CN1718242A - 狂犬病病毒糖/核等结构蛋白的犬2型腺病毒重组疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种狂犬病病毒糖/核等结构蛋白的犬2型腺病毒重组疫苗，该重组疫苗是以犬2型腺病毒为载体，将犬2型腺病毒基因组E3区进行了部分缺失并克隆进了狂犬病病毒糖/核等结构蛋白的表达盒；糖/核等结构蛋白表达盒由巨细胞病毒(CMV)立即早期(IE)启动子、糖/核等结构蛋白cDNA和SV40病毒多聚A(poly A)信号序列构成；重组犬2型腺病毒接种易感细胞或动物体后，可表达狂犬病病毒糖/核等结构蛋白，并可诱导机体产生针对狂犬病病毒的中和抗体或细胞免疫，对狂犬病病毒强毒株的攻击具有保护力。因此，本发明获得的携带狂犬病病毒糖/核等结构蛋白表达盒的重组犬2型腺病毒可作为预防狂犬病病毒感染的疫苗株。

Description

狂犬病病毒糖/核等结构蛋白的犬2型腺病毒重组疫苗
技术领域：
本发明涉及一种在腺病毒E3区携带狂犬病病毒糖/核等结构蛋白表达盒的犬2型腺病毒重组疫苗，特别是涉及一种狂犬病病毒糖/核等结构蛋白的犬2型腺病毒重组疫苗。
背景技术：
目前用于犬狂犬病预防的疫苗主要包括浓缩纯化的灭活疫苗和冻干的弱毒活疫苗。浓缩纯化灭活苗制备工艺复杂，成本较高，比较适用于发达国家；弱毒活疫苗制备工艺相对简单，免疫期也较长，在发展中国家应用较多。但弱毒活疫苗在敏感动物体内具有毒力返祖的潜在危险，曾有动物接种后发生狂犬病的个例报道。
狂犬病病毒由糖蛋白(G)、核蛋白(N)、基质蛋白(M)、磷酸化蛋白(NS)和转录酶大蛋白(L)等五种结构蛋白组成，其中，糖蛋白是唯一一种可以诱导机体产生中和抗体的保护性抗原成分；核蛋白主要诱导产生特异性细胞免疫，同时还可以促进中和抗体的产生；其它结构成分尚未发现和免疫功能有关。近年来，以糖蛋白和核蛋白作为目的抗原的疫苗研究比较活跃，先后报道了亚单位疫苗、基因工程疫苗、抗独特型抗体苗、活载体疫苗以及DNA疫苗等，其中以糖蛋白为基础的亚单位疫苗和基因工程疫苗虽然制备比较容易，但由于免疫原性较弱，未能得到实际应用；抗独特型抗体苗在技术上一直没有成熟，不可能形成规模生产；以痘苗病毒和人5型腺病毒为载体表达糖蛋白或核蛋白的重组活载体疫苗，在北美和西欧等国家经过野生动物的免疫试验，证明具有很好的免疫保护作用，但前者存在再次免疫排斥问题。后者在欧洲野生动物的狂犬病预防试验中发挥了重要作用，但在作为人基因治疗载体时发现存在一定的安全问题，因此均未被正式批准应用。DNA疫苗方面的研究文章近年来很多，但综合来看，狂犬病DNA疫苗中抗原蛋白在体内的表达量及其诱导的抗体水平甚低。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种狂犬病病毒糖/核等结构蛋白的犬2型腺病毒重组疫苗，具体地说，是以犬2型腺病毒为载体，在其基因组E3区内进行部分缺失，并插入由巨细胞病毒(CMV)立即早期(IE)启动子指导，以狂犬病病毒糖/核等结构蛋白cDNA为目的基因，以SV40病毒或牛生长激素基因多聚A(poly A)为终止信号共同组成的表达盒。此种重组病毒疫苗接种动物后可诱导机体产生针对狂犬病病毒的中和抗体和细胞免疫，对狂犬病病毒强毒株的攻击有保护力。
