CN112725288A - 犬腺病毒2型弱毒疫苗株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明实施例涉及一种犬腺病毒2型弱毒疫苗株及其应用，该犬腺病毒2型弱毒疫苗株保藏号为CGMCC No.19992。本发明犬腺病毒2型(CAV2/15株)弱毒株为分离的自然弱毒株，具有以下优点：其培养毒价高，每毫升稳定在10⁹ _. ⁰TCID₅₀/ml；其免疫剂量低，最小免疫剂量为10³ _. ⁰TCID₅₀，使用10⁵ _. ⁰TCID₅₀即可达到好的免疫效果；其可用于各种品种、各种年龄的犬，也可用于怀孕犬；其使用安全，超剂量注射(注射20倍免疫剂量)仍然对犬安全。

Description

犬腺病毒2型弱毒疫苗株及其应用

技术领域

本发明属于生物制品领域。本发明涉及犬腺病毒2型弱毒疫苗株及其应用。

背景技术

犬腺病毒包括犬腺病毒1型(Canineadenovirus virus 1,CAV1)和犬腺病毒2型(CAV2)，犬腺病毒2是引起犬传染性喉气管炎(canine infectious laryngotracheitis，CIL)的主要病原。本病为高度接触性传染病，各种年龄犬均可感染，尤其是4月龄以下的幼犬，可以造成全窝或全群咳嗽，因此该病依临床特征常称为"犬窝咳"，可导致幼犬发育不良。临床症状主要表现持续性高热、咳嗽、浆液性至粘液性鼻漏、扁桃体炎、喉气管炎和肺炎，幼犬的症状通常比较严重。病理变化主要见肺炎和支气管炎病变，肺充血、实变、膨胀不全，支气管淋巴结充血、管腔有大量分泌物。本病常与犬副流感病毒、疱疹病毒病等混合感染，这时症状复杂而严重，死亡率增高。

对于本病尚无特效疗法，防制本病的最有效措施是定期接种犬腺病毒2型疫苗。

犬腺病毒2型在我国普遍存在，且发病率较高，对犬危害较大。为预防该类传染病，国内外都在进行大量研究，但目前疫苗存在针对性不强、造价高等缺点，研制新型高效的犬腺病毒2型疫苗尤为重要。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

发明目的

本发明的目的在于提供一株犬腺病毒2型弱毒疫苗株及其应用。

解决方案

为了实现本发明的目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明目的之一是提供一株犬腺病毒2型弱毒疫苗株，其保藏号为：CGMCCNo.19992。

在一种可能的实现方式中，犬腺病毒2型弱毒CAV2/15株在MDCK细胞上传代50代，其培养毒价稳定在每毫升10^9.0TCID₅₀以上。

在一种可能的实现方式中，犬腺病毒2型弱毒CAV2/15株免疫剂量低，最小免疫剂量为10^3.0TCID₅₀。

在一种可能的实现方式中，犬腺病毒2型弱毒CAV2/15株在MDCK细胞上传代50代，对犬安全，无致病性。

在一种可能的实现方式中，犬腺病毒2型弱毒CAV2/15株注射20倍免疫剂量(2×10⁶TCID₅₀)仍然对犬安全。

本发明目的之二是提供一种上述犬腺病毒2型弱毒疫苗株在制备治疗、预防犬腺病毒2型所致疾病的药物中的应用。

在一种可能的实现方式中，所述药物包括疫苗；可选地，所述疫苗为：犬腺病毒2型弱毒疫苗或犬腺病毒2型弱毒疫苗株与其它病原体联合制备的多联苗。

在一种可能的实现方式中，其它病原体选自以下的一种或多种：犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒1型、犬冠状病毒。

本发明目的之三是提供一种犬腺病毒2型弱毒疫苗，其包括上述犬腺病毒2型弱毒疫苗株及药学上可接受的辅料。

在一种可能的实现方式中，犬腺病毒2型弱毒疫苗株以含有犬腺病毒2型弱毒疫苗株的病毒液形式加入，所述含有犬腺病毒2型弱毒疫苗株的病毒液通过以下方法制备：犬腺病毒2型病毒毒种按2％比例接种于MDCK单层细胞，37℃培养4～5天，当细胞病变达到80％以上收获病毒液。

在一种可能的实现方式中，所述药学上可接受的辅料包括耐热稳定剂，所述耐热稳定剂为冻干保护剂且包括以下配方：脱脂奶粉1000g，蔗糖80g，明胶25g分别用适量注射用水溶解，115℃灭菌20分钟；VC 200g，谷氨酸钠100g，两性霉素5.0mg，溶解过滤除菌，定溶为10000mL。

在一种可能的实现方式中，所述犬腺病毒2型弱毒疫苗在免疫后，可产生较高的抗体，强毒攻击可达100％(5/5)的保护，免疫期1年以上。

在一种可能的实现方式中，用冻干保护剂制备冻干苗，4℃条件下可保存2年以上。

在一种可能的实现方式中，所述犬腺病毒2型弱毒疫苗适用于各种品种、各种年龄的犬；可选地，所述犬腺病毒2型弱毒疫苗也适用于怀孕犬。

本发明目的之四是提供一种多联疫苗，其包括上述犬腺病毒2型弱毒疫苗株、其它病原体及药学上可接受的辅料。

在一种可能的实现方式中，其它病原体选自以下的一种或多种：犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒1型、犬冠状病毒。

