CN112899240B - 犬副流感病毒弱毒株、其应用及疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及兽药领域，具体涉及一种犬副流感病毒弱毒株、其应用及疫苗。本发明提出一株犬副流感病毒弱毒株，保藏号为：CGMCC No.19993。本发明的犬副流感病毒弱毒株的针对性强，可用于各种品种、各种年龄的犬，也可用于怀孕犬、产生的抗体高、免疫期长。

Description

犬副流感病毒弱毒株、其应用及疫苗

技术领域

本发明涉及兽药领域，具体涉及一种犬副流感病毒弱毒株、其应用及疫苗。

背景技术

犬副流感病毒(Canine parainfluenza virus，CPIV)是引起犬上呼吸道感染和脑脊髓炎的传染性疾病的主要病原，CPIV核酸型为单股负链RNA，多形性，一般呈球形，也可见长达数微米的丝状体，直径约80nm～200nm。犬副流感病毒对犬、狐、貉的神经系统有较强的感染力，病情严重可导致死亡，从而严重影响犬和狐等养殖业的发展。犬副流感病毒可感染，以幼犬较重。感染途径主要是呼吸道，呼吸道分泌液通过空气、尘埃感染其他犬，也可通过直接接触传染。感染期间犬因抵抗力降低而继发其他细菌感染，临床表现为发热、流涕和咳嗽，病理变化以卡他性鼻炎和支气管炎为主。当与其它病原混合感染时，病情加重。可见鼻孔周围有浆液性或黏液脓性鼻漏、结膜炎、扁桃体炎、气管和支气管炎。神经型主要表现为急性脑脊髓炎和脑内积水，整个中枢神经系统和脊髓均有病变。犬副流感病毒对犬、狐、貉的神经系统有较强的感染力，病情严重可导致死亡，影响犬和狐等养殖业的发展。对于犬副流感病毒尚无特效疗法，防治犬副流感病毒的最有效措施是定期接种犬副流感病毒疫苗。

犬副流感病毒在我国普遍存在，且发病率较高，对犬危害较大。为预防该类传染病，目前国内外的疫苗存在针对性弱、造价高等缺点。鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的首要发明目的在于提供一株犬副流感病毒弱毒株。

本发明的第二发明目的在于提供该犬副流感病毒弱毒株的应用。

本发明的第三发明目的在于提供该犬副流感病毒弱毒株的制备方法。

本发明的第四发明目的在于提供一种用于预防犬副流感的疫苗。

为了实现本发明的发明目的，采用的技术方案为：

本发明涉及一株犬副流感病毒弱毒株，保藏号为CGMCC No.19993。

可选的，所述犬副流感病毒弱毒株的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

本发明涉及上述犬副流感病毒弱毒株在制备用于预防或诊断犬科动物的犬副流感的药物或试剂中应用。

可选的，所述犬科动物包括幼犬和成年犬，所述成年犬包括怀孕母犬。

本发明涉及上述犬副流感病毒弱毒株的生产方法，所述犬副流感病毒弱毒株采用Vero细胞进行培养传代；

和/或，所述生产方法包括：将所述犬副流感病毒弱毒株用Vero细胞培养，在细胞传代时按5％比例同步接种含10％胎牛血清的DMEM培养液，培养22～26小时，优选24小时后，换成含有2％胎牛血清的DMEM维持液，继续培养5～7天，当细胞病变达到80％以上时收获病毒液；

所述培养的条件优选为：温度为36～37℃，气体环境中含有5％CO₂。

本发明涉及一种用于预防犬副流感的疫苗，所述疫苗含有预防有效量的上述的犬副流感病毒弱毒株，所述疫苗中犬副流感病毒含量为10^5.0TCID₅₀/mL/头份。

本发明涉及一种用于预防犬副流感的疫苗组合物，所述组合物中含有预防有效量的上述的犬副流感病毒弱毒株以及药学上可接受的载体。

可选的，所述疫苗组合物的剂型为冻干剂，所述药学上可接受的载体选自冻干保护剂，所述冻干保护剂中含有脱脂奶粉、蔗糖、明胶、谷氨酸钠和两性霉素中的一种或多种。

可选的，所述冻干保护剂中含有脱脂奶粉900～1200重量份、蔗糖60～100重量份、明胶15～30重量份、谷氨酸钠90～120重量份、两性霉素0.001～0.01重量份；优选为：脱脂奶粉1000重量份、蔗糖80重量份、明胶20重量份、谷氨酸钠100重量份、两性霉素0.005重量份；

