CN104645325A

CN104645325A - 一种重组禽流感亚单位口服疫苗的制备方法

Info

Publication number: CN104645325A
Application number: CN201510085590.7A
Authority: CN
Inventors: 王华瑞; 李永亮
Original assignee: Si Qiyuan Bio Tech Ltd Wuhan
Current assignee: Si Qiyuan Bio Tech Ltd Wuhan
Priority date: 2015-02-16
Filing date: 2015-02-16
Publication date: 2015-05-27

Abstract

本发明涉及一种重组禽流感亚单位口服疫苗的制备方法，包括以下步骤：构建含有HA基因的重组质粒，将其转染到表达细胞中，进行培养、表达；将表达的蛋白进行纯化，获得重组禽流感亚单位颗粒；将得到的重组禽流感亚单位颗粒冻干；将得到的冻干粉溶解于单磷酰脂质A和氢氧化铝的混合溶液中，混合均匀，得到混合液；将得到的混合液，包装，制剂、辐射灭菌，获得重组禽流感亚单位口服疫苗。所述冻干粉在混合溶液中的质量分数为1％。所述单磷酰脂质A在混合溶液中的质量分数为0.2％，所述氢氧化铝在混合溶液中的质量分数为0.03％。本发明制成禽流感亚单位口服疫苗,不需要注射，仅仅通过口服就可以达到很好的免疫效果。

Description

一种重组禽流感亚单位口服疫苗的制备方法

技术领域

本发明属于疫苗制备领域，尤其涉及一种重组禽流感亚单位口服疫苗的制备方法。

背景技术

禽流感，是由禽甲型流感病毒某些亚型忠的一些毒株引起的急性呼吸道传染病。动物禽流感的大规模爆发，不仅给养殖户带来严重损失，也危害到人类的身体健康，同时带来了重大的经济损失。

一般采用动物禽流感疫苗来预防与治疗动物禽流感。

一方面，现有的技术中，一般选取灭活的毒株来制备疫苗。一般用鸡胚生产，病毒适应鸡胚后在鸡胚中的生长，疫苗生产周期长。另外病毒在鸡胚的传代的过程中很容易发生变异，导致疫苗的免疫效果不好。很难达到有效预防的目的。

另一方面，现有的疫苗多采用注射的形式接种，接种复杂，易产生疼痛感，因此，研究一款能够口服的疫苗具有重要意义。

发明内容

鉴于现有技术所存在的问题，提供一种重组禽流感亚单位口服疫苗的制备方法，具有免疫效果好、服用方便等优点。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种重组禽流感亚单位口服疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)构建含有HA基因的重组质粒，将其转染到表达细胞中，进行培养、表达；

2)将步骤1)表达的蛋白进行纯化，获得重组禽流感亚单位颗粒；

3)将步骤2)得到的重组禽流感亚单位颗粒冻干；

4)将步骤3)得到的冻干粉溶解于单磷酰脂质A和氢氧化铝的混合溶液中，混合均匀，得到混合液；

5)将步骤4)得到的混合液，包装，制剂、辐射灭菌，获得重组禽流感亚单位口服疫苗。

进一步，所述冻干粉在混合溶液中的质量分数为1％。所述单磷酰脂质A在混合溶液中的质量分数为0.2％，所述氢氧化铝在混合溶液中的质量分数为0.03％。

本发明的有益效果是：本发明所述一种重组禽流感亚单位口服疫苗的制备方法，通过将冻干粉溶解于单磷酰脂质A和氢氧化铝的混合溶液中，制成禽流感亚单位口服疫苗。不需要注射，紧紧通过口服就可以达到很好的免疫效果。

附图说明

图1为本发明所述一种重组禽流感亚单位口服疫苗对小鼠的免疫效果图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本发明所述的实验方法若无特别说明均采用本领域的常规技术手段，可参见说明书或者分子生物学克隆指南第三版。本发明所使用的实验试剂若无特别说明均为本领域的常规实际，市场上可以购买到。