本发明目的之五是提供一种上述犬腺病毒2型弱毒疫苗株在制备诊断或检测犬腺病毒2型所致疾病的试剂中的应用。

有益效果

1、本发明犬腺病毒2型(CAV2/15株)弱毒株为分离的自然弱毒株，具有以下优点：

(1)其培养毒价高，每毫升稳定在10^9.0TCID₅₀/ml；

(2)其免疫剂量低，最小免疫剂量为10^3.0TCID₅₀，使用10^5.0TCID₅₀可达到很好的免疫效果；

(3)其可用于各种品种、各种年龄的犬，也可用于怀孕犬；

(4)其使用安全，超剂量注射(注射20倍免疫剂量)仍然对犬安全；

(5)其生产工艺简单，用MDCK细胞培养即可，对设备要求不高，适合于工业化大规模生产；

(6)其遗传性状稳定，经传代50代后未出现碱基的缺失或突变、毒力和病毒毒价均未发生任何改变、也无毒力返强、无致病作用；

(7)其对氯仿不敏感、对乙醚不敏感、对胰蛋白酶敏感、耐酸性较强、有一定耐热性，既可单独制成疫苗、还可以与其它病原体制成联苗。

2、本发明犬腺病毒2型(CAV2/15株)弱毒株制备的活疫苗，具有免疫产生期早，免疫持续期长，不受母源抗体干扰的优点。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

图1为犬腺病毒2型CAV2/15株毒电镜照片。

图2为犬腺病毒2型CAV2/15株毒的PCR扩增的电泳鉴定图。M:DL2000Marker，1:CAV2阳性对照，2:CAV2/15分离株，3:阴性对照。

本发明将所涉及犬腺病毒2型弱毒株(CAV2/15株)提交专利认可机构保藏(即保藏证明中的200611株)，微生物保藏号为：CGMCC No.19992；保藏时间是：2020年6月12日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

实施例1犬腺病毒自然弱毒CAV2/15株分离鉴定。

病毒分离：辽宁省沈阳市一养犬场多数断奶幼犬出现轻微咳嗽、流浆液性鼻液等临床症状，诊断为疑似犬腺病毒病，解剖无明显病理变化。取犬的扁桃体、肺与肺门淋巴结组织分离病毒。

细胞：犬肾传代细胞MDCK(87代)细胞系购自中国兽药品监察所，北京生泰尔科技股份有限公司保存供应。

实验动物：实验用犬为42～49日龄未经犬腺病毒疫苗免疫，抗原、抗体阴性的健康比格犬，购于沈阳康平实验动物研究所。

血清：犬CAV2标准阳性血清(SN≥1:512)、阴性血清，由本发明人实验室自制。

1、病毒培养：取收集的病料组织研磨后以1：8的比例加入PBS(pH7.2，含青、链霉素)研磨处理，8000r/min 4℃离心15min，取上清用无菌滤器(0.22μm)过滤除菌。将病毒液按2％的比例接入单层MDCK细胞，吸附1h，加入含2％胎牛血清的DMEM维持液，37℃静置培养4～5天，每天观察有无细胞病变(CPE)，待细胞病变达80％以上时收毒，-30℃保存备用。

细胞病变观察结果：CAV2/15毒株在MDCK细胞上生长，37℃培养第2天开始出现细胞病变(CPE)，培养4天80％以上的细胞出现同样病变。以此传代培养，4～5天后出现同样稳定CPE，细胞变圆、细胞萎缩、呈葡萄状细胞病变。

2、病毒鉴定

(1)病毒形态学观察：取待鉴定的CAV2/15株毒接种于MDCK单层细胞培养毒，经-30℃冻融3次，8000r/min离心沉淀15min，取上清作电镜负染观察，取细胞作超薄切片观察。

病毒形态观察结果：取CAV2/15株毒细胞培养物经8000r/min离心15min，取上清用电镜负染标本和切片进行观察，可见CAV2病毒呈六角型或圆型，不规则结晶排列，直径为70nm左右，粒子分为中空和实心两种.病毒衣壳呈二十面体对称，无囊膜.在衣壳的顶端可看到纤突，如图1所示。

(2)病毒核酸类型鉴定：采用5-碘脱氧尿核苷(5-IUDR)法鉴定病毒核酸类型。将MDCK细胞用96孔板培养，待细胞长成单层后，倾去生长液，换成含2％胎牛血清的DMEM维持液，并在维持液内加入5-IUDR，使其终浓度为50μg/mL，随后在细胞培养孔内接种不同稀释度的病毒液，每个稀释度3个重复，接种后逐日观察细胞病变。以病毒出现CPE的最高稀释倍数的负对数作为病毒的效价，测定病毒在MDCK细胞上生长的TCID₅₀变化，同时以不加5-IUDR的培养液作对照。因5-IUDR对DNA病毒有明显的抑制作用，对RNA病毒没有或仅有较低的抑制作用，两者的差距低于2个对数值为RNA病毒，反之为DNA病毒。通过5-IUDR对病毒生长的抑制作用，用处理组与对照组病毒滴度之差来判定该病毒的核酸类型。

