1 베트남)과 동일한 아형의 인플루엔자 균주 (예컨대, H5N1 베트남)를 포함하는 백신으로 수행된다. 특정 구체예에서, 재백신접종은 동일한 아형의 드리프트 균주, 예컨대 H5N1 인도네시아로 수행된다. 또 다른 구체예에서, 재백신접종에 이용된 인플루엔자 균주는 시프트 균주이고, 즉 일차 백신접종에 이용된 것과 상이하며, 예컨대 이것은 H5N2 (H5N1과 동일한 HA 아형이나 상이한 NA 아형) 또는 H7N1 (H5N1과 상이한 HA 아형이나 동일한 NA 아형)과 같이, 상이한 HA 또는 NA 아형을 지닌다.
적합하게는 일차 백신접종이 범유행성의 선언시에 수행되고 재백신접종이 이후에 수행된다. 대안적으로, 일차 백신접종이 범유행성-전 전략의 일부이고 프라이밍 전략으로서 범유행성 선언 이전에 수행되므로, 이것은 면역계가 프라이밍되도록 할 수 있고, 재백신접종이 추후에 수행된다. 통상적으로, 재백신접종은 일차 백신접종한 지 적어도 4개월 후, 적합하게는 6 또는 8 내지 14개월 후에 수행되며, 적합하게는 약 10 내지 12개월 후나 심지어 더 늦게 수행된다. 적합하게는, 1년 후 또는 1년 넘은 후의 재백신접종이 항체 및/또는 세포 면역 반응을 부스팅할 수 있다. 이것은, 추가 감염 파동이 범유행성의 일차 발발 후 수 개월이 지나서 발생할 수 있으므로 특히 중요하다. 요구에 따라, 1회 넘게 재백신접종할 수 있다.
적합하게는, 상기 수중유 에멀젼이 대사가능한 오일, 스테롤 또는 토코페롤, 예컨대 알파 토코페롤, 및 에멀젼화제를 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 수중유 에멀젼 애주번트가 하나 이상의 대사가능한 오일을 총 부피의 0.5% 내지 20%의 양으로 포함하고, 70세기% 이상이 1 ㎛ 미만의 직경을 갖는 오일 점적을 지닌다. 적합하게는, 알파 토코페롤과 같은 토코페롤이 면역원성 조성물의 총 부피의 1.0% 내지 20%의 양, 특히 1.0% 내지 5%의 양으로 존재한다.
본 발명의 추가의 측면에서, 변이체 인플루엔자 균주에 의해 야기된 인플루엔자 감염에 대한 보호를 제공하기 위한 본원에 정의된 면역원성 조성물의 제조에서 일차 범유행성 인플루엔자 균주로부터의 항원 또는 항원성 제제의 용도가 제공된다.
특정 측면에서, 단일 범유행성 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 적은 양의 인플루엔자 항원 또는 이의 항원성 제제를 본원에 정의된 수중유 에멀젼 애주번트와 함께 포함하는 인플루엔자 면역원성 조성물을 고위험 성인 또는 노인과 같은 면역-약화된 인간 개체 또는 개체군에게 투여하는 것을 포함하여, 상기 개체 또는 개체군을 백신접종하는 방법이 제공된다.
추가로 또 다른 구체예에서, 본 발명은 단일 범유행성 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 인플루엔자 항원 또는 이의 항원성 제제를 수중유 에멀젼 애주번트와 함께 포함하는 일가 인플루엔자 면역원성 조성물로 이전에 백신접종된 인간을 재백신접종하는 방법을 제공하며, 이 방법은 애주번트 첨가되거나 비첨가된 인플루엔자 바이러스를 포함하는 면역원성 조성물을 상기 인간에게 투여하는 것을 포함한다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 하나의 범유행성 인플루엔자 바이러스 균주에 대해 인간 개체군 또는 개체를 백신접종한 후 변이체 인플루엔자 바이러스 균주에 대해 상기 인간 또는 개체군을 재백신접종하는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 인간에게 (i) 일차 범유행성 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제제 및 수중유 에멀젼 애주번트를 포함하는 제1 조성물, 및 (ii) 일차 인플루엔자 바이러스 균주의 인플루엔자 바이러스 균주 변이체를 포함하 는 제2 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 상기 변이체 균주는 범유행성과 관련되거나 범유행성과 관련될 가능성이 있다. 또 다른 특정 구체예에서, 변이체 균주는 상기 범유행성 인플루엔자 바이러스 변이체 이외에, 하나 이상의 순환(시즌) 인플루엔자 바이러스 균주를 포함하는 다가 조성물의 일부이다. 특히, 범유행성 인플루엔자 바이러스 균주는 하나, 두 개 또는 세 개의 시즌 균주를 추가로 포함하는 각각 이가, 삼가 또는 사가 조성물의 일부이다.
명세서 전반에 걸쳐서, 인플루엔자 감염 또는 질병의 예방을 위해 본원에 정의된 조성물의 제조시 적은 양의 범유행성 인플루엔자 바이러스 항원의 이용, 및 청구된 조성물을 이용한 인간의 치료 방법은 상호교환적으로 이용될 것이다.
본 발명의 그 밖의 측면 및 이점은 하기 상세한 설명의 바람직한 구체예에서 추가로 기술될 것이다.
도 1: PCS에 의해 측정되는, SB62 수중유 에멀젼 중의 오일 점적 입자 크기의 분포. 도 1A는 맬번 제타사이저(Malvern Zetasizer) 3000HS로 SB62 로트(lot) 1023 크기 측정을 보여준다: A = 1/10000 희석(Rec22 내지 Rec24)(콘틴(Contin) 및 변형 광학 모델에서 분석 1.5/0.01); B = 1/20000 희석(Rec28 내지 Rec30)(콘틴 및 변형 광학 모델에서 분석 1.5/0.01). 도 1B는 세기에 의해 레코드(22)(상부) 및 레코드(23)(하부)을 개략적으로 도시한 것이다.
도 2: 흰족제비 실험. 도 2A: 상이한 용량의 H5N1 A/베트남으로 면역된 흰족제비에서 헤마글루틴화 억제 시험(GMT). 도 2B: 치사 또는 안락사 당일 흰족제 비로부터의 폐 조직의 평균 H5N1 PCR 데이터 (왼쪽 그래프) 및 평균 바이러스 역가 데이터 (오른쪽 그래프)(PCR 데이터는 연속 희석된 바이러스 원액으로부터 생성된 표준 곡선으로부터 결정된 대조 희석 유닛(CDU)으로서 표시되고, 각 희석액은 시험 샘플과 동일한 수단으로 핵산 추출 및 Taqman PCR 증폭을 거친다. 바이러스 역가 데이터는 TCID50/g 조직으로 표시된다).
도 3: 상이한 용량의 H5N1 A/베트남으로 면역된 흰족제비에서 항-A/인도네시아 중화 항체 반응.
도 4: 인플루엔자 일가 벌크의 제조에 대한 개략도.
도 5: 항원의 최종 벌크에 대한 제형화 흐름도
도 6: AS03으로 애주번트 첨가되거나 첨가되지 않은 H5N1 스플리트 바이러스 항원의 용량-범위를 이용한 인간 임상 시험. 0일, 21일 및 42일 시점에 항-HA 항체에 대한 GMT (95% CI 지님).
도 7: AS03으로 애주번트 첨가되거나 첨가되지 않은 H5N1 스플리트 바이러스 항원의 용량-범위를 이용한 인간 임상 시험. 백신접종 후 21일 및 42일 시점에 항-HA 항체에 대한 혈청전환율 (95% CI 지님).
도 8: AS03으로 애주번트 첨가되거나 첨가되지 않은 H5N1 스플리트 바이러스 항원의 용량-범위를 이용한 인간 임상 시험. 각 시점(0일, 21일 및 42일)에 항-HA 항체에 대한 혈청보호율 (95% CI 지님).
도 9: AS03으로 애주번트 첨가되거나 첨가되지 않은 H5N1 스플리트 바이러스 항원의 용량-범위를 이용한 인간 임상 시험. 백신접종 후(21일 및 42일)에 항-HA 항체에 대한 혈청전환지수 (95% CI 지님).
도 10: H5N1 베트남 균주에 대한 중화 역가 (GMT: 도 10A; 혈청전환율: 도 10B). HN4 = 애주번트 비첨가된 3.8 ㎍의 HA; HN8 = 애주번트 비첨가된 7.5 ㎍의 HA; HN4AD = AS03으로 애주번트 첨가된 3.8 ㎍의 HA; HN8AD = AS03 애주번트 첨가된 7.5 ㎍의 HA.
도 11: H5N1 베트남 균주에 대한 CD4 특이적인 반응. HN4 = 애주번트 비첨가된 3.8 ㎍의 HA; HN8 = 애주번트 비첨가된 7.5 ㎍의 HA; HN4AD = AS03으로 애주번트 첨가된 3.8 ㎍의 HA; HN8AD = AS03 애주번트 첨가된 7.5 ㎍의 HA.
본 발명자들은 범유행성과 관련되거나 범유행성과 관련될 수 있는 적은 양의 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제제를 대사가능한 오일, 스테롤 또는 토코페롤, 예컨대 알파 토코페롤 및 에멀젼화제를 포함하는 수중유 에멀젼 애주번트와 함께 포함하는 인플루엔자 제형이 애주번트 비첨가 바이러스 또는 이의 항원성 제제로 얻어진 것과 비교하여 인간 또는 개체군에서 상기 항원 또는 항원성 조성물에 대한 체액 면역 반응 및/또는 CD4 T-세포 면역 반응 및/또는 B 세포 기억 반응을 개선시킬 수 있음을 발견하였다. 이들은 동종 인플루엔자 균주에 의해 야기되는 이환율/사망률에 대한 보호를 달성할 수 있을 것이다. 본원에 정의된 수중유 에멀젼 애주번트로 애주번트화된 제형은 MHC 클래스 II 분자에 의해 제공된 인플루엔자 에피토프를 검출할 수 있는 항-인플루엔자 CD4-T 세포 반응을 유도하는 데 유리하게 사용될 것이다. 본원에 정의된 수중유 에멀젼 애주번트로 애주번트화된 제형은 교차-반응성 면역 반응, 즉 변이체 균주 또는 관련 균주의 범위에 대해 검출가능한 면역성 (체액 및/또는 세포)을 유도하는데 유리하게 이용될 것이다. 애주번트 첨가된 제형은 동종 및 드리프트 인플루엔자 균주(백신접종 및 감염시)에 대한 반응성을 증가시키기 위해 체액 및/또는 세포 매개 면역 시스템을 표적화하는데 유리하게 효과적일 것이다. 이들은 또한 교차-프라이밍 전략, 즉 변이체 균주로 재백신접종(일-용량)시 반응을 촉진하는 "프라이밍된" 면역학적 기억을 유도하는데 유리하게 이용될 것이다.
본 발명에 따른 애주번트 첨가된 범유행성 인플루엔자 조성물은 여러 이점을 갖는다:
1) 개선된 면역원성: 이들은 덜 면역원성인 인플루엔자 균주에 대한 약한 면역 반응을 애주번트 비첨가 제형에서 관찰된 것 보다 높은 수준으로 개선시킬 수 있을 것이다;
2) 애주번트의 이용은 나이브 개체군에서 항원의 잠재적인 약한 면역원성을 극복할 수 있다;
3) 이들은 고령층(통상적으로 60세 초과)과 같은 특정 개체군에서의 면역원성을 18세 내지 60세의 더 젊은 사람에게서 보여지는 수준까지 개선시킬 수 있다 (항체 및/또는 T 세포 반응);
4) 이들은 개선된 교차-보호 프로필을 유도할 수 있다: 변이체 (드리프트된) 인플루엔자 균주에 대한 증가된 교차-반응성, 교차-보호능은 교차-프라이밍 전략을 설정할 수 있게 하고, 여기서 이들은 (순환) 범유행성 균주에 대한 보호를 향상시키는데 요구되는 범유행성 백신의 단 1회 투여를 추가로 가능하게 하는 범유행성-전 백신으로서 이용될 수 있다;
5) 감소된 항원 투여량으로 임의의 이러한 추가의 이점 또는 모든 이점에 도달함에 의해, 이들은 위급한 경우 또는 범유행성 상태의 준비시에 증가된 수용량을 보장할 것이다.
다른 이점이 하기 설명 및 실시예 부분으로부터 명백할 것이다. 본 발명에 이용되는 조성물은 인플루엔자의 보호 상관관계를 충족시키는 인간 피검체의 수에 의해 평가되는 바와 같이 재백신접종 후 인플루엔자에 대해 보다 우수한 혈청보호를 제공할 수 있다. 또한, 본 발명에 사용하기 위한 조성물은 애주번트 비첨가 조성물과 비교하여 인간 피검체의 일차 백신접종 후 보다 높은 체액 반응 또는 B 세포 기억 반응 및 재백신접종 후 보다 높은 반응을 유도할 수 있다.
청구된 애주번트 첨가된 조성물은 애주번트 비첨가 조성물로 수득된 것 보다 더 많은 개체에서, 백신에 제공된 인플루엔자 균주에 대한 항체의 보호 수준을 유도할 수 있을 뿐 아니라 유지할 수도 있다.
따라서, 또 다른 구체예에서, 청구된 조성물은 인플루엔자 관련 질병에 대해 지속적인 면역 반응을 보장할 수 있다. 특히, 지속성은 백신접종 후, 적어도 3개월 후에, 바람직하게는 적어도 6개월 후에 관리 기준에 부합할 수 있는 HI 항체 면역 반응을 의미한다. 특히, 청구된 조성물은 적어도 3개월 후에 백신내 존재하는 범유행성 인플루엔자 균주에 대해, 개체의 50%를 초과하는 보호율(표 1 참조), 적합하게는 개체의 60% 초과, 개체의 70% 초과, 적합하게는 개체의 80% 초과 또는 적합하게는 개체의 90%를 초과하는 보호율에 의해 측정된 대로 항체의 보호 수준을 유도할 수 있다. 특정 측면에서, 90% 초과의 항체의 보호 수준은 백신 조성물내 존재하는 인플루엔자 균주에 대해 백신접종한 지 적어도 6개월 후에 달성된다.
본 발명의 추가의 측면에 따르면, 청구된 조성물은 백신 인플루엔자 균주에 대한 EU 요건에서 제공된 것 보다 더 높은 정도로 혈청보호 및 혈청전환을 유도할 수 있다. 이것은 하기에 추가로 상세히 개시될 것이다 (표 1 및 하기 "효능 기준" 참조).
인플루엔자 바이러스 균주 및 항원
일 구체예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제제는 스플리트 인플루엔자 바이러스 또는 이의 스플리트 바이러스 항원성 제제일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 인플루엔자 제제는 또 다른 유형의 불활성화된 인플루엔자 항원, 예컨대 불활성화된 전 바이러스 또는 재조합 및/또는 정제된 HA 및 NA(서브유닛 백신), 또는 인플루엔자 비로좀(virosome)을 함유할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 인플루엔자 바이러스 약독화된 생인플루엔자 제제일 수 있다.
본 발명에 따른 스플리트 인플루엔자 바이러스 또는 이의 스플리트 바이러스 항원성 제제는 적합하게는 바이러스 입자가 지질 외피를 용해시키는 세척제 또는 다른 시약으로 붕괴되는 불활성화된 바이러스 제제이다. 스플리트 바이러스 또는 이의 스플리트 바이러스 항원성 제제는 적합하게는 감염성이거나 불활성화된 전 인플루엔자 바이러스를 용해화 농도의 유기 용매 또는 세척제로 단편화시키고, 이어서 상기 용해제 전부 또는 대부분 및 바이러스 지질 물질의 일부 또는 대부분을 제거함으로써 제조된다. 이의 스플리트 바이러스 항원성 제제는 스플리트 바이러스와 비교하여 어느 정도 정제가 진행된 것이나 스플리트 바이러스 성분의 항원성 특성을 대부분 보유할 수 있는 스플리트 바이러스 제제를 의미한다. 예를 들어, 달걀에서 생성되는 경우, 스플리트 바이러스는 달걀-오염 단백질로부터 소모되거나, 세포 배양울ㅎ 생성될 경우, 스플리트 바이러스는 숙주 세포 오염물질로부터 소모될 수 있다. 스플리트 바이러스 항원성 제제는 하나 초과의 바이러스 균주의 스플리트 바이러스 항원성 성분을 포함할 수 있다. 스플리트 바이러스를 함유하는 백신(소위 '인플루엔자 스플리트 백신') 또는 스플리트 바이러스 항원성 제제는 일반적으로 잔류하는 기질 단백질 및 핵단백질, 및 때때로 지질, 뿐만 아니라 막외피 단백질을 함유한다. 이러한 스플리트 바이러스 백신은 반드시 전 바이러스에서 발생하는 것과 동일한 비율은 아니지만 일반적으로 바이러스 구조 단백질을 대부분 또는 전부 함유할 것이다.
다르게는, 인플루엔자 바이러스는 전 바이러스 백신의 형태로 존재할 수 있다. 이는 스플리트 바이러스 백신이 새로운 인플루엔자 바이러스 균주에 대해 성공적으로 제조될 수 있는 지에 대한 불확실성을 피함으로써 범유행성 상황에 대해 스플리트 바이러스 백신에 비해 유리한 것으로 입증할 수 있다. 몇몇 균주에 대해, 스플리트 바이러스를 제조하는 데 사용되는 통상적인 세척제는 바이러스를 손상시켜, 사용할 수 없게 할 수 있다. 스플리트 백신을 제조하기 위해 다른 세척제를 사용하고/하거나 다른 방법을 개발할 가능성이 항상 존재하지만, 이는 시간을 필요로 하여 범유행성 상태에서 이용하지 못할 수 있다. 전 바이러스 방법으로의 보다 큰 확실성 이외에, 또한 적합한 스플리트 백신을 제조하기 위해 필요한 추가의 정제 단계 동안에 상당량의 항원이 손실되기 때문에, 스플리트 바이러스 보다 큰 백신 제조 용량이 있어야 한다.
또 다른 구체예에서, 인플루엔자 바이러스 제제는 정제된 서브유닛 인플루엔자 백신의 형태로 존재한다. 서브유닛 인플루엔자 백신은 일반적으로 두 개의 주요 외피 단백질인 HA 및 NA를 함유하며, 특히 어린 백신접종자에게서 일반적으로 반응원성이 덜하기 때문에 전 비리온 백신에 비해 추가의 이점을 가질 수 있다. 서브유닛 백신은 붕괴된 바이러스 입자로부터 정제되거나 재조합에 의해 생성될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 인플루엔자 바이러스 제제는 비로좀의 형태로 존재한다. 비로좀은 비로좀의 인지질 이층 막에 끼워져 있는 진짜 형태의 기능적 바이러스 외피 당단백질 HA 및 NA를 함유하는 구형의 단층 소포체이다.
상기 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제제는 달걀 유도되거나 조직 배양 유도될 수 있다. 이들은 곤충 세포, 식물, 효모 또는 세균과 같은 다른 시스템에서 생성될 수 있거나 재조합에 의해 생성될 수도 있다.
예를 들어, 본 발명에 따른 인플루엔자 바이러스 항원 또는 이의 항원성 제제는, 달걀에서 인플루엔자 바이러스를 배양하고, 수집한 요막액을 정제함으로써 통상적인 발육란 방법으로부터 유도될 수 있다. 달걀은 금새 대다수로 축적될 수 있다. 다르게는, 본 발명에 따른 인플루엔자 바이러스 항원 또는 이의 항원성 제제는 바이러스를 성장시키거나 재조합 인플루엔자 바이러스 표면 항원을 발현시키는 조직 배양을 사용하는 임의의 새로운 생성 방법으로부터 유도될 수 있다. 바이러스를 성장시키기 위한 적합한 세포 기질은 개의 신장 세포, 예컨대, MDCK 또는 MDCK의 클론으로부터의 세포, MDCK 유사 세포, 원숭이 신장 세포, 예컨대 베로(Vero) 세포를 포함하는 AGMK 세포, 적합한 돼지 세포주, 또는 백신 용도에 맞는 인플루엔자 바이러스의 제조에 적합한 임의의 그 밖의 포유동물 세포 유형을 포함한다. 또한, 적합한 세포 기질은 사람 세포, 예컨대 MRC-5 또는 Per-C6 세포를 포함한다. 적합한 세포 기질에는 예를 들어, 영장류 세포, 예컨대 계배아 섬유모세포 및 조류 세포주가 또한 포함되나, 이러한 세포주로 제한되는 것은 아니다.
인플루엔자 바이러스 항원 또는 이의 항원성 제제는 예를 들어 본원에 참고문헌으로 인용되는 특허 제 DD 300 833호 및 제 DD 211 444호에 기술된 스플리트 flu 방법과 같은 임의의 다수의 통상적으로 적용할 수 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 전통적으로 스플리트 flu는 용매/세척제 처리, 예컨대 트리-n-부틸 포스페이트 또는 트윈(Tween)™과 함께 디에틸에테르("트윈-에테르" 스플리팅으로서 공지되어 있음)를 사용하여 생성되었으며, 이 방법은 일부 제조 설비에서 여전히 사용되고 있다. 현재 사용되는 다른 스플리팅제로는 세척제 또는 단백질분해 효소 또는 담즙 염, 예를 들어 본원에 참고문헌으로 인용되는 특허 번호 DD 155 875에 기술된 바와 같은 나트륨 데옥시콜레이트가 포함된다. 스플리팅제로서 사용될 수 있는 세척제는 양이온성 세척제, 예를 들어, 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB), 그 밖의 이온성 세척제, 예를 들어, 라우릴설페이트, 타우로데옥시콜레이트, 또는 비이온성 세척제, 예컨대 트리톤(Triton) X-100(예를 들어, Lina et al, 2000, Biologicals 28, 95-103) 및 트리톤 N-101, 또는 임의의 두개 이상의 세척제의 조합을 포함하는 상기 기술된 것들이 포함된다.
스플리트 백신을 제조하는 방법은 다수의 상이한 여과 및/또는 다른 분리 단계, 예컨대, 다양한 조합의 초원심분리, 초여과, 띠 원심분리 및 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환) 단계, 및 임의로 스플리팅 전 또는 후에 수행될 수 있는, 예를 들어 열, 포름알데히드 또는 β-프로피오락톤 또는 U.V.에 의한 불활성화 단계를 포함할 수 있다. 스플리팅 방법은 배치식, 연속식 또는 반연속식 공정으로서 수행될 수 있다. 스플리트 면역원성 조성물을 위한 바람직한 스플리팅 및 정제 방법이 WO 02/097072에 기술되어 있다.
본 발명에 따른 바람직한 스플리트 flu 백신 항원 제제는 제조 공정으로부터 잔류하는 잔류량의 트윈 80 및/또는 트리톤 X-100를 포함하는 데, 이들은 스플리트 항원의 제조 후에 첨가되거나 농도가 조절될 수 있다. 바람직하게는 트윈 80 및 트리톤 X-100 둘 모두가 존재한다. 백신 용량 중 이들 비이온성 계면활성제의 최종 농도에 대한 바람직한 범위는 하기와 같다:
트윈 80: 0.01 내지 1%, 보다 바람직하게는 약 0.1%(v/v)
트리톤 X-100: 0.001 내지 0.1(% w/v), 보다 바람직하게는 0.005 내지 0.02%(w/v).
특정 구체예에서, 트윈 80에 대한 최종 농도는 0.045% 내지 0.09% w/v이다. 또 다른 특정 구체예에서, 항원은 2배 농축된 혼합물로부터 제공되는 데, 이 혼합물은 트윈 80 농도가 0.045%-0.2%(w/v) 범위이고, 애주번트 첨가되는(또는 대조군 제형에서 완충액) 최종 제형시 두배 희석되어야 한다.
또 다른 특정 구체예에서, 트리톤 X-100에 대한 최종 농도는 0.005%-0.017% w/v이다. 또 다른 특정 구체예에서, 항원은 2배 농축된 혼합물로부터 제공되는 데, 이 혼합물은 트리톤 X-100 농도가 0.005%-0.034%(w/v) 범위이고, 애주번트 첨가된(또는 대조군 제형에서 완충액) 최종 제형시 두배 희석되어야 한다.
바람직하게는, 인플루엔자 제제는 낮은 수준의 보존제, 특히 티오메르살(thiomersal)의 존재 하에서, 또는 바람직하게는 티오메르살의 부재 하에서 제조된다. 바람직하게는, 형성되는 인플루엔자 제제는 유기수은 보존제의 부재 하에서 안정하며, 특히 잔류하는 티오메르살을 전혀 함유하지 않는다. 특히, 인플루엔자 바이러스 제제는 티오메르살의 부재 하에서, 또는 저수준의 티오메르살(일반적으로 5㎍/ml 이하)에서 안정화된 헤마글루티닌 항원을 포함한다. 특이적으로, B 인플루엔자 균주의 안정화는 알파 토코페롤의 유도체, 예컨대 알파 토코페롤 숙시네이트(또한, 비타민 E 숙시네이트, 즉, VES로서 공지되어 있음)에 의해 달성된다. 이러한 제제 및 이의 제조 방법이 WO 02/097072에 개시되어 있다.
다르게는, 특히 다중-용량 컨테이너의 경우, 티오메르살 또는 임의의 다른 적합한 보존제가 오염의 위험을 감소시키기 위해 존재한다. 이것은 다수의 사람을 가능한 가장 짧은 시간내에 백신접종할 수 있도록 고안된, 범유행성 백신에 특히 적합하다.
재백신접종에 바람직한 조성물은 범유행성 인플루엔자 균주에 추가하여, 적합한 인플루엔자 시즌의 WHO 권장된 균주로부터 제조된 3개의 불활성화된 스플리트 비리온 항원을 함유한다.
일 구체예에서, 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제제 및 수중유 에멀젼 애주번트가 동일 컨테이너에 함유된다. 이를 '원 바이알법(one vial approach)'이라 한다. 바람직하게는, 바이알은 미리충전된(pre-filled) 주사기이다. 대안적 구체예에서, 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제제 및 수중유 에멀젼 애주번트는 개별 컨테이너 또는 바이알 또는 유닛에 함유되어 피검체에 투여되기 직전 또는 투여시에 혼합된다. 이를 "투 바이알법(two vial approach)"이라 한다. 예를 들어, 백신이 주사되는 용량의 총 용량 부피가 0.5ml인 2 성분 백신인 경우, 농축 항원(예를 들어, 농축된 불활성화된 스플리트 비리온 항원)이 한 바이알(330 ㎕)(항원 컨테이너, 예컨대 바이알)에 제공되고, 미리충전된 주사기는 애주번트(400 ㎕)(애주번트 컨테이너, 예컨대 주사기)를 함유한다. 통상적으로, 범유행성 백신은 0.5 ml의 주사 용량이고 다중용량 바이알은 피검체에 주사되기에 앞서 먼저 1:1 바이알:바이알 혼합물을 함유한다. 다르게는, 범유행성 백신이 1.0 ml의 바이알:주사기 주사 용량이다. 주입시, 농축된 불활성화된 스플리트 비리온 항원을 함유하는 바이알의 내용물은 애주번트를 함유하는 주사기를 사용한 후 주사기를 부드럽게 혼합함으로써 바이알로부터 분리된다. 주입전에, 사용되는 주사기는 근내 주사기로 대체되고, 부피는 530 ㎕로 보정된다. 재구성된 애주번트 첨가된 인플루엔자 백신 후보물질의 1회 용량은 530 ㎕에 상응한다.