本发明的技术方案是这样实现的：首先，将狂犬病病毒(RV)糖/核等结构蛋白cDNA克隆在一个由巨细胞病毒(CMV)立即早期(IE)启动子和SV40病毒poly(A)信号序列组成的表达盒中，糖/核等结构蛋白的表达受CMV启动子的调控，并随犬2型腺病毒的复制而表达；其次，将狂犬病病毒糖/核等结构蛋白表达盒插入在犬2型腺病毒部分缺失的E3区内，该缺失是通过E3区天然位点和/或人工突变位点的酶切，去除了位点间的序列实现的；E3区的前13个核苷酸是pVIII基因的3’末端序列，不在缺失区内；然后，使狂犬病病毒糖/核等结构蛋白表达盒的启动子方向和犬2型腺病毒基因组的转录方向一致，即为正向插入；第四，狂犬病病毒糖/核等结构蛋白随重组病毒增殖而表达，在宿主细胞内翻译出完整的该结构蛋白，并进行正确的翻译后加工过程，其免疫原性与来源病毒株(狂犬病病毒疫苗株SRV9)糖/核等结构蛋白一致；第五，本重组病毒疫苗的增殖、扩大培养以及免疫接种的方式和载体病毒疫苗株犬2型腺病毒完全一致；第六，动物在接种本重组疫苗以后，将同时获得针对犬腺病毒感染和狂犬病病毒感染的免疫力，可以抵抗正常致死剂量强毒的攻击。
一、狂犬病病毒糖/核等结构蛋白的重组犬2型腺病毒的构建过程包括
1.首先通过PCR克隆犬2型腺病毒基因组(31.3kb)上下游两末端各1.0kb的片段，正向、串联连接克隆到质粒pPolyII的多克隆位点，形成重组质粒pPoly-CAV53end(4.1kb)。上游片段的5’端有ClaI位点，下游片段的3’端有AscI位点，两片段中间形成单一酶切位点NotI，可以线性化，两个片段在质粒中的排列方式如图1所示。
2.利用犬2型腺病毒疫苗株培养液提取病毒的全基因组，和经NotI酶切线性化的pPoly-CAV53end共转化E coli SURE，涂布氨苄青霉素抗性琼脂平板，过夜培养后挑取重组菌落，扩大培养，碱裂解法提取质粒，酶切鉴定，获得重组有犬2型腺病毒全基因组的质粒克隆，命名为pPolyII-CAV2(33.3kb)；以SalI和NruI双酶切，回收29.2kb大片段A备用。
3.以狂犬病病毒SRV9株糖/核等结构蛋白cDNA为目的基因，通过SalI/NotI酶切质粒pTX，并经Klenow和dNTPs补平，获得其cDNA片段B；同时，通过EcoRV酶切pIRES1neo，牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)脱磷，获得载体片段C，B、C二片段以T4DNA连接酶连接过夜，转化JM109大肠杆菌，鉴定获得正向连接的糖/核等结构蛋白表达载体pIX-neo。
4.通过NotI和XbaI双酶切pIX-neo，Klenow和dNTPs补平后回收大片段D，D片段以T4DNA连接酶自连过夜，转化大肠杆菌JM109，鉴定，获得neo基因缺失的糖/核等结构蛋白表达载体pIX-neoΔ。
5.以NruI和XhoI双酶切糖/核等结构蛋白表达载体pIG-neoΔ，以Klenow和dNTPs补平后回收含外源基因的片段E，作为糖/核等结构蛋白的表达盒待用。
6.提取犬2型腺病毒基因组，KpnI酶切，回收4.861kb片段F(在全基因组中的位置为23303-28164bp)，其中含有E3区。将片段F克隆到pVAX1载体的KpnI位点，获得pVAX-E3。