病毒核酸类型鉴定结果：病毒经5-IUDR处理后观察72h，结果处理组与对照组病毒的平均TCID₅₀分别为10^3.2和10^6.3，两者的差距不低于2个对数值，由此说明该病毒株是一种DNA病毒。结果见表1。

表1核酸类型测定结果

(3)病毒对氯仿敏感试验：按4.8％比例向病毒液中加入分析纯氯仿，于4℃条件下振荡混合10min，随后5000r/min离心5min除去细胞碎片，吸取病毒上清液，滴定病毒感染力，对照病毒液内按4.8％的比例加入生理盐水，同法处理作为对照。处理后在96孔培养板上培养测定病毒毒价，根据试验组和对照组病毒毒价差异是否大于2个滴度，以确定该病毒对氯仿的敏感性。

对氯仿敏感试验结果：病毒经氯仿处理后，试验组病毒平均TCID₅₀为10^5.5/mL，对照组为10^6.3/mL，试验组和对照组值相差小于1个对数，说明该病毒对氯仿不敏感。结果见表2。

表2氯仿感性试验结果

(4)病毒对乙醚敏感试验：取收获培养的病毒细胞培养液，装入无菌离心管，5000r/min离心20min除去细胞碎片，吸取病毒上清液，分成两管，一管按20％比例加入乙醚，另一管不加乙醚对照管。两管在冰浴上振荡60min，以5000r/min离心20min，吸取病毒液层，连续吹打使乙醚充分挥发，然后处理组和对照组病毒液分别接种细胞培养，测定病毒效价。以此确定该病毒对乙醚的敏感性。

对乙醚敏感试验结果：病毒经乙醚处理后，试验组病毒平均TCID50为10^5.7/mL，对照组为10^6.3/mL，试验组和对照组值相差小于1个对数，说明该病毒对乙醚不敏感。结果见表3。

表3乙醚感性试验结果

(5)病毒胰蛋白酶敏感性试验：取培养的病毒液装入无菌离心管，5000r/min离心20min除去细胞碎片，吸取病毒上清液，分成两管，一管加入无血清DMEM稀释的1％胰蛋白酶溶液0.5ml，混匀后置37℃感作1h，随即加入灭活犊牛血清4ml，充分混匀,终止酶促反应。另一管不加胰蛋白酶的无血清DMEM作为对照，在96孔细胞培养板上测定病毒效价。以确定该病毒对胰蛋白酶的敏感性。

对胰蛋白酶敏感性试验结果：病毒经胰蛋白酶处后，试验组与对照组病毒平均TCID₅₀分别为10^3.1/mL和10^5.9/mL，病毒平均效价相2.8个对数值，差异显著，说明该病毒对胰蛋白酶敏感，结果见表4。

表4胰蛋白酶敏感性试验结果

(6)病毒耐酸性试验：将培养的病毒液5000r/min离心20min，用0.1moL/L的盐酸将病毒液调至pH值3.0，同时设生理盐水为对照，置37℃恒温箱感作2h，再用5.6％的NaHCO₃将处理组病毒液调至pH值7.2，在96孔细胞平装板上培养，确定pH值3.0及其对照组病毒液的感染力。以确定该病毒的耐酸性强弱。

病毒耐酸性试验结果：病毒经过pH值3.0处理后，结果处理组与对照组平均TCID₅₀分别为10^5.3/ml和10^6.1/ml，病毒效价与对照组病毒效价相差平均不超过1个对数值，说明该病毒的耐酸性较强，见表5。

表5耐酸性试验结果

(7)病毒耐热性试验：将病毒悬液等量分装，其中病毒悬液分别置于50℃、56℃、60℃、70℃、80℃水浴中感作30min和60min，感作后在96孔细胞培养板上测定经不同温度和不同时间处理后的病毒效价，以确定该病毒的耐热性强弱。

耐热性试验结果：病毒经过56℃水浴中感作30min和60min，在96孔板上测定病毒效价，每个稀释度4个重复，处理30min后病毒平均效价为10^5.4/ml，处理60min后病毒平均效价为10^2.4/ml，对照组平均效价为10^6.2/ml，分别下降0.8和3.9个滴度，其最高耐受为56℃、60min。表明该病毒有一定耐热性。结果见表6。

表6 CAV2/15病毒对不同温度的耐热性试验

(8)病毒红细胞凝集试验：用鸡、猪、豚鼠、猴、犬、大鼠和人“O”型红血球，用pH7.4、0.15mL/L PBS液稀释，以6000r/min离心、洗涤后，再用pH7.4 PBS液制备5mL/L红细胞悬液，取CAV2/15毒株培养物分别做血凝试验(HA)。以确定CAV2/15毒株对红细胞的凝集反应。