적합하게, 애주번트 첨가된 범유행성 인플루엔자 후보 백신은 타입 I 유리 바이알에 제공된 0.5 ml의 농축된 불활성화된 스플리트 비리온 항원 및 0.5 ml의 애주번트를 함유하는 미리충전된 타입 I 유리 주사기로 구성된 2 성분 백신이다. 다르게는, 백신이, 환자에게 투여되기 전에 먼저 혼합물을 2개의 바이알 (항원용 하나와 애주번트용 하나, 각 10회 용량)로 제공하고 후속 투여를 위해 단기간 동안 (예컨대, 1주 이내) 4℃에서 후속 저장되는 2 성분 백신이다. 주입시에, 애주번트를 함유하는 미리충전된 주사기의 내용물을 농축된 3가 불활성화된 스플리트 비리온 항원을 함유하는 바이알에 주사한다. 혼합시킨 후, 내용물을 주사기로 뽑아 내고 바늘을 근내 바늘로 교체한다. 일 용량의 재구성된 애주번트 첨가된 인플루엔자 후보 백신은 0.5 ml이다. 0.5 ml의 각 백신 용량은 1.9 ㎍, 3.8 ㎍, 7.5 ㎍, 15㎍ 또는 30 ㎍의 헤마글루티닌 (HA), 또는 백신 조성물이 본원에 정의된 효능 기준을 충족하도록 결정될 임의의 적합한 양의 HA를 함유한다. 1 ml의 백신 용량 (0.5 ml 애주번트 플러스 0.5 ml 항원 제제)도 적합하다.
본 발명에 따르면 본원에 정의된 일가 면역원성 조성물 중 인플루엔자 균주는 범유행성과 관련이 있거나 범유행성과 관련될 가능성을 지닌다. 이러한 균주는 하기 본문에서 '범유행성 균주'로서 언급될 수도 있다. 특히, 백신이 재백신접종을 위한 다가 백신, 예컨대 이가 또는 삼가 또는 사가 백신일 때, 1종 이상의 균주가 범유행성과 관련되거나 범유행성과 관련될 가능성이 있다. 적합한 균주로는 H5N1, H9N2, H7N7, H2N2, H7N1 및 H1N1이 있으나 이로 제한되지 않는다. 인간에서의 다른 범유행성 균주는 H7N3 (캐나다에서 보고된 2 경우), H10N7 (이집트에서 보고된 2 경우) 및 H5N2 (일본에서 보고된 한 경우)이다.
재백신접종을 위한 상기 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제제는 적합하게는 이가 또는 삼가 또는 사가와 같은 다가이거나 심지어 더 많은 인플루엔자 균주를 함유한다. 적합하게는 재백신접종을 위한 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제제가 3개의 상이한 인플루엔자 균주로부터의 항원을 지니는 삼가 또는 사가이며, 적어도 하나의 균주는 범유행성과 관련되거나 범유행성 발생과 관련될 가능성을 지닌다. 적합하게는, 재백신접종 조성물이 일차 백신접종을 위해 조성물에 제공된 범유행성 균주의 변이체일 수 있는 범유행성 균주, 및 전통적인 순환 균주인 3개의 다른 균주를 포함한다.
다르게는, 적합한 범유행성-전 백신 전략이, 경시적으로 이들 바이러스에 대한 반응을 유지하고 확장시키려는 목적으로 상이한 잠재적인 범유행성 균주를 이용한 주기적인 (예컨대, 매 1-2년마다) 면역화를 필요로 한다. 예를 들어 일 구체예에서, 일차 백신접종이 1년에 H5N1과 같은 하나의 범유행성 균주를 포함하는 청구된 애주번트 첨가된 일가 백신으로 수행된 후, 다음 시점에 (예컨대, 6개월, 1년 또는 2년 후) H9N2와 같은 상이한 범유행성 인플루엔자 균주를 포함하는 애주번트 첨가된 조성물로 수행된 다음, H7N7과 같은 여전히 또 다른 범유행성 인플루엔자 균주를 포함하는 애주번트 첨가된 조성물로 백신접종되는 것 등등이다. a) 잠재적인 범유행 시기 및 b) 특정 범유행 균주를 예측할 수 없기 때문에, 청구된 애주번트 첨가된 조성물에 의존적인 이러한 전략은 올바른 시점에 보호성 면역 반응의 크기 및 범위를 최대화시키는 증가된 보증을 제공할 것이다. 이러한 전략에서, 애주번트는 적합하게 본원에 정의된 바와 같다.
인플루엔자 바이러스 균주에 범유행성 인플루엔자 균주와 관련된 인플루엔자 질병의 범유행성 또는 발생을 야기시킬 가능성을 제공하는 인플루엔자 바이러스 균주의 특징은, 이것이 현재 순환되는 균주에서의 헤마글루티닌과 비교하여 신규한 헤마글루티닌을 함유하므로 거의 모든 사람이 면역학적으로 경험한 적이 없고(naive); 인간 개체군에서 수평적으로 전염될 수 있으며; 이것이 인간에 대해 변원성이라는 것이다. 신규한 헤마글루티닌은 연장된 기간 동안, 아마도 수십년 동안, H2와 같이 인간 개체군에서 뚜렷하지 않았던 것일 수 있다. 또는, 이것이 이전에는 인간 개체군에서 순환되지 않았던 헤마글루티닌일 수 있고, 예를 들어 이에는 조류에서 발견되는 H5, H9, H7 또는 H6이 있다. 대부분의 경우에, 또는 적어도 다수의 개체군 또는 심지어 전체 개체군이 이전에 그 항원을 만난 적이 없고 면역학적으로 경험한 적이 없다. 현재, WHO에 의해 인간에서 잠재적으로 범유행성을 야기시킬 수 있었던 것으로서 확인된 인플루엔자 A 바이러스는 고도로 병원성인 H5N1 조류 인플루엔자 바이러스이다. 따라서, 본 발명에 따른 범유행성 백신은 H5N1 바이러스를 포함하는 것이 적합할 것이다.
특정 무리가 일반적으로 범유행성 상태에서 인플루엔자에 감염될 위험성이 높다. 만성적으로 아픈 노인 및 소아가 특히 걸리기 쉬우나 많은 청년 및 명백히 건강한 사람도 걸릴 수 있다. H2 인플루엔자의 경우, 1968년 이후에 태어난 개체군의 일부가 증가된 위험성을 지닌다. 이들 그룹을 가능한 한 효과적으로 단순한 방법으로 보호하는 것이 중요하다.
위험성이 증가된 또 다른 그룹의 사람들은 여행자들이다. 사람들은 오늘날 이전보다 더 많이 여행하며, 대부분의 새로운 바이러스가 출현하는 지역인 중국 및 동남아시아는 최근 인기있는 여행지가 되었다. 여행 패턴의 이러한 변화는 신규한 바이러스가 수 개월 또는 수 년이 아닌 수 주와 관련하여 세계적으로 도달되도록 한다.
따라서, 이러한 그룹의 사람들에 대하여, 범유행성 상태 또는 잠재적인 범유행성 상태에서 인플루엔자에 대해 보호하는 백신접종이 특히 필요하다. 적합한 범유행성 균주로는 H5N1, H9N2, H7N7, H7N1, H2N2 및 H1N1이 있으나 이로 제한되지 않는다. 인간에서의 다른 범유행성 균주는 H7N3 (캐나다에서 보고된 2 경우), H10N7 (이집트에서 보고된 2 경우) 및 H5N2 (일본에서 보고된 한 경우)이다.
수중유 에멀젼 애주번트
본 발명의 애주번트 조성물은 수중유 에멀젼 애주번트를 함유하고, 바람직하게는 상기 에멀젼은 총 부피의 0.5% 내지 20%의 양으로, 그리고 오일 점적의 적어도 70세기%가 직경이 1㎛ 미만인 오일 점적을 지닌, 대사가능한 오일을 포함한다.
임의의 수중유 조성물을 사람 투여에 적합하게 되도록 하기 위해, 에멀젼 시스템의 오일상은 대사가능한 오일을 포함해야 한다. 용어 대사가능한 오일의 의미는 당해 널리 공지되어 있다. 대사가능한은 "대사작용에 의해 변형될 수 있는" 것으로서 정의될 수 있다[참조: Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 25th edition (1974)]. 상기 오일은 수용체에게 비독성이고, 대사에 의해 변형될 수 있는, 임의의 식물성유, 어유, 동물성유 또는 합성유일 수 있다. 견과, 종자 및 곡물은 식물성유의 통상적인 공급원이다. 합성유 또한 본 발명의 일부이며, 시판되는 오일, 예컨대 NEOBEE® 등을 포함할 수 있다. 특히 적합한 대사가능한 오일은 스쿠알렌이다. 스쿠알렌(2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사헥사엔)은 상어간유에서 대량으로, 그리고 올리브유, 밀배아유, 쌀겨오일, 및 효모에서 소량으로 발견되는 불포화 오일이며, 본 발명에 사용하기에 특히 바람직한 오일이다. 스쿠알렌은 콜레스테롤 생합성에서 중간체라는 사실에 비추어 대사가능한 오일이다[참조: Merck index, 10th Edition, entry no.8619].
수중유 에멀젼은 그 자체로 당해 널리 공지되어 있으며, 애주번트 조성물로서 유용한 것으로 제안되었다(EP 399843; WO 95/17210).
적합하게는, 대사가능한 오일은 면역원성 조성물의 총 부피의 0.5% 내지 20%(최종 농도)의 양으로, 바람직하게는 총 부피의 1.0% 내지 10%의 양으로, 바람직하게는 총 부피의 2.0% 내지 6.0%의 양으로 존재한다.
특정 구체예에서, 대사가능한 오일은 면역원성 조성물의 총 부피의 약 0.5%, 1%, 3.5% 또는 5%의 최종량으로 존재한다. 또 다른 특정 구체예에서, 대사가능한 오일은 면역원성 조성물의 총 부피의 0.5%, 1%, 3.57% 또는 5%의 최종량으로 존재한다. 적합한 양의 스쿠알렌은 백신 용량 당 약 10.7 mg이고, 적합하게는 백신 용량 당 10.4 내지 11.0 mg이다.
바람직하게는, 본 발명의 수중유 에멀젼 시스템은 작은 오일 점적 크기가 서브-미크론 범위이다. 적합하게는, 점적 크기는 직경이 120 내지 750nm, 보다 바람직하게는 120 내지 600nm일 것이다. 통상적으로, 수중유 에멀젼은 70세기% 이상의 직경이 500nm 미만이고, 보다 바람직하게는 80세기% 이상의 직경이 300nm 미만이고, 보다 바람직하게는 90세기% 이상의 직경이 120 내지 200nm 범위로 존재하는 오일 점적을 함유한다.
본 발명에 따른 오일 점적 크기, 즉, 직경은 세기에 의해 주어진다. 세기에 의해 오일 점적 크기의 직경을 측정하는 방법은 여러가지가 있다. 세기는 사이징 기구를 사용함으로써, 적합하게는 동적 광산란법, 예컨대, 맬번 제타사이저(Malvern Zetasizer) 4000 또는 바람직하게는 맬번 제타사이저 3000HS에 의해 측정된다. 자세한 절차는 실시예 II.2에 제시되어 있다. 첫번째 가능한 방법은 동적 광산란법(PCD-광양자상관분광법)에 의해 z 평균 직경 ZAD를 측정하는 것이며, 이 방법은 추가로 다분산성 지수(PDI)를 제공하며, ZAD 및 PDI 둘 모두 누적평가 알고리즘(cumulants algorithm)으로 계산된다. 이들 값은 입자 굴절 지수를 알 필요가 없다. 두번째 수단은 또 다른 알고리즘인 콘틴(Contin) 또는 NNLS, 또는 자동 "맬번" 알고리즘(사이징 기기에 의해 제공된 디폴트(default) 알고리즘)에 의해 전입자 크기 분포를 측정함으로써 오일 점적의 직경을 계산하는 것이다. 대개의 경우, 복합 조성물의 입자 굴절 지수는 알려져 있기 않기 때문에, 세기 분포만이 고려되며, 필요에 따라 이러한 분포로부터 기원하는 세기 평균이 고려된다.
본 발명에 따른 수중유 에멀젼은 알파 토코페롤과 같은 스테롤 또는 토코페롤을 포함한다. 스테롤은 당해 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 콜레스테롤이 널리 공지되어 있고, 이는 문헌(Merck Index, 11th Edn., page 341)에 동물성 지방에서 발견되는 천연 스테롤로서 기술되어 있다. 다른 적합한 스테롤에는 β-시토스테롤, 스티그마스테롤, 에르고스테롤 및 에르고칼시페롤이 포함된다. 상기 스테롤은 적합하게는 면역원성 조성물의 총 부피의 0.01% 내지 20%(w/v)의 양으로, 바람직하게는 0.1% 내지 5%(w/v)의 양으로 존재한다. 바람직하게는, 스테롤이 콜레스테롤인 경우, 면역원성 조성물의 총 부피의 0.02% 내지 0.2%(w/v)의 양으로, 보다 바람직하게는 0.5ml 백신 투여 부피의 0.02%(w/v), 또는 0.5ml 백신 투여 부피의 0.07%(w/v) 또는 0.7ml 백신 투여 부피의 0.1%(w/v)의 양으로 존재한다.
적합하게는, 알파-토코페롤 또는 이의 유도체, 예컨대 알파-토코페롤 숙시네이트가 존재한다. 바람직하게는, 알파-토코페롤은 면역원성 조성물의 총 부피의 0.2% 내지 5.0%(v/v), 보다 바람직하게는 0.5ml 백신 투여 부피의 2.5%(v/v), 또는 0.5ml 백신 투여 부피의 0.5%(v/v), 또는 0.7ml 백신 투여 부피의 1.7-1.9%(v/v), 바람직하게는 1.8%(v/v)의 양으로 존재한다. 분명히 하자면, v/v로 주어진 농도는 하기 전환지수를 적용시킴으로써 w/v의 농도로 전환될 수 있다: 5%(v/v) 알파-토코페롤 농도는 4.8%(w/v) 알파-토코페롤 농도와 등가이다. 적합한 양의 알파-토코페롤은 백신 용량 당 약 11.9 mg이고, 적합하게는 백신 용량 당 11.6 내지 12.2 mg이다.
수중유 에멀젼은 추가로 에멀젼화제를 포함한다. 에멀젼화제는 면역원성 조성물의 0.01 내지 5.0중량%(w/w)의 양으로 존재할 수 있고, 바람직하게는 0.1 내지 2.0중량%(w/w)의 양으로 존재할 수 있다. 바람직한 농도는 총 조성물의 0.5 내지 1.5중량%(w/w)이다.
에멀젼화제는 적합하게는 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레에이트(트윈 80)일 수 있다. 특정 구체예에서, 0.5ml 백신 투여 부피는 1%(w/w) 트윈 80을 함유하고, 0.7ml 백신 투여 부피는 0.7%(w/w) 트윈 80을 함유한다. 다른 특정 구체예에서, 트윈 80의 농도는 0.2%(w/w)이다. 적합한 양의 폴리소르베이트 80은 백신 용량 당 약 4.9 mg이고, 적합하게는 백신 용량 당 4.6 내지 5.2 mg이다.
바람직하게는 백신 용량이 백신 용량 당 약 11.9 mg의 알파-토코페롤, 백신 용량 당 10.7 mg의 스쿠알렌, 및 백신 용량 당 약 4.9 mg의 폴리소르베이트 80을 포함한다.
수중유 에멀젼 애주번트는 다른 애주번트 또는 면역자극제와 함께 이용될 수 있어서 본 발명의 중요한 구체예는 스쿠알렌 또는 다른 대사가능한 오일, 토코페롤, 예컨대 알파 토코페롤, 및 트윈 80을 포함하는 수중유 제형이다. 수중유 에멀젼은 또한 스판(span) 85 및/또는 레시틴을 함유할 수 있다. 일반적으로, 수중유는 면역원성 조성물의 총 부피의 2 내지 10%의 스쿠알렌, 2 내지 10%의 알파 토코페롤 및 0.3 내지 3%의 트윈 80을 포함할 것이며, WO 95/17210에 기술된 절차에 따라 제조될 수 있다. 바람직하게는 알파 토코페롤에 대한 스쿠알렌의 비는 1 이하이며, 이로써 보다 안정한 에멀젼을 제공한다. 스판 85(폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리올레에이트) 또한 예를 들어, 1%의 수준으로 존재할 수 있다.
본 발명의 일차 백신접종에 사용되는 면역원성 조성물의 면역원성 특성
본 발명에서, 일가 인플루엔자 조성물은 애주번트 첨가되지 않은, 즉 어떠한 외인성 애주번트를 함유하지 않는 상응하는 조성물(본원에서는 또한 '플레인 조성물'이라고도 함)로 얻어지는 CD4-T 세포 면역 반응과 비교하여 항원 성분(들) 또는 항원성 조성물 중 적어도 하나에 대해 개선된 CD4-T 세포 면역 반응을 유도할 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 개선된 CD4 T-세포 면역 반응은 범유행성 인플루엔자 균주에 대한 것이다.
'개선된 CD4 T-세포 면역 반응'은 보다 높은 CD4 반응이 사람 환자에게서 애주번트 부재의 동일한 조성물의 투여 후 얻어진 것보다 애주번트 첨가된 면역원성 조성물의 투여 후에 얻어진다는 것을 의미한다. 예를 들어, 보다 높은 CD4 T-세포 반응은 사람 환자에게서 애주번트 첨가되지 않는 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제제를 포함하는 면역원성 조성물을 투여한 후 유도된 반응과 비교하여, 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제제를 대사가능한 오일, 토코페롤, 예컨대 알파 토코페롤 및 에멀젼화제를 포함하는 수중유 에멀젼 애주번트와 함께 포함하는 면역원성 조성물의 투여시에 얻어진다. 이러한 제형은 유리하게는 MHC 클래스 II 분자에 의해 제공되는 인플루엔자 에피토프를 검출할 수 있는 항-인플루엔자 CD4 T-세포 반응을 유도하는 데 사용될 것이다.
바람직하게는, 본 발명에 사용하기 위한 애주번트 첨가된 스플리트 인플루엔자 조성물에 의해 유도된 상기 면역학적 반응은 임의의 다른 통상적인 애주번트 첨가되지 않은 인플루엔자 백신, 예컨대 서브유닛 인플루엔자 백신 또는 인플루엔자 전 바이러스 백신에 의해 유도된 면역학적 반응보다 높다.
한정되지는 않아야 하지만, 특히 상기 '개선된 CD4 T-세포 면역 반응'은 면역학적으로 프라이밍되지 않은 환자, 즉, 상기 인플루엔자 바이러스 또는 항원에 대해 혈청음성인 환자에게서 달성된다. 이러한 혈청음성은 이러한 바이러스 또는 항원에 전혀 접한 적이 없거나(소위 '나이브' 환자), 또는 다르게는 직면된 경우 상기 항원에 대한 반응이 실패된 환자의 결과일 수 있다. 바람직하게는, 상기 개선된 CD4 T-세포 면역 반응은 노년층, 일반적으로 50세 이상, 통상적으로 65세 이상, 또는 고위험 의학적 상태를 갖는 65세 미만의 성인('고위험' 성인), 또는 2세 미만의 소아와 같은 면역약화된 피검체에서 얻어진다.
개선된 CD4 T-세포 면역 반응은 임의의 하기 시토킨을 생성하는 다수의 세포를 측정함으로써 평가될 수 있다:
ㆍ 적어도 두개의 상이한 시토킨 (CD40L, IL-2, IFNγ, TNFα)을 생성하는 세포
ㆍ 적어도 CD40L 및 또 다른 시토킨(IL-2, TNFα, IFNγ)을 생성하는 세포
ㆍ 적어도 IL-2 및 또 다른 시토킨(CD40L, TNFα, IFNγ)을 생성하는 세포
ㆍ 적어도 IFNγ 및 또 다른 시토킨(IL-2, TNFα, CD40L)을 생성하는 세포
ㆍ 적어도 TNFα 및 또 다른 시토킨(IL-2, CD40L, IFNγ)을 생성하는 세포
임의의 상기 시토킨을 생성하는 세포가 애주번트 첨가되지 않는 조성물의 투여와 비교하여 애주번트 첨가된 조성물의 투여를 수행하는 데 보다 많은 양으로 존재할 경우에 CD4 T-세포 면역 반응이 개선될 것이다. 일반적으로, 상기 본원에 언급된 하나 이상, 바람직하게는 5개 조건 중 두 개가 충족될 것이다. 특정 구체예에서, 4개 모두의 시토킨을 생성하는 세포가 애주번트 비첨가 그룹과 비교하여 애주번트 첨가된 그룹에서 보다 많은 양으로 존재할 것이다.
특정 구체예에서, 본 발명의 애주번트 첨가된 인플루엔자 조성물에 의해 주어진 개선된 CD4 T-세포 면역 반응은 이상적으로는 1회 단일 투여 후에 얻어질 수 있다. 단일 용량 방법은 예를 들어 빠르게 전개되는 발생 상황에서 매우 적합할 것이다. 특정 상황에서, 특히 중장년층 집단에 대해, 또는 인플루엔자에 대해 최초로 백신접종된 어린이(9세 미만)의 경우에, 또는 범유행성의 경우에 그러한 시즌에 대해 동일한 조성물을 2회 용량으로 투여하는 것이 유리할 수 있다. 상기 동일 조성물의 제 2 용량(여전히 '일차 백신접종을 위한 조성물'로서 간주됨)은 진행중인 일차 면역 반응 동안에 투여될 수 있으며, 충분하게 시간을 둔다. 일반적으로 조성물의 제 2 용량은 제 1 용량 이후 수주일에, 또는 대략 한달에, 예를 들어, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주에 제공되어 비반응성 또는 반응성이 낮은 개체에서의 면역 시스템을 프라이밍하는 것을 돕는다. 특정 측면에서, 프리모(primo)-백신접종 이후에 이종성 인플루엔자 균주를 함유하는 애주번트 첨가된 백신 제품의 후속적인 백신접종이 진행된다.
특정 구체예에서, 상기 면역원성 조성물의 투여는 다르게는 또는 추가로 애주번트 비첨가 조성물로 면역화된 개체에서 유도된 B-기억 세포 반응과 비교하여 애주번트 첨가된 면역원성 조성물이 투여된 환자에게서 개선된 B-기억 세포 반응을 유도한다. 개선된 B-기억 세포 반응은 시험관내 분화의 촉진에 의해 측정하여, 항원 직면시 항체 분비 혈장 세포로 분화될 수 있는 말초혈 B 림프구의 증가된 빈도를 의미하는 것으로 의도된다[참조: 실시예 부분, 예를 들어, 엘리스폿(Elispot) B 세포 기억 방법].
추가의 특정 구체예에서, 애주번트 첨가된 일차 백신접종을 위한 조성물로의 백신접종은 CD8 반응에 측정가능할 정도의 영향은 주지 않는다.
바람직하게는, 수중유 에멀젼 애주번트, 특히 대사가능한 오일, 알파 토코페롤과 같은 스테롤 또는 토코페롤, 및 에멀젼화제를 포함하는 수중유 에멀젼 애주번트로 제형화된 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제제를 포함하는 청구된 조성물이 면역-약화된 사람 집단에서 T 세포 반응을 촉진시키는 데 효과적일 것이다. 바람직하게는 본원에 개시된 바와 같이, 일차 백신접종을 위한 면역원성 조성물의 단일 용량의 투여가 애주번트 비첨가 인플루엔자 백신으로 백신접종하는 것보다, 인플루엔자에 대한 재백신접종 이후에 인플루엔자 백신에 대한 보호능 상관관계에 의해 평가되는 바와 같이, 보다 우수한 혈청-보호능을 제공할 것이다. 또한, 청구된 애주번트 첨가된 제형은 또한 애주번트 비첨가 제형으로 얻어지는 것과 비교하여 인플루엔자 바이러스에 대해 개선된 CD4 T-세포 면역 반응을 유도할 수 있다. 이러한 성질은 인플루엔자 항원성 노출에 대한 백신접종 또는 감염시 증가된 반응성과 관련될 수 있다. 추가로, 이는 또한 교차-반응성, 즉, 변이체 인플루엔자 균주에 대한 보다 높은 반응력과 관련될 수 있다. 이러한 질적으로 및/또는 양적으로 개선된 반응은 범유행성의 경우에 모든 집단에서 유리할 수 있고, 특히 노인 집단(65세 이상), 및 특히 고위험 중장년층 집단과 같은 면역-약화된 사람 집단에서 특히 유리할 수 있다. 이는 또한 유아 집단(5세 미만, 특히 2세 미만)에 유리할 수 있다. 이렇게 개선된 반응은 범유행성 발생 이전 또는 개시 시점에 드리프트 변이체를 함유하는 예컨대 비축된 백신으로부터 프라이밍을 위해 사용하는데 유리할 것이다. 이는 전체적인 이환율 및 사망율을 감소시키고 폐렴 및 다른 인플루엔자-유사 질병으로 병원에 긴급 방문하게 되는 것을 막을 것이다. 추가로, 애주번트 비첨가 제형으로 유도된 반응과 비교하여 일차 백신접종 후 소정 기간 지속되는, 예를 들어 1년간 존재하는 CD4 T-세포 반응을 유도할 수 있다.
바람직하게는, CD4 T-세포 반응, 예컨대 프라이밍되지 않은 피검체에서 달성된 개선된 CD4 T-세포 면역 반응은 교차 반응성 CD4 T 헬퍼 반응의 유도를 포함한다. 특히, 교차-반응성 CD4 T세포의 양이 증가된다. '교차-반응성' CD4 반응은 인플루엔자 균주 간에 공유된 에피토프를 표적화하는 CD4 T-세포를 의미한다.