和/或，所述疫苗组合物中，所述犬副流感病毒弱毒株与所述冻干保护剂的重量比为5～10：1，优选7：1。

本发明涉及一种多联疫苗，含有上述疫苗，还含有犬腺病毒疫苗、犬细小病毒疫苗、犬瘟热病毒疫苗和犬冠状病毒疫苗中的一种或多种。

本发明至少具有以下有益的效果：

本发明的犬副流感病毒弱毒株的针对性强，最小免疫剂量为10^3.0TCID₅₀/mL，最低SN抗体保护值为l:16，可用于各种品种、各种年龄的犬，也可用于怀孕犬、不受母源抗体干扰、产生的抗体高、免疫期长。

本发明的犬副流感病毒弱毒株生产工艺简单，采用Vero细胞培养，对设备要求不高，适合于工业化大规模生产。

本发明的犬副流感病毒弱毒株可以制成单苗，还可以与其它病原体制成联苗。本发明的弱毒疫苗病毒毒价高，生产成本低，有利于我国普遍推广应用。

附图说明

图1为犬副流感病毒弱毒株CPIV/15株电镜照片。

图2为犬副流感病毒弱毒株CPIV/15株毒的PCR扩增的电泳鉴定图。1：DL2000Marker，2：CPIV阳性对照，3：CPIV/15分离株。

保藏说明

本发明的犬副流感病毒弱毒株(CPIV/15株)的微生物保藏号：CGMCC No.19993；保藏时间：2020年6月12日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。

除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。

本发明实施例提出一株犬副流感病毒弱毒株，2015年自吉林省长春市不同宠物医院疑似犬副流感病犬鼻腔分泌物采集了五份样品，分别将采集的鼻腔分泌物加入含有青、链霉素的3倍PBS缓冲液(pH 7.2)，反复冻融3次后，经8000r/min 4℃离心15min后，用无菌滤器(0.22μm)过滤除菌，菌检阴性后置-30℃保存。将处理的病毒液分别同步接入Vero细胞，加入含10％胎牛血清的DMEM培养基，37℃5％CO₂静置培养24h后，换成含2％胎牛血清的DMEM培养基，37℃5％CO₂静置培养5～7天，每天观察有无细胞病变(CPE)，待细胞病变达80％以上时收毒，反复冻融3次，分装成小管，-30℃保存。对分离获得的毒株经过病毒形态学观察、红细胞凝集试验、生物学特性、分子生物学特性、致病力和动物回归等鉴定，结果从5份样品中获得一株犬副流感病毒自然弱毒株，命名为CPIV/15株。并于2020年6月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，保藏号为：CGMCC No.19993。本发明犬副流感病毒弱毒株(CPIV/15株)制备的活疫苗具有遗传性稳定，在Vero细胞上传代60代，再经犬体传5代未出现碱基的缺失或者突变；对犬安全、无致病性。对同源强毒攻毒可达到100％(5/5)保护，无致病性；免疫持久，在Vero细胞上传代60代其毒价稳定在10^8.0TCID₅₀/mL以上，免疫效果好。由此可见所分离的犬副流感病毒弱毒株(CPIV/15株)对犬可提供较好的免疫保护，是理想的疫苗候选株。与现有上市产品相比，具有病毒培养毒价高、不受母源抗体干扰，免疫持续期长。本发明实施例弱毒株的免疫期可达420天，为了确保免疫效果，确定免疫期为360天(1年)。

根据已发表的CPIV核苷酸序列，根据CPIV基因保守性和同源性分析，选择其N基因保守区域设计的特异引物对病毒RNA序列进行扩增，并测序，本发明实施例的犬副流感病毒弱毒株的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明实施例还涉及该犬副流感病毒弱毒株在制备用于预防或诊断犬科动物的犬副流感的药物或试剂中应用。犬科动物包括幼犬和成年犬，所述成年犬包括怀孕母犬。本发明通过实验发现，本发明的犬副流感病毒弱毒株对怀孕母犬安全，所有犬均正常分娩发育，无流产和死胎，仔犬均成活、生长发育正常。用10倍免疫剂量接种42～49日龄易感犬和怀孕犬，对犬安全、无致病性。犬副流感病毒活疫苗(CPIV/15株)对犬的最小免疫剂量为10^3.0TCID₅₀/mL，最低SN抗体保护值为l:16，犬副流感病毒活疫苗(CPIV/15株)免疫犬后血清SN抗体保护效价与攻毒之间成正相关，因此，检测疫苗的免疫效果可用检测免疫后犬血清SN抗体，代替攻毒保护检验方法。