红细胞血凝性试验结果：CAV2/15毒株能凝集鸡、猴、大鼠红细胞，对犬、绵羊、兔、猪、豚鼠和人“O”型红细胞均不发生凝集。符合犬腺病毒2型血凝特性。

(9)病毒特异性血清中和试验：取CAV2/15毒株细胞培养物2.0mL，加入CAV2阳性血清0.5mL，混匀，置37℃作用1h。感作后接种MDCK细胞单层两瓶，接种量为细胞培养液的5％，同时设未中和的病毒和正常细胞培养物对照，于37℃中培养96h，逐日观察CPE情况，以测定CAV2/15毒株是否能被特异的CAV2抗体所中和。

病毒特异性血清中和试验结果：用CAV2特异阳性血清与CAV2/15毒株细胞培养物中和后，接种MDCK细胞单层，于37℃培养96h，逐日观察CPE情况，结果均无CAV2特异的CPE，表明CAV2/15毒株能被特异的CAV2血清所中和。

(10)分子病毒学鉴定

引物设计：根据已发表的CAV2核苷酸序列，根据CAV2 M蛋白基因保守性和同源性分析，选择其E3基因保守区域设计一对特异引物，HAl：5'-CGCGCTGAACATTA CTACCTTGTC3’；HA2：5'-CCT AGAGCACTICGTGTCCGCTT3’，由北京生工公司合成，预期扩增片段大小为1030bp。

病毒DNA提取：DNA提取按EasyPure Viral DNA/RNA Kit说明书进行操作：取一个无菌的1.5mL离心管，加入20μLProteinase K，加入200μL样品，200μLBB5(包含5.6μgCarrier RNA)，漩涡混匀15秒。56℃孵育15分钟。加入250μL无水乙醇，漩涡混匀15秒，室温放置5分钟。将溶液加入到离心柱种，10 000g离心1分钟，弃掉液体。加入500μL WB5，10000g离心1分钟，弃掉液体。将离心柱转入一个新的1.5mL离心管中，加入20-50μL RNase-free Water，室温静置1分钟。室温10 000g离心1分钟，洗脱DNA。将DNA置于-20℃保存。PCR扩增：25μL反应体系,分别加入CAV2病毒模板2μL、10×PCR Buffer 2.5μL、dNTP 2μL、HA1和HA2 10pmol/L各1μL、TaKaRa TaqTM DNA聚合酶0.25μL，用去离子水补至25μL，于PCR仪上进行反应。PCR程序为：94℃预变性5min；94℃变性60S，55℃退火45S，72℃延伸45S，30个循环；72℃延伸10min。反应结束后取产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。PCR鉴定结果：扩增的PCR产物经l％琼脂糖电泳后观察结果，结果扩增出与预期相符的一条长1030bp的目的片段。见图2所示。

序列测序：经PCR鉴定后，取PCR扩增鉴定的产物，经北京生工公司进行序列测定，将测定的基因序列(犬腺病毒2型CAV2/15株毒的E基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。)与GenBank中其它CAV2相同序列进行比较分析。用DNASTAR.Lasergene软件分析其同源性。序列测定分析结果：结果表明CAV2/15E3基因与GenBank中的弱毒疫苗株kF2576982.1，ku315333.1，ku725671.1E3基因序列一致，同源性为100％。表明所分离的CAV2/15毒株为一株弱毒株。

实验结论：综上，将分离的犬腺病毒株经MDCK细胞传代培养可产生典型的细胞病变，经生物学、生物化学、分子生物学鉴定，血清中和试验，红细胞凝集试验，分子生物学和序列分析，证明该毒株为CAV2自然弱毒株，并将其命名为CAV2/15株。

实施例2犬体传代返祖试验

试验材料和方法

细胞：犬肾传代细胞(MDCK)，购于中国兽药监察监所，由北京生泰尔科技股份有限公司保存和提供。

毒种：犬腺病毒2型病毒CAV2/15株毒种，F50代；由北京生泰尔科技股份有限公司保存和提供。

实验动物：实验用犬为42～49日龄未经犬腺病毒2型疫苗免疫的CAV2抗原、抗体阴性的健康犬。

1、细胞传代稳定性试验：应用MDCK传代细胞，采取同步接毒的方法，37℃条件下培养，培养4～5天出现80％以上细胞病变(CPE)收获，再继续用MDCK培养传代至50代(CAV2/15F50)观察各代次细胞的变化，并测定各代次培养物病毒毒价。

细胞传代后遗传稳定性试验结果：CAV2/15毒株在MDCK细胞上传50代，均可出现相同有细胞肿大、变圆，形成葡萄串状细胞病变，经病毒毒价测定，其病毒价稳定在10^9.0TCID₅₀/mL以上。表明CAV2/15毒株在MDCK细胞中传50代，性状稳定，经细胞传代后毒力和病毒毒价均未发生任何改变。