보통, 입수할 수 있는 인플루엔자 백신은 유사한 항원성 특징의 헤마글루티닌을 갖는 인플루엔자 바이러스 균주를 감염시키는 것에 대해서만 효과적이다. 인플루엔자 바이러스 감염(순환)으로 특정 헤마글루티닌에서 표면 당단백질에 약간의 변화(예컨대, 점 돌연변이 또는 예를 들어 아미노산 변화를 초래하는 점 돌연변이의 축적)가 진행된 경우, 백신은 새롭게 생긴 변이체가 이전의 인플루엔자 감염 또는 백신접종에 의해 유도된 면역성을 벗어날 수 있음에 따라 단지 제한된 보호능을 제공할 수 있기는 하지만, 백신은 여전히 약간의 보호능을 제공할 수 있다. 항원성 드리프트는 범유행기 사이 동안에 일어나는 연례적 범유행병의 원인이 된다[참조: Wiley & Skehel, 1987, Ann. Rev. Biochem. 56, 365-394]. 교차-반응성 CD4 T 세포의 유도는 또한 교차 보호, 즉, 이종 감염, 즉, 면역원성 조성물에 함유된 인플루엔자 균주의 변이체(예를 들어, 드리프트)인 순환하는 인플루엔자 균주에 의해 유도된 감염에 대한 보호능을 제공할 수 있다는 점에서 본 발명의 조성물에 추가의 이점을 제공한다. 이는 드리프트된 균주를 대안 작업에서 사용하게 하는, 순환 균주가 달걀에서 전파되거나 조직 배양물에서 생성되기가 어려운 경우에 유리할 수 있다. 이는 또한 피검체가 수개월 또는 일년 간격으로 일차 및 이차 백신접종을 하고, 제 2 면역화에 사용된 면역원성 조성물내 인플루엔자 균주가 일차 백신접종에 사용된 조성물에 사용된 균주의 드리프트 변이체 균주인 경우에 유리할 수 있다.
본원에 정의된 애주번트 첨가된 인플루엔자 면역원성 조성물은 따라서 백신접종된 고령 피검체에서 혈청-보호 및 교차-반응성 CD4 T 세포를 유도하는 높은 능력을 지닌다. 이러한 특성은 면역원성 조성물로 제시된 균주의 변이체 균주에 반응하는 더 높은 능력과 관련될 수 있다. 이는 범유행성 상태에서 중요한 이점인 것으로 입증될 수 있다. 예를 들어, 임의의 H5, H2, H9, H7 또는 H6 균주(들)를 포함하는 일가 인플루엔자 면역원성 조성물은 상기 드리프트 균주에 의한 후속적인 백신접종시 또는 감염시에 범유행성 변이체, 즉 상기 범유행성 균주(들)의 드리프트 균주에 대해 반응하는 더 높은 능력을 제공할 수 있다.
인플루엔자 백신에 의한 백신접종 후 교차-반응성 CD4 T-세포의 검출
전통적인 3가 인플루엔자 백신 투여 후(3주), 백신에 존재하는 것과 상동성인 항원성 균주 제제(전 바이러스 또는 스플리트 항원)(H3N2: A/파나마/2007/99, H1N1 : A/뉴 칼레도니아/20/99, B: B/샹동/7/97)에 반응하는 말초혈 CD4 T-세포의 빈도가 상당히 증가한다(실시예 III 참조). 빈도에서 필적할 만한 증가가 말초혈 CD4 T-세포가 드리프트된 균주로서 분류된 인플루엔자 균주(H3N2: A/시드니/5/97, H1N1 : A/베이징/262/95, B: B/야마나시/166/98)로 재자극되는 경우에 보여질 수 있다.
대조적으로, 말초혈 CD4 T-세포가 당해 숙련자에 의해 시프트 균주로서 분류된 인플루엔자 균주(H2N2: A/싱가폴/1/57, H9N2: A/홍콩/1073/99)로 재자극되는 경우, 백신접종 후 관찰될 수 있을 정도의 증가가 없다.
상동성인 인플루엔자 균주 및 드리프트된 인플루엔자 균주 둘 모두를 인지할 수 있는 CD4 T-세포는 본 명세서에서 "교차-반응성"으로 명명된다. 본원에 기술된 애주번트 첨가된 인플루엔자 조성물은, 드리프트된 인플루엔자 균주에 대해 교차-반응성이 관찰가능한 정도이기 때문에 이형서브타입 교차 반응성을 나타낼 수 있었다. 상기와 같이, 드리프트 범유행성 균주에 대해 유효한 범유행성 백신 제형의 능력은 범유행성의 경우에 중요한 특징으로 입증될 수 있다.
상기 관찰과 일관되게, 상이한 인플루엔자 균주에 의해 공유되는 CD4 T-세포 에피토프가 사람에게서 확인되었다[참조: Gelder C et al. 1998, lnt Immunol. 10(2):211-22; Gelder CM et al. 1996 J Virol. 70(7):4787-90; Gelder CM et al. 1995 J Virol. 1995 69(12):7497-506].
청구된 조성물은 이의 면역원성으로 인해, 범유행성의 개시에 더 잘 대비하기 위해 범유행성-전 백신을 비축하는 것을 포함하여, 인간 인플루엔자 범유행성의 위협에 대한 사전활성 백신접종 전략을 수립할 수 있을 것이다.
구체적으로, 범유행성-전 백신은 조류 집단에서 현재 순환되는 것들과 유사한 H5N1 (조류 독감)의 균주를 이용하여, 예를 들어 역 유전학의 이용을 통해 생성된 것이다. 범유행성-전 백신에 반응하여 발생된 면역성이, 면역계가 대비하여 '프라이밍'되거나 '육성(educated)'되도록 할 것이므로 실제 범유행성 바이러스 균주와 만난 후 보호성 면역 반응의 보다 신속한 전개를 가능하게 하며, 이것은 인플루엔자의 관련 범유행성 균주에 감염될 가능성을 감소시킨다. 일단, 범유행성이 WHO에 의해 선언되고 최종 범유행성 균주가 동정되면 (이것이 드리프트 균주가 됨), 범유행성-전 백신도 후자가 유효할 때 범유행성 백신에 대한 더욱 신속한 면역 반응을 허용할 것이다.
특정 구체예에서, 애주번트 첨가된 조성물은 최근 입수할 수 있는 백신이 효능이 전혀 없는 헤마글루티닌(항원성 시프트)에서 약간의 변화(예컨대, 두개의 상이한 종 간의 유전자 재조합)가 일어난 순환 균주에 대해 보다 우수한 보호능을 제공하는 추가의 이점을 제공할 수 있다.
기타 애주번트
상기 조성물은 추가의 애주번트, 특히 TRL-4 리간드 애주번트, 적합하게는 지질 A의 비독성 유도체를 포함할 수 있다. 적합한 TRL-4 리간드는 3 데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)이다. 그 밖의 적합한 TRL-4 리간드는 리포폴리사카라이드(LPS) 및 유도체, MDP(무라밀 디펩티드) 및 RSV의 F 단백질이다.
일 구체예에서, 조성물은 톨형 수용체(TLR) 4 리간드, 예컨대 지질 A의 비독성 유도체, 특히 모노포스포릴 지질 A, 또는 보다 특히 3-데아실화 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)를 추가로 포함할 수 있다.
3D-MPL은 코릭사 코포레이션(Corixa corporation), 현재 GSK에 의해 상표 MPL® (본원에서 MPL)로 시판되고 있으며, 주로 IFN-γ(Th1) 표현형과의 CD4+ T 세포 반응을 촉진한다. 3D-MPL은 GB 2 220 211 A에 기술된 방법에 따라 제조될 수 있다. 화학적으로는, 3D-MPL은 3-데아실화 모노포스포릴 지질 A와 3, 4, 5 또는 6 아실화 사슬의 혼합물이다. 특히, 본 발명의 조성물에서는 소입자 3D-MPL이 사용된다. 소입자 3D-MPL은 0.22㎛ 필터를 통해 살균 여과될 수 있도록 하는 입자 크기를 갖는다. 이러한 제제는 WO 94/21292 및 실시예 II에 기술된다.
3D-MPL은 예를 들어, 조성물 용량 당 1 내지 100μg(w/v), 바람직하게는 조성물 용량 당 10 내지 50μg(w/v)의 양으로 사용될 수 있다. 3D-MPL의 적합한 양은 예를 들어, 조성물 용량 당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 μg(w/v) 중 어느 하나이다. 보다 바람직하게는, 3D-MPL의 양은 조성물 용량 당 25 내지 75μg(w/v)의 범위이다. 보통, 조성물 용량은 약 0.5 ml 내지 약 1 ml의 범위일 것이다. 일반적인 백신 투여량은 0.5 ml, 0.6 ml, 0.7 ml, 0.8 ml, 0.9 ml 또는 1 ml이다. 바람직한 구체예에서, 3D-MPL의 50㎍의 최종 농도가 백신 조성물 ml 당 함유되거나, 0.5ml 백신 용량 당 25㎍이 함유된다. 다른 바람직한 구체예에서, 3D-MPL의 35.7㎍ 또는 71.4㎍의 최종 농도가 백신 조성물 ml 당 함유된다. 특히, 0.5ml 백신 투여 부피는 용량 당 25㎍ 또는 50㎍의 3D-MPL을 함유한다.
MPL의 용량은 적합하게는 사람의 항원에 대한 면역 반응을 증진시킬 수 있다. 특히, 적합한 MPL 양은 애주번트 비첨가 조성물과 비교하거나, 다른 MPL 양으로 애주번트 첨가된 조성물과 비교하여 반응원성 프로필로부터 입수될 수 있으면서 조성물의 면역학적 효능을 개선시키는 양이다.
지질 A의 합성 유도체는 공지되어 있으며, 일부는 TLR-4 효능제로서 기술되고, 하기를 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다.
OM174 (2-데옥시-6-o-[2-데옥시-2-[(R)-3-도데카노일옥시테트라-데카노일아미노]-4-o-포스포노-β-D-글루코피라노실]-2-[(R)-3-히드록시테트라데카노일아미노]-α-D-글루코피라노실디히드로겐포스페이트), (WO 95/14026)
OM 294 DP (3S, 9R)-3-[(R)-도데카노일옥시테트라데카노일아미노]-4-옥소-5-아자-9(R)-[(R)-3-히드록시테트라데카노일아미노]데칸-1,10-디올,1,10-비스(디히드로게노포스페이트)(WO 99/64301 및 WO 00/0462)
OM 197 MP-Ac DP (3S-, 9R)-3-[(R)-도데카노일옥시테트라데카노일아미노]-4-옥소-5-아자-9-[(R)-3-히드록시테트라데카노일아미노]데칸-1,10-디올,1-디히드로게노포스페이트 10-(6-아미노헥사노에이트)(WO 01/46127)
다른 적합한 TLR-4 리간드는 예를 들어 리포폴리사카라이드 및 이의 유도체, 무라밀 디펩티드(MEP) 또는 호흡기 합포체 바이러스의 F 단백질이다.
본 발명에 사용하기 위한 또 다른 적합한 면역자극제는 쿠일(Quil) A 및 이의 유도체이다. 쿠일 A는 남아메리카에 자생하는 퀴라자 사포나리아 모리나(Quillaja saponaria Molina) 나무로부터 분리된 사포닌 제제이며, 애주번트 활성을 갖는 것으로 1974년 달스가드(Dalsgaard) 등("Saponin adjuvants", Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p243-254)에 의해 처음으로 기술되었다. 쿠일 A와 관련된 독성 없이 애주번트 활성을 보유한 쿠일 A의 정제된 단편(EP 0 362 278), 예를 들어 QS7 및 QS21(또한 QA7 및 QA21로서 공지되어 있음)이 HPLC에 의해 단리되었다. QS-21은 퀴라자 사포나리아 모리나의 껍질로부터 유래된 천연 사포닌이며, 이는 CD8+ 세포독성 T 세포(CTL), Th1 세포 및 현저한 IgG2a 항체 반응을 유도하며, 본 발명의 내용상 바람직한 사포닌이다.
특히 바람직한 QS21의 특정 제형이 기술되었으며, 이러한 제형은 추가로 스테롤을 포함한다(WO 96/33739). 본 발명의 사포닌 형성부는 수중유 에멀젼의 형태로 존재할 수 있다(WO 95/17210)
재백신접종 및 재백신접종에 사용되는 조성물( 부스팅 조성물)
본 발명의 일 측면은 본원에 정의된 일가 인플루엔자 조성물, 또는 본원에 정의된 수중유 에멀젼 애주번트로 제형화된 변이체 인플루엔자 균주를 포함하는 일가 인플루엔자 조성물로 이미 백신접종된 사람을 재백신접종하기 위한 인플루엔자 면역원성 조성물의 제조시 인플루엔자 항원의 용도를 제공한다.
일반적으로, 재백신접종은 일차 백신접종 후 적어도 6개월 후, 바람직하게는 8개월 내지 14개월 후, 보다 바람직하게는 대략 10 내지 12개월 후에 이루어진다.
재백신접종을 위한 면역원성 조성물(부스팅 조성물)은 불활성화되거나 재조합 또는 생 약독화된 임의의 유형의 항원 제제를 함유할 수 있다. 일차 백신접종에 사용된 면역원성 조성물로서, 동일한 유형의 항원 제제, 즉 스플리트 인플루엔자 바이러스 또는 이의 스플리트 인플루엔자 바이러스 항원성 제제, 전 비리온, 정제된 HA 및 NA(서브유닛) 백신 또는 비로좀을 함유할 수 있다. 다르게는, 부스팅 조성물은 일차 백신접종에 사용된 것과는 다른 타입의 인플루엔자 항원, 즉, 스플리트 인플루엔자 바이러스, 또는 이의 스플리트 인플루엔자 바이러스 항원성 제제, 전 비리온, 정제된 HA 및 NA(서브유닛) 백신 또는 비로좀을 함유할 수 있다. 적합하게는 스플리트 바이러스 또는 전 비리온 백신이 이용된다.
따라서, 일 구체예에서, 본 발명은 본원에 정의된 일가 범유행성 면역원성 조성물로 이미 백신접종된 사람을 재백신접종하기 위한 면역원성 조성물의 제조에서 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제제의 용도를 제공한다.
부스팅 조성물은 애주번트 첨가되거나 애주번트 첨가되지 않을 수 있다. 일 구체예에서, 재백신접종을 위한 조성물은 애주번트 첨가되지 않으며, 적합한 인플루엔자 시즌의 WHO 권장 균주로부터 제조된 세 개의 불활성화된 스플리트 비리온 항원을 함유하는 전통적인 인플루엔자 백신이고, 예컨대 근내 투여되는 플루아릭스(Fluarix)™/α-릭스(Rix)®/인플루스플리트(Influsplit)®일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 재백신접종을 위한 조성물은 애주번트 첨가된다. 바람직하게는, 부스팅 조성물이 수중유 에멀젼 애주번트, 특히 대상가능한 오일, 스테롤 또는 토코페롤, 예컨대 알파 토코페롤, 및 에멀젼화제를 포함하는 수중유 에멀젼 애주번트를 포함한다. 구체적으로, 상기 수중유 에멀젼 애주번트는 하나 이상의 대사가능한 오일을 총 부피의 0.5% 내지 20%의 양으로 포함하고 70세기% 이상이 1㎛ 미만의 직경을 갖는 오일 점적을 지닌다. 대안적으로, 부스팅 조성물은 수산화알루미늄 또는 인산알루미늄 또는 둘 모두의 혼합물인 명반(alum) 애주번트를 포함한다.
일 구체예에서, 일차 백신접종은 본원에 정의된 범유행성 인플루엔자 조성물, 적합하게는 스플리트 인플루엔자 조성물로 수행되고, 재백신접종은 하기와 같이 수행된다.
특정 구체예에서, 재백신접종을 위한 면역원성 조성물은 일차 백신접종에 사용된 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제제와 공통되는 CD4 T-세포 에피토프를 공유하는 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제제를 함유한다. 공통되는 CD4 T 세포 에피토프는 동일한 CD4 세포에 의해 인지될 수 있는 상이한 항원으로부터의 펩티드/서열/에피토프를 의미하는 것으로 의도된다[에피토프가 기술되어 있는 참조예: Gelder C et al. 1998, lnt Immunol. 10(2):211-22; Gelder CM et al. 1996 J Virol. 70(7):4787-90; Gelder CM et al. 1995 J Virol. 1995 69(12):7497-506].
본 발명에 따른 구체예에서, 부스팅 조성물은 범유행성과 관련되거나 범유행성과 관련될 가능성이 있는 인플루엔자 균주를 포함하는 일가 인플루엔자 조성물이다. 적합한 균주는 H5N1, H9N2, H7N7, H2N2, H7N1 및 H1N1이나, 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 균주는 일차 백신접종에 이용된 조성물에 제공된 것 또는 제공된 것들 중 하나와 동일할 수 있다. 대안적인 구체예에서, 상기 균주는 일차 백신접종에 이용된 조성물에 제공된 균주의 변이체 균주, 즉 드리프트 균주일 수 있다.
또 다른 특정 구체예에서, 재백신접종을 위한 조성물은 다가 인플루엔자 백신이다. 특히, 부스팅 조성물이 이가, 삼가 또는 사가 백신과 같은 다가 백신일 때, 하나 이상의 균주가 범유행성과 관련되거나 범유행성과 관련될 가능성이 있다. 특정 구체예에서, 부스팅 조성물 중 둘 이상의 균주가 범유행성 균주이다. 또 다른 특정 구체예에서, 부스팅 조성물 중 하나 이상의 범유행성 균주가 일차 백신접종을 위해 사용된 조성물에 존재하는 것 또는 존재하는 것들 중 하나와 동일한 유형이다. 대안적인 구체예에서, 하나 이상의 균주는 일차 백신접종에 이용된 조성물에 존재하는 하나 이상의 범유행성 균주의 변이체 균주, 즉 드리프트 균주일 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면에서, 일차 인플루엔자 균주의 변이체인 인플루엔자 균주에 의해 야기된 인플루엔자 감염에 대한 보호를 위해, 본원에 정의된 면역원성 조성물의 제조에서 일차 범유행성 인플루엔자 균주로부터의 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제제의 용도가 제공된다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면에서, 일차 인플루엔자 균주의 변이체인 인플루엔자 균주에 의해서 야기된 인플루엔자 감염에 대한 보호를 위한, 본원에 정의된 면역원성 조성물의 제조에서, (a) 일차 인플루엔자 균주로부터의 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제제, 및 (b) 본원에 정의된 수중유 에멀젼 애주번트의 용도가 제공된다.
재백신접종을 위한 조성물을 애주번트 첨가되거나 첨가되지 않을 수 있다.
일반적으로, 사용되는 부스팅 조성물은 다음 인플루엔자 시즌, 예를 들어 제 1 면역원성 조성물 접종 후 대략 1년 경에 제공된다. 또한, 부스팅 조성물은 다음 해 마다(3차, 4차, 5차 백신접종 등) 제공될 수 있다. 부스팅 조성물은 일차 백신접종에 사용된 조성물과 동일할 수 있다. 적합하게는, 부스팅 조성물은 일차 백신접종에 사용된 인플루엔자 바이러스의 변이체 균주인 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제제를 함유한다. 특히, 인플루엔자 바이러스 균주 또는 이의 항원성 제제는 재백신접종의 해에 순환하는 인플루엔자 균주에 적합하도록 세계 보건 기구에 의해 분배된 기준 물질에 따라 선택된다. 일차 백신접종은 범유행성의 선언시에 수행되고 재백신접종은 그 이후에 수행되는 것이 적합하다. 적합하게는, 재백신접종은 일차 백신접종에 사용된 것(예컨대, H5N1 베트남)과 동일한 아형인 인플루엔자 균주 (예컨대, H5N1 베트남)을 포함하는 백신으로 수행된다. 특정 구체예에서, 재백신접종은 동일한 아형의 드리프트 균주, 예컨대 H5N1 인도네시아로 수행된다. 또 다른 구체예에서, 재백신접종에 이용된 상기 인플루엔자 균주는 시프트 균주이며, 즉 일차 백신접종에 이용된 것과 상이하고, 예컨대 H5N2 (H5N1과 동일한 HA 아형이나 상이한 NA 아형) 또는 H7N1 (H5N1과 상이한 HA 아형이나 동일한 NA 아형)과 같이 상이한 HA 또는 NA 아형을 지닌다.
재백신접종에 사용되는 인플루엔자 항원 또는 항원성 조성물은 적합하게는 상기 기술된 바와 같은 애주번트 또는 수중유 에멀젼을 포함하는 것이 바람직하다. 애주번트는 임의로 TLR-4 리간드, 예컨대 3D-MPL 또는 사포닌과 같은 추가의 애주번트를 함유하는, 상기 본원에 기술된 바와 같은 수중유 에멀젼 애주번트이거나(이것이 바람직하다), 명반(alum) 또는 명반 대안물, 예컨대 폴리포스파젠과 같은 또 다른 적합한 애주번트일 수 있다.
바람직하게는, 재백신접종은 하기 중 어느 것들, 바람직하게는 두 개 또는 전부를 유도한다; 애주번트 비첨가 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제제로 일차 백신접종된 후에 유도된 해당 반응과 비교하여, (i) 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제제에 대해 개선된 CD4 반응, (ii) 개선된 B 세포 기억 반응, 또는 (iii) 개선된 체액 반응. 바람직하게는, 본원에 정의된 바와 같은 애주번트 첨가된 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제제로 재백신접종된 후 유도된 면역학적 반응은 애주번트 비첨가 조성물로 재백신접종된 후에 유도된 상응하는 반응에 비해 더 높다. 바람직하게는, 애주번트 비첨가된, 바람직하게는 스플리트 인플루엔자 바이러스로 재백신접종된 후 유도된 면역학적 반응은 애주번트 비첨가된, 바람직하게는 스플리트 인플루엔자 조성물로 일차 백신접종된 집단에서의 상응하는 반응보다 애주번트 첨가된, 바람직하게는 스플리트 인플루엔자 조성물로 일차 백신접종된 집단에서 더 높다.
출원인이 입증한 바와 같이, 상기 정의된 바와 같이, 대사가능한 오일, 알파 토코페롤과 같은 스테롤 또는 토코페롤 및 에멀젼화제를 포함하는 수중유 에멀젼 애주번트 및 인플루엔자 바이러스를 포함하는 부스팅 조성물로의 피검체의 재백신접종은 애주번트 비첨가 조성물로 일차 백신접종되고, 애주번트 비첨가 조성물로 부스팅된 집단 군에서의 상응하는 값보다 높은 항체 역가를 보여줄 것이다. 재백신접종에 대한 항체 반응을 증진시킴에 있어서 애주번트의 효과는 인플루엔자 바이러스에 의한 감염 또는 백신접종에 대해 낮은 반응을 갖는 것으로 알려진 중장년층 집단에서 특히 중요하다. 또한, 애주번트 첨가된 조성물과 관련된 이점은 재백신접종 후 CD4 T-세포 반응을 개선시킨다는 점에서 두드러진다.
본 발명의 애주번트 첨가된 조성물은 대조군 백신에 의해 부여된 보호능과 비교하여 드리프트된 균주(다음 인플루엔자 시즌으로부터의 인플루엔자 균주)에 대해 보다 우수한 교차-반응성을 유도할 수 있다. 상기 교차-반응성은 애주번트 비첨가 제형으로 얻어지는 것과 비교하여 보다 높은 지속성을 나타내었다. 드리프트된 균주에 대한 교차-반응성을 향상시키는데 있어서 애주번트의 효과는 범유행성 상태에서 중요하다.
추가의 구체예에서, 본 발명은 일차 백신접종을 잠재적으로 범유행성을 야기할 수 있었던 인플루엔자 균주를 함유하는 인플루엔자 조성물, 적합하게는 스플리트 인플루엔자 조성물로 수행하고, 재백신접종을 범유행성 균주 또는 전통적인 균주인 하나 이상의 순환 균주를 포함하는 일가 또는 다가 조성물로 수행하는 백신접종 요법에 관한 것이다.
HA 에서의 CD4 에피토프
본 항원성 드리프트는 바이러스 표면 단백질인 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미디다제(NA)의 에피토프 영역에 주로 존재한다. 숙주 면역 시스템의 적응성 반응을 회피하는 바이러스에 의해 사용되는, 상이한 인플루엔자 균주 간의 CD4 및 B 세포 에피토프에서의 어떠한 차이점도 인플루엔자 백신접종에 중요한 역할을 할 것이다.
상이한 인플루엔자 균주에 의해 공유되는 CD4 T-세포 에피토프가 사람에게서 확인되었다[참조예: Gelder C et al. 1998, lnt Immunol. 10(2):211-22; Gelder CM et al. 1996 J Virol. 70(7):4787-90; and Gelder CM et al. 1995 J Virol. 1995 69(12):7497-506].
특정 구체예에서, 재백신접종은 일차 백신접종에 사용된 인플루엔자 바이러스 항원 또는 이의 항원성 제제와 공통되는 CD4 T-세포 에피토프를 공유하는 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제제를 함유하는 부스팅 조성물을 사용함으로써 이루어진다. 따라서, 본 발명은 추가로 부스팅 투여량으로서 일차 백신접종에 제공된 투여량의 범유행성 인플루엔자 바이러스 항원 또는 이의 바이러스 항원성 제제와 공통되는 CD4 T-세포 에피토프를 공유하는 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제제를 포함하는 다중용량 백신의 일차 백신접종-성분의 제조시, 범유행성 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제제 및 수중유 에멀젼 애주번트, 특히 대사가능한 오일, 알파 토코페롤과 같은 스테롤 또는 토코페롤 및 에멀젼화제를 포함하는 수중유 에멀젼 애주번트를 포함하는 면역원성 조성물의 용도에 관한 것이다.
백신접종 수단
본 발명의 조성물은 피내, 점막, 예를 들어, 비강, 경구, 근내 또는 피하와 같은 임의의 적합한 전달 경로에 의해 투여될 수 있다. 그 밖의 전달 경로가 당해 널리 공지되어 있다.
근내 전달 경로가 애주번트 첨가된 인플루엔자 조성물에 바람직하다. 본 발명에 따른 조성물은 범유행성 백신에 특히 적합한 단일용량 컨테이너 또는 대안적으로 다중용량 컨테이너로 제공될 수 있다. 이 경우, 티오메르살(thiomersal)과 같은 항균 보존제가 사용 동안의 오염을 방지하기 위해 통상적으로 존재한다. 5 ㎍/0.5 ml 용량 (즉, 10 ㎍/ml) 또는 10 ㎍/0.5 ml 용량 (즉, 20 ㎍/ml)의 티오메르살 농도가 적합하다. 바늘이 없는 액체 젯 주사 장치와 같은 적합한 IM 전달 장치, 예를 들어 바이오젝터 2000 (Bioject, Portland, OR)을 이용할 수 있었다. 다르게는, 에피네프린의 앳-홈(at-home) 전달에 이용되는 것과 같은 펜(pen)-인젝터 장치를 백신의 자가 투여를 위해 이용할 수 있었다. 이러한 전달 장치의 이용은 범유행성 동안 요구될 대규모 면역화 캠페인에 특히 적합할 수 있다.