犬副流感病毒活疫苗(CPIV/15株)对幼犬免疫不受母源抗体的影响。

本发明实施例还涉及该犬副流感病毒弱毒株的生产方法，犬副采用Vero细胞进行培养传代。具体的生产方法包括：将犬副流感病毒弱毒株用Vero细胞培养，在细胞传代时按5％比例同步接种含10％胎牛血清的DMEM培养液，培养22～26小时，优选24小时后，换成含有2％胎牛血清的DMEM维持液，继续培养5～7天，当细胞病变达到80％以上时收获病毒液；培养的条件优选为：温度为36～37℃，气体环境中含有5％CO₂。

其中，DMEM培养液的配方为：DMEM溶液86mL、胎牛血清10mL、青霉素液(10000u/mL)1mL、链霉素液(10000μg/mL)1mL、3％L-谷氨酰胺液1mL、1.1％丙酮酸钠溶液1mL，7.5％碳酸氢钠溶液调pH为7.2-7.4。DMEM维持液的配方为：DMEM溶液94mL、胎牛血清2mL、青霉素液(10000u/mL)1mL、链霉素液(10000μg/mL)1mL、3％L-谷氨酰胺液1mL、1.1％丙酮酸钠溶液1mL，7.5％碳酸氢钠溶液调pH为7.2-7.4。

本发明的毒株经Vero传60代，均可产生典型的CPE，毒价测保持在10^8.0TCID₅₀/mL以上。

本发明实施例还涉及用于预防犬副流感的疫苗，疫苗含有预防有效量的上述的犬副流感病毒弱毒株。疫苗中犬副流感病毒的滴度不低于10^8.0TCID₅₀/mL，最小免疫剂量为10^3.0TCID₅₀/mL，最低SN抗体保护值为l:16。

本发明实施例还涉及用于预防犬副流感的疫苗组合物，其特征在于，所述组合物中含有预防有效量的上述的犬副流感病毒弱毒株以及药学上可接受的载体。

其中，疫苗组合物的剂型为冻干剂，药学上可接受的载体选自冻干保护剂，冻干保护剂中含有脱脂奶粉、蔗糖、明胶、谷氨酸钠和两性霉素中的一种或多种。

具体的，冻干保护剂中含有脱脂奶粉900～1200重量份、蔗糖60～100重量份、明胶15～30重量份、谷氨酸钠90～120重量份、两性霉素0.001～0.01重量份；优选为：脱脂奶粉1000重量份、蔗糖80重量份、明胶20重量份、谷氨酸钠100重量份、两性霉素0.005重量份。在疫苗组合物中，犬副流感病毒弱毒株与所述冻干保护剂的重量比为5～10:1，优选7:1。采用本发明实施例配方的疫苗组合物具有安全可靠、保存期长等优点。

本发明实施例还涉及一种多联疫苗，含有上述的疫苗，还含有犬腺病毒疫苗、犬细小病毒疫苗、犬瘟热病毒疫苗和犬冠状病毒疫苗中的一种或多种。

实施例1犬副流感病毒自然弱毒CPIV/15株分离鉴定。

材料和方法

病料来源：从吉林省长春市宠物医院幼犬出现鼻孔周围有浆液性或黏液脓性鼻漏，并伴有轻微咳嗽等临床症状，初步诊断为疑似犬副流感病毒病。共收集到五份鼻腔分泌物病料(编号为1号，2号，3号，4号，5号)，分别取其鼻腔分泌物加入含有青、链霉素的3倍PBS缓冲液(pH 7.2)反复冻融3次后，经8000r/min 4℃离心15min后，用无菌滤器(0.22μm)过滤除菌，菌检阴性后置-30℃保存。

细胞：Vero(F87)细胞系购自中国兽医兽药品监察所，北京生泰尔科技股份有限公司保存供应。

实验动物：实验用犬为42～49日龄未经犬副流感病毒疫苗免疫，犬副流感病毒中和抗体(SN)阴性或≤2的健康比格犬，购于沈阳康平实验动物研究所。

血清：犬CPIV标准阳性血清(SN≥1:256)、阴性血清(SN≤1:2)，由本发明人实验室自制。

病毒初步分离：

病毒分离：分别将五份病毒液样品同步接入Vero细胞，加入含10％胎牛血清的DMEM营养液，37℃5％CO₂静置培24小时后，换成含2％胎牛血清的DMEM维持液，37℃5％CO₂静置培养5～7天，每天观察有无细胞病变(CPE)，连续盲传5代，第4代出现稳定的CPE，待细胞病变达80％以上收毒，反复冻融3次，将融化的病毒液转入离心管中，在4℃温度下，8000r/min离心15min，除去细胞碎片，收集上清液并分装成小管，保存于-80℃冰箱中备用。