2、犬体传代返强试验：取CAV2/15F50代细胞培养物10ml，接种42～49日龄健康犬2只，每犬口、鼻各接种10mL，隔离饲养，每天观察其精神、食欲、体温与粪便性状，于第7天扑杀，观察记录是否有无病理变化，取两犬的扁桃体、肺与肺门淋巴结各10g，共60g，混合后用Hank’s液制成1:10乳剂，经8000rmin离心沉淀15min，取上清接种42～49日龄健康犬2只，每只犬口、鼻各接种20ml，如此用42～49日龄健康犬2只连续传5代，观察试验犬精神、食欲、体温与粪便变化和剖解变化。取第5代犬的扁桃体、肺与肺门淋巴结制成1:10乳剂，离心取上清，用MDCK细胞分离病毒，并进行进一步鉴定。

动物体传代后毒力返强试验结果：CAV2/15毒株经MDCK细胞传50代，接种42～49日龄健康犬，连传5代后，各代次所有试验犬的精神、食欲、体温、运动和粪便均正常，无犬腺病毒2型临床症状表现，剖检均无可见病理变化。结果表明CAV2/15毒经细胞传50代后再经犬体传5代遗传性状稳定、无毒力返强，对犬安全，无致病性。见表9。

表9 CAV2/15毒株犬体传代毒力返强试验结果

3、病毒传代后白细胞总数检测：取CAV2/15F50代细胞培养物，再用犬连传5代，同时于第5代接种后3天、5天和7天采血检测白细胞总数，同时设对照犬2只。观察犬接种CAV2/15后不同时间的白细胞总数与对照犬有无差异。

病毒传代后白细胞总数检测结果：CAV2/15F50代细胞培养物经犬连传5代，取犬体传5代接种犬后3天、5天和7天采血进行白细胞总数检测，检测结果显示接种犬与对照犬白细胞总数无差异，均在正常值范围内。结果表明CAV2/15株毒接种42～49日龄犬安全，无任何副作用，无毒力返强和致病作用。结果见表10。

表10接种后不同时间血液中白细胞总数检测结果

4、病毒传代后核苷酸检测及基因序列比较：取CAV2/15F50代细胞培养物再经犬体传5代后分离获得的CAV2/15毒，与CAV2/15F50代MDCK细胞培养物同时进行PCR扩增鉴定和序列测定并进行同源性比较。

病毒传代后PCR检测及基因序列比较结果：结果表明CAV2/15弱毒株传50代后未发生基因变异，PCR扩增结果和序列测定比较完全一致，未出现碱基的缺失或突变，未发生基因变异，仍保持较好的遗传稳定性。

实验结论：综上，CAV2/15毒株经MDCK传50代，均可产生典型的CPE，毒价测保持在10^9.0TCID₅₀/mL以上。经犬体传5代后未出现碱基的缺失或者突变，表明CAV2/15毒株遗传性状稳定，对犬安全、无致病性。

实施例3犬腺病毒2型活疫苗(CAV2/15株)的制备

犬腺病毒2型(CAV2/15株)弱毒抗原的制备：CAV2/15株病毒毒种按2％比例接种MDCK细胞单层，37℃培养4～5天，当细胞病变达到80％以上冻融收获病毒液。

病毒培养毒价测定：将培养的病毒液作10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹稀释，接种至已长有良好MDCK细胞单层的96孔细胞培养板，每个稀释度接种4孔，0.1mL/孔，同时设病毒和正常细胞对照，置37℃、5％CO₂培养箱培养4～5天，每天观察并记录CPE，按照Reed-Muench法计算TCID₅₀，病毒培养毒价≥10^9.0TCID₅₀/mL。

犬腺病毒2型活疫苗(CAV2/15株)的配备：将检验合格的犬腺病毒2型(CAV2/15株)病毒作为抗原(以病毒液的形式)与冻干保护剂(其配方为：脱脂奶粉1000g，蔗糖80g，明胶25g分别用适量注射用水溶解，115℃灭菌20分钟；VC 200g，谷氨酸钠100g，两性霉素5.0mg，溶解过滤除菌，定溶为10000mL)以7：1的比例混匀后，定量分装疫苗瓶，每瓶1mL，病毒含量最终为10^5.0TCID₅₀/头份，低温冷冻干燥。

犬腺病毒2型活疫苗(CAV2/15株)成品检验

1、经剩余水分、真空度按现行《中华人民共和国兽药典》附录检进行检测，均应合格。

2、无菌检验：按现行《中华人民共和国兽药典》附录检进行检测，应无细菌、霉菌、支原体。

3、外源性病毒检验

红细胞吸附检验:分别将各待检毒种接种其适应细胞于37℃培养4天，然后按《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，结果应均为血吸附阴性。

特定病毒检验:分别采用PCR/RT-PCR法检测CDV、CPV、CAV1、CPIV、CCV和RV检测，结果应均为阴性。

根据犬腺病毒2型活疫苗(CAV2/15株)的制备标准，制备了三批犬腺病毒2型活疫苗(CAV2/15株)，批号为201701，201702，201703。

实施例4犬腺病毒2型活疫苗(CAV2/15株)免疫原试验、最小免疫量和血清抗体与攻毒保护之间的相关性

试验材料和方法

犬腺病毒2型活疫苗(CAV2/15株)，批号：201701。

实验动物：实验用犬为42～49日龄未经犬腺病毒2型疫苗免疫的CAV2抗原、抗体阴性的健康犬。

1、一次单剂量注射安全试验

对42～49日龄犬安全性试验：选择CAV2抗原、抗体阴性的42～49日龄健康犬10只，随机分成2组，每组5只，1组用犬腺病毒2型活疫苗(CAV2/15株)颈部皮下注射1个免疫剂量(1×10^5.0TCID₅₀)，另一组犬注射生理盐水作为空白对照。注射后观察21天，观察所有犬局部反应、精神、食欲、体温、眼鼻分泌物、咳嗽等临床症状。