피내 전달이 또 다른 적합한 경로이다. 임의의 적합한 기구, 예를 들어, US 4,886,499, US 5,190,521, US 5,328,483, US 5,527,288, US 4,270,537, US 5,015,235, US 5,141,496, US 5,417,662에 기술된 것과 같은 숏 니들(short needle) 기구가 피내 전달에 사용될 수 있다. 피내 백신은 또한 본원에 참고 문헌으로 인용되는 WO 99/34850 및 EP 1092444에 기술된 것들과 같이, 피부에 침투되는 효과적인 니들 길이를 제한하는 기구 및 이의 기능적 등가물에 의해 투여될 수도 있다. 또한, 액체 젯트 인젝터를 통해 또는 각질층을 뚫어 진피에 이르는 젯트를 생성하는 니들을 통해 진피에 액체 백신을 전달하는 젯트 주사 기구가 적합하다. 젯트 주사 기구는 예를 들어, US 5,480,381, US 5,599,302, US 5,334,144, US 5,993,412, US 5,649,912, US 5,569,189, US 5,704,911, US 5,383,851, US 5,893,397, US 5,466,220, US 5,339,163, US 5,312,335, US 5,503,627, US 5,064,413, US 5,520,639, US 4,596,556, US 4,790,824, US 4,941,880, US 4,940,460, WO 97/37705 및 WO 97/13537에 기술되어 있다. 또한, 분말 형태의 백신을 피부의 외층을 통해 진피로 가속화시키기 위해 압축 기체를 사용하는 탄도 분말/입자 전달 기구가 적합하다. 또한, 통상적인 주사기가 피내 투여의 전통적인 망토우(mantoux) 방법에서 사용될 수 있다.
또 다른 적합한 투여 경로는 피하 경로이다. 임의의 적합한 기구, 예를 들어, 전통적인 니들이 피하 전달에 사용될 수 있다. 바람직하게는, WO 01/05453, WO 01/05452, WO 01/05451, WO 01/32243, WO 01/41840, WO 01/41839, WO 01/47585, WO 01/56637, WO 01/58512, WO 01/64269, WO 01/78810, WO 01/91835, WO 01/97884, WO 02/09796, 및 WO 02/34317에 개시된 바와 같은 니들 부재 젯트 주입 서비스가 사용된다. 보다 바람직하게는, 이러한 기구는 액체 백신 제형으로 미리 충전된다.
다르게는, 백신은 비강내 투여된다. 일반적으로, 백신은 바람직하게는 폐에 흡입되지 않으면서 비인두 면적(nasopharyngeal area)에 국부적으로 투여된다. 폐에 도입되지 않거나, 실질적으로 도입되지 않으면서 비인두 면적에 백신 제형을 전달하는 비강 전달 기구를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명에 따른 백신의 비내 투여를 위해 바람직한 기구는 분무 기구이다. 통상적으로 이용할 수 있는 적합한 비강 분무 기구는 아쿠스프레이(Accuspray)™(Becton Dickinson)를 포함한다. 분무기(nebuliser)는 폐에 쉽게 흡입될 수 있어 비강 점막에는 효과적으로 도달하지 않는 매우 미세한 분무를 생성한다. 그러므로, 분무기는 바람직하지 않다.
비내 사용하기에 바람직한 분무 기구는 기구의 성능이 사용자에 의해 가해지는 압력에 의존하지 않는 기구이다. 이러한 기구는 압력 역치 기구(pressure threshold device)로서 공지되어 있다. 액체는 역치 압력이 가해지는 경우에만 노즐로부터 방출된다. 이러한 기구는 규칙적인 점적 크기를 갖는 분무를 용이하게 달성하도록 한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 압력 역치 기구는 당해 공지되어 있으며, 예를 들어 본원에 참고문헌으로 인용되는 WO 91/13281 및 EP 311 863에 기술되어 있다. 이러한 기구는 파이퍼 게엠바하(Pfeiffer GmbH)로부터 통상적으로 입수할 수 있으며, 또한 문헌(Bommer, R. Pharmaceutical Technology Europe, Sept 1999)에 개시되어 있다.
바람직한 비내 기구는 1 내지 200㎛, 바람직하게는 10 내지 120㎛ 범위의 점적(액체로서 물을 사용하여 측정함)을 생성한다. 10㎛ 미만의 경우, 흡입 위험이 있으므로, 10㎛ 미만의 점적은 약 5% 이하인 것이 바람직할 수 있다. 120㎛ 초과의 점적 뿐만 아니라 보다 작은 점적은 확산되지 않으므로, 120㎛를 초과하는 점적은 약 5% 이하인 것이 바람직할 수 있다.
이중-용량 전달(Bi-dose delivery)이 본 발명에 따른 백신과 사용하기 위한 비내 전달 시스템의 추가의 바람직한 특징이다. 이중-용량 기구는 단일 백신 투여량의 두개의 서브-용량, 즉, 각 콧구멍에 투여하기 위한 하나의 서브-용량을 함유한다. 일반적으로, 두개의 서브-용량은 단일 챔버에 존재하며, 기구의 구성이 한번에 단일 서브-용량의 전달을 효과적이게 한다. 다르게는, 본 발명에 따른 백신을 투여하기 위해 단일용량 기구가 사용될 수 있다.
다르게는, 상피 또는 경피 백신 접종 경로 또한 본 발명에 고려될 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 일차 투여를 위한 애주번트 첨가된 면역원성 조성물은 근내 제공될 수 있으며, 애주번트 첨가되거나 비첨가된 부스팅 조성물은 상이한 경로, 예를 들어, 피내, 피하 또는 비내를 통해 투여될 수 있다. 또 다른 특정 구체예에서, 일차 투여를 위한 조성물은 범유행성 인플루엔자 균주 당 15㎍ 미만의 HA 양을 함유할 수 있으며, 부스팅 조성물은 표준 양인 15㎍을 함유하거나, 적합하게는 적은 양의 HA, 즉 15㎍ 미만의 HA를 함유할 수 있으며, 투여 경로에 따라 보다 적은 용량으로 투여될 수 있다.
백신접종을 위한 개체군
백신접종을 위한 표적 집단은 건강한 성인 (예컨대, 18-60세), 노인 (통상적으로 60세가 넘음) 또는 유아/소아와 같은 전체 집단이다. 표적 집단은 특히 면역 약화될 수 있다. 면역-약화된 사람은 일반적으로 건강한 성인과 비교하여 항원, 특히 인플루엔자 항원에 대해 덜 반응할 수 있다.
본 발명에 따른 일 측면에서, 표적 집단은 나이브(예를 들어, 범유행성 균주를 경험한 적 없음)이거나, 인플루엔자 감염 또는 백신접종에 대해 이전에 반응한 적이 없는, 인플루엔자에 대해 프라이밍되지 않은 집단이다. 바람직하게는, 표적 집단은 적어도 60세, 또는 65세 이상의 노인, 보건 연구소에서 일하는 사람들과 같은 보다 젊은 고위험 성인(즉, 18세 내지 60세), 또는 심혈관 및 폐 질환, 또는 당뇨병과 같은 위험 인자를 지닌 젊은 성인이다. 또 다른 표적 집단은 6개월 이상의 모든 어린이, 특히 상대적으로 높은 인플루엔자 관련 입원율을 경험한 6-23개월 된 소아이다.
백신접종 요법, 투여 및 효능 기준
적합하게는, 본 발명에 따른 면역원성 조성물은 대부분의 경우에 표준 0.5ml 주사가능한 투여량으로 존재하며, 일원 면역 확산법(SRD)(J.M. Wood et al.: J. Biol. Stand. 5(1997) 237-247; J.M. Wood et al., J. Biol. STand. 9(1981) 317-330)에 의해 측정시, 범유행성 인플루엔자 균주로부터 15㎍ 미만의 헤마글루티닌 항원 성분을 함유한다. 적합하게는, 백신 용량 부피는 0.5 ml 내지 1 ml이며, 특히 표준 백신 용량 부피는 0.5 ml, 또는 0.7 ml이다. 투여량 부피의 다소의 조정은 원래의 벌크 샘플 중 HA 농도 및 더 적은 용량이 비내 또는 피내 경로에 의해 제공됨에 따라 전달 경로에 의존하여 관례대로 이루어질 수 있다.
적합하게는, 상기 면역원성 조성물은 적은 투여량의 HA 항원, 예를 들어, 인플루엔자 균주당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14 ㎍중 어느 하나를 함유하며 균주 당 15㎍의 HA를 초과하지 않는다. 상기 적은 양의 HA는 하기 상세히 기술된 (표 1 및 개시된 특정 파라미터 참조) 효능에 대한 국제적인, 예컨대 EU 또는 FDA 기준을 충족하는 백신을 제형화할 수 있다면 실제로 실행할 수 있을 만큼 낮을 수 있다. 적은 양의 적합한 HA는 인플루엔자 균주당 1 내지 7.5㎍, 적합하게는 인플루엔자 균주당 3.5 내지 5㎍, 예컨대 인플루엔자 균주 당 3.75㎍ 또는 3.8㎍, 통상적으로 인플루엔자 균주 당 약 5㎍의 HA이다. 또 다른 적합한 양의 HA는 인플루엔자 균주 당 0.1 내지 5㎍, 적합하게는 인플루엔자 균주 당 1.0 내지 2㎍의 HA, 예컨대 인플루엔자 균주 당 1.9㎍의 HA이다.
유리하게는, 본 발명에 따른 백신 용량, 특히 낮은 HA 양 백신이, 일반적으로 용량 당 대략 0.5, 0.7 또는 1ml인, 통상적으로 주입되는 스플리트 flu 백신에 비해 적은 용량으로 제공될 수 있다. 본 발명에 따른 낮은 부피 용량은 용량 당 바람직하게는 500㎕ 미만, 통상적으로 300㎕ 미만, 적합하게는 약 200㎕ 이하 또는 그 미만이다.
따라서, 본 발명의 일 측면에 따른 바람직한 저 부피 백신 용량은 적은 부피의 낮은 항원 투여량, 예를 들어, 약 200㎕의 부피 중에서 약 15㎍ 또는 약 7.5㎍ HA 또는 약 3.0㎍ HA(균주당)을 갖는 용량이다.
본 발명의 인플루엔자 약제는 바람직하게는 백신에 대한 특정 국제 기준에 부합한다. 표준물질이 국제적으로 인플루엔자 백신의 효능을 측정하기 위해 사용된다. 혈청학적 변수는 인플루엔자 백신의 연례 라이센싱 절차와 관련된 임상 시험의 경우 인간 용도의 의약 제품을 평가하기 위한 유럽 당국의 기준에 따라 평가된다 (CHMP/BWP/214/96, Committe for Proprietary Medicinal Products (CPMP). Note for harmonization of requirements for influenza vaccines, 1997. CHMP/BWP/214/96 circular N°96-0666:1-22)(표 1). 요건들은 성인 집단 (60세 초과)에 대해 상이하다 (표 1). 범유행기 사이의 인플루엔자 백신의 경우, 평가치(혈청전환지수, 혈청전환율, 혈청보호율) 중 하나 이상이 백신에 포함된 인플루엔자의 모든 균주에 대하여 유럽 요건에 부합하여야 한다. 1:40이거나 이를 초과하는 역가의 비율은, 이러한 역가가 가장 양호한 상관관계의 보호인 것으로 예상되므로 가장 적합한 것으로 여겨진다 [Beyer W et al. 1998. Clin Drug Invest,; 15-1-12]
범유행성 인플루엔자 백신 마케팅 공인 적용을 위한 사건기록 구성 및 내용에대한 가이드라인 (CHMP/VEG/4717/03, April 5th 2004)에 특정된 대로, 비 순환 균주로부터 유도된 인플루엔자 백신에 대한 특정 기준의 부재시에, 범유행성 후보 백신은, 백신의 2회 투여 후, 프라이밍되지 않은 성인 또는 노인 피검체에서 현존하는 백신에 대한 현행 표준 중 적합하게는 세 개 모두를 충족시키기에 충분한 면역학적 반응을 (적어도) 유도할 수 있어야 한다.
본 발명의 조성물은 조성물에 포함된 범유행성 균주에 대하여 적어도 하나의 이러한 기준을 충족하는 것이 적합하고 (한 기준이 허가받기에 충분하다), 적합하게는 적어도 두 개, 또는 통상적으로 표 1에 개시된 보호에 대한 적어도 세 개 모두의 기준을 충족한다.
표 1 ( CHMP 기준)
18-60세 > 60세
혈청전환율* >40% >30%
전환지수** >2.5 >2.0
보호율*** >70% >60%
* 혈청전환율은 백신접종 후 보호 역가가 ≥1:40인 각 그룹에서의 피검체의 비율로서 정의된다. 간단히 표현된 혈청전환율은 백신접종 전 <1:10 및 백신접종 후 ≥1:40인 HI 역가를 지니는 피검체의 %이다. 그러나, 만약 초기 역가가 ≥1:10이라면, 백신접종 후 항체의 양에서 적어도 4배 이상 증가될 필요가 있다.
** 전환지수는 각 백신 균주에 대해 백신접종 후, 혈청 HI 기하 평균 역가(GMT)에서의 증가 배수로서 정의된다.
*** 보호율은 백신접종 전에 혈청음성이고 (보호성) 백신접종 후 HI 역가가 ≥1:40인 피검체의 비율 또는 백신접종 전에 혈청양성이고 백신접종 후 역가에 있어서 현저한 4배의 증가를 나타내는 피검체의 비율로서 정의되며; 이것은 일반적으로 보호능을 나타내는 것으로 인정된다.
70% 혈청보호율은 연례적인 시즌 인플루엔자 백신이 일반적으로 충족하여야 하는 세 개의 기준 중 하나인 유럽 건강 관리청 (CHMP - Committe for Medicinal Products for Human Use)에 의해 정의되며 CHMP는 또한 마주칠 범유행성 후보 백신을 예정하고 있다. 그러나, 수리적인 모델링은, 특정 드리프트된 균주에 대해 단지 30% 효능있는 백신이 범유행성의 크기를 감소시키는 것을 돕는데 유리할 것이라고 지적하였다 (Ferguson et al, Nature 2006).
FDA는 범유행성 인플루엔자 백신의 라이센스를 지지하는데 요구되는 임상 데이터에 대한 지침 초안(available from the Office of Communication, Training and Manufacturers Assistance (HFM-40), 1401 Rockville Pike, Suite 200N, Rockville, MD 20852-1448, or calling 1-800-835-4709 or 301-827-1800, or from the Internet at http://www.fda.gov.cber/guidelines.htm)을 발행하였고, 제안된 기준은 CHMP 기준에 준한 것이다. 적합한 종료점은 유사하게 하기를 포함한다: 1) ≥1:40의 HI 항체 역가를 달성하는 피검체의 퍼센트, 및 2) 백신접종 후 HI 항체 역가에 있어서 4배 상승으로 정의되는 혈청전환율. 기하 평균 역가(GMT)가 결과에 포함되어야 한다. 상기 평가의 포인트 견적의 이러한 데이터 및 95% 신뢰 구간(CI)이 제공되어야 한다.
따라서, 본 발명의 일 측면에서, 본원에 청구된 조성물, 방법 또는 용도가 제공되며, 여기서 면역 반응 또는 보호능은 인플루엔자 백신 효능에 대한 모든 세 개의 EU 관리 기준을 충족하는 예기된 범유행성 조성물을 투여함에 의해 유도되었다. 적합하게는, 하기 기준 중 적어도 하나, 적합하게는 둘, 또는 세 개의 기준이 조성물의 범유행성 균주에 대해 충족된다:
- 성인 개체군(18-60세), 및/또는 적합하게는 노인 개체군(>60세)에서 >50% , >60%, >70%, 적합하게는 >80% 또는 >90%의 혈청전환율;
- 성인 개체군(18-60세), 및/또는 적합하게는 노인 개체군(>60세)에서 >75% , >80%, >85%, 적합하게는 >90%의 보호율;
- 성인 개체군(18-60세), 및/또는 적합하게는 노인 개체군(>60세)에서 >4.0, >5.0 , >6.0, >7.0, >8.0, >9.0 또는 10 또는 10을 초과하는 전환지수.
특정 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물은 성인 개체군에서 >60%, 또는 >70%, 또는 적합하게는 >80%의 혈청전환율 및 >75%, 적합하게는 >80%의 보호율 둘 모두를 충족시킬 것이다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물은 성인 개체군에서 >5.0, 또는 >7.0 또는 적합하게는 >10.0의 전환지수 및 >60%, 또는 >70%, 또는 적합하게는 >80%의 혈청전환율 둘 모두를 충족시킬 것이다. 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물은 성인 개체군에서 >5.0, 또는 >7.0 또는 적합하게는 >10.0의 전환지수 및 >75%, 적합하게는 >80%의 보호율 둘 모두를 충족시킬 것이다. 여전히 또 다른 특정 구체예에서, 본 발명에 따른 조성물은 10.0 또는 이를 초과하는 전환지수, 80% 또는 이를 초과하는 혈청전환율, 및 80% 또는 이를 초과하는 보호율을 충족시킬 것이다.
또 다른 구체예에서, 청구된 백신은 드리프트된 균주에 대해 적어도 30%, 적합하게는 적어도 40%, 또는 드리프트된 균주에 대해 >50% 또는 >60%의 혈청보호율을 충족할 것이다. 적합하게는, 혈청보호율이 드리프트 균주에 대해 >70%, 또는 적합하게는 >80%일 것이다.
적합하게는 상기 임의의 기준 또는 모든 기준이 소아 및 임의의 면역-약화된 개체군과 같은 다른 개체군에 대해 충족된다.
적합하게는 상기 반응(들)이 1회 투여 후, 또는 통상적으로 2회 투여 후에 달성된다. 면역 반응이 애주번트 첨가된 백신의 단 1회 투여 후에 달성된다는 것이 청구된 조성물의 특별한 장점이다. 따라서, 본 발명의 일 측면에서, 인플루엔자에 대해 일-용량 백신접종을 위한 백신 조성물의 제조에서, 살아있지 않은(non-live) 범유행성 인플루엔자 바이러스 항원 제제, 특히 스플리트 인플루엔자 바이러스 제제의 용도가 제공되며, 여기서 일-용량 백신접종이 인플루엔자 백신에 대한 적어도 하나, 적합하게는 둘 또는 세 개의 국제 관리 요건을 충족하는 면역 반응을 생성한다. 또 다른 특정 구체예에서, 상기 일-용량 백신접종은 역시 또는 추가로 애주번트 비첨가 백신으로 수득된 것 보다 높은 CD4 T 세포 면역 반응 및/또는 B 세포 기억 반응을 발생시킨다. 특정 구체예에서, 면역 반응은 교차-반응성 항체 반응 또는 교차-반응성 CD4 T 세포 반응이거나 둘 모두이다. 특정 구체예에서, 인간 환자는 백신접종되는 균주에 대해 면역학적으로 나이브이다 (즉, 면역성이 이미 존재하지 않음). 구체적으로, 백신 조성물은 낮은 양의 HA 항원을 함유한다. 구체적으로, 백신 조성물은 본원에 정의된 바와 같다. 특히, 백신 조성물의 면역원성 특성이 본원에 정의된 대로이다. 적합하게는, 백신이 근내 투여된다.
재백신접종을 위한 조성물과 관련하여, 이것이 다가 조성물일 때, 상기 기준 중 적어도 두 개 또는 세 개 모두가 모든 균주, 특히 상이한 경로를 통해 전달되는 신규한 백신과 같은 새로운 백신에 대해 충족될 필요가 있을 것이다. 몇몇 경우에, 두 기준으로 충분할 수 있다. 예를 들어, 세 개의 기준 중 두 개가 모든 균주에 의해 충족되면서 세 번째 기준은 모든 균주가 아닌 일부(예컨대, 세 개의 균주 중 둘)에 의해 충족되는 것이 조건에 맞을 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 CD4+ T 세포 활성화를 통해 치유되거나 치료되는 것으로 공지된 질병의 백신을 설계하는 방법을 제공하며, 이 방법은
1) CD4+ T 에피토프를 함유하는 항원을 선택하고,
2) 상기 항원을 본원에서 정의된 바와 같은 수중유 에멀젼 애주번트와 조합시키는 것을 포함하며, 여기서 상기 백신을 상기 포유동물에게 투여시 백신은 포유동물에서 증진된 CD4 T 세포 반응을 유도할 수 있다.
특허 출원 및 등록 특허를 포함하는 본 출원의 모든 참고문헌의 교시내용은 본원에서 참고로 인용된다. 본 출원이 주장하는 우선권에 관한 임의의 특허 출원이, 간행물 및 참조문헌에 대해 본원에 개시된 방식으로, 그 전체로서 본원에 참조로서 포함된다.
명료하게 하기 위해, 본원에서 용어 '포함하는' 및 '포함한다'는 본 발명자에 의해 모든 경우에서 용어 '구성되는' 및 '구성된다'와 임의로 치환가능할 수 있는 것으로 의도된다.
본 발명은 하기 비제한적 실시예를 참조로 하여 추가로 기술될 것이다:
실시예 I은 흰족제비 및 인간 연구에 사용된 면역학적 판독 방법을 기술한 것이다.
실시예 II는 예시된 연구에 사용된 수중유 에멀젼 및 애주번트 제형의 제조 및 특성화를 기술한 것이다.
실시예 III은 흰족제비에서의 애주번트 첨가 및 애주번트 비첨가 인플루엔자 백신의 임상전 평가를 나타낸다.
실시예 IV는 범유행성 H5N1 균주로부터의 스플리트 인플루엔자 항원 제제 및 AS03 애주번트를 함유하는 백신을 이용한 연령이 18-60세인 성인 개체군에서의 임상 시험을 설명한다.
실시예 I - 면역학적 판독 방법
I.1. 흰족제비 방법
시즌 균주로 수행된 실험에 통상적으로 사용되는 적합한 방법이 하기에 제공된다. 숙련된 판독자는 사용된 인플루엔자 균주에 따라 일부 조정 또는 최적화가 필요할 수 있음을 이해할 것이다.
I.1.1. 헤마글루틴화 억제 시험( HI )
시험 절차
인플루엔자 바이러스 균주에 대한 항-헤마글루티닌 항체 역가를 헤마글루틴화 억제 시험(HI)을 사용하여 측정하였다. HI 시험의 이론은 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA)에 의한 특이적 항-인플루엔자 항체의 말 적혈구(RBC)의 헤마글루틴화 억제능에 기초한다. 혈청의 사전처리 후(콜레라, RED, 열 불활성화...), 혈청의 2배 희석물을 인플루엔자 균주의 4개의 헤마글루틴화 유닛과 함께 인큐베이션 하였다. 이후, 말(조정: 칠면조 또는 말) 적혈구를 첨가하고, 응집 억제능을 점수 매겼다. 헤마글루틴화를 완전히 억제한 혈청의 최고 희석율의 역수로서 역가를 표현하였다. 혈청의 최초 희석율이 1:10이었음에 따라, 검출불가능한 수준은 5와 동등한 역가로서 기록하였다. 보다 상세한 것은 하기 섹션 I.2.1에서 볼 수 있다.
I.1.2. 체온 모니터링
14일째에 케타민-롬푼-아트로핀 믹스(2.5%-0.25%-0.025%)를 이용한 마취하에 백색선에서 소 절개를 통해 복강으로 이식된 온도 센서(Star Oddi, Iceland)에 의해 체온을 기록하였다. 상처는 꿰매어 봉합하고 매일 조사하였다.
I.2.3. 바이러스 역가
인두, 코 및 직장 스왑을 모든 동물로부터 수집하였다. 개개 스왑을 3 ml의 바이러스 운반 배지 (VTM; 살균 PBS 또는 적합한 등장성 용액, 예컨대 항생제 (100 유닛/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신) 및 2% 우태아 혈청이나 0.5% 젤라틴을 함유하는 행크(Hank's) BSS)에 놓고 분석시까지 -80℃에서 저장하였다. 검시 후, 각 동물로부터의 오른쪽 폐의 머리등쪽, 머리배쪽, 꼬리배쪽 및 꼬리등쪽 섹션을 칭량하고 분석시까지 -80℃에서 저장하였다. 폐 섹션을 3 ml의 VTM에서 균질화하였다. 바이러스 역가를 H5N1-특이적인 TaqMan PCR 및 마딘 다비(Madine Darby) 개속 신장(MDCK) 세포에 대한 바이러스 역가 배양에 의해 결정하였다.
TaqMan PCR의 경우, 바이러스 H5N1 Flu RNA를 흰족제비 샘플로부터 추출한 다음, 인플루엔자 게놈의 보존된 영역에서 고안된 프로브 및 프라이머를 이용하여 정량적 RT-PCR 검정에 의해 증폭시켰다. 데이터를 대조 희석 유닛(CDU) 및 1 그램 의 폐 조직 또는 1 ml의 스왑에 대한 TCID50으로서 각각 표시하였다. 대조 희석 유닛을 연속 희석된 바이러스 원액으로부터 생성된 표준 곡선으로부터 결정하였고, 각 희석액은 시험 샘플과 동일한 방식으로 핵산 추출 및 Taqman PCR 증폭을 거친다.
바이러스 배양의 경우, 모든 샘플의 연속 희석액을 배지 및 MDCK 세포를 함유하는 미세역가 플레이트로 옮긴 다음 35℃에서 5-7일 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 바이러스 셰딩(shedding) 역가를 "리드 및 뮌크"에 의해 측정하고 1 그램의 폐 조직 또는 1 ml의 스왑에 대한 Log TCID50으로서 표시하였다.
I.1.4. 중화 항체 검정
중화 항체 측정을 해동되는 동결 혈청 샘플에 대해 수행하였다. 혈청내 함유된 항체에 의한 바이러스 중화를 마이크로중화 검정으로 측정하였다. 혈청을 추가 처리하지 않고 본 검정에 사용하였다. 각각의 혈청을 삼중으로 시험하였다. 표준화된 양의 바이러스를 일련의 혈청 희석액과 혼합하고, 바이러스에 항체가 결합하도록 인큐베이션하였다. 이후, 정해진 양의 MDCK 세포를 함유하는 세포 현탁액을 상기 바이러스와 항혈청의 혼합물에 첨가하고, 33℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 후, 바이러스 복제를 닭 적혈구의 헤마글루틴화에 의해 가시화하였다. 혈청의 50% 중화 역가를 리드 및 뮌크의 방법 (Am. J; Hyg. 1938, 27: 493-497)에 의해 계산하였다.
I.2. 사람의 면역 반응을 평가하기 위한 검정
I.2.1. 헤마글루틴화 억제 검정
면역 반응을 문헌(WHO Collaborating Centre for influenza, Centres for Disease Control, Altanta, USA(1991))에 기술된 방법을 사용하여 HI 항체를 측정함으로써 측정하였다.
항체 역가 측정은 4-헤마글루틴화 억제 유닛(4 HIU)의 적합한 항원 및 0.5% 가금(또는 H5N1에 대해 0.5% 가금 및 말) 적혈구 현탁액을 사용하는 표준화되고 포괄적으로 인증된 마이크로방법으로 해동되는 동결 혈청 샘플 상에서 수행하였다. 비특이적 혈청 억제제를 열처리 및 수용체-파괴 효소에 의해 제거하였다.