7.以DraIII和SspI双酶切pVAX-E3，Klenow和dNTPs补平并经CIAP去磷后回收6.76kb片段G。片段E、G以T4 DNA连接酶连接过夜，转化JM109大肠杆菌，鉴定获得糖/核等结构蛋白表达盒与E3转录方向一致的重组质粒pVAX-E3X。
8.利用SalI和NruI酶切pVAX-E3X，回收含外源基因表达盒的片段H，定向克隆到片段A中，转化JM109，鉴定重组质粒，获得正确插入目的基因的重组病毒基因组质粒pPolyII-CAV2-X。
9.碱裂解法制备5微克重组病毒基因组质粒pPolyII-CAV2-X，以ClaI和AscI双酶切，游离重组全基因组，乙醇沉淀酶切产物，通过脂质体转化法将该重组全基因组转化犬肾传代细胞系MDCK，每两天传代一次，直至细胞出现典型的葡萄串状细胞病变。
10.病变MDCK细胞部分上清收集保存，余下部分提取病毒基因组，以HindIII和XhoI分别酶切分析鉴定，获得重组有糖/核等结构蛋白表达盒的犬2型腺病毒。
二.狂犬病病毒糖/核等结构蛋白的重组犬2型腺病毒的免疫原性
1.在MDCK细胞上大量制备狂犬病病毒糖/核等结构蛋白的重组犬2型腺病毒，测定TCID50。以无免疫史的家犬为受试动物，每条犬肌肉注射0.2ml TCID50为10-6.0的重组病毒；同时以犬2型腺病毒疫苗株免疫犬作为对照组。
2.免疫后1周开始每隔1周采集和分离免疫犬及对照犬血清一次。
3.采用间接ELISA方法，即以纯化的狂犬病病毒作为抗原包被酶标板，待检免疫犬血清与之反应，再以辣根过氧化物酶标记的羊抗犬二抗结合并显色。结果表明，重组病毒免疫后狂犬病病毒(糖/核等结构蛋白)特异性抗体显著升高。
4.采集核蛋白重组苗免疫后4周犬的抗凝血液，按2×0.1ml分装入2个离心管中，加入红细胞裂解液，感作后离心，沉淀用0.2mlPBS悬浮，将FITC标记的羊抗犬CD4+和CD8+抗血清分别与PBS悬浮的白细胞4℃感作1h，经PBS洗涤2次后悬浮进行FACS检测。结果表明，免疫犬CD4+数量较对照组显著增高，CD4+/CD8+比值显著增加。说明，重组苗中核蛋白诱导了水平较高的细胞免疫。
三.狂犬病病毒糖/核等结构蛋白的重组犬2型腺病毒诱导产生抗体的中和试验作用及免疫保护作用
取前一试验中对照组及免疫组犬血清各100μl，各与35LD50狂犬病强毒CVS细胞毒混合，室温孵育3h后，后肢皮下注射BALB/c乳鼠各40只，每只10μl，观察4周。结果显示，与对照组犬血清共孵育的CVS造成全部40只乳鼠发病死亡，而重组病毒免疫犬血清孵育组无发病致死。说明该重组CAV-2诱发机体产生的糖/核等结构蛋白抗体具有显著的中和作用。
从以上结果可以得出，本发明的积极效果在于重组病毒是通过将携带狂犬病病毒糖/核等结构蛋白表达盒的重组全基因组DNA序列转染犬2型腺病毒E3区易感细胞(即MDCK细胞系)中获得的。其无需进行大量复杂的病毒分离、鉴定和纯化工作。同时本重组疫苗除了具有犬2型腺病毒的生物学和免疫学特征以外，还展现了狂犬病病毒糖蛋白或核蛋白的免疫学特性，即除了可刺激机体产生针对犬腺病毒的免疫力以外，还可产生针对狂犬病病毒的免疫力，实现了外源基因的持续稳定表达。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明做进一步的描述：
实施例1：CAV-2可复制性全基因组的克隆
参照CAV-2DNA首、尾端核苷酸序列，设计如下2对引物：
F5：5’-CCATCGATGCATCATCAATAATATACAGGACAAAG