结果表明：注射疫苗后对犬无刺激和任何不良反应轻，表明犬腺病毒2型(CAV2/15株)活疫苗对犬安全。

2、单剂量重复注射安全试验

选择CAV2抗原、抗体阴性的42～49日龄健康犬10只，随机分成2组，每组5只，用犬腺病毒2型活疫苗(CAV2/15株)颈部皮下注射1个免疫剂量，间隔21天重复注射一次，连续注射3次。另5只犬注射生理盐水作为空白对照。三次注射后观察21天，观察所有犬局部反应、精神、食欲、体温、眼鼻分泌物、咳嗽等临床症状。

结果：所有犬经三次注射后均未出现任何不良临床反应，表明三次单剂量重复注射对犬安全，无任何不良反应。

3、超剂量注射安全试验

选择CAV2抗原、抗体阴性的42～49日龄健康犬10只，随机分成2组，每组5只，试验组5只犬每一只均用犬腺病毒2型活疫苗(CAV2/15株)颈部皮下注射20个免疫剂量(2×10^6.0TCID₅₀)，另5只犬注射生理盐水作为对照。注射后观察21天，观察犬的局部反应、精神、食欲、体温、眼鼻分泌物、咳嗽等临床症状。

结果：注射疫苗犬仅在注射部位有轻微红肿症状，经过1～2天后逐渐消失，未出现任何其它不良临床反应，对犬安全，无明显的不良反应。

4、对怀孕犬安全性试验

用怀孕母犬10只，随机分成2组，每组5只犬。试验组5只犬均于产前30天左右颈部注射犬腺病毒2型活疫苗(CAV2/15株)，每只注射20个免疫剂量(2×10^6.0TCID₅₀)；另一对照组犬注射生理盐水作为对照。注射后观察母犬的临床变化至分娩，包括有无早产、流产、死胎、弱胎等情况以及仔犬的成活、生长发育等。

结果：所有试验犬均正常分娩，无流产和死胎，仔犬均成活、生长发育正常。表明该疫苗超剂量注射怀孕母犬安全。

5、犬腺病毒2型活疫苗(CAV2/15株)最小免疫量和最低血清SN抗体保护价测定：取CAV2抗原、抗体阴性的健康犬20只，分为4组，每组5只犬，第1、2、3组每犬分别接种犬腺病毒2型CAV2/15株细胞毒10^5.0TCID₅₀、10^4.0TCID₅₀、10^3.0TCID₅₀，第4组犬注射细胞培养液作为对照，分组隔离饲养。于接种的当天和第21天各采血测定每只犬的SN抗体效价，并于接种后21天用CAV2强毒(10.0×10^6.0TCID₅₀)对所有犬肌肉注射和滴鼻攻毒，攻毒后逐日观察21天。以能保护80％试验犬的最低用量为最小免疫量，以能使试验犬攻毒保护最低的SN抗体值为其最低SN抗体保护价，并以此分析和确定疫苗的免疫期、免疫间隔时间及免疫后血清SN抗体效价与攻毒保护的相关性。

试验表明结果：接种10^5.0、10^4.0和10^3.0TCID₅₀ CAV2/15弱毒的试验犬，接种后均未出现任何临床异常症状，接种21天后SN抗体由接种当天≤1:2分别上升到1:556～752，1:256～578和1:18～63，用CAV2强毒攻毒后，观察21天，结果第1组(10^5.0TCID₅₀)和第2组(10^4.0TCID₅₀)均为5/5保护，且全部健活；第3组(10^3.0TCID₅₀)5只犬攻毒后4只正常，1只攻毒后第7天出现体温39.5℃，流浆液性鼻液等临床症状。未免疫的对照犬，SN抗体始终小于1:6，用CAV2强毒攻毒后，5只犬全部都出现CAV2临床症状，观察期间均存活。结果表明，接种10^5.0TCID₅₀和10^4.0TCID₅₀的CAV2/15弱毒株可使犬获得100％(5/5)的免疫保护；接种10^3.0TCID₅₀可使犬获得80％(4/5)的免疫保护；最低SN抗体保护值为l:18。因此，根据结果确定：CAV2/15弱毒株的最小免疫剂量为10^3.0TCID⁵⁰，最低SN抗体保护效价为1:18。为了使免疫更可靠，规定疫苗免疫剂量为10^5.0TCID₅₀，根据疫苗免疫犬后血清中和抗体SN值检测结果表明，其SN抗体与攻毒保护呈正相关，SN抗体最低保护效价为1:18。因此可以用检测疫苗免疫犬后血清中SN抗体值来代替攻毒保护的检验方法。结果见表11。