수득된 혈청을 HI 항체 수준에 대해 평가하였다. 초기 희석율 1:10으로 시작하여, 일련의 희석액(2배씩)을 최종 희석율 1:20480까지 제조하였다. 역가 종료점이 최고 희석 단계로서 선택되었으며, 헤모글루틴화의 완전한 억제(100%)를 보여주었다. 모든 검정을 중복하여 수행하였다.
H5N1 에 대한 조정
말 적혈구를 이용한 HI의 구체적인 설명:
당단백질(헤마글루티닌)이 바이러스 외피에 위치하여, 닭과 같은 다수의 종의 적혈구를 응집시킬 수 있다.
헤마글루틴화 억제 시험은 두 단계로 수행된다:
1. 항원-항체 반응: 인플루엔자 항원 (DTA, 투석 시험 항원)을 피검체 혈청의 항체와 반응시킨다.
2. 과도한 항원의 응집: 과도한 항원을 첨가된 적혈구와 반응시킨다.
말의 적혈구를 H5N1 범유행성 균주에 대하여 이용한다.
0.5% BSA(우태아 알부민, 최종 농도)를 함유하는 인산염 완충액 중 0.5% (최종 농도)의 말 적혈구 현탁액.
적혈구를 동일한 인산염 완충액으로 세척하고 후속적인 원심분리 단계 (10분, 2000 rpm)를 거침에 의해 상기 현탁액을 제조한다. 이러한 세척 단계는 일 회 반복되어야 한다.
말 적혈구의 낮은 침강율로 인해 말 적혈구를 환자/피검체 혈청 및 바이러스 현탁액의 반응 믹스에 첨가시킨 후, 플레이트를 실온에서 (RT, 20℃+/-2℃) 2시간 동안 인큐베이션해야 한다.
I.2.2. 뉴라미니다제 억제 검정
본 검정을 페투인(fetuin) 코팅된 마이크로역가 플레이트에서 수행하였다. 일련의 2배 희석액의 항혈청을 제조하고, 표준화된 양의 인플루엔자 A H3N2, H1N1 또는 인플루엔자 B 바이러스와 혼합하였다. 이 시험은 페투인으로부터 효소적으로 뉴라민산을 방출하는 뉴라미니다제의 생물학적 활성에 기초한다. 말단 뉴라민산의 분해 후, β-D-갈락토스-N-아세틸-갈락토사민이 드러났다. 갈락토스 구조에 특이적으로 결합하는 땅콩(Arachis hypogaea)으로부터의 호스래디시 퍼옥시다제(HRP)-표지된 땅콩 아글루티닌(peanut agglutinin)을 웰에 첨가하였다. 결합된 아글루티닌의 양을 검출하고, 테트라메틸벤지딘(TMB)과의 기질 반응으로 정량하였다. 바이러스 뉴라미니다제 활성을 여전히 50% 이상으로 억제하는 최고 항체 희석액을 표시하였으며, 이는 NI 역가이다.
I.2.3. 중화 항체 검정
중화 항체 측정을 해동되는 동결 혈청 샘플에 대해 수행하였다. 혈청내 함유되는 항체에 의한 바이러스 중화를 마이크로중화 검정으로 측정하였다. 혈청을 추가 처리하지 않고 본 검정에 사용하였다. 각각의 혈청을 삼중으로 시험하였다. 표준화된 양의 바이러스를 일련의 혈청 희석액과 혼합하고, 바이러스에 항체가 결합하도록 인큐베이션하였다. 이후, 정해진 양의 MDCK 세포를 함유하는 세포 현탁액을 상기 바이러스와 항혈청의 혼합물에 첨가하고, 33℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 후, 바이러스 복제를 닭 적혈구의 헤마글루틴화에 의해 가시화하였다. 혈청의 50% 중화 역가를 리드 및 뮌크의 방법 (Am. J; Hyg. 1938, 27: 493-497)에 의해 계산하였다.
I.2.4. 시토킨 유세포분류기(CFC)에 의한 세포 매개된 면역성 평가
말초혈 항원 특이적 CD4 및 CD8 T 세포는 시험관내에서 재자극되어 이들의 상응하는 항원과 인큐베이션될 경우, IL-2, CD40L, TNF-알파 및 IFN을 생성할 수 있다. 결과적으로, 항원 특이적 CD4 및 CD8 T 세포 뿐만 아니라 세포내 시토킨 생성은 세포 표현형의 통상적인 면역형광 표지 후에 유세포분류기에 의해 계수될 수 있다. 본 연구에서, 인플루엔자 백신 항원을 인플루엔자 특이적 T 세포를 재자극하기 위한 항원으로서 사용하였다. 결과는 CD4 또는 CD8 T 세포 아집단내 시토킨-포지티브 CD4 또는 CD8 T 세포의 빈도로서 표현되었다.
I.2.5. 엘리스폿(ELISPOT)에 의한 기억 B 세포
엘리스폿 기술은 주어진 항원에 특이적인 기억 B 세포의 정량을 가능하게 한 다. 기억 B-세포는 CpG와 5일 동안 배양 후에 시험관내에서 혈장 세포로 분화하도록 유도될 수 있다. 따라서 시험관내에서 생성된 항원-특이적인 혈장 세포는 엘리스폿 검정을 이용하여 열거될 수 있다. 간단히 말해, 시험관내 생성된 혈장 세포를 항원으로 코팅된 배양 플레이트에서 인큐베이션한다. 항원-특이적인 혈장 세포가 통상적인 면역-효소 절차에 의해 검출될 수 있는 항체/항원 스폿을 형성한다. 본 연구에서, 인플루엔자 백신 균주 또는 항-인간 면역글로불린을 이용하여 배양 플레이트를 코팅시킴으로써, 인플루엔자-특이적인 항체 또는 IgG 분비 혈장 세포를 각각 열거한다. 결과는 IgG-생성 혈장 세포내에서 인플루엔자-특이적인 항체를 분비하는 혈장 세포의 빈도로서 표시된다.
I.2.6. 통계적 방법
I.2.6.1. 일차 종료점
ㆍ 백신접종 이후의 7일 기간(즉, 백신접종일 및 이후 6일) 동안 및 전 기간 동안 요청된 국부적 및 전반적 징후 및 증상의 백신접종율, 세기 및 관련성
ㆍ 백신접종 이후의 21일 기간(즉, 백신접종일 및 이후 20일) 동안 및 전 기간 동안 요청된 국부적 및 전반적 징후 및 증상의 백신접종율, 세기 및 관련성
ㆍ 전 연구 동안에 심각한 부작용의 발생
I.2.6.2. 이차 종료점
체액 면역 반응의 경우:
관찰된 변수:
·0일 및 21일째: 백신(항-H1N1, 항-H3N2 및 항-B-항체)에서 나타난 3개의 인플루엔자 바이러스 균주 각각에 대해서 개별적으로 시험된 혈청 헤마글루틴화-억제 (HI) 및 NI 항체 역가
·0일 및 21일째: 백신에서 나타난 3개의 인플루엔자 바이러스 균주 각각에 대해서 개별적으로 시험된 중화 항체 역가.
유도 변수(95% 신뢰 구간):
·백신접종 전후에 95% 신뢰 구간(95% CI)을 지니는 혈청 HI 항체의 기하 평균 역가(GMT)
·21일째 95% CI에 의한 혈청전환율*
·21일째 95% CI에 의한 전환지수**
·21일째 95% CI에 의한 혈청보호율***
·모든 시점에서의 혈청 NI 항체 GMT(95% 신뢰 구간에 의한)
*각각의 백신 균주에 대해서 0일째에 비해 21일째 혈청 HI 역가에서 4배 이상의 증가를 보인 백신접종자의 백분율로 정의된 혈청전환율.
**각각의 백신 균주에 대해서 0일째에 비해 21일째 혈청 HI GMT에서 배수 증가로 정의된 전환지수.
***보호를 나타내는 것으로 일반적으로 받아들여지는 백신접종(각각의 백신 균주에 대해서) 후의 혈청 HI 역가=40인 백신접종자의 백분율로 정의되는 보호율.
세포 매개된 면역( CMI ) 반응의 경우
관찰된 변수
0일 및 21일째: 상이한 시험에서의 106당 시토킨-양성 CD4/CD8 세포의 빈도.
각각의 시험은 이하 기재된 항원에 대한 CD4/CD8 T 세포의 반응을 정량한다:
·펩티드 인플루엔자(pf) 항원(이들 항원의 정확한 특성 및 기원이 기재되고 설명되어야 한다)
· 스플리트 인플루엔자(sf) 항원
· 전체 인플루엔자(wf) 항원.
유도변수:
· 둘 이상의 상이한 시토킨을 생성하는 세포((CD40L, IL-2, IFNγ, TNFα)
· 적어도 CD4OL 및 또 다른 시토킨을 생성하는 세포(IL-2, TNFα, IFNγ)
· 적어도 IL-2 및 또 다른 시토킨을 생성하는 세포(CD40L, TNFα, IFNγ)
· 적어도 IFNγ 및 또 다른 시토킨을 생성하는 세포(IL-2, TNFα, CD40L)
· 적어도 TNFα 및 또 다른 시토킨을 생성하는 세포(IL-2, CD40L, IFNγ)
I.3.5.3. 면역원성 분석
면역원성 분석은 전체 백신접종된 코호트(cohort)를 기준으로 하였다. 각각의 처리군에 대해서, 다음 파라메터(95% 신뢰구간)가 계산되었다:
· 0일 및 21일째에서의 HI 및 NI 항체 역가의 기하 평균 역가(GMT)
· 0일 및 21일째에서의 중화 항체 역가의 기하 평균 역가(GMT)
· 21일째에서의 전환지수.
· 0일째에 비해서 21일째에서 4배 이상의 혈청 HI 역가 증가를 나타내는 백 신접종자의 백분율로 정의된 21일째에서의 혈청전환율(SC).
· 혈청 HI 역가=1:40인 백신접종자의 백분율로 정의된 21일째에서의 보호율.
· 반응에서의 CD4/CD8 T-림프구 분비의 빈도가 각각의 백신접종 그룹에 대해서, 각각의 시점(0일, 21일)에서 및 각각의 항원(펩티드 인플루엔자(pf), 스플리트 인플루엔자(sf) 및 전체 인플루엔자(wf))에 대해 요약(기술통계: descriptive statistics)되었다.
· 각각 5가지의 상이한 시험에서의 각각의 백신접종 그룹과 각각의 항원(pf, sf, 및 wf)에 대한 시점(후-전) 반응 사이의 개별적인 차이가 있는 기술통계.
· 비-파라메터 시험(크러스컬-월리스 시험: Kruskall-Wallis test)을 이용하여 3 그룹 사이의 위치 차이를 비교하고, 통계학적 p-값을 각각 5 가지의 상이한 시험에서 각각의 항원에 대해서 계산하였다. 모든 유의성 검사(significance test)는 양측검사(two-tailed)로 수행하였다. 0.05 미만 또는 이와 동일한 P-값은 통계적으로 유의한 값으로 고려하였다.
실시예 II - 수중유 에멀젼 및 애주번트 제형의 제조 및 특성화
달리 설명되지 않는 한, 후속되는 실시예에서 사용된 오일/물 에멀젼은 2 가지의 오일(알파-토코페롤 및 스쿠알렌)으로 제조된 유기상과 에멀젼화제로서 트윈 80을 함유하는 PBS의 수성상으로 구성된다. 달리 설명되지 않는 한, 후속되는 실시예에서 사용된 수중유 에멀젼 애주번트 제형은 다음 수중유 에멀젼 성분(최종 농 도)을 포함함으로써 제조되었다: 2.5% 스쿠알렌 (v/v), 2.5% 알파-토코페롤 (v/v), 0.9% 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트 (v/v) (트윈 80), 참조 WO 95/17210. 후속되는 실시예에서 ASO3으로 지칭되는 본 에멀젼을 다음과 같이 두배 농축물로서 제조하였다.
II.1. 에멀젼 SB62 의 제조
II.1.1. 실험실 제조
트윈 80은 인산염 완충된 염수(PBS)에 용해되어 PBS중의 2% 용액을 형성시킨다. 100ml의 2배 농축 에멀젼을 생성시키기 위해서, 5g의 DL 알파 토코페롤 및 5ml의 스쿠알렌을 와동시켜 완전히 혼합한다. 90ml의 PBS/트윈 용액을 첨가하고 완전히 혼합한다. 생성되는 에멀젼을 이어서 주사기를 통해서 전달하고 M11OS 미세유동공학적 장치를 이용함으로써 최종적으로 미세유동화시킨다. 생성되는 오일 점적은 약 120-180nm의 크기를 지닌다(PCS에 의해서 측정된 Z 평균으로 표현됨). 그 밖의 애주번트/항원 성분을 간단한 혼합으로 에멀젼에 첨가한다.
II.1.2. 대규모 제조
SB62 에멀젼의 제조는 소수성 성분(α-토코페롤 및 스쿠알렌)으로 구성된 오일상과 수용성 성분(트윈 80 및 PBS mod(mod: 변화됨), pH 6.8)을 함유하는 수성상을 강한 진탕하에 혼합함으로써 수행된다. 교반하면서, 오일상(전체 부피의 1/10)을 수성상(전체 부피의 9/10)에 옮기고, 혼합물을 15분 동안 실온에서 교반한다. 생성되는 혼합물을 이어서 미세유동화기(15000 PSI - 8 사이클)의 상호작용 챔버에서 전단, 충격 및 공동화 작용력에 가하여 미크론 이하 점적(100 내지 200nm 사이 에 분포)을 생성시킨다. 생성되는 pH는 6.8 ± 0.1이다. SB62 에멀젼을 이어서 0.22㎛ 막을 통해서 여과하여 무균화시키고, 무균 벌크 에멀젼을 2 내지 8℃에서 큐팩(Cupac) 컨테이너에 냉장 저장한다. 무균의 불활성 가스(질소 또는 아르곤)을 SB62 에멀젼 최종 벌크 컨테이너의 빈 공간에 15초 이상 동안 플러싱한다.
SB62 에멀젼의 최종 조성은 다음과 같다:
트윈 80: 1.8 % (v/v) 19.4 mg/ml; 스쿠알렌: 5 % (v/v) 42.8 mg/ml; α-토코페롤: 5 % (v/v) 47.5 mg/ml; PBS-mod: NaCl 121 mM, KCl 2.38 mM, Na2HPO4 7.14 mM, KH2PO4 1.3 mM; pH 6.8 ± 0.1.
II.2. 오일 점적 크기 측정 역학적 광 산란
II.2.1. 소개
오일 점적 직경의 크기는 하기 과정 및 하기 실험 조건하에서 측정된다. 점적 크기 측정은 세기 측정으로 주어지며, PCS에 의해서 측정된 z 평균으로 표현된다.
II.2.2. 샘플 제조
크기 측정은 수중유 에멀젼 애주번트: 대량 제조법에 따라 제조된 SB62, AS03 및 ASO3+MPL(50 ㎍/ml)에 대해서 수행되며, 마지막 두 개는 사용 직전에 제조된다. 샘플의 조성은 하기(참조 단락 II.2.4)되어 있다. 샘플은 PBS 7.4중에 4000x 내지 8000x로 희석되었다. 대조로서, PL-나노칼 입자(PL-Nanocal Particle) 크기 표준 100nm(cat n° 6011-1015)을 10mM NaCl에 희석시켰다.
II.2.3. 맬번 제타사이져 3000HS( Malvern Zetasizer 3000HS) 크기 측정
모든 크기 측정은 맬번 제타사이져 3000HS 둘 모두로 수행되었다. 샘플은 적합한 희석액(일반적으로 샘플 농도에 따라서 4000x 내지 20000x의 희석액으로)으로 맬번 분석을 위한 플라스틱 큐벳내로, 및 두 가지의 광학적 모델: 즉, - 0의 실제 입자 굴절지수 및 0의 허수(imaginary) 굴절지수, 또는 1.5의 실제 입자 굴절 지수 및 0.01의 허수 굴절 지수(문헌에서 밝혀진 값에 따라서 에멀젼에 대해 적용된 광학적 모델)로 측정하였다.
기술적 조건은 다음과 같다:
- 레이저 파장: 532 nm (Zeta3000HS),
- 레이저 파워: 50 mW (Zeta3000HS),
- 90°에서 검출된 산란광 (Zeta3000HS),
- 온도: 25°C,
- 기간: 소프트에 의한 자동 측정,
- 횟수: 3 회 연속 측정,
- z-평균 직경: 누적평가방법(cumulants analysis)에 의해서,
- 크기 분포: 콘틴(Contin) 또는 자동(Automatic) 방법에 의해서.
자동 맬번 알코리즘은 누적치, 콘틴 및 비음성 최소제곱(NNLS) 알고리즘의 조합을 이용한다.
세기 분포는 미에(Mie) 이론에 기인한 부피 분포로 전환될 수 있다.
II.2.4. 결과 (표 2 참조)
누적평가분석(Z 평균 직경 ):
표 2
Figure 112009009707040-PCT00001
(*) 다음과 같이 제조됨: 주사용 물, 10x 농축된 PBS, 250㎕의 SB62 에멀젼 및 25㎍의 MPL을 함께 혼합하여 280㎕의 최종 부피가 되게 한다.
z-평균 직경(ZAD) 크기는 샘플에서 각각의 입자 크기에 의해서 산란된 빛의 양에 의해서 칭량한다. 이러한 값은 샘플의 모노모달 분석과 관련되어 있으며, 주로 재현 목적으로 사용된다.
계수율(CR)은 산란된 빛의 측정치이며; 이는 초당 수천의 광자에 상응한다.
다분산성 (Poly) 지수는 분포 폭이다. 이는 분포 폭의 무차원 측정치(dimensionless measure)이다.
콘틴 및 자동 분석:
두 가지의 다른 SB62 제제(2배 농축된 AS03)을 제조하고 하기된 작은 변수를 주면서 상기된 과정에 따라서 검정하였다:
샘플은 최적 계수율 값: 제타사이저 3000HS에 대해서 10000x 및 20000x를 얻도록 결정된 두 희석액, 즉, 상기 실시예에서 사용된 바와 동일한 광학적 모델로 맬번 분석을 위해서 플라스틱 큐벳에 정량하였다.
표 3
Figure 112009009707040-PCT00002
"-" 얻어진 값이 일관되지 않은 경우
이들 결과의 도식적인 표현이 제형 1023에 대해서 도 1에 도시되어 있다. 도면에서 알 수 있는 바와 같이, 입자의 대부분(예컨대, 적어도 80%)은 300nm 미만의 세기의 직경을 지닌다.
II.2.5. 전체 결론
SB62 제형은 맬번 제타사이저 3000HS 및 두 광학적 모델로 상이한 희석액으로 측정되었다. 상기 검정된 제형의 입자 크기 ZAD(즉, 누적평가분석에 의한 세기 평균)은 약 150 내지 155nm였다.
누적평가 알고리즘을 사용하는 경우, ZAD 및 다분산성에 대한 희석의 영향은 없음이 관찰되었다.
실시예 III - 흰족제비에서 애주번트 첨가된 범유행성 스플리트 인플루엔자 백신 ( H5N1 균주 포함)의 임상전 평가
III .1. 원리 및 목적
흰족제비 모델에서의 인플루엔자 감염은 감염 및 임상 반응에 대한 민감성 모두와 관련하여 인간 인플루엔자와 매우 유사하다. 흰족제비는 바이러스 균주의 사전개조 없이 인플루엔자 A 및 B 바이러스 모두로의 감염에 대해 매우 민감하다. 그러므로, 이는 투여된 인플루엔자 백신에 의해 제공되는 보호 연구에 대한 우수한 모델 시스템을 제공한다.
상기 연구에서, H5N1 동종 균주 A/베트남/1194/2004 또는 이종 균주 A/인도네시아를 이용한 치명적인 챌린징(challenged)에 대하여 흰족제비를 보호하는 AS03으로 애주번트 첨가된 H5N1 스플리트 백신의 효능을 조사하였다. 본 실험의 목적은 PBS 또는 애주번트만으로 면역화된 흰족제비와 비교하여 애주번트 첨가된 인플루엔자 백신의 효능을 입증하는 것이었다.
III .2. 실험 설계
III .2.1. 처리/그룹(표 4)
약 8개월령의 (체중 0.8-1.5 kg) 36마리의 새끼 이계된(36 Young outbred) 수컷 흰족제비(Mustela putorius furo)(6 마리 흰족제비/그룹)에게 완전한 인간 용량 (500 ㎕의 백신 용량)을 0일 및 21일째에 근내 주사하였다. 네 개의 흰족제비 그룹 (n=6)을 AS03와 함께 네 개의 상이한 농도의 A/베트남/1194/2004 (NIBRG-14)(15, 5.0, 1.7 및 0.6 ㎍ HA)로 면역시켰다 (표준 인간 용량, 250 ㎕/용량). 두 대조군 그룹은 플라시보- 및 AS03-처리된 동물로 구성되었다. 혈청학 반응을 분석하기 위해 21일 및 42일째에 혈청을 수집하였다. 동종 바이러스에 대한 항체 역가를 헤마글루틴화 억제 검정 (HI 역가)으로 측정하였다. 49일째에, 모든 동물 을 비내 경로에 의해 106 TCID50의 동형 균주 A/베트남/1194/04의 용량으로 챌린징하였다. 챌린징 동안, 바이러스 셰딩(shedding)을 평가하기 위해, 코, 인후 및 직장 스왑(swab)을 수집하였다. 검시 후, 각 동물로부터의 오른쪽 폐의 머리배쪽, 머리등쪽, 꼬리배쪽 및 꼬리등쪽 섹션을 칭량하고 분석시까지 -80℃에서 저장하였다. H5N1-특이적인 TaqMan PCR 및 MDCK 세포에 대한 바이러스 역가 배양에 의해 바이러스 역가를 결정하였다. 데이터를 대조 희석 유닛(CDU) 및 1 그램의 폐조직 또는 1 ml의 스왑에 대한 TCID50으로서 각각 표시하였다. CDU를 연속 희석된 바이러스 원액으로부터 생성된 표준 곡선으로부터 결정하였고, 각 희석액은 시험 샘플과 동일한 방식으로 핵산 추출 및 Taqman PCR 증폭을 거친다.
표 4
Figure 112009009707040-PCT00003
III .2.2. 백신 제형의 제조
III .2.2.2. 500 ㎕의 용량으로 수중유 에멀젼 애주번트 AS03A 로 애주번트 첨가된 스플리트 H5N1
버젼 1
미리혼합된 완충액을 티오메르살, 트윈 80 및 트리톤 X100을 균주에서의 이들의 농도를 고려한 양으로 함유하는 최종 벌크 완충액(PBS pH 7.4)에서 미리 제조한다. 면역화 15-5일에 1.7 또는 0.6 ㎍의 H5N1 균주를 미리혼합된 완충액에 첨가한다. 30분 교반 후에, 250 ㎕의 SB62 에멀젼을 첨가한다. 제형을 30분 동안 교반한다. 제형 완성 후 1시간 내에 주사한다.
버젼 2
적합하게는, 제형을 하기와 같이 제조한다. 트윈 80, 트리톤 X100 및 티오메르살을 균주에서의 이들의 농도를 고려한 양으로 최종 벌크 완충액에 첨가한다. 5분 교반 후, 15-5-1.7 또는 0.6 ㎍의 H5N1 균주를 첨가한다. 30분 교반 후, 250 ㎕의 SB62 에멀젼을 첨가한다. 제형을 30분 동안 교반한다. 제형 완성 후 1시간 내에 주사한다.
III .2.2.3. 500 ㎕ 용량의 AS03A
버젼 1
250 ㎕의 SB62 에멀젼을 250 ㎕의 PBS pH 6.8과 혼합하고, 5분 동안 교반하고, 투여시까지 4℃에서 저장한다.
버젼 2
적합하게는 제형을 하기와 같이 제조한다. 250 ㎕의 SB62 에멀젼을 250 ㎕ 의 PBS pH 6.8과 혼합하고, 5분 동안 교반한다. 제형 완성 후 1시간 내에 주사한다.
주의: 각 제형에서, 10배 농축된 PBS를 첨가하여 등장성에 도달하며 이것은 최종 부피에서 1배 농축된다. H2O 부피를 표적화된 부피에 도달하도록 계산한다.
III .2.3. 판독 (표 5)
표 5
Figure 112009009707040-PCT00004
III .3. 결과 및 결론
표 6은 동종 H5N1 균주로 챌린징한 후 흰족제비에서 수득된 폐 조직 및 인두 스왑에서의 보호능 데이터, HI 역가 및 바이러스 로드를 요약한 것이다.
표 6 - 동종 H5N1 인플루엔자 바이러스로의 챌린징에 대한 AS03 - 애주번트 첨가된 H5N1 - 백신접종된 흰족제비의 보호능
Figure 112009009707040-PCT00005
aPBS로 면역화된 한 마리의 동물 및 1.7㎍ HA의 애주번트 첨가된 백신으로 면역화된 한 마리를 백신접종 동안 안락사시켰다 (25일). 백신접종 및 이러한 사망간에 뚜렷한 관련성은 없었다.
b기하 평균 HI 역가(D42): +++(>160), ++(60-160), +(40-60), -(<40).
c1 g의 조직 또는 1 ml의 스왑에 대하여 바이러스 배양에 의해 >102 TCID50으로 측정된 바이러스 로드를 지니는 동물의 수.
III .3.1. 보호 데이터
H5N1으로 챌린징하기 전에, 두 마리의 동물을 안락사시켰다. PBS로 면역화된 한 마리 동물은 백신접종 동안 과도한 체중 손실로 인해 안락시켰다 (14일). 1.7 ㎍ HA의 애주번트 첨가된 백신으로 면역화된 한 마리 동물을 백신접종 동안 과도한 체중 손실로 인해 안락사시켰다 (25일). 백신접종과 이들 사망간에 명백한 관련성은 없었다.
AS03-애주번트 첨가된 H5N1 백신으로 백신접종된 흰족제비에서의 A/베트남/1194/04를 이용한 챌린지는 항원 용량-의존적인 보호 또는 생존 곡선을 나타내었다 (표 6). 5 또는 15 ㎍ HA의 AS03-애주번트 첨가된 백신으로 면역화된 모든 동물이 치명적인 챌린지에 대해 보호되었다. 중요하게는, 동종 A/베트남/1194/2004 바이러스에 대한 평균 HI 역가가 AS03-애주번트 첨가된 백신으로 면역화된 흰족제비의 모든 그룹에서 ≥40이었고, 이는 가장 낮은 용량을 투여받은 그룹을 포함하 며, AS03 애주번트 첨가된 0.6 및 1.7 ㎍의 H5N1 스플리트 백신으로 면역화된 흰족제비에서 동종 챌린지에 대해 66.67% 및 80.00%의 보호가 각각 달성되었다. PBS 또는 애주번트 단독으로 면역화된 모든 족제비는 폐 조직 1 g에 대하여 105 TCID50을 초과하는 바이러스 로드를 나타내었고 모든 동물은 주입 동안 내내 인두에서 높은 수준의 바이러스를 셰딩(shed)하였다. 역으로, AS03-애주번트 첨가된 백신의 투여는 대부분의 동물에서 바이러스 로드를 폐 조직 1g 또는 인두 스왑으로부터의 유체 1 ml에 대하여 102 TCID50의 역치 미만으로 감소시켰다 (표 6). AS03-애주번트 첨가된 백신으로 면역화된 그룹 당 단지 한 마리 또는 두 마리 흰족제비만이 중간 내지 높은 바이러스 로드를 지녔다 (>102 TCID50).