R5：5’-GCGGCCGCTTCGGCAAGGGCCTTTAGATAGC
F3：5’-GCGGCCGCACTCATAGAAGTAGGCAGCTCCG
R3：5’-CGGCGCGCCATCATCAATAATATACAGGACAAAG
其中F5内引入ClaI位点(ATCGAT)，R5、F3内引入NotI位点(GCGGCCGC)，R3内引入AscI位点(GGCGCGCC)。
以CAV-2基因组DNA为模板，以F5R5、F3R3引物对分别进行PCR扩增，反应混合物成分如下：
10×PCR Buffer        5μl
25mM MgCl             4μl
CAV-2DNA              1μl(200ng)
10mM引物              各5μl
2.5mM dNTP              3μl
Pfu DNA聚合酶           1μl(1U)
加水补足至总体积        50μl
PCR条件如下：
96℃    预变性5min后进入循环
95℃    40sec
55℃    40sec
72℃    120sec
25个循环后，PCR产物以DNA回收试剂盒回收。引物对F5R5的扩增产物以ClaI和NotI双酶切，引物对F3R3的扩增产物以NotI和AscI双酶切，载体pPolyII以ClaI和AscI双酶切，酶切反应参照如下体系进行：
    10×Buffer               5μl
    PCR产物或质粒            500ng
    限制性内切酶             5U
    加水补足至总体积         50μl
酶切条件为：37℃水浴1h，反应完成后，于1％琼脂糖凝胶上电泳，紫外灯下切取酶切后的条带，以DNA凝胶回收试剂盒回收DNA，溶于20μl去离子水中备用。
上述3个酶切产物在如下体系内，12℃进行连接反应过夜：
    10×ligation Buffer      2μl
    DNA片段                  各约100ng
    T4DNA连接酶              1μl
    加水补足至总体积         20μl
取过夜连接产物5μl，转化E.coli JM109，涂布氨苄青霉素抗性LB-琼脂平板，鉴定重组菌落，正确重组质粒命名为pPoly-CAV53end(4.1kb)。
以NotI酶切pPoly-CAV53end，质粒线性化后，取约200ng，与CAV-2基因组DNA 1000ng混合，共转化E.coli SURE感受态细菌，涂布氨苄青霉素抗性LB-琼脂平板，鉴定重组菌落。经细菌内同源重组，CAV-2 DNA完整重组入质粒pPoly-CAV53end，该重组质粒命名为pPolyII-CAV-2(33.3kb)。以AscI和ClaI双酶切该重组质粒可游离出CAV-2全基因组。
实施例2：含CAV-2E3区片段的克隆、改造和狂犬病病毒糖/核等结构蛋白表达盒的构建
参照实施例1中的酶切反应体系，取CAV-2DNA 1μg，以KpnI酶切，电泳，切胶，以试剂盒回收其中的4.8kb片段；再以KpnI酶切质粒pVAX1，以碱性磷酸酶(CIAP)去磷酸化后，回收线性化片段(3.0kb)。按照实施例1中的连接反应体系将4.8kb的含E3区的片段和3.0kb的pVAX1连接，重组质粒命名为pVAX-E3(7.8kb)。对pVAX-E3以DraIII和SspI进行双酶切，以Klenow补平末端，CIAP去磷酸化后回收6.76kb片段备用。