形态学观察：取待鉴定的分离株毒接种于Vero细胞培养毒，经-30℃冻融3次，8000r/min离心10min，取上清作电镜负染观察，取离心细胞作超薄切片观察。结果，在5份样品中1号、2号、3号、5号可见犬副流感病毒形态。

细胞病变观察结果：CPIV/15毒株在Vero细胞上生长，37℃5％CO₂培养第3天开始出现细胞病变(CPE)，培养5～7天80％以上的细胞出现同样稳定CPE，细胞变圆、细胞萎缩、呈葡萄状细胞病变。

病毒形态观察：取CPIV/15株毒细胞培养物经8000r/min离心10min，取上清用电镜负染和切片染色进行观察，可见病毒呈圆形、长丝状等形态多样、大小不等的颗粒状的不规则形病毒颗粒，取其细胞培养物电镜超薄切片观察，可见有出芽生长的CPIV样病毒结构，如图1所示。

红细胞血凝性试验：对1号、2号、3号、5号4个样品经红细胞凝集试验结果表明，2号和5号样品对鸡、豚鼠、绵羊、兔和人“O”型红血球均有凝集作用，具有犬副流感病毒特性。

特异性血清中和试验结果：用CPIV特异阳性血清与对2号和5号2份样品的细胞培养物中和后，经Vero细胞传代培养3代，其中2个样品均无病毒生长和CPE。结果表明2个样品均可被CPIV阳性血清完全中和。

对犬体毒力试验：分别用以上2号和5号的细胞培养物20mL，各接种42～49日龄易感犬2只，每犬口、鼻各接种10mL，隔离饲养观察10天，每天观察其精神，食欲、体温和呼吸道临床症状，于第10天扑杀，观察有无特异病理变化，用气管分泌物和脑脊髓液进行病毒核酸检测，并于接种后3天、5天和10天采血检测白细胞总数，观察犬接种后不同时间的白细胞总数与对照犬有无差异。同时设照犬2只。结果2号和5号样品均检出CPIV特异的核酸；5号样品接种犬后，犬出现轻度咳嗽症状，白细胞总数略有减少；2号样品接种犬后，犬无任何临床症状，白细胞总数与对照犬无差异。从而初步确定2号样品为犬副流感弱毒株，命名为CPIV/15，并作进一步鉴定。

实施例2犬副流感弱毒株CPIV/15全面鉴定

病毒核酸类型鉴定：采用5-碘脱氧尿核苷(5-IUDR)法：将Vero细胞用96孔板培养，待细胞长成单层后，倾去生长液，换成含2％胎牛血清的DMEM维持液，并在维持液内加入5-IUDR，使其终浓度为50μg/mL，随后在细胞培养孔内接种不同稀释度的病毒液，每个稀释度4个重复，接种后逐日观察细胞病变。以病毒出现CPE的最高稀释倍数的负对数作为病毒的效价，测定病毒在Vero细胞上生长的TCID₅₀变化，同时以不加5-IUDR的培养液作对照。因5-IUDR对DNA病毒有明显的抑制作用，对RNA病毒没有或仅有较低的抑制作用，两者的差距低于2个对数值为RNA病毒，反之为DNA病毒。通过5-IUDR对病毒生长的抑制作用，用处理组与对照组病毒滴度之差来判定该病毒的核酸类型。

病毒核酸类型鉴定结果：病毒经5-IUDR处理后观察72h，结果处理组与对照组病毒的平均TCID₅₀/mL分别为10^4.4和10^5.1，两者的差距低于2个对数值，因5-IUDR对DNA病毒有明显的抑制作用，对RNA病毒没有或仅有较低的抑制作用，由此说明该病毒株是一种RNA病毒。结果见表1。结果见表1。

表1

病毒对氯仿敏感试验：按4.8％比例加入分析纯氯仿，于4℃条件下振荡混合10min，随后500r/min离心5min，吸取上层液体，滴定病毒感染力，对照病毒液内按4.8％的比例加入生理盐水，同法处理作为对照。处理后在96孔培养板上培养观察病毒毒价，根据试验组和对照组病毒毒价差异大于2个滴度，以确定该病毒对氯仿的敏感性。