이러한 데이터에 대해 수행된 통계적 분석은 하기 결론을 유도하였다:
- 모든 백신 용량은 대조군과 통계적으로 유의하였다
- P 값 (Fischer's exact test)은 가장 낮은 용량에 대해 0.0276 내지 가장 높은 용량에 대해 0.0006의 범위였다
- 90% 보호를 유도하기 위해 산정된 용량은 상기 모델에서 2.9 ㎍인 것으로 예측되었다
- 100% 보호를 유도하기 위한 가장 낮은 용량은 상기 모델에서 2.9 내지 5 ㎍인 것으로 예측되었다.
III .3.2. 체액 반응 ( HI 역가 )
백신접종에 대한 체액 면역 반응을 각 면역화 후 21일 및 42일에 측정하였다. 혈청 샘플을 말 적혈구를 이용한 헤마글루틴화 억제(HI) 시험에 의해 검사하였다. 결과를 표 6에 제시한다.
AS03 애주번트 첨가된 일가 H5N1 스플리트 제형은 PBS 또는 AS03 단독으로 면역화된 흰족제비에 비해 동종 균주에 대해 가장 강한 HI 반응을 유도하였다. 항원 용량 효과는, 가장 낮은 두 용량 (1.7 또는 0.8 ㎍ HA의 애주번트 첨가된 백신)을 투여받은 흰족제비에서의 보다 낮은 면역 반응과 비교하여, 가장 높은 항원 용량 (15 또는 5 ㎍ HA의 애주번트 첨가된 백신)으로 면역화된 흰족제비에서 수득된 가장 높은 HI 역가로 관찰되었다.
표 6 및 도 2A에 도시된 대로, A/베트남 H5N1을 이용한 흰족제비 챌린지에서 HI 역가와 보호간의 상관관계가 발견되었다. 40을 초과하는 HI 역가는 AS03으로 애주번트 첨가된 H5N1 스플리트 백신으로 면역화된 흰족제비에서 보호와 관련이 있는 것으로 보여진다.
III .3.3. 체액 반응 (중화 항체 역가 )
백신접종에 대한 체액 면역 반응도 각 면역화 후 21일 42일에 중화 검정에 의해 시험하였다. 결과를 도 3에 제시한다.
AS03 애주번트 첨가된 일가 H5N1 스플리트 제형은 PBS 또는 AS03 단독으로 면역화된 흰족제비에 비해 이종 균주에 대해 가장 강한 중화 항체 반응을 유도하였다. 항원 용량 효과는, 가장 낮은 두 용량 (1.7 또는 0.8 ㎍ HA의 애주번트 첨가된 백신)을 투여받은 흰족제비에서의 보다 낮은 면역 반응과 비교하여, 가장 높은 항원 용량 (15 또는 5 ㎍ HA의 애주번트 첨가된 백신)으로 면역화된 흰족제비에서 수득된 가장 높은 HI 역가로 관찰되었다.
III .3.4. A/베트남 H5N1 동종 챌린지 후 바이러스 셰딩
폐 조직 및 코/인후/직장 스왑에 대하여 바이러스 배양 및 TaqMan PCR에 의해 바이러스 셰딩을 수행하였다.
표 6에 도시된 대로, AS03-애주번트 첨가된 H5N1 스플리트 백신으로 면역화된 흰족제비의 폐 조직 및 인두 스왑에서의 바이러스 로드의 감소와 관련하여, 보호가 또한 관찰되었다 (대부분의 동물에서 조직 1 g 또는 스왑 1 ml에 대하여 102 TCID50 미만). PBS 또는 애주번트 단독으로 면역화된 모든 흰족제비가 주입 동안 폐 조직 및 인두에서 높은 바이러스 로드를 나타내었다.
도 2B는 각 그룹에서 PCR 및 바이러스 배양 둘 모두에 의해 결정된 평균 바이러스 로드를 나타낸다. 이것은, 애주번트 첨가된 백신을 투여받은 모든 그룹이 PBS 또는 애주번트를 단독으로 투여받은 대조군에 비해 감소된 바이러스 로드를 나타내는 경향이 있음을 입증하며, 0.7 ㎍ HA의 애주번트 첨가된 백신으로 면역화된 흰족제비는 바이러스 로드에 있어서 더욱 간소한 감소를 나타낸다. 1.6, 5 또는 15 ㎍ HA의 애주번트 첨가된 백신으로 면역화된 흰족제비간에 차이는 거의 관찰될 수 없었다. 마지막으로, 폐의 바이러스 로드에 관해, PCR 결과는 바이러스 역가와 일치하였다.
더욱이, 코와 직장 스왑, 및 혈장에서의 바이러스 셰딩을 바이러스 배양 및 PCR에 의해 조사하였다. 일반적으로, 바이러스 역가는 PCR 분석 보다 덜 민감하였다. 이러한 분석은, PBS를 투여받은 5 마리 흰족제비 중 2 마리의 비강 및 직장 스왑으로의 H5N1의 존재를 나타내었다. 이 그룹에서, 5 마리 중 한 마리는 혈청에서도 바이러스를 셰딩시켰다. AS03-애주번트 첨가된 H5N1 스플리트 백신으로 면역화된 동물은 직장 스왑 또는 혈장에서 바이러스를 셰딩하지 않았다. 흥미롭게도, 각 개개 흰족제비의 분석은 일부 보호된 흰족제비가 높은 바이러스 로드와 낮은 HI 역가를 지님을 나타내었으며, 이는 보호를 달성하는 메커니즘이 적어도 부분적으로 세포 면역성의 유도에 기인할 수 있음을 입증한다 (이 실험은 평가되지 않음).
III .3.5. 체온
모든 동물의 체온을 기록하였다. 백신접종기 동안 체온의 변화는 관찰되지 않았다. A/베트남/1194/04를 이용한 챌린지는 챌린지 개시 후 12 내지 24시간에 피크를 지니며 40℃ 내지 42℃ 범위의 체온 발열의 개시를 유도하였다. 주입하는 동안, 체온은 챌린지에서 생존한 동물에서 정상 수준까지 감소되었다. 5일 이전에 죽은 동물은 발열 피크 이후에 체온이 빠르게 감소되었다.
요약해 보면, 혈청학적 시험은 현저하게 높은 HI 역가가 PBS 또는 애주번트 단독으로 면역화된 동물에 비해 애주번트 첨가된 백신으로 면역화된 동물에서 수득되었음을 나타낸다. 동종 A/베트남/1194/04 바이러스를 이용한 챌린지는 대조군에 비해 애주번트 첨가된 백신을 투여받은 그룹으로부터의 폐 조직 및 인두 스왑에서 감소된 바이러스 로드를 지니며 항원-용량 의존적인 생존 곡선을 나타내었다. 대 조군의 모든 동물 (PBS 또는 애주번트 단독으로 면역됨)은 폐 1 g에 대하여 105 TCID50을 초과하는 바이러스 로드를 지니며 상기도로 바이러스를 셰딩시킨 반면, 애주번트 첨가된 백신을 투여받은 그룹에서는, 일정 비율의 동물만이 상기도로 바이러스를 셰딩시켰다 (17 마리 중 4 마리가 폐 조직 1 g에 대해 105 내지 107 TCID50, 대부분은 폐 1 g 또는 인두 스왑 1 ml에 대하여 102 TCID50 미만). 더욱이, 플라시보 및 애주번트만으로 처리된 그룹과 비교하여, 애주번트 첨가된 백신을 투여받은 그룹으로부터의 폐 조직에서 바이러스 역가가 감소되었다. 이러한 감소는 부분적으로 항원 용량 의존적이며, 5 ㎍의 항원에서 명백한 안정기에 도달한다.
실시예 IV - 스플리트 인플루엔자 항원 제제 및 AS03 애주번트를 함유하는 백신을 이용한 18세 내지 60세 성인 개체군에서의 임상 시험
IV .1. 소개
애주번트 AS03으로 애주번트 첨가되거나 첨가되지 않은 상이한 항원 용량 (3.8 ㎍, 7.5 ㎍, 15㎍ 및 30 ㎍ HA)으로 투여된 범유행성 인플루엔자 후보의 반응원성 및 면역원성을 평가하기 위해 제 1기, 관찰자-블라인드, 랜덤 연구가 2006년에 18세 내지 60세의 성인 개체군에서 현재 수행되고 있다. 체액 면역 반응 (즉, 항-헤마글루티닌, 중화 및 항-뉴라미니다제 항체 역가) 및 세포 매개된 면역 반응 (CD4 및/또는 CD8 T 세포 반응)을 후보 백신 제형을 2회 근내 투여한 후 각각 21일째에 측정하였다. 애주번트 비첨가 그룹을 동일한 항원 함량을 투여받은 개개 애 주번트 첨가된 그룹에 대한 기준으로서 다루었다.
IV .2. 연구 설계
8 그룹의 각각 50명 피검체가 하기 백신을 근내로 동시에 투여받았다:
·3.8 ㎍ HA를 함유하는 범유행성 스플리트 바이러스 인플루엔자 백신을 2회 투여받은 한 그룹의 50명 피검체.
·3.8 ㎍ HA를 함유하고 AS03으로 애주번트 첨가된 범유행성 스플리트 바이러스 인플루엔자 백신을 2회 투여받은 한 그룹의 51명 피검체.
·7.5 ㎍ HA를 함유하는 범유행성 스플리트 바이러스 인플루엔자 백신을 2회 투여받은 한 그룹의 50명 피검체.
·7.5 ㎍ HA를 함유하고 AS03으로 애주번트 첨가된 범유행성 스플리트 바이러스 인플루엔자 백신을 2회 투여받은 한 그룹의 50명 피검체.
·15 ㎍ HA를 함유하는 범유행성 스플리트 바이러스 인플루엔자 백신을 2회 투여받은 한 그룹의 50명 피검체.
·15 ㎍ HA를 함유하고 AS03으로 애주번트 첨가된 범유행성 스플리트 바이러스 인플루엔자 백신을 2회 투여받은 한 그룹의 50명 피검체.
·30 ㎍ HA를 함유하는 범유행성 스플리트 바이러스 인플루엔자 백신을 2회 투여받은 한 그룹의 50명 피검체.
·30 ㎍ HA를 함유하고 AS03으로 애주번트 첨가된 범유행성 스플리트 바이러스 인플루엔자 백신을 2회 투여받은 한 그룹의 50명 피검체.
각 그룹으로부터의 피검체의 절반이 18세 내지 30세일 것을 확실히 하기 위 해 등록부 기재를 수행하였다.
백신접종 스케쥴: 0일 및 21일에 범유행성 인플루엔자 후보 백신의 2회 주사, 21일 42일에 채혈, 판독 분석 (HI 항체 측정, NI 항체 측정, 중화 항체의 측정, 및 CMI 분석), 연구 결론 (51일) 및 연구 종료 (180일).
IV .3. 연구 목표
IV .3.1. 일차 목표
- 항-헤마글루티닌 항체 역가와 관련하여 연구 백신에 의해 유도된 체액 면역 반응 평가.
- 요청된 국소 및 전반적인 부작용, 요청되지 않은 부작용 및 심각한 부작용과 관련하여 연구 백신의 안전성 및 반응원성 평가.
체액 면역 반응에 대하여:
0일, 21일, 42일 및 180일에 관찰된 변수: 혈청 헤마글루틴화-억제 항체 역가.
유도 변수(95% 신뢰 구간):
·0일, 21일, 42일 및 180일에 혈청 항체의 기하 평균 역가(GMT)
·21일, 42일 및 180일에 혈청전환율*
·21일, 42일 및 180일에 전환지수**
·0일, 21일, 42일 및 180일에 보호율***
*헤마글루티닌 항체 반응에 대한 혈청전환율은 백신접종 전 역가가 <1:10이고 백신접종 후 역가가 ≥1:40이거나 백신접종 전 역가가 ≥1:10이고 백신접종 후 역가가 적어도 4배의 증가를 나타내는 백신접종자의 백분율로서 정의된다.
**전환지수는 0일째에 비해 백신접종 후 혈청 HI GMT에 있어서의 증가 배수로서 정의된다.
***보호율은 지시된 보호로서 일반적으로 인정된 백신접종 후 혈청 HI 역가가 ≥40인 백신접종자의 백분율로서 정의된다.
안전성/ 반응원성 평가에 대하여:
1. 각 백신접종 후 7일 기간 (즉, 백신접종 당일 및 추후 6일) 동안 및 전체적으로, 요청된 국소 및 전반적인 징후 및 증상의 비율, 세기 및 관련성.
2. 일차 백신접종 후 21일 기간 동안, 이차 백신접종 후 30일 기간 동안 및 전체적으로, 요청되지 않은 국소 및 전반적인 징후 및 증상의 비율, 세기 및 관련성.
전체 연구 동안 심각한 부작용의 발생.
IV .3.2. 이차 목적
- 혈청 중화 역가와 관련하여 연구 백신에 의해 유도된 체액 면역 반응 평가.
- 인플루엔자-특이적인 CD4/CD8 T 림프구의 빈도와 관련하여 연구 백신에 의해 유도된 세포-매개된 면역 반응 평가.
추가로, 엘리스폿 기술을 이용하여 인플루엔자-특이적인 기억 B 세포에 대한 백신접종의 효과를 평가할 것이다.
체액 면역 반응에 대하여:
0일, 21일, 42일 및 180일에 관찰된 변수: 혈청 중화 항체 역가.
유도 변수 (95% 신뢰 구간):
- 0일, 21일, 42일 및 180일에 혈청 항체의 기하 평균 역가(GMT)
- 21일, 42일 및 180일에 혈청전환율*
*중화 항체 반응에 대한 혈청전환율은 백신접종 후 역가에 있어서 최소 4배의 증가를 나타내는 백신접종자의 백분율로서 정의된다.
CMI 반응에 대하여:
1. 적어도 두 상이한 시토킨 (CD40L, IL-2, TNF-α, IFN-γ)을 생성하는 시험에서 106 당 시토킨 CD4/CD8 세포의 빈도
2. 적어도 CD40L 및 또 다른 시그널 분자 (IL-2, TNF-α, IFN-γ)를 생성하는 시험에서 106 당 시토킨-포지티브 CD4/CD8 세포의 빈도
3. 적어도 IL-2 및 또 다른 시그널 분자 (CD40L, IFN-γ, TNF-α)를 생성하는 시험에서 106 당 시토킨-포지티브 CD4/CD8 세포의 빈도
4. 적어도 TNF-α 및 또 다른 시그널 분자 (IL-2, IFN-γ, CD40L)를 생성하 는 시험에서 106 당 시토킨-포지티브 CD4/CD8 세포의 빈도
적어도 IFN-γ 및 또 다른 시그널 분자 (CD40L, IL-2, TNF-α)를 생성하는 시험에서 106 당 시토킨-포지티브 CD4/CD8 세포의 빈도.
0일, 21일, 42일 및 180일째에: 시험에서 106개 세포 당 인플루엔자-특이적인 기억 B 세포의 빈도.
IV .4. 백신 조성물 및 투여 (표 7)
III .4.1. 백신 제조
III .4.1.1. AS03 애주번트 첨가된 인플루엔자 백신의 조성물
AS03은 DL-α-토코페롤 및 스쿠알렌을 함유하는 오일상 및 비이온성 세척제 폴리소르베이트 80을 함유하는 수성상으로 구성된 수중유 SB62 에멀젼을 함유한다.
범유행성 인플루엔자 백신 후보의 활성 물질은 백신 바이러스 균주 A/베트남/1194/2004 (H5N1) NIBRG-14로부터 유래된 포름알데히드 불활성화된 스플리트 바이러스 항원이다. HA 항원의 용량은 용량 당 3.8 내지 30 ㎍의 범위이다. AS03 애주번트 첨가된 인플루엔자 백신을 생성하는데 이용된 스플리트 바이러스 일가 벌크를 GSK 바이올로지칼스 라이센싱된 범유행기 사이 인플루엔자 백신 플루아릭스(Fluarix™)/α-릭스(Rix)®에 대해 이용된 것과 동일한 절차에 따라 제조한다. 이러한 임상 시험을 목적으로, 임상 로트를 제조하는데 이용된 바이러스 균주는 고도로 병원성인 A/베트남/1194/04로부터 유래된 H5N1 백신 균주 A/베트남/1194/04 NIBRG-14 재조합 H5N1 원형 백신 균주이다. 이 재조합 원형 균주를 역 유전학을 이용하여 NIBSC에 의해 개발하였다 (적합한 참조문헌은 Nicolson et al. 2005, Vaccine, 23, 2943-2952이다). 재회합 균주는 H5 및 N1 세그먼트를 A/PR/8/34 균주 백본에 조합시키며, H5는 원래 균주의 높은 발병력의 원인이 되는 HA 절단 부위에서 아미노산의 다염기(polybasic) 스트레치(stretch)를 제거하도록 공학처리된다. 이것은, 베로(Vero) 세포를 인간 단리물인 A/베트남/1194/2004 (H5N1)의 HA 유전자 (높은 병원성 결정인자를 제거하도록 개질됨) 및 NA 유전자를 함유하는 혈장과 PR8의 내부 유전자를 함유하는 혈장으로 트랜스펙션시킴에 의해 달성되었다. 구조된 바이러스를 달걀상에서 2회 계대시킨 다음 기준 바이러스 NIBRG-14로서 명명하였다. 이 H5N1 재회합체의 약독화된 특성은 이것이 전통적인 flu 백신 균주에 대해 통례적으로 수행된 대로, 임상전 안전성 평가 (NIBSC에 의해 수행됨)에서 광범하게 문서화되었다.
본 발명에 따른 AS03-애주번트 첨가된 범유행성 인플루엔자 후보 백신은 타입 I 유리 바이알에 제공된 0.5 ml의 농축된 불활성화된 스플리트 비리온 항원 및 0.5 ml의 AS03 애주번트를 함유하는 미리충전된 타입 I 유리 주사기로 구성된 2 성분 백신이다. 주입시에, 애주번트를 함유하는 미리충전된 주사기의 내용물을 농축된 불활성화된 스플리트 비리온 항원을 함유하는 바이알로 주사한다. 혼합시킨 후, 내용물을 주사기로 뽑아내고 바늘을 근내 바늘로 교체한다. 일 용량의 재구성된 AS03-애주번트 첨가된 인플루엔자 후보 백신은 1 ml이다. 1 ml의 각 백신 용량은 백신이 본원에 기술된 효능 기준을 충족하도록 결정되어야 할 3.8 ㎍, 7.5 ㎍, 15 ㎍ 또는 30 ㎍의 헤마글루티닌 (HA) 또는 임의의 적합한 HA 양을 함유한다.
대안적으로, 본 발명에 따른 AS03-애주번트 첨가된 범유행성 인플루엔자 후보 백신은 타입 I 유리 바이알에 제공된 0.25 ml의 농축된 불활성화된 스플리트 비리온 항원 및 0.25 ml의 AS03 애주번트를 함유하는 미리충전된 타입 I 유리 주사기로 구성된 2 성분 백신이다. 주입시에, 애주번트를 함유하는 미리충전된 주사기의 내용물을 농축된 불활성화된 스플리트 비리온 항원을 함유하는 바이알로 주사한다. 혼합시킨 후, 내용물을 주사기로 뽑아내고 바늘을 근내 바늘로 교체한다. 일 용량의 재구성된 AS03-애주번트 첨가된 인플루엔자 후보 백신은 0.5 ml이다. 0.5 ml의 각 백신 용량은 백신이 본원에 기술된 효능 기준을 충족하도록 결정되어야 할 3.8 ㎍, 7.5 ㎍, 15 ㎍ 또는 30 ㎍의 헤마글루티닌 (HA) 또는 임의의 적합한 HA 양을 함유한다.
백신 부형제는 폴리소르베이트 80 (트윈 80), 옥토시놀 10 (트리톤 X-100), 염화나트륨, 인산수소 이나트륨, 인산이수소칼륨, 염화칼륨, 마그네슘 클로라이드 헥사히드레이트 및 주사용 물이다. 티오메르살을 항균 보존제로서 첨가시켜 사용 동안 오염을 방지하는데, 이것은 범유행성이 발생할 때, 주된 제공이 다중용량 컨테이너(바이알 또는 앰플)에 제공될 것으로 예상되기 때문이며, 이를 위해 보존제가 필요하다. 이러한 이유로 범유행성 백신은 보존제로서 용량 당 5 ㎍의 티오메르살과 함께 제형화된다. 적합하게는, 범유행성 백신이 보존제로서 용량 당 10 ㎍의 티오메르살 또는 다소 높은 용량인, 예컨대 백신 용량 당 25 ㎍ 이하의 티오메르살과 함께 제형화될 수 있다.
III .4.1.2. 스플리트 불활성화된 인플루엔자 H5N1 항원 제제의 생성
H5N1 작업용 시드를 암탉 발육란에서 성장시킴에 의해 바이러스 모노벌크를 제조한다. 도 4에 도시된 스플리트 불활성화된 인플루엔자 H5N1 균주의 일가 벌크에 대한 제조 과정은 α-릭스™의 일가 벌크에 대한 제조 과정과 동일하다.
기본적으로, 일가 벌크의 제조 과정은 4개의 주된 부분으로 나누어질 수 있다:
1) 수정된 암탉의 알에서 작업용 시드의 번식, 감염된 요막액의 회수 및 푸울링으로 "미정제 일가 전 바이러스 벌크" 수득 (단계 1).
2) 각 바이러스 균주를 정제시켜 "정제된 일가 전 바이러스 벌크" 유도 (단계 2-6).
3) 정제된 일가 전 바이러스 벌크를 나트륨 데옥시콜레이트로 스플리팅시켜 "정제된 일가 스플리트 바이러스 벌크" 생성 (단계 7-8/1).
4) 정제된 일가 스플리트 바이러스 벌크를 나트륨 데옥시콜레이트 및 포름알데히드와 함께 인큐베이션시킨 다음, 초여과 및 살균 여과시키는 두 단계로 정제된 일가 스플리트 바이러스 벌크를 불활성화시켜 "정제된 일가 불활성화된 스플리트 바이러스 벌크" 또는 "일가 벌크" 수득 (단계 8/2-9).
1) 미정제 일가 전 바이러스 벌크의 생성
바이러스 접종물의 제조
발육란의 접종 당일에, 작업용 바이러스 시드 로트를 25 ㎍/ml의 히드로코르티손, 및 0.5 mg/ml의 젠타마이신 설페이트를 함유하는 인산염 완충액과 혼합시켜 접종물을 제조하였다. 이 바이러스 접종물은 접종시까지 실온에서 유지된다.
발육란의 접종:
11일된 미리-인큐베이션된 발육란을 바이러스 복제에 이용하였다. 달걀 껍질의 포름알데히드 훈증 후에 달걀을 제조 룸으로 옮겼다. 약 120,000개의 달걀을 각각 자동화 달걀 접종 장치를 이용하여 0.2 ml의 바이러스 접종물로 접종하였다. 접종된 달걀을 34.0℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다.
인큐베이션 기간의 끝에, 살아있는 배아 및 나이-적합한 혈관의 존재에 대해 시각적으로 조사하였다. 달걀을 냉각시켜 배아를 죽이고 12-46시간 동안 2-8℃에서 저장하였다.
회수
냉각된 발육란으로부터의 요막액 (약 12 ml)을 달걀 회수 기계에 의해 회수하였다. 요막액을 2-8℃로 온도-조절된 스테인레스 강 탱크에 수집하였다. 이 단계의 생성물을 "미정제 일가 전 바이러스 벌크"라 부른다. 미정제 일가 전 바이러스 벌크를 저장하지 않고 즉시 정화 단계로 옮겼다.
2) 정제된 일가 전 바이러스 벌크의 생성
실온에서 수행되는 흐름 통과(flow through) 초원심분리시까지 모든 작업을 2-8℃에서 수행하였다.
정화:
회수된 요막액을 연속된 적당한 속도의 원심분리에 의해 정화시켰다. 이 단계로 요막액의 회수 동안 수집될 수 있었던 큰 입자를 제거한다 (예컨대, 달걀 껍 질 일부).
흡수 단계:
이 단계는 이염기성 인산수소칼슘 겔로의 흡수에 의해, 바이러스 재료의 침전을 통해 요막액을 추가로 정화시킬 수 있다.
이염기성 인산수소칼슘 (CaHPO4) 겔을 수득하기 위해, 0.5 mol/L의 인산수소이나트륨 (Na2HPO4) 및 0.5 mol/L의 염화칼슘 (CaCl2)을 정화된 바이러스 푸울에 첨가시켜 1L에 대하여 1.87 g CaHPO4의 최종 농도에 도달한다.
적어도 8시간 내지 최대 36시간 동안 침전시킨 후, 상청액을 제거하고, 인플루엔자 바이러스를 함유하는 침전물을 8.7% 이나트륨 EDTA 용액을 첨가시킴에 의해 재용해시켰다.
여과:
재현탁된 인플루엔자 침전물을 6 ㎛ 필터 막을 통해 여과시켜 가능한 잔류하는 펠릿을 제거하였다.
흐름 통과 초원심분리 :
인플루엔자 바이러스를 추가로 정제시키고 (단백질 및 인지질의 제거) 선형 수크로오스 구배 (0-55%)에서 시간 당 8-20 리터의 유속으로 등밀도 초원심분리에 의해 농축시켰다. 0.01% 티오메르살을 지니는 수크로오스 용액 55% (w/w), 및 0.01% 티오메르살을 지니는 인산염 완충액 pH 7.4를 이용하여 구배를 형성하였다. 이것은, 원심분리가 실온에서 수행되기 때문에, 과정 바이오버든(bioburden)을 제 어하기 위해 100±15 ㎍/ml의 티오메르살의 존재하에 수행되었다.