以SalI和NotI双酶切含狂犬病病毒糖蛋白基因的质粒pTG，Klenow补平后回收1.6kb片段，连入经EcoRV酶切并回收的线性化质粒pIRES1neo，转化E.coliJM109，正确重组质粒命名为pIG-neo(6.8kb)；以NotI和XbaI双酶切pIG-neo，Klenow补平，回收5.4kb片段，并以T4 DNA连接酶自连，转化E.coli JM109，鉴定获得去除IVS、IRES、neo等元件的表达质粒pIG-neoΔ(5.0kb)。以NruI和XhoI双酶切质粒pIG-neoΔ，Klenow补平后回收2.5kb片段并与上一步骤回收的6.76kb片段连接，转化E.coli JM109，获得正向重组质粒pVAX-E3-G(9.3kb)。
核蛋白(N)等狂犬病病毒结构蛋白以同样的步骤和不同的限制性内切酶分别重组到E3区内，获得正向的重组质粒。
实施例3：狂犬病病毒糖/核等结构蛋白-CAV-2重组基因组的构建和重组病毒的包装
重组质粒pVAX-E3-G或pVAX-E3-N等和pPolyII-CAV-2分别以NruI和SalI双酶切，并分别回收5.5kb和29.2kb片段，两片段连接，转化E.coli JM109，鉴定重组质粒，将糖/核等结构蛋白表达盒插入CAV-2 E3区的重组质粒分别命名为pPolyII-CAV-G(34.7kb)和pPolyII-CAV-N(34.5kb)等。
重组基因组转染细胞前18h，MDCK细胞传代入50ml细胞培养瓶，以无抗生素培养基培养。
重组基因组pPolyII-CAV-G或pPolyII-CAV-N(34.5kb)等6μg，以AscI和ClaI双酶切，酶切产物经等体积氯仿抽提后，2倍体积乙醇沉淀，沉淀物溶于500μl DMEM培养基；另取20μl脂质体Lipofectamine(Invitrogen)，溶于500μl DMEM培养基；DNA溶液与脂质体溶液混合，室温感作20min后，加入前1日传代的MDCK细胞瓶内，6h后弃去细胞上清，换新鲜培养基。隔日传代，直至细胞出现聚集、变圆、呈葡萄串样改变。细胞及培养上清冻融3次后收集分装。电镜观察，有大量典型的腺病毒粒子。
实施例4：狂犬病病毒糖/核等结构蛋白-犬2型腺病毒重组病毒的鉴定
1.重组病毒的基因组鉴定
取50ml培养瓶内已呈葡萄串状病变的单层MDCK细胞，倾弃培养基，以PBS洗涤2次，加入800μl新鲜配制的细胞裂解液(0.6％SDS，10mM EDTA，100μg/ml蛋白酶K)，37℃温育1小时，加入200μl 5M NaCl，轻柔混匀后，冰水浴1小时。将全部混合物移入离心管，于4℃，12000rpm离心40min，上清移入另管，以等体积酚∶氯仿抽提2次，加入终浓度0.25M醋酸钠和2倍体积无水乙醇，12000rpm离心10min，DNA沉淀以70％乙醇洗涤1次，无菌风干后，溶于50μl去离子水。DNA完全溶解后，取1μg于20μl体系内，分别以HindIII、XhoI和SacI进行酶切，鉴定外源基因及其表达盒的插入大小、方向等。
2.TCID50测定