表11犬腺病毒2型活疫苗(CAV2/15株)最小免疫剂量和最低SN抗体与攻毒保护试验结果

6、母源抗体消长规律试验：选用犬腺病毒2型活疫苗(CAV2/15株)免疫后的母犬所产仔犬5只，分别于出生后14d、21d、28d、35d、42d、49d、56d、63d、70d采血测定SN抗体效价，检测其母源抗体消失规律，以确定对仔犬进行首次免疫的时间。

试验结果：母源抗体检测结果表明，幼犬出生后63天SN抗体仍高于最低保护效价(1:18)，出生后70天时，2/5的犬SN抗体值低于最低保护效价，表明幼犬母源可保持63d以上。

7、母源抗体干扰试验：分别选择母源抗体≤1:2和1:15的42～49日龄健康犬各5只，均以21天的间隔，接种犬腺病毒2型活疫苗(CAV2/15株)3次，每次接种剂量均为10⁵TCID₅₀/头份，于每次接种前和第3次接种后21天采血测定其SN抗体效价，以检测母源抗体对犬腺病毒2型活疫苗(CAV2/15株)免疫的干扰情况。

试验结果：以相同剂量的犬腺病毒2型活疫苗(CAV2/15株)免疫不同母源抗体水平犬的2两组试验结果表明，对不同母源抗体水平的犬，第1次免疫14天后SN抗体均升高，经3次免疫后SN抗体均在1:512～1:1024之间。其中母源抗体≤1:2组犬三次免疫后抗体分别为1:31(26～45)、1:123(96～150)、1:769(512～1024)；母源抗体为1:15组犬三次免疫后抗体分别为1:28(22～39)、1:119(85～150)、1:753(512～1024)。两组差异不显著，可见母源抗体对犬腺病毒2型活疫苗(CAV2/15株)免疫无明显的干扰作用。。

8、免疫期试验：取42～49日龄CAV2抗原、抗体阴性的健康犬15只，其中10只犬采用一个免疫剂量(10^5.0TCID₅₀)免疫犬，连续免疫3次，每次间隔21d，另5只不免疫作为对照。分别于免疫后90d、180d、270d、360d、420d各采血，测定血清SN抗体，并于免疫后420d用CAV2强毒进行攻毒保护试验，以能维持最低抗体保护价的最长时间即为其免疫期。

试验结果：免疫后不同时间SN抗体价结果表明，犬3次免疫后420d时，血清中SN抗体均保持在最低保护效价1:18以上，分别用CAV2强毒攻毒，对照组犬5只均表现为CAV2症状，免疫组均正常，无CAV2临床症状。结果表明CAV2/15弱毒株的免疫原较好，免疫期可达420d。为了确保免疫效果，确定免疫期为360d(1年)。

实验结论

CAV2/15弱毒株经MDCK传代50代，其病毒毒价稳定在10^9.0TCID₅₀/mL以上；用20倍免疫剂量接种42～49日龄易感犬和怀孕犬，对犬安全、无致病性。

用CAV2/15毒接种犬后抗体检测表明，CAV2/15弱毒株最小免疫剂量为10^3.0TCID₅₀，最低SN抗体保护值为l:18，SN抗体保护效价与攻毒之间成正相关，因此，检测犬腺病毒2型疫苗免疫效果，可采用检测免疫后犬血清SN抗体，代替攻毒保护检验方法。

实施例5犬腺病毒2型活疫苗(CAV2/15株)保存期试验

试验材料和方法

犬腺病毒2型活疫苗(CAV2/15株)，批号为201701，201702，201703。

实验动物：实验用犬为42～49日龄未经犬腺病毒2型疫苗免疫的CAV2抗原、抗体阴性的健康犬。

犬腺病毒2型活疫苗(CAV2/15株)保存试验：将三批疫苗在2～8℃条件下保存，分别在保存后第3、6、9、12、18、24、30个月随机取样，进行性状、真空度、剩余水分含量、病毒含量检测和效力检验。

三批疫苗常规检验：结果表明三批疫苗2～8℃保存30个月，性状、真空度、剩余水分均合格。

三批疫苗无菌检验：将三批疫苗在2～8℃条件下保存30个月随机取样，按现行《中华人民共和国兽药典》附录检进行检测。结果：三批疫苗均无细菌、霉菌、支原体检出。

三批疫苗病毒含量检验：三批疫苗在2～8℃条件下保存30个月随机取样，结果三批疫苗病毒含量均大于10^5.0TCID₅₀/头份。

安全试验：取2～8℃保存30个月三批疫苗，每批疫苗分别于犬颈部皮下接种42～49日龄犬5只，1mL/只，检测注射后24h、48h、7天体温变化，连续观察21天。

结果：所有犬注射后均无任何不良临床反应，均健活，表明该三批疫苗保存30个月后免疫犬安全，无不良副作用。

效力检验：用2～8℃保存30个月三批疫苗，每批疫苗经颈部皮下注射接种42～49日龄犬5只，1.0mL/只，间隔21日按照相同方法和剂量免疫3次，同时取5只不接种对照犬。第3次免疫后21天时分别用犬腺病毒2型强毒进行攻毒，攻毒后观察21天，观察各组犬局部反应、精神、食欲、体温、眼鼻分泌物、咳嗽等临床症状和剖解病理变化，计算攻毒保护率。