굴절계를 통해 수크로오스 농도를 측정함에 의해 네 개의 상이한 분획을 회수하였다:
분획 4/1: 55-47% 수크로오스
분획 4/2: 47-38% 수크로오스
분획 4/3: 38-20% 수크로오스
분획 4/4: 20-0% 수크로오스
분획 4/2의 상한은 고순도 공동작용(coefficient) HA/단백질과 전 바이러스의 최대 회수간에 균형을 잡도록 선택된다. 분획 4/2와 4/3간의 한계는 분획 4/2의 오브알부민 함량을 최소화하도록 선택된다. 분획 4/3의 하한은 낮은 수크로오스 구배 범위에서 발견된 HA 함량을 기준으로 선택된다. 분획 4/2 및 4/3은 추가의 제조를 위해 이용된다. 대부분의 바이러스가 분획 4/2에서 수집된다. 바이러스 및 단백질 둘 모두를 함유하는 분획 4/3을 추가로 정제한다. 먼저, 분획 4/3의 수크로오스 농도를 초여과에 의해 6% 미만으로 감소시킨다 (후속 원심분리 단계를 위해 필요함). 이후, 분획 4/3을 원심분리를 통해 펠릿화하여 임의의 가용성 오염물질 (단백질)을 제거한다. 펠릿을 인산염 완충액 pH 7.4에 재현탁하고 충분히 혼합시켜 균질한 현탁액을 수득한다. 보유 시간은 분획 4/3에 대해 최대 36시간, 분획 4/2에 대해 최대 60시간 및 정제된 분획 4/3에 대해 최대 36시간이다.
희석
처리된 분획 4/3 및 미처리된 분획 4/2인 두 분획 모두를 푸울링하고 60 L의 인산염 완충액 pH 7.4를 첨가시켜 희석한다.
이 단계에서, 재료의 푸울은 "정제된 일가 전 바이러스 벌크"에 상응한다.
3) 정제된 일가 스플리트 바이러스 벌크의 제조
나트륨 데옥시콜레이트의 존재하에 흐름 통과 초원심분리 :
인플루엔자 바이러스를 스플리팅하고 1.5% 나트륨 데옥시콜레이트를 함유하는 선형 수크로오스 구배 (0-55% - 수크로오스 용액 S8a 및 완충액 S6a로 형성됨)에 의한 원심분리에 의해 추가로 정제하였다. 트윈-80은 구배 중에 0.1%로 존재한다. 바이러스를 시간 당 8 리터의 속도로 프로세싱한다. 원심분리의 끝에, 세 개의 상이한 분획을 수집하였다. 주요 분획(분획 7/2)의 범위를, 현저하게 붕괴된 인플루엔자 바이러스 항원으로 구성된 분획을 수집하면서, 스플리팅 후 남아 있는 전 바이러스 입자 및 바이러스 막으로부터의 인지질을 가능한 한 크게 최소화시킬 목적으로, 스플리팅 조건의 균주-의존적인 유효성에 근거하여 선택하였다.
A/베트남/1194/2004 NIBRG-145에 대하여, 분획 7/2의 범위는 20-41%의 수크로오스로 설정된다. 헤마글루티닌 항원을 분획 7/2에서 농축시키며, 이것은 약 1.2%의 나트륨 데옥시콜레이트를 함유한다. 이 재료는 "정제된 일가 스플리트 바이러스 벌크"에 상응한다.
4) 정제된 최종 일가 스플리트 불활성화된 바이러스 벌크의 제조
여과:
분획 7/2를 인산염 완충액 S7c에서 세 배로 희석시키며, 이것은 0.025%의 트윈-80을 함유한다. 이후, 분획 7/2를 0.45 ㎛ 필터 막 아래로 차례로 여과시키며, 간단히 말해 초음파처리하고 (여과 촉진) 0.2 ㎛ 막을 통해 여과시킨다. 여과의 끝에, 필터를 0.025%의 트윈-80을 함유하는 인산염 완충액 (S107c)으로 세정한다. 여과 및 세정 결과, 여액의 최종 부피가 원래 분획 7/2 부피의 5배가 된다.
나트륨 데옥시콜레이트 불활성화:
생성된 용액을 22±2℃에서 적어도 84시간 동안 인큐베이션하였다.
일차 불활성화 단계를 완료한 후, 재료를 인산염 완충액 S7c로 희석시켜 총 단백질 함량을 계산된 농도인 500 ㎍/ml까지 감소시켰다.
포름알데히드 불활성화:
포름알데히드를 100 ㎍/ml의 계산된 최종 농도로 첨가하였다. 단일 용도 저밀도 폴리에틸렌 100 L 백에서 20±2℃로 적어도 72시간 동안 불활성화가 일어났다.
초여과 :
불활성화된 스플리트 바이러스 재료를 연속하여 완충액 S7b 및 S1b를 이용하여, 분자량 컷오프가 30,000 돌턴인 막을 통해 초여과시켰다.
부피 감소 후, 인산염 완충액 및 0.01% 트윈-80을 함유하는 인산염 완충된 염수 (S1b)를 첨가시킴에 의해, 부피는 초여과 동안(정용여과) 일정하게 유지된다.
초여과 동안, 포름알데히드, NaDoc 및 수크로오스의 함량이 감소된다.
재료를 15-25 리터로 농축시키고, 즉시 최종 여과 단계로 옮겼다.
살균 여과:
초여과 후, 스플리트 불활성화된 재료는 0.2 ㎛ 막 아래로 차례로 여과된다.
0.22 ㎛ 살균 등급 막을 통한 최종 살균 여과를 클래스 100 환경에서 수행하였다. 여과의 끝에, 필터를 0.01% 트윈-80을 함유하는 인산염 완충된 염수 용액 S1b로 세정하였다. 여기에서, 여액을 1000 ㎍/ml 미만의 단백질 농도로 희석시켜, 추후 저장 동안 응집을 피하였다.
생성된 재료는 "정제된 일가 불활성화된 스플리트 바이러스 벌크" 또는 "일가 벌크"이다.
저장:
스플리트 불활성화된 인플루엔자 H5N1 바이러스의 최종 일가 벌크를 타입 I 유리병에서 최대 18개월 동안 2-8℃에서 보관한다.
III .4.1.3. AS03 애주번트 첨가된 H5N1 을 지니는 백신 조성물의 제조
1) 조성물
1기 임상 시험 H5N1-007에서 평가되는 AS03 애주번트 첨가된 불활성화된 스플리트 바이러스 범유행성 인플루엔자 후보 백신은 근내 투여용이다. 백신은 타입 I 유리 바이알에 제공된 농축된 불활성화된 스플리트 비리온 (H5N1) 항원 및 미리충전된 타입 I 유리 주사기에 함유된 AS03 애주번트로 구성된 2 성분 백신이다.
일 용량의 재구성된 AS030-애주번트 첨가된 범유행성 인플루엔자 백신은 1 ml이다. 조성은 표 7에 제공된다. 연구 H5N1-007이 용량 발견 연구이기 때문에, 용량 당 HA 함량이 시험하려는 임상 로트 각각에 대해 상이하다. 일 용량은 3.8, 7.5, 15 또는 30 ㎍의 HA를 함유한다. 백신은 약물의 제조 과정으로부터 하기 잔류물을 함유한다: 포름알데히드, 오브알부민, 수크로오스, 티오메르살 및 나트륨 데옥시콜레이트.
표 7 - 재구성된 AS03 애주번트 첨가된 범유행성 인플루엔자 후보 백신의 조성
Figure 112009009707040-PCT00006
2) 제형
AS03-애주번트 첨가된 범유행성 인플루엔자 백신의 제조는 3개의 주요 단계로 구성된다:
(a) 애주번트 없는 스플리트 바이러스 최종 벌크 (2 x 농축됨)의 제형화 및 항원 컨테이너에 충전
(b) AS03 애주번트의 제조 및 애주번트 컨테이너에 충전
(c) AS03 애주번트 첨가된 스플리트 바이러스 백신의 즉석 재구성.
1) 애주번트 없는 최종 벌크의 제형화 및 항원 컨테이너에 충전
제형화 흐름도를 도 5에 도시한다.
일가 벌크의 부피는 제형화 전에 일가 벌크에서 측정된 HA 함량 및 4000 ml 의 표적 부피에 의존한다.
최종 벌크 완충액 (제형화 완충액은 염화나트륨: 7.699 g/l; 이나트륨 포스페이트 도데카히드레이트; 2.600 g/l; 칼륨 디히드로겐 포스페이트: 0.373 g/l; 염화칼륨; 0.2 g/l; 마그네슘 클로라이드 헥사히드레이트; 0.1 g/l을 포함함) 및 정확한 부피의 트리톤 X-100 (5% 옥토시놀 10 (트리톤 X-100) 용액) 및 티오메르살 (0.9% 티오메르살 원액)을 지속적인 교반하에 함께 혼합한다. 모노벌크 H5N1을 생성된 벌크 완충액-트리톤 X-100-티오메르살에서 희석시켜 1 ml의 최종 벌크에 대하여 60/30/15/7.6 ㎍의 H5N1의 최종 농도를 수득한다 (30, 15, 7.5 또는 3.8 ㎍ HA/500 ㎕의 최종 벌크). 혼합물을 30-60분 동안 교반한다. pH는 7.2±0.3 인 것으로 조사된다. 모노벌크에서 제공된 트윈 80의 농도 (822 ㎍/ml)가 표적 농도에 도달하기에 충분하기 때문에 (12.26 ㎍/㎍ HA) 트윈 80은 첨가할 필요가 없다.
최종 벌크는 3-ml 살균 타입 I (Ph. Eur.) 유리 바이알에 무균 충전된다. 각 바이알은 0.65 ml±0.05 ml의 부피를 함유한다.
2) AS03 살균 애주번트 벌크의 제조 및 애주번트 컨테이너에 충전.
SB62 에멀젼 및 인산염 완충액의 두 성분을 혼합시킴에 의해 애주번트 AS03을 제조한다.
SB62 에멀젼
SB62 에멀젼의 제조는, 소수성 성분 (α-토코페롤 및 스쿠알렌)으로 구성된 오일상 및 수용성 성분 (트윈 80 및 인산염-염수 완충액 pH 6.8)을 함유하는 수성상을 강한 와동하에 혼합시킴에 의해 실현된다. 교반시키면서, 오일상 (1/10 총 부피)을 수성상 (9/10 총 부피)으로 옮기고, 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반한다. 이후 생성된 혼합물을 미세유동화기의 상호작용 쳄버 (15000 PSI - 8 사이클)에서 전단, 충격 및 공동화력으로 처리하여 서브미크론 점적을 생성한다 (100 내지 200 nm의 분포). 야기된 pH는 6.8±0.1이다. SB62 에멀젼을 0.22 ㎛ 막을 통해 여과시킴에 의해 살균하고, 살균 벌크 에멀젼을 쿠팩(Cupac) 컨테이너에 2 내지 8℃에서 냉각 저장한다. 살균 비활성 기체 (질소)를 SB62 에멀젼 최종 벌크 컨테이너의 빈 공간에 적어도 15초 동안 플러싱한다.
SB62 에멀젼의 최종 조성은 다음과 같다 (표 8):
표 8
Figure 112009009707040-PCT00007
AS03 애주번트 시스템
완충액 (PBS mod)를 SB62 벌크와 혼합시켜 AS03 애주번트 시스템을 제조한다. 혼합물을 실온에서 15-45분 동안 교반하고, pH를 NaOH (0.05 또는 0.5 M)/HCl (0.03 M 또는 0.3 M)으로 6.8±0.1까지 조정한다. 15-20분 동안 실온에서 추가로 교반시킨 후, pH를 측정하고 혼합물을 0.22 ㎛ 막을 통해 여과시켜 살균한다. 살균 AS03 애주번트를 1.25 ml 살균 타입 I (Ph. Eur.) 유리 주사기에 무균 충전하기까지 +2-8℃에서 저장한다. 각 주사기는 720 ㎕의 과잉 부피를 함유한다 (500 ㎕ + 220 ㎕ 과잉충전).
AS03 애주번트의 최종 조성은 다음과 같다 (표 9):
표 9
Figure 112009009707040-PCT00008
3) AS03 애주번트 첨가된 스플리트 바이러스 백신의 즉석 재구성.
주입시에, 애주번트를 함유하는 미리충전된 주사기의 내용물을 농축된 삼가 불활성화된 스플리트 비리온 항원을 함유하는 바이알에 주사한다. 혼합시킨 후, 내용물을 주사기로부터 뽑아 내고 바늘을 근내 바늘로 교체한다. 일 용량의 재구성된 AS03-애주번트 첨가된 인플루엔자 후보 백신은 1 ml이다.
III .4.2 백신 제조
백신을 비-우성 팔의 어깨세모근 부위에 근내 투여하였다. 범유행성 인플루엔자 후보 백신은 바이알 (항원 컨테이너)에 제공된 항원 및 애주번트 (애주번트 컨테이너)나 희석제를 함유하는 미리충전된 주사기로 구성된 2성분 백신이다. 주입시에, 미리충전된 주사기의 내용물을 항원을 함유하는 바이알에 주사한다. 혼합시킨 후, 내용물을 주사기로부터 뽑아낸다. 사용된 바늘을 근내 바늘로 교체한다. 일 용량의 백신은 1 ml이다.
IV .5 연구 집단 결과
총 400명의 피검체를 본 연구에 참여시켰다: 각 49명 내지 51명의 피검체인 8개의 그룹. 백신접종시 백신접종된 총 코호트의 평균 연령은 34.3세였고 표준 편차는 12.76세였다. 8개의 백신 그룹에 걸쳐서 피검체의 평균 연령 및 성별 분포는 유사하였다.
IV .6 안전성 결론
AS03으로 애주번트 첨가된 범유행성 인플루엔자 후보 백신의 투여는 안전하며, 연구 집단, 즉 연령이 18세 내지 60세인 성인에서 임상적으로 잘 관용되었다.
IV .7 면역원성 결과
ATP 코호트 (394명 피검체)에 대하여 면역원성 분석을 수행하였다.
III .7.1. 체액 면역 반응
AS03으로 애주번트 첨가된 범유행성 인플루엔자 H5N1 후보 백신에 의해 유도된 체액 면역 반응을 평가하기 위해, 하기 파라메터 (95% 신뢰 구간을 지님)를 각 처리 그룹에 대해 산출하였다:
·0일, 21일 및 42일째 HI 항체 역가의 기하 평균 역가(GMT)
·21일 및 42일째 혈청전환율(SC)
·21일 및 42일째 전환지수
·21일 및 42일째 보호율
III .7.1.1 항- 헤마글루티닌 항체 반응
a) HI 기하 평균 역가 ( GMT )
95% CI를 지니는 HI 항체에 대한 GMT를 표 10 (항-HI 항체에 대한 GMT) 및 도 6에 도시한다. H5N1 백신접종 균주에 대한 항체의 백신접종-전 GMT는 8개의 연구 그룹에서 동일한 범위 내에 있었다. 일차 백신접종 후, 모든 애주번트 비첨가 그룹에서, 항-헤마글루티닌 항체 수준은 매우 합당하게 용량 의존적인 방식으로만 증가되었다. 애주번트 첨가된 백신접종 그룹에서, 항-헤마글루티닌 항체 수준에 있어서의 보다 뚜렷한 증가가 일차 백신접종 후에 이미 관찰되었으며, 가장 높은 항원 용량을 투여받은 그룹이 가장 높은 GMT를 지녔다 (HN30AD). 이차 백신접종 후, 애주번트 비첨가 그룹의 GMT가 일차 백신접종 후 GMT에 비해 약간 상승하였다. 비교해 보면, 애주번트 첨가된 모든 그룹에서 이차 백신접종 후 현저하게 높은 GMT가 관찰되었고, 3.8 ㎍에서 7.5 ㎍, 15 ㎍까지 용량 의존적인 증가가 관찰되었다. 30 ㎍ 그룹의 경우, 7.5 ㎍ 그룹 보다 낮은 GMT가 관찰되었다. 3.8 ㎍ HA의 가장 낮은 용량을 포함하는 애주번트 첨가된 모든 연구 그룹은 FDA 지침 초안 (200년 3월) 뿐 아니라 EMEA에 의해 확립된 기준에 의거하여 범유행성 백신의 허가를 위한 기준을 만족시키는 면역 반응을 유도하였다.
표 10 - 상이한 시점에서 항- HA 항체에 대한 기하 평균 역가 ( GMT ) (면역원성에 대한 ATP 코호트 )
Figure 112009009707040-PCT00009
b) 항- HI 항체 역가의 전환지수 , 혈청보호율 및 혈청전환율(인간에서 인플루엔자 백신에 대해 확립된 보호능과 상호관련된다)
결과가 표 11 (전환지수), 12 (혈청보호율) 및 13 (혈청전환율)에 기재되어 있다.
전환지수는 0일째에 비해서 21일 및 42일째에 백신 균주에 대한 혈청 HI GMT 에서의 배수 증가를 나타낸다 (표 11, 도 9). 전환지수는 이차 백신접종 후 4개의 애주번트 비첨가 그룹에서 1.2 내지 3.9로 다양하며 애주번트 첨가된 그룹에서 27.9 내지 60.5로 다양하다. AS03 애주번트 첨가된 그룹에서의 전환지수는 성인에 대하여 범유행기 사이 백신에 대한 유럽 관계당국에 의해서 요구된 GMT에서의 2.5 배 증가에 비해서 월등히 우수하다 (표 1에 기술됨). 현재, 범유행성 후보 백신에 대하여, 범유행기 사이 인플루엔자 백신의 연례 허가를 위해 사용된 것과 동일한 기준이 적용된다. 가장 낮은 항원 농도를 제외한 애주번트 첨가된 모든 그룹이 일차 백신접종 후 이미 ≥2.5의 전환지수를 달성하였음을 주목한다.
혈청보호율은 21일 및 42일째에서의 혈청 HI 역가 ≥ 40인 피검체의 비율을 나타낸다 (표 12, 도8). 백신접종 전에, 피검체 중 3명 (HN15 그룹에서 한 명, HN8AD 그룹에서 한 명 및 HN4D 그룹에서 한 명)이 백신 균주 H5N1 A/베트남/1194/2004에 대하여 보호 수준의 항체를 지니는 것으로 나타났다. H5N1에 대하여, 백신접종 전에 매우 낮은 백분율의 혈청보호된 개체가 관찰되었으며, 이것은 이전 연구에서의 관찰을 확실히 한다 (Bresson JL et al. The Lancet. 2006:367 (9523): 1657-1664; Treanor JJ et al. N Engl J Med. 2006; 354: 1343-1351). 21일째에, 애주번트 비첨가 그룹에서의 혈청보호율은 0.0% 내지 28.6%인 반면 (표 12), 애주번트 첨가된 그룹에서는 피검체의 26.0% 내지 58.3%가 보호 역가를 달성하였다. 범유행성 인플루엔자 후보 백신의 이차 투여 후, 애주번트 비첨가 그룹의 피검체 중 4.0 내지 42.9% 및 애주번트 첨가된 그룹의 84.0% 내지 95.9%가 보호성인 것으로 고려되는 역치 (즉, HI 역가 ≥ 1:40)와 같거나 이를 초과하는 역가를 지녔다. 결과적으로, 애주번트 첨가된 범유행성 후보 백신을 투여받고 있는 피검체의 95.9% 이하 (그룹 15HNAD)가 2회 백신접종 후 ≥40의 혈청 HI 역가를 지녔고 H5N1 백신접종 균주에 대해 보호된 것으로 간주되었다. 네 개의 모든 후보 제형은 유럽 당국에 의해 18-60세 개체군에서 요구되는 70%의 혈청보호율을 초과한 반면 -실질적인 비율의 피검체가 이미 일차 투여 후 보호성 역가를 달성함- 애주번트 비첨가 후보 백신은 어떤 것도 이러한 기준에 도달하지 못했다.
혈청전환율은 0일째에 비해서 21일 및 42일째에 백신접종 전 역가가 <1:10이고 백신접종 후 역가가 ≥1:40이거나 백신접종 전 역가가 ≥1:10이고 백신접종 후 역가가 적어도 4배 증가를 보이는 백신접종자의 백분율을 나타낸다. 일차 백신접종 후, 애주번트 비첨가 그룹의 혈청전환율은 0.0% 내지 14.9%였다 (표 13). 상응하는 애주번트 첨가된 연구 그룹에서, 혈청전환율은 일차 백신접종 후 24.0% 내지 58.3%인 것으로 관찰되었고, 이것은 상이한 항원 함량을 투여받은 4개의 애주번트 첨가된 그룹 중 3개에서 EMEA 요건(18-60세의 개체군에서 혈청전환율이 40%를 초가할 것이 요구됨)을 이미 능가한 것이다. 이차 백신접종 후, 애주번트 비첨가 그룹의 피검체 중 4.0% 내지 40.8%, 그러나 애주번트 첨가된 그룹의 피검체 중 82.0% 내지 95.9%가 혈청전환 또는 4배의 증가를 달성하였다. 따라서, 2회 백신접종 후, 후보 백신의 네 개의 모든 애주번트 첨가된 제형이 EMEA에 의한 허가 기준을 충족하였으나, 애주번트 비첨가 백신 중 단지 가장 높은 용량만이 이러한 역치를 달성하였다 (HN30: 40.8%).
표 11 - 백신접종 후 각 시점에 HAI 항체 역가에 대한 혈청전환지수 (면역원 성에 대한 ATP 코호트 )
Figure 112009009707040-PCT00010
표 12 - 혈청 항- HA 역가가 ≥1:40인 백신접종자들의 백분율로서 정의된 0일, 21일 및 42일째에 혈청보호율 (면역원성에 대한 ATP 코호트 )
Figure 112009009707040-PCT00011
표 13 - 백신접종 후 21일 및 42일 각각에 항- HA 항체 역가에 대한 혈청전환율 (면역원성에 대한 ATP 코호트 )
Figure 112009009707040-PCT00012
결론적으로:
인플루엔자 범유행성의 경우에, 대부분의 개체군은 범유행성 인플루엔자 균주에 대해 나이브이고 보호하려는 백신의 2회 투여를 요구할 것이다. 잠재적인 범유행성 백신에서의 항원 함량을 감소시켜 백신 공급을 증가시키기 위해, 애주번트 비첨가 H5N1 후보 백신 (H5N1은 다음 인플루엔자 범유행성을 야기하는 주된 후보이다)이 항원의 다회 투여 후에만 면역 반응을 유도하는 것으로 나타난 후 (Treanor JJ et al. N Engl J Med. 2006; 354: 1343-1351) 애주번트 첨가 전략을 적용한다.
AS03을 지니는 H5N1 범유행성 인플루엔자 후보 백신을 이용한 본원에 보고된 일차 시도에서, 하기 결과가 수득되었다:
·시험된 모든 상이한 헤마글루티닌 용량에 대해 애주번트 AS03은 플레인(plain) 항원 제형에 비해 명백한 이점을 지닌다. 이차 백신접종 후, HI 항체의 GMT에 있어서 애주번트 첨가된 그룹의 명백한 우수성이 관찰되었다: 시험된 가장 낮은 항원 용량 (3.8 ㎍ HA)을 투여받은 애주번트 첨가된 그룹의 GMT는 가장 높은 항원 용량 (2회 주사 30 ㎍의 HA)에 의해 유도된 애주번트 비첨가 그룹에서 달성된 가장 높은 GMT 보다 여전히 7.5배 더 높다. 42일째에 애주번트 첨가 그룹과 애주번트 비첨가 그룹간에 95% CI는 중복되지 않았다.
·42일째에 혈청전환율은 3.8 ㎍, 7.5 ㎍, 15㎍ 및 30 ㎍ 플러스 애주번트 그룹에 대하여 각각 82.0%, 90.0%, 95.9% 및 85.6%였다. 이것은 시험된 AS03 애주번트 첨가된 네 개의 모든 항원 함량에 대하여 유럽 당국이 요구하는 40% 보다 우수한 것이다. 애주번트 비첨가 그룹 중 단 하나인 가장 높은 항원 용량 그룹 (30 ㎍)만이 설정된 역치를 초과하는 백분율을 수립할 수 있었다.
·42일째에, 네 개의 애주번트 첨가된 그룹의 혈청보호율은 3.8 ㎍, 7.5 ㎍, 15 ㎍ 및 30 ㎍ 플러스 애주번트 그룹에 대하여 각각 84.0%, 90.0%, 95.9% 및 85.4%였다. 60세 미만의 성인 연령군에 대하여 EMEA가 요구하는 백분율은 70%이므로, 애주번트 첨가된 모든 그룹이 이러한 기준을 충족시키는 반면, 애주번트 비첨가 플레인 그룹은 어떤 것도 요구되는 혈청보호율을 달성할 수 없었다.
·본 연구에서, 상이한 후보 백신 제형으로 2회 백신접종 후, 혈청전환지수는 애주번트 첨가된 네 개의 그룹에서 27.9를 초과하였으므로, 2.5로 설정된 요건 을 충분히 초과한다. 또한, 애주번트 비첨가 그룹의 경우, 가장 높은 항원 용량 (15 ㎍ 및 30 ㎍)을 투여받은 2 그룹이 2.8 (HN15 그룹) 및 3.9 (HN30 그룹)으로 요건을 충족하였다.
범유행성 인플루엔자 후보 백신을 평가하기 위해서도 적용될 수 있는 EMEA에 의해 설정된 세 가지 기준과 관련하여, 애주번트 첨가된 모든 그룹이 AS03으로 애주번트 첨가된 각각의 H5N1 백신의 이차 투여 후 상기 연령군에 대해 정의된 세 개의 모든 기준을 달성하였다. 애주번트 첨가된 모든 그룹이 이차 투여 후 혈청전환, 혈청보호 및 전환지수에 대하여 FDA 제시된 기준도 달성하였다.
III .7.1.2 항- 헤마글루티닌 항체 반응 이종 균주
백신 균주와 항원적으로 상이한 H5N1 균주에 대해 면역원성을 평가하는 것은 범유행성 백신 후보의 가능성을 추가로 평가할 수 있는 것으로 고려된다. 교차 반응성 시험을 백신접종 균주를 투여받은 피검체의 혈청상에서 수행하고 항원적으로 상이한 균주와 반응하는 백신에 의해 유도된 항체의 가능성을 평가한다. 교차 반응성을 평가하기 위해, H5N1 A/인도네시아/5/2005를 선택하였다. H5N1 A/인도네시아는 클레이드(Clade) 2에 속하는 반면, 백신 균주인 H5N1 A/베트남/1194/200는 클레이드 1에 속하며 WHO에 의해 발표된 신규한 유전자 그룹으로부터의 1기 범유행성 백신 원형 균주이다. 따라서 두 균주는 항원적으로 상이한 것으로 고려될 수 있다.
a) 연구 H5N1 -007에서 H5N1 인도네시아에 대한 기하 평균 역가 및 혈청양성 (표 14)
혈청양성은 HI 항체 역가가 ≥1:10인 것으로 정의된다. 모든 피검체는 베트남 균주를 이용한 일차 백신접종 전에 인도네시아에 대하여 혈청음성이었다. 이차 백신접종 후, 애주번트 첨가된 그룹의 피검체 중 48% 이하 (28% 3.8 ㎍ 그룹, 48% 7.5 ㎍ 그룹, 26.5% 15 ㎍ 그룹, 33.3% 30 ㎍ 그룹)가 혈청양성 상태에 도달하였다. 비교해 보면, 3.8, 7.5 및 15 ㎍의 애주번트 비첨가 그룹에서는 혈청양성이 전혀 관찰되지 않은 반면, 2%만이 (1명의 피검체) 가장 높은 항원의 애주번트 비첨가 그룹에서 (30 ㎍) H5N1 인도네시아에 혈청양성인 것으로 나타났다.