将1×107MDCK细胞传入96孔细胞培养板，每孔内细胞约1×105，补加培养基至100μl。次日，接入待测病毒样品。在1-11孔内，进行10-1，10-2→10-11稀释，A-H列同浓度重复。7天后，以Karber法计算待测重组病毒的TCID50。
3.蛋白表达鉴定(Western blotting)
取含犬2型腺病毒、糖/核等结构蛋白-犬2型腺病毒重组病毒及狂犬病病毒SRV9株的细胞裂解液各50μl，加等量2×SDS-PAGE上样缓冲液，沸水浴10min，冷却至室温，短时离心后进行SDS-PAGE电泳。电泳完毕，将胶上蛋白样品电转移到硝酸纤维素膜上，先后与兔抗狂犬病病毒多抗、HRP标记羊抗兔二抗反应，最后以DAB/H2O2显色，根据显色带出现与否及其位置判定糖/核等结构蛋白-犬2型腺病毒重组病毒是否表达狂犬病病毒糖蛋白或核蛋白。
4.毒力鉴定
取4-5月龄犬腺病毒和狂犬病病毒抗体阴性犬40条，分8组，每组5条，分别肌肉注射含有106TCID50和107TCID50的狂犬病病毒糖/核结构蛋白-重组腺病毒细胞培养液。注射后，观察注射犬的饮食、精神等表现、测量体温、计数白细胞数量和其它临床表现等，并在4周后各取5条106TCID50和107TCID50注射犬解剖，观察大体病理变化，并进行肝等组织切片进行观察。
5.稳定性鉴定
1×106MDCK细胞连续传入25cm2细胞培养瓶内，每次细胞长满后接种，按培养瓶内培养基体积的0.5％接入重组病毒，接种后3-4天收毒，连续传代40次，标记并保存每次的培养液，同时每隔5代，提取感染细胞中的腺病毒基因组，分别以HindIII、XhoI和SacI进行酶切，鉴定外源基因及其表达盒的大小、方向并进行DNA测序等。
结果：
1.重组病毒基因组内正确插入了糖/核等结构蛋白的完整表达盒，且该表达盒处在部分缺失的E3区内，启动子方向与病毒基因组转录方向一致；
2.0.1ml狂犬病病毒糖蛋白-犬2型腺病毒重组病毒的TCID50为10-5.6-10-6.8；0.1ml狂犬病病毒核蛋白-犬2型腺病毒重组病毒的TCID50为10-6.0-10-7.0；
3.犬病病毒糖蛋白-犬2型腺病毒重组病毒表达了狂犬病病毒糖蛋白，其分子量约66kD，狂犬病病毒核蛋白-犬2型腺病毒重组病毒表达了狂犬病病毒核蛋白，其分子量约55kD，与狂犬病病毒SRV9株相应蛋白的分子量一致；
4.毒力检测结果显示，注射犬未出现饮食和精神表现等异常，体温在正常范围内(37.5℃-39.0℃)波动变化。体内白细胞计数显示，白细胞总数(7.5-16.0×109/L)分类计数均在正常范围之内，注射犬未出现蓝眼或厌食等临床表现。
解剖未见主要组织器官出现异常变化，重组病毒注射犬肝和肾组织切片与对照犬的组织切片无明显区别。
5.稳定性鉴定结果表明，重组病毒经过40次传代，重组病毒的基因组，包括糖/核等结构蛋白的表达盒大小和方向均保持不变，糖/核等结构蛋白DNA序列均未发生改变。
实施例5：狂犬病病毒糖蛋白-犬2型腺病毒重组疫苗的免疫效果
实验动物
未经免疫接种的4-5月龄幼犬40条，随机分为2组，每组20条；
动物免疫
分别以TCID50为10-6.0的CAV-2弱毒疫苗及狂犬病病毒糖蛋白重组CAV-2疫苗对甲乙组免疫，剂量均为每条0.5ml，后肢内侧皮下注射。
免疫检测