实施例1培养病毒株A/Anhui/1/2013(H7N9),提取病毒株中的RNA

所述A/Anhui/1/2013(H7N9)来自中国疾控中心(CDC)。

将禽流感病毒株A/Anhui/1/2013(H7N9)取0.2mL接种于15日龄鸡胚，37摄氏度培养40h，置于4摄氏度冰箱过夜，无菌收集尿囊液。取病毒尿囊液500mL4摄氏度条件下6000rpm离心20min收集上清,25000rpm离心2h超速离心，沉淀用5mLTEN重悬，用质量分数10％-40％的蔗糖梯度离心，35000rpm离心2h，收集质量分数30％-35％的病毒带，透析脱糖，用无RNA酶的TE缓冲液悬浮，分装，冻存。

利用QIANGEN Rneasy Mini Kit试剂盒提取RNA，具体操作步骤参见说明书。

实施例2利用反转录PCR获得cDNA

取RNA菌悬液10微升，加入20pmol引物1(如SEQ ID NO：3所示核酸序列)混匀后置于70摄氏度水浴中反应10min，再加入5*反转录酶缓冲液、0.1mol/LDTT2微升、2.5mmol/LdNTP 4微升、RNA酶抑制剂1微升、M-MLV反转录酶10U,37摄氏度水浴1h，97摄氏度作用10min。获得cDNA。

实施例3以获得的cDNA为模板，扩增HA基因

按照如下反应体系配置反应液：

cDNA(50ng/μL)	1μL
		引物1(10μmol/L)	1μL
引物1(10μmol/L)	1μL
		Taq DNA聚合酶	1μL
10*Taq DNA聚合酶缓冲液	5μL
		dNTP(2.5mmol/L)	4μL
ddH2O	补足50μL

按照如下反应条件扩增HA基因：

引物1具有如SEQ ID NO：3所示核酸序列，即CCG GGTACCATGAACACTCAAATCCTCGT，具有KpnI酶切位点。

引物2具有如SEQ ID NO：4所示核酸序列，即AAT AAGCTTTTAGATACAGATTGTGCAGC,具有HindIII酶切位点。

扩得的HA基因具有如SEQ ID NO：1所示核酸序列，即：

ATGAACACTCAAATCCTCGTTTTCGCCCTCATCGCCATCATCCCCACTAACGCTGATAAGATCTGCCTCGGTCACCACGCTGTCTCCAACGGCACCAAGGTTAACACCCTCACTGAGAGAGGAGTGGAAGTGGTCAACGCTACAGAGACCGTGGAACGCACAAACATCCCCAGGATCTGCTCCAAGGGCAAGCGTACCGTCGACTTGGGCCAGTGTGGCCTGCTCGGAACTATCACAGGCCCCCCTCAGTGCGATCAATTCTTGGAGTTCTCTGCCGACCTGATCATCGAGCGTCGCGAAGGAAGCGATGTGTGTTACCCTGGCAAGTTCGTCAACGAGGAAGCTCTGAGACAGATCCTCCGTGAGAGCGGTGGCATCGACAAGGAAGCCATGGGATTCACCTACTCAGGTATCCGCACAAACGGAGCTACCTCGGCTTGCAGGAGATCCGGCTCCTCTTTCTACGCTGAGATGAAGTGGTTGCTGTCTAACACTGACAACGCTGCCTTCCCACAGATGACAAAGAGCTACAAGAACACCAGGAAGTCACCGGCTCTGATCGTTTGGGGTATCCACCACTCTGTGAGCACTGCCGAGCAAACAAAGCTCTACGGCTCCGGAAACAAGTTGGTTACCGTGGGAAGCTCAAACTACCAGCAATCCTTCGTCCCATCTCCGGGTGCTCGCCCACAGGTTAACGGTCTGTCTGGCAGGATCGATTTCCACTGGTTGATGCTGAACCCAAACGACACCGTGACTTTCTCATTCAACGGCGCTTTCATCGCCCCGGACAGAGCTTCGTTCCTGCGTGGCAAGTCTATGGGCATCCAGAGCGGAGTCCAAGTTGATGCCAACTGCGAGGGTGACTGTTACCACTCAGGAGGTACCATCATCTCGAACCTCCCCTTCCAGAACATCGACAGCCGTGCTGTCGGCAAGTGCCCTCGCTACGTTAAGCAAAGGTCTCTCTTGCTGGCCACTGGAATGAAGAACGTCCCCGAGATCCCTAAGGGTCGCGGCTTGTTCGGTGCTATCGCCGGCTTCATCGAGAACGGATGGGAAGGTCTGATCGACGGCTGGTACGGATTCAGGCACCAGAACGCTCAAGGAGAGGGTACTGCTGCCGATTACAAGTCAACACAGTCGGCCATCGACCAAATCACCGGAAAGCTCAACAGATTGATCGAAAAGACTAACCAGCAATTCGAGCTGATCGATAACGAATTCAACGAGGTGGAAAAGCAGATCGGTAACGTCATCAACTGGACCCGTGACTCCATCACTGAAGTGTGGTCTTACAACGCTGAGCTCTTGGTCGCCATGGAAAACCAGCACACCATCGATCTGGCTGACTCCGAGATGGATAAGCTCTACGAACGTGTGAAGCGCCAATTGAGGGAGAACGCCGAGGAAGACGGCACTGGATGTTTCGAAATCTTCCACAAGTGCGACGATGACTGTATGGCTTCGATCCGCAACAACACATACGACCACTCCAAGTACAGAGAGGAAGCCATGCAGAACCGTATCCAAATCGATCCTGTTAAGCTGTCGTCCGGTTACAAGGACGTCATCCTCTGGTTCAGCTTCGGCGCTTCATGCTTCATCCTGCTCGCCATCGTTATGGGACTGGTTTTCATCTGCGTCAAGAACGGCAACATGCGCTGCACAATCTGTATCTAA