표 14 - 0일, 21일 및 42일째에 백신 그룹에 의한 혈청양성율 및 HI 항체 역 가에 대한 GMT (면역원성에 대한 ATP 코호트 )
Figure 112009009707040-PCT00013
b) 연구 H5N1 -007에서 H5N1 인도네시아에 대한 혈청보호 (표 15)
이차 백신접종 후, 애주번트 첨가된 그룹의 피검체 중 32.0% 이하가 백신에 함유되어 있지 않은 인도네시아 균주에 대해 혈청보호되는 것으로 나타났다. 3.8 ㎍, 7.5 ㎍, 15 ㎍ 및 30 ㎍의 애주번트 첨가된 그룹에서, 피검체의 20.0%, 32.0%, 20.4% 및 29.2%가 각각 이차 백신접종 후 ≥1:40의 역가를 지녔다. 애주번트 비첨가 그룹의 피검체는 어떤 것도 혈청보호되지 않았다.
표 15 - 0일, 21일 및 42일째에 백신 그룹에 의한 HI 항체 역가에 대한 혈청보호율 ( SP ) (면역원성에 대한 ATP 코호트 )
Figure 112009009707040-PCT00014
c) 연구 H5N1 -007에서 H5N1 인도네시아에 대한 혈청전환 (표 16)
애주번트 첨가된 그룹의 피검체 중 32.0% 이하가 백신에 함유되어 있지 않은 인도네시아 균주에 대해 혈청전환을 달성하였다. 3.8 ㎍, 7.5 ㎍, 15 ㎍ 및 30 ㎍의 애주번트 첨가된 그룹에서, 피검체의 20.0%, 32.0%, 20.8% 및 29.2%가 각각 이차 백신접종 후 혈청전환되었다. 애주번트 비첨가 그룹의 피검체는 어느 경우에서도 혈청전환이 증명될 수 없었다.
표 16 - 21일 및 42일째에 백신 그룹에 의한 HI 항체 역가에 대한 혈청전환율 ( SC ) (면역원성에 대한 ATP 코호트 )
Figure 112009009707040-PCT00015
d) 연구 H5N1 -007에서 H5N1 인도네시아에 대한 혈청전환지수
연구에서 애주번트 첨가된 그룹에 의해 2 내지 2.8의 혈청전환지수가 달성되었다. 3.8 ㎍, 7.5 ㎍, 15 ㎍ 및 30 ㎍의 애주번트 첨가된 그룹에서, 혈청전환지수는 각각 2.0, 2.8, 2.1 및 2.3이었다.
e) H5N1 A/인도네시아에 대한 교차 반응 데이터에 대한 결론
결론적으로, AS03 애주번트로 애주번트 첨가된 스플리트 바이러스 후보 백신의 2회 투여 후, 아시아인에서 현저한 이환율 및 사망율을 야기시켰던, 백신 균주와 상이한 클레이드로부터의 H5N1 균주에 대해 수득된 교차 반응성 데이터는 양성이었다. 피검체의 48% 이하가 프라이밍된 증세를 나타내었고, 피검체의 32% 이하가 비 백신 균주에 대해 실제로 혈청보호되었다. 이러한 결과는, 범유행성 백신의 애주번트 첨가가 백신 후보에 사용된 범유행성 균주의 드리프트 변이체에 대해 교차-반응성을 제공할 수 있음을 나타낸다. 이러한 결과는 프라이밍 및 교차-프라이 밍에 대한 애주번트 첨가된 백신의 가능성을 확인시켜 준다.
III .7.1.3 이종 균주인 H5N1 A/베트남에 대한 중화 항체 반응
중화 검정은 인플루엔자 바이러스가 세포에 부착, 침투 및 번식되는 것을 억제시키는 항체를 정량할 수 있는 방법이다. 헤마글루티닌 억제 검정의 경우, 혈청보호 역치가 수립되었으나, 이것은 본 검정에 맞지 않다. 대안적으로, 중화 역가에 있어서의 4배 증가가, 백신접종된 개체가 백신접종 균주 또는 이종 균주에 대해 반응하였는지를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 혈청전환율은 후보 인플루엔자 백신의 유효성을 평가하기 위해 CHMP/FDA에 의해 사용되는 중요한 면역원성 파라메터 중 하나이다. 드리프트 균주를 이용하는 이러한 중화 검정으로 혈청 샘플을 검사하는 것은 적어도 백신 균주와 상이한 제공된 균주에 대하여 "프라이밍"된 개체의 빈도를 예측할 수 있게 할 것이다.
a) 연구 H5N1 -007에서 H5N1 베트남에 대한 중화 검정으로 측정된 기하 평균 역가 및 혈청양성 (표 17)
혈청양성에 대한 역치는 ≥1:28의 역가로 설정되며, 중화 검정은 고도로 민감한 시험이기도 하다. 0일째에 GMT는 애주번트 비첨가 그룹에서 14.0 내지 18.1이었고 애주번트 첨가된 그룹에서 18.5 내지 25.2였다. 이차 백신접종 후, 역가는 애주번트 비첨가 그룹에서 용량 의존적인 방식으로 3.8, 7.5, 15 및 30 ㎍의 그룹에 대해 각각 43.9, 61.7, 86.9 및 177.8까지 증가되었다. 애주번트 첨가된 그룹에서, 정확하게 HI 역가에서 수행된 관찰을 반복하여, 3.8, 7.5, 15 및 30 ㎍의 그룹에 대하여 381.0, 421.2, 464.7 및 333.3의 역가가 각각 달성되었다: 3.8 ㎍에서 7.5 ㎍을 넘어 15 ㎍의 애주번트 첨가된 그룹에서는 GMT의 용량 의존적인 증가가 관찰되었다 (표 17).
표 17 - 0일, 21일 및 42일째에 중화 항체 역가에 대한 혈청양성율 및 GMT (면역원성에 대한 ATP 코호트 )
Figure 112009009707040-PCT00016
b) 연구 H5N1 -0007에서 H5N1 베트남에 대한 중화 항체 역가에서의 혈청전환율 (표 18)
상기 언급한 대로, 인플루엔자 균주에 대한 혈청전환을 결정하기 위해 4배 증가를 이용한다. 따라서, 0일째에 혈청양성인 피검체가 4배 증가를 달성하였다면 이들만을 포함시켜, 잠재적인 백그라운드를 제외시켰다.
이차 투여 후, 애주번트 비첨가 그룹의 혈청전환을 용량 의존적인 방식으로 재관찰할 수 있었다: 3.8, 7.5, 15 및 30 ㎍의 그룹에서 피검체의 20.9, 37.5, 53.5 및 76.0%가 각각 혈청전환되었다. 애주번트 첨가된 그룹에서, 3.8, 7.5, 15 및 30 ㎍의 그룹에서 피검체의 86.0, 83.3, 86.0 및 100.0%가 각각 혈청전환되었으므로, 또한 HI 결과를 확인시켜 준다. 애주번트 첨가된 백신의 1회 투여 후, 피검체의 66.7% 내지 88.0%가 애주번트 첨가된 네 개의 그룹에서 이미 혈청전환되었음을 주목한다.
표 18 - 백신접종 후 각 시점에 중화 항체 역가(드레스덴으로부터)에 대한 혈청전환율( SC )(면역원성에 대한 ATP 코호트 )
Figure 112009009707040-PCT00017
베트남 균주에 대한 GMT 역가 및 혈청전환율을 도 10A 및 10B에 각각 도시한다. 결론적으로, 백신 균주(베트남)에 대해 측정된 중화 항체는 HI에 의해 수득된 결과를 확인시켜 준다. 3.8 ㎍의 가장 낮은 용량 그룹을 포함하는 애주번트 첨가된 모든 그룹이 범유행성 후보 백신의 일차 투여 후 피검체의 65%를 초과하는 혈청전환을 달성하였고 이차 투여 후 80%를 초과하는 혈청전환을 달성하였다.
III .7.1.4. 이종 균주인 H5N1 A/인도네시아에 대한 중화 항체 반응
일부 데이터 (3.8 ㎍ 및 7.5 ㎍의 HA 애주번트 첨가된 그룹만)를 하기 본원에 제시한다. 이미 논의된 대로, 바이러스 부착의 억제에 추가하여, 인플루엔자 바이러스의 세포로의 침투 및 세포에서 세포로의 번식을 억제하는 항체를 측정하는 중화 검정의 특성으로 인해, 드리프트 균주를 평가하는 것은 비 백신 균주에 대해 프라이밍되는 백신의 가능성을 추가로 평가할 수 있게 한다.
a) 연구 H5N1 -007에서 H5N1 A/인도네시아에 대한 중화 검정에서 측정된 기하 평균 역가 및 혈청양성 (표 19)
가장 낮은 두 애주번트 첨가된 그룹에서, 백신의 2회 투여 후에 달성된 인도네시아 균주에 대한 GMT는 3.8 ㎍ 및 7.5 ㎍의 애주번트 첨가된 그룹에 대해 각각 70.6 및 73.1이었다.
표 19 - 0일, 21일 및 42일째에 인도네시아 균주에 대한 중화 항체 역가의 혈청양성율 및 GMT (면역원성에 대한 ATP 코호트 )
Figure 112009009707040-PCT00018
b) 연구 H5N1 -007에서 H5N1 A/인도네시아에 대한 중화 항체 역가에서의 혈청전환율 (표 20)
3.8 ㎍ 및 7.5 ㎍의 애주번트 첨가된 그룹 둘 모두가 항원적으로 상이한 비-백신접종 균주에 대해 높은 혈청전환율을 받았다: 피검체의 84.2%가 A/인도네시아 균주에 대해 시험시에 혈청전환되었다.
표 20 - 백신접종 후 각 시점에 인도네시아 균주에 대한 중화 항체 역가의 혈청전환율( SC )(면역원성에 대한 ATP 코호트 )
Figure 112009009707040-PCT00019
중화 검정의 교차-반응성에 대해 이용가능한 데이터는, 시험된 인도네시아 균주에 비해 이종 균주를 함유하는 애주번트 첨가된 백신의 현저한 효과를 나타내며, 이것은 후보 백신의 교차-반응 가능성을 확인시켜 준다.
III .7.1.5 세포 매개된 면역성 ( CMI )
CMI의 평가에 대해서는, 섹션 I.2, I.3 및 IV.3.2를 참조한다. 백신의 면역원성을 개선시키는 애주번트의 중요한 특징들 중 하나는 세포 매개된 면역성을 자극하는 능력이다. 본 시험에서, Th1 관련 시토킨의 빈도를 포함하는 인플루엔자 특이적인 CD4- 및 CD8-세포의 평가 뿐만 아니라 기억 B-세포의 빈도의 평가도 예견된다. 데이터는 AS03으로 애주번트 첨가되거나 첨가되지 않은, 가장 낮은 두 항원 그룹의 T-세포 반응에 대해 이용가능하다. CMI는 시토킨(들)-양성 CD4 T 세포의 빈도로서 표시된다.
중간 값 (1사분위 및 3사분위 포함, 표 21 참조)이 도 11에 제시된다. 이러한 결과는, 애주번트 첨가된 그룹이 애주번트 비첨가 그룹에 비해 훨씬 강한 CD4 반응을 뚜렷하게 유도하였음을 나타내었다.
표 21 - 각 시점에 빈도-양성인 CD4 T-세포에 대한(백만개의 CD4 T-세포에 대하여) 기술적인 통계치 (면역원성에 대한 ATP 코호트 )
Figure 112009009707040-PCT00020
Figure 112009009707040-PCT00021
추론 분석에서, 일차 백신접종 후 21일째 (IFN 감마 양성인 CD4 세포는 예외)와 이차 백신접종 후 42일째에, 동일한 용량을 투여받은 애주번트 비첨가 그룹에 비해 애주번트 첨가된 그룹에서 시토킨 양성인 CD4 세포의 유도가 현저하게 더 높은 것이 확인되었다. 따라서, 백신에 의해 유도된 항체의 혈청학적 평가에서 보여진 애주번트 효과는 CMI 결과에 의해 확인되었다. 유사한 양상으로, 상기 분석은, CMI에 대한 효과가 명백히 용량-의존적이 아니라 애주번트-의존적임을 나타내고 (3.8 ㎍과 7.5 ㎍ 용량만을 비교), 이것은 HI 결과와 일관된다 (표 22 참조).
표 22 - 각 시점에 시토킨 -양성인 CD4 T-세포의 빈도에 대한 추론 통계치 (크 루스칼 - 월리스 테스트로부터의 p-값)
Figure 112009009707040-PCT00022
결론적으로, 잠재적인 범유행성 균주 A/베트남과 조합된 AS03은 시험된 가장 낮은 두 항원 용량으로 세포 매개된 면역 반응을 자극할 수 있었다. 추가로, 애주번트 첨가된 그룹에서 관찰된 반응은 애주번트 비첨가 그룹에서 유도된 CD4 반응 보다 더 강했다.
IV .8 전체적인 결론
IV .8.1. 반응원성 및 안전성 결과
다음 인플루엔자 범유행성을 선도하는 후보는, 비록 유효한 인간-에서-인간 전달이 충분히 확인되지는 않았으나, 조류-에서-인간 전달의 경우에 높은 사망율을 초래하였던 조류 바이러스 H5N1이다. 세계적인 운반 네트워크와 조합하여 사람에서 사람으로 효과적으로 퍼지는 H5N1의 능력이 입증되면, 그 결과는 높은 비율의 개체에게 영향을 미치는 보급된 인플루엔자 돌발을 실행할 수 있을 것이고, 이것은 모든 국가에서 증가된 이환율 및 사망율을 초래한다. 따라서, 잠재적으로 범유행성의 황폐된 효과를 피하려면 면역학적으로 효과적이고 백신접종에 대해 항원 스페어링 접근법이 확립되어야 한다. 이것은 적합한 애주번트를 사용하여 달성될 수 있고, 처음으로, H5N1 후보 백신에 대한 신규한 애주번트의 면역원성 개선 효과가 본 시험에서 제시될 수 있었다.
본 연구는 (1) 수중유 에멀젼으로 애주번트, 즉 AS03 첨가되거나 비첨가된 범유행성 인플루엔자 후보 백신의 건강한 성인에서의 안전성 및 반응원성, (2) 항체 및 세포-매개된 면역 반응을 평가하도록 고안되었다.
반응원성 데이터는, 애주번트 첨가된 범유행성 후보 백신이 애주번트 비첨가 그룹 보다 더욱 국소적이고 일반적인 징후를 유도 (항원 함량과 무관)하였음을 나타낸다. 그러나, 4개 모두의 애주번트 첨가된 그룹의 안전성 프로필은 임상적으로 허용될 수 있었다. 심각한 부작용은 보고되지 않았다.
이러한 결과로부터, AS03으로 애주번트 첨가된 범유행성 후보 백신의 반응원성 및 안전성 프로필은 만족스럽고 임상적으로 허용될 수 있는 것으로 결론내릴 수 있다.
IV .8.2. 면역원성 결과
면역 반응과 관련하여, AS03으로 애주번트 첨가된 범유행성 인플루엔자 후보 백신은 시험된 모든 항원 함량에서 (3.8 ㎍, 7.5 ㎍, 15 ㎍ 및 30 ㎍ HA, H5N1 A/베트남/1194/2004), 현재 범유행성 후보 인플루엔자 백신을 평가하기 위한 기준으로서 사용되는 (Guideline on dossier structure and content for pandemic influenza marketing authorization application, CPMP/VEG/4717/03) 스플리트 비리온 인플루엔자 백신의 연례 기명에 대한 유럽 당국의 요건을 초과하였다 ("Note for Guidance on Harmonisation of Requirements for influenza Vaccines" for the immuno-logical assessment of the annual strain changes -CPMP/BWP214/96).
본 임상에서 시험된 애주번트 첨가된 범유행성 인플루엔자 후보 백신에 대한 네 개의 상이한 항원 함량은 HI에 의해 측정시 인플루엔자 헤마글루티닌에 대해 양호한 항체 반응을 일으킨 건강한 성인에서 면역원성이었다 (표 23).
표 23
Figure 112009009707040-PCT00023
헤마글루티닌 억제 검정을 이용하여 항원적으로 상이한 균주인 H5N1 A/인도네시아/5/05에 대해 교차 반응성을 평가한 데이터는, 애주번트 첨가된 그룹에서 드리프트된 균주에 대한 백신접종자의 교차-프라이밍을 추가로 나타내었다. 동종 및 이종 균주에 대하여 중화 검정을 이용한 평가에 의해 혈청학적 측정을 완료하였다. 또한 중화 검정에 의해, 백신 후보의 면역원성 및 교차-보호 가능성을 확인할 수 있었다.
요악하면, 애주번트 첨가된 신규한 범유행성 인플루엔자 후보 백신의 2회 투여가 시험된 가장 낮은 용량인 3.8 ㎍에서, 인플루엔자 백신의 면역원성을 평가하기 위해 수립된 모든 기준을 초과하며, 매우 높은 비율의 피검체에서 백신 균주 H5N1 A/베트남/1194/2004에 대해 보호 역가를 유도한다. 추가로, 수득된 결과는 드리프트 균주에 대해 면역성을 유도하는 후보 범유행성-전 백신의 능력을 입증한다.
상기 결과는 범유행성-전 프라이밍이 순환 범유행성 균주와 이종인 균주를 포함하는 백신으로 수행되는 범유행성 상태에서 혈청보호를 달성하는 청구된 백신 조성물의 사용을 지지한다. 바꾸어 말해, 청구된 조성물을 이용하여 드리프트된 범유행성 균주(들)에 대한 후속적인 반응을 프라이밍할 수 있다. 이 결과는 AS03으로 애주번트 첨가된 범유행성 일가(H5N1) 인플루엔자의 이종 및 동종 1- 및 2-용량 프라임-부스트(prime-boost) 사용에서 청구된 조성물의 용도를 지지한다:
- 하나의 범유행성 균주 (예컨대, 베트남 균주)를 함유하는 애주번트 첨가된 백신의 1 또는 2 용량으로 환자를 프라이밍, 선택된 용량, 적은 양의 HA 포함,
- 1 용량의 수 개월 후에 (예컨대, 6 또는 12개월 후) i) 동일한 범유행성 균주 (예컨대, 베트남 균주, 즉 동종 프라임-부스트) 또는 ii) 이종 (예컨대, 인도네시아 균주, 즉 이종 프라임-부스트) 균주를 부스트로서 제공.
이러한 애주번트 첨가된 백신의 가치는, 범유행성이 개시되기 전 또는 그 즈음에 개체가 '범유행성' 균주와 동일한 균주 또는 상이한 균주로 1회 또는 2회 프라이밍된 후 범유행성이 선언된 상태에서 중요하게 인정될 것이다.

Claims (44)

  1. 범유행성(pandemic)과 관련되거나 범유행성과 관련될 가능성이 있는 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 적은 양의 인플루엔자 바이러스 항원 또는 항원성 제제를 애주번트와 함께 포함하는 일가 인플루엔자 백신 조성물로서, 상기 적은 항원 양은 용량 당 15 ㎍의 헤마글루티닌(HA)을 초과하지 않고, 상기 애주번트는 대사가능한 오일, 스테롤 또는 토코페롤 및 에멀젼화제를 포함하는 수중유 에멀젼인 일가 인플루엔자 백신 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 토코페롤이 알파-토코페롤인 조성물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 대사가능한 오일이 스쿠알렌인 조성물.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대사가능한 오일이 상기 면역원성 조성물의 총 부피의 0.5% 내지 20%의 양으로 존재하는 조성물.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대사가능한 오일이 상기 면역원성 조성물의 총 부피의 1.0% 내지 10%의 양으로 존재하는 조성물.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대사가능한 오일이 상기 면역원성 조성물의 총 부피의 2.0% 내지 6.0%의 양으로 존재하는 조성물.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 토코페롤 또는 알파-토코페롤이 상기 면역원성 조성물의 총 부피의 1.0% 내지 20%의 양으로 존재하는 조성물.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 토코페롤 또는 알파-토코페롤이 상기 면역원성 조성물의 총 부피의 1.0% 내지 5.0%의 양으로 존재하는 조성물.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 스쿠알렌 : 토코페롤 또는 스쿠알렌 : 알파 토코페롤의 비율이 1이거나 1 미만인 조성물.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에멀젼화제가 트윈(Tween) 80인 조성물.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에멀젼화제가 상기 면역원성 조성물의 0.01 내지 5.0 중량%(w/w)의 양으로 존재하는 조성물.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 에멀젼화제가 상기 면역 원성 조성물의 0.1 내지 2.0 중량%(w/w)의 양으로 존재하는 조성물.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, HA 항원의 양이 용량 당 10 ㎍을 초과하지 않는 조성물.
  14. 제 13항에 있어서, HA 항원의 양이 용량 당 8 ㎍ 또는 4 ㎍ 또는 2 ㎍을 초과하지 않는 조성물.
  15. 제 12항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, HA 항원의 양이 용량 당 1 내지 7.5 ㎍, 또는 1 내지 5 ㎍인 조성물.
  16. 제 15항에 있어서, HA 항원의 양이 균주 당 2.5 내지 7.5 ㎍의 HA를 함유하는 조성물.
  17. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 범유행성 인플루엔자 바이러스 균주가 H5N1, H9N2, H7N7, H2N2, H7N1 및 H1N1으로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 범유행성 인플루엔자 바이러스 균주가 H5N1, H9N2, H7N7, H2N2, H7N1 및 H1N1으로 구성된 군으로부터 선택되는 조성물.
  19. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 또는 항원 조성물이 정제된 전(whole) 인플루엔자 바이러스, 살아있지 않은(non-live) 인플루엔자 바이러스, 또는 인플루엔자 바이러스의 서브유닛 성분(들)의 형태인 조성물.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 살아있지 않은 인플루엔자 바이러스가 스플리트(split) 인플루엔자 바이러스인 조성물.
  21. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인플루엔자 항원 또는 항원성 조성물이 세포 배양으로부터 유래되거나 수정란(embryonic egg)에서 생성되는 조성물.
  22. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로 사용되기 위한 조성물.
  23. 적은 양의 인플루엔자 바이러스 항원 또는 이의 항원성 제제를 포함하는 유닛 및 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 정의된 수중유 애주번트를 포함하는 유닛을 포함하는 키트.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 항원이 HA인 키트.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 HA의 양이 제 1항 또는 제 13항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 정의된 것인 키트.
  26. 범유행성과 관련되거나 범유행성과 관련될 가능성이 있는 단일 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 인플루엔자 바이러스 항원을 수중유 에멀젼 애주번트와 혼합시키고 용량 당 15 ㎍ 이하의 인플루엔자 헤마글루티닌 항원을 함유하는 백신 유닛을 제공하는 것을 포함하여, 범유행성 상태 또는 범유행성-전 상태용 인플루엔자 백신 조성물을 제조하는 방법.
  27. 제 26항에 있어서, 수중유 에멀젼 애주번트가 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 정의된 것인 방법.
  28. 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 청구된 면역원성 조성물의 제조에서 (a) 범유행성과 관련되거나 범유행성과 관련될 가능성이 있는 인플루엔자의 단일 균주로부터의 적은 양의 인플루엔자 바이러스 항원 또는 이의 항원성 제제, 및 (b) 수중유 에멀젼 애주번트의 용도로서, i) 개선된 CD4 T-세포 면역 반응, ii) 인간에서 상기 바이러스 또는 항원성 조성물에 대한 개선된 B 세포 기억 반응, iii) 개선된 체액 반응 중 하나 이상을 유도하기 위한 용도.
  29. 제 28항에 있어서, 상기 CD4 T-세포 면역 반응이 교차-반응성 CD4 T 헬퍼 반응의 유도 또는 교차-반응성 체액 면역 반응의 유도를 수반하는 용도.
  30. 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 보호용 백신 로트(lot) 또는 백신 키트의 제조에서 (a) 범유행성과 관련되거나 범유행성과 관련될 가능성이 있는 인플루엔자의 단일 균주로부터의 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 항원인 적은 양의 범유행성 인플루엔자 바이러스 항원 또는 이의 항원성 제제, 및 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 정의된 (b) 수중유 에멀젼 애주번트의 용도.
  31. 제 29항 또는 제 30항에 있어서, 상기 면역 반응 또는 보호가 인플루엔자 백신 효능에 대한 적어도 하나, 적어도 둘 또는 세 개 모두의 국제 관리 기준을 모두 충족하는 용도.
  32. 제 28항 내지 제 31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 반응 또는 보호가 백신의 1회 투여 또는 2회 투여 후에 수득되는 용도.
  33. 제 29항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 백신이 비경구로 투여되는 용도.
  34. 상기 HA 항원 양이 제 14항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 정의된 것인 제 27항 또는 제 28항에 청구된 방법 또는 제 29항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 청구된 용도.
  35. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 청구된 면역원성 조성물로 이미 백신접종된 인간을 재백신접종하기 위한 면역원성 조성물의 제조에서 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제제의 용도.
  36. 제 35항에 있어서, 재백신접종을 위해 사용된 조성물이 애주번트를 함유하는 용도.
  37. 제 36항에 있어서, 상기 애주번트가 수중유 에멀젼 애주번트인 용도.
  38. 제 35항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 재백신접종을 위한 상기 면역원성 조성물이 범유행성과 관련되거나 범유행성과 관련될 가능성이 있는 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제제를 함유하는 용도.
  39. 제 38항에 있어서, 상기 범유행성 균주가 H5N1, H9N2, H7N7, H2N2, H7N1 및 H1N1으로 구성된 군으로부터 선택되는 용도.
  40. 제 38항 또는 제 39항에 있어서, 재백신접종을 위한 상기 면역원성 조성물이 일차 백신접종에 사용된 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제제와 공통된 CD4 T-세포 에피토프 또는 공통된 B 세포 에피토프를 공유하는 인플루엔자 바이러스 또는 이의 항원성 제제를 함유하는 용도.
  41. 제 35항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 있어서, 일차 백신접종이 잠재적으로 범유행성을 야기시킬 수 있었던 인플루엔자 균주를 함유하는 인플루엔자 조성물로 수행되고 재백신접종이 순환 범유행성 균주를 함유하는 인플루엔자 조성물로 수행되는 용도.
  42. 변이체 인플루엔자 균주에 의해 야기된 인플루엔자 감염에 대한 보호를 위한 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 청구된 면역원성 조성물의 제조에서 일차 인플루엔자 균주로부터의 항원 또는 항원성 제제의 용도.
  43. 제 42항에 있어서, 일차 인플루엔자 균주가 범유행성과 관련되거나 범유행성과 관련될 가능성이 있는 용도.
  44. 제 42항에 있어서, 변이체 인플루엔자 균주가 범유행성과 관련되거나 범유행성과 관련될 가능성이 있는 용도.
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