结果：三批疫苗在2～8℃条件下保存30个月对犬均可以提供较好的保护力，攻毒保护率均达到100％(5/5)保护。对照组犬5/5发病。

综上表明：三批疫苗在2～8℃条件下保存30个月对犬安全、可靠、稳定、有效。为了给靶动物提供更好的保护力，规定该疫苗在2～8℃条件下保存，保存期为24个月。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京华夏兴洋生物科技有限公司

北京生泰尔科技股份有限公司

<120> 犬腺病毒2型弱毒疫苗株及其应用

<130> 1103-200391F

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1030

<212> DNA

<213> Canine adenovirus virus 2

<400> 1

cagtttggga aatgctacca aactgcaaat gagtctgccc acgggcctat ttccaggccc 60

ctcaacgaga tgcctcttcc ccagcgtaac cataaatgct tccctcttct atcccgcctt 120

tctggagctg cccccacagt acagcaatga ccttagcaat gtgcgctggt ataaagtaga 180

ccccagcggc ttccaagccc aaaaaatctc taaagtcaga agcggaggca gaaaagagaa 240

cctgcatccc aactgggcct tggttaccta tactggagac cttcttgtct tgcatgtttc 300

gccaaacacc cttggactgt ggctggcagc cgtgcagcat cgcggggggc gcactaattt 360

cattaccttc aacataactg tacccaactg gcaacaaaat ctagtaacca tatttaatca 420

acacgagccc ccaaaaaagg gcgataatta tgaggacagt tttatggaat ggactctgtt 480

taaaaagctc aaaaaaggct tatttagagt aacttgcaga gccaagtcaa tattcccaga 540

gtgcgtcctc aacatcaccc gcgacggaac tttcctgctt attggggata gcaaaaagac 600

cccctatgtc atcctgctgc ccttttttgc aaaccccaaa gaagacactc caattttaat 660

ggcccttagc cattccatgc ccgtcgccat acctgacact gcaatgccta tatatatttc 720

catcatgttt tttattgtgg ccatgctagc caccctcagc cttctaatgg gactaaacaa 780

caaaatcagg cccatgtagc ttgtcaaata aacttaccta atttttgcta agacgtctgg 840

gtcctgcgtt tctatgtcca ccaaagtccc ctcttcccag ctttggtact ccacttgtgc 900

gcgcgagcca gcttgcggat gtgcttgaaa gataatgtgg tctctcccaa cagcttcccg 960

ttcaccagca ccagggccat gaagcggaca cgagagggct ctaggaaacc ctttggtact 1020

tccacttgtg 1030

Claims (10)

1.一株犬腺病毒2型弱毒疫苗株，其特征在于：保藏号为CGMCC No.19992。

2.一种权利要求1所述的犬腺病毒2型弱毒疫苗株在制备治疗、预防犬腺病毒2型所致疾病的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述药物包括疫苗；可选地，所述疫苗为：犬腺病毒2型弱毒疫苗或犬腺病毒2型弱毒疫苗株与其它病原体联合制备的多联苗。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：其它病原体选自以下的一种或多种：犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒1型、犬冠状病毒。

5.一种犬腺病毒2型弱毒疫苗，其特征在于：包括权利要求1所述的犬腺病毒2型弱毒疫苗株及药学上可接受的辅料。

6.根据权利要求5所述的一种犬腺病毒2型弱毒疫苗，其特征在于：所述犬腺病毒2型弱毒疫苗株以含有犬腺病毒2型弱毒疫苗株的病毒液形式加入，所述含有犬腺病毒2型弱毒疫苗株的病毒液通过以下方法制备：犬腺病毒2型病毒毒种按2％比例接种于MDCK单层细胞，37℃培养4～5天，当细胞病变达到80％以上收获病毒液。

7.根据权利要求5所述的一种犬腺病毒2型弱毒疫苗，其特征在于：所述药学上可接受的辅料包括耐热稳定剂，所述耐热稳定剂为冻干保护剂且包括以下配方：脱脂奶粉1000g，蔗糖80g，明胶25g分别用适量注射用水溶解，115℃灭菌20分钟；VC 200g，谷氨酸钠100g，两性霉素5.0mg，溶解过滤除菌，定溶为10000mL。

8.根据权利要求5所述的一种犬腺病毒2型弱毒疫苗，其特征在于：所述犬腺病毒2型弱毒疫苗适用于怀孕犬。

9.一种多联疫苗，其包括上述犬腺病毒2型弱毒疫苗株、其它病原体及药学上可接受的辅料；可选地，其它病原体选自以下的一种或多种：犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒1型、犬冠状病毒。

10.一种权利要求1所述的犬腺病毒2型弱毒疫苗株在制备诊断或检测犬腺病毒2型所致疾病的试剂中的应用。

Images