扩得的HA基因具有如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列，即：

实施例4构建含有HA基因的重组表达质粒并在Sf9细胞中表达

利用KpnI和HindIII对获得的HA基因进行双酶切，37摄氏度反应过夜，回收酶切片段；同时利用KpnI和HindIII对表达载体pBlueBAC4.5进行双酶切，37摄氏度反应过夜，回收大片段载体。

将HA的酶切片段与大片段载体按照质量比10:1配置连接反应体系，加入1μLT4连接酶和1μLT4连接酶缓冲液，16摄氏度反应过夜。将连接反应液转入大肠杆菌JM109中，获得含有HA基因的重组表达质粒，即pBlueBAC-HA。经测序后，与预期序列一致。

将重组质粒pBlueBAC-HA按照Bac-N-Blue转染试剂盒使用手册进行。获得含有重组质粒pBlueBAC-HA的Sf9细胞，命名为Sf9-HA。

实施例5培养含有重组表达质粒的细胞、收集、纯化重组禽流感亚单位疫苗

将获得的Sf9-HA细胞液，按照体积比1％侵染Sf9细胞，室温培养24h,收集培养细胞及上清。将细胞用PBS洗涤三次，超声裂解至透明，离心后，取上清和沉淀。利用扁豆凝集素酶亲和层析法进行纯化，扁豆凝集素酶亲和层析柱选自扁豆凝集素亲和层析凝胶4B-CL(Lens culinaris(Lentil)4B-CL)，购自上海胜创生物科技有限公司，具体方法参见说明书。最终获得重组禽流感亚单位颗粒。

实施例6

将实施例5得到的重组禽流感亚单位颗粒-80摄氏度条件下冻干2h,得到冻干粉；取1g冻干粉溶解于100g单磷酰脂质A和氢氧化铝的混合溶液中，混合均匀，得到混合液,述冻干粉在混合液中的质量分数为1％,所述单磷酰脂质A在混合液中的质量分数为0.2％,所述氢氧化铝在混合溶液中的质量分数为0.03％；将得到的混合液，包装，制剂、辐射灭菌，获得重组禽流感亚单位口服疫苗。分别将冻干粉、单磷酰脂质A和氢氧化铝的混合溶液(作为佐剂)、口服疫苗接种小鼠或者让小鼠服用，并检测HI受体的浓度，检测结果如图1所示，口服疫苗效果远远好于其他两种方式的免疫效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种重组禽流感亚单位口服疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3)将步骤2)得到的重组禽流感亚单位颗粒冻干；

2.根据权利要求1所述一种重组禽流感亚单位口服疫苗的制备方法，其特征在于，所述冻干粉在混合溶液中的质量分数为1％。

3.根据权利要求1所述一种重组禽流感亚单位口服疫苗的制备方法，其特征在于，所述单磷酰脂质A在混合溶液中的质量分数为0.2％。

4.根据权利要求1所述一种重组禽流感亚单位口服疫苗的制备方法，其特征在于，所述氢氧化铝在混合溶液中的质量分数为0.03％。