免疫前及免疫后第7d、14d、21d、28d、35d和42d分别采少量静脉血，分离血清，以间接ELISA法检测被免疫犬的糖蛋白抗体产生水平，即以纯化狂犬病病毒SRV9株包被反应板，以50倍稀释的待检血清与之反应，再以辣根过氧化物酶标记的抗犬IgG与血清抗体结合，最后邻苯二胺(OPD)/H2O2为显色剂进行显色反应，测定490nm处的紫外吸收值，以评价和比较受试犬体内抗体水平的变化。
强毒攻击试验
免疫后6周的甲组犬，随机分为甲A、甲B两组，乙组犬，随机分为乙A、乙B两组，每小组10条犬。甲A、乙A两组以CAV-2及CAV-1强毒混合物接种；甲B、乙B两组以狂犬病病毒强毒株接种。各犬接种剂量均为100 LD50。隔离观察各犬至接种后40d，详细记录各小组犬的发病及死亡情况。
结果
1.所有犬只，免疫前血清内检不出抗CAV-2及抗狂犬病病毒的特异性抗体；
2.所有犬免疫后21d，其血清中皆可检出抗CAV-2抗体，至第42d，抗体仍维持在较高水平；
3.乙组犬免疫后21d，其血清中还可检出抗狂犬病病毒糖蛋白的抗体，抗体消长规律与抗CAV-2抗体相当；
4.甲A乙A两组被免疫犬皆能抵抗CAV-2和CAV-1强毒攻击，存活率为95％(19/20)；
5.甲B小组不能抵抗狂犬病病毒强毒攻击，存活率为0(0/10)，乙B小组能抵抗狂犬病病毒强毒攻击，存活率为90％(9/10)。
结论
狂犬病病毒糖蛋白重组犬2型腺病毒疫苗可诱发机体产生针对犬腺病毒和狂犬病病毒的特异性中和抗体，对犬腺病毒和狂犬病病毒感染有保护作用。
实施例6：狂犬病病毒糖蛋白主要抗原区-犬2型腺病毒重组疫苗免疫犬试验
实验动物
未经免疫接种的4-5月龄幼犬40条，随机分为2组，每组20条；
动物免疫
分别以TCID50为10-6.0的CAV-2弱毒疫苗及狂犬病病毒糖蛋白主要抗原区重组CAV-2疫苗对甲、乙组免疫，剂量均为每条0.5ml，颈部皮下注射。
免疫检测
免疫前及免疫后第7d、14d、21d、28d、35d和42d分别采少量静脉血，分离血清，以间接ELISA法检测被免疫犬针对糖蛋白主要抗原区的抗体产生水平。首先以纯化狂犬病病毒SRV9株包被酶联板，然后加入50倍稀释的待检血清，感作、洗涤后，以辣根过氧化物酶标记的抗犬IgG与之反应，最后以邻苯二胺(OPD)/H2O2进行显色反应，测定490nm OD值，以评价并比较免疫前后和不同组间受试犬的抗体水平。
强毒攻击试验
免疫后6周的甲组犬，随机分为甲A、甲B两组，乙组犬随机分为乙A、乙B两组，每组10条犬。甲A、乙A两组以CAV-2及CAV-1混合强毒肌肉注射；甲B、乙B两组以狂犬病病毒强毒CVS株注射，注射剂量均为100 LD50。隔离观察40d，详细记录各组犬的发病及死亡情况。
结果
1.所有犬只，免疫前血清内检不出抗CAV-2及抗狂犬病病毒的特异性抗体；
2.所有犬免疫两周后，血清中均可检出很高水平的抗CAV-2抗体，至第42d，抗体仍维持在较高水平；
3.乙组犬免疫两周后，血清中除了可以检出抗CAV-2抗体以外，还可检出较高水平的抗狂犬病病毒抗体，抗体消长规律与抗CAV-2抗体一致；
4.甲A、乙A两组免疫犬均能抵抗CAV-2和CAV-1强毒攻击，存活率为100％(20/20)；
5.甲B组不能抵抗狂犬病病毒强毒攻击，存活率仅为20％(2/10)，乙B组能抵抗狂犬病病毒强毒株的攻击，存活率为90％(9/10)。
结论
狂犬病病毒糖蛋白主要抗原区-犬2型腺病毒重组疫苗可诱发机体产生针对犬腺病毒和狂犬病病毒的特异性中和抗体，对犬腺病毒和狂犬病病毒强毒攻击具有保护作用。
实施例7：狂犬病病毒核蛋白-犬2型腺病毒重组疫苗免疫犬的试验
实验动物
未经免疫接种的4-5月龄幼犬40条，随机分为2组，每组20条；
动物免疫
分别以TCID50为10-6.0的CAV-2弱毒疫苗及狂犬病病毒核蛋白-CAV-2重组疫苗对甲、乙组进行免疫，剂量均为每条0.5ml，颈部皮下注射。
免疫检测
免疫前及免疫后第7d、14d、21d、28d、35d和42d分别采少量静脉抗凝血，分离白细胞并悬浮于PBS中。以荧光标记的羊抗犬CD4+和CD8+抗血清与悬浮白细胞4℃感作1h，PBS洗涤后进行FACS检测，比较甲乙组CD4+数量与CD4+/CD8+比值的大小与相互关系，以评价狂犬病病毒核蛋白重组CAV-2疫苗免疫后受试犬细胞免疫水平的变化。
强毒攻击试验
免疫后6周的甲组犬，随机分为甲A、甲B两组，乙组犬，随机分为乙A、乙B两组，每小组10条犬。甲A、乙A两组以CAV-2及CAV-1强毒混合物接种；甲B、乙B两组以狂犬病病毒强毒株接种。各犬接种剂量均为100 LD50。隔离观察各犬至接种后40d，详细记录各小组犬的发病及死亡情况。
结果
1.所有犬只，免疫后21d，其外周血CD4+数量及CD4+/CD8+比值较免疫前均有增加；
2.乙组犬免疫后21d，其外周血CD4+数量及CD4+/CD8+比值较同时采集的甲组犬外周血增加显著，但消长趋势一致；
4.甲A乙A两组被免疫犬皆能抵抗CAV-2和CAV-1强毒攻击，存活率为100％(20/20)；
5.甲B小组不能抵抗狂犬病病毒强毒攻击，存活率为0(0/10)，乙B小组能抵抗狂犬病病毒强毒攻击，存活率为70％(7/10)。
结论
狂犬病病毒核蛋白-犬2型腺病毒重组疫苗可诱发机体产生针对犬腺病毒和狂犬病病毒的特异性细胞免疫，对犬腺病毒和狂犬病病毒感染有保护作用。

Claims (5)

1、狂犬病病毒糖/核等结构蛋白的犬2型腺病毒重组疫苗，其特征在于：以犬2型腺病毒为载体，将犬2型腺病毒基因组E3区进行部分缺失后，插入外源基因或其表达盒，外源基因为狂犬病病毒的结构蛋白基因，即糖蛋白基因或核蛋白基因。
2、根据权利要求1所述的狂犬病病毒糖/核等结构蛋白的犬2型腺病毒重组疫苗，其特征在于所述的对犬2型腺病毒基因组的改造，其具体操作是在克隆有犬2型腺病毒全基因组的质粒上进行的，该质粒可在大肠杆菌(如JM109)内高拷贝复制，能够大量制备。即在质粒水平上对腺病毒基因进行酶切、连接等操作，改造后的全基因组又可以通过酶切从质粒上释放下来。
3、根据权利要求1所述的狂犬病病毒糖/核等结构蛋白的犬2型腺病毒重组疫苗，其特征在于所述的犬2型腺病毒E3区部分缺失是通过E3区内的自然酶切位点和/或人为突变的酶切位点酶切后产生的；
4、根据权利要求1所述的狂犬病病毒糖/核等结构蛋白的犬2型腺病毒重组疫苗，其特征在于所述的重组病毒携带的狂犬病病毒结构蛋白表达盒由巨细胞病毒(CMV)立即早期(IE)启动子指导，以狂犬病病毒糖蛋白或核蛋白为目的基因，以SV40病毒多聚A(polyA)为终止信号共同组成。
5、根据权利要求1所述的狂犬病病毒糖/核等结构蛋白的犬2型腺病毒重组疫苗，其特征在于所述的重组病毒的获得是以改造后的全基因组转染犬2型腺病毒易感细胞即MDCK细胞获得的。
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