对氯仿敏感试验结果：病毒经氯仿处理后，试验组病毒平均TCID₅₀/mL为10^1.3/mL，对照组为10^5.0，说明该病毒对氯仿敏感。结果见表2。

表2氯仿感性试验结果

病毒对乙醚敏感试验：取收获培养的病毒细胞培养液，装入无菌离心管，5000r/min离心20min除去细胞碎片，吸取病毒上清液，分成两管，一管按20％比例加入乙醚，另一管不加乙醚对照管。两管在冰浴上振荡60min，以5000r/min离心20min，液体上下两层，吸取病毒液层，连续吹打使乙醚充分挥发，然后处理组和对照组病毒液分别接种细胞培养，测定病毒效价。如试验组和对照组病毒毒价差异大于2个滴度，则病毒对乙醚敏感。以此确定该病毒对乙醚的敏感性。对乙醚敏感试验结果：病毒经乙醚处理后，试验组病毒平均TCID₅₀/mL为10^1.0，对照组为10^4.9，说明该病毒对乙醚敏感。结果见表3。

表3乙醚感性试验结果

病毒胰蛋白酶敏感性试验：取培养的病毒液装入无菌离心管，5000r/min离心20min除去细胞碎片，吸取病毒上清液，分成两管，一管加入无血清DMEM稀释的1％胰蛋白酶溶液0.5mL，混匀后置37℃感作1h，随即加入灭活犊牛血清4mL，充分混匀，终止酶促反应。另一管不加胰蛋白酶的无血清DMEM作为对照，在96孔细胞培养板上测定病毒效价。根据试验组和对照组病毒毒价差异是否大于2个滴度，来确定该病毒对胰蛋白酶的敏感性。

对胰蛋白酶敏感性试验结果：病毒经胰蛋白酶处后，试验组与对照组病毒平均TCID₅₀/mL分别为10^4.3和10^5.0，病毒平均效价相差小于1个对数值，差异不显著，说明该病毒对胰蛋白酶不敏感，结果见表4。

表4胰蛋白酶敏感性试验结果

病毒耐酸性试验：将培养的病毒液5000r/min离心20min，用0.1moL/L的盐酸将病毒液分别调至pH值3.0和5.0，同时设生理盐水为对照，置37℃恒温箱感作2h，再用5.6％的NaHCO₃将处理组病毒液调至pH值7.2，在96孔细胞平装板上培养，确定pH值5.0和3.0及其对照组病毒液的感染力。根据试验组和对照组病毒毒效价上否相差2个对数值以上判定，确定该病毒的耐酸性强弱。病毒耐酸性试验结果：病毒经过不同pH值5.0和3.0处理后，结果pH值5.0处理组与对照组病毒的平均TCID₅₀/mL分别为10^3.2和10^4.4；pH值3.0处理组与对照组平均TCID₅₀/mL分别为10^2.4和10^4.3，各组病毒效价与其相应对照组病毒效价相差平均超过1个对数值，说明该病毒的不耐酸，结果见表5。

表5耐酸性试验结果

病毒耐热性试验：将病毒悬液等量分装10瓶，其中4瓶分别置于50℃、60℃、70℃、80℃水浴中感作30min和60min，感作后在96孔细胞培养板上测定病毒效价，每个稀释度3个重复。病毒经不同温度和不同时间处理的病毒滴度，测定处理后病毒活性，以确定该病毒的耐热性强弱。耐热性试验结果：病毒经过50℃、60℃、70℃、80℃水浴中感作50min和60min，在96孔板上测定病毒效价，每个稀释度3个重复，结果经不同温度和不同时间处理后，其最高耐受限为50℃、50min，病毒效价为10^2.3，对照组为10^5.0，下降2.3个滴度，表明其最高耐受为50℃、50min，60℃处理50min仅有很少病毒存活。其它不同温度不同时间处理后病毒均被灭活而无活性，表明该病毒不耐热。结果见表6。

表6 CPIV/15病毒对不同温度的耐热性试验

病毒红细胞凝集试验：用鸡、猪、豚鼠、猪、绵羊、兔和人“O”型红血球，用pH 7.4、0.15mL/L PBS液稀释，以5000r/min离心、洗涤后，再用pH7.4 PBS液制备5.0mL/L红细胞悬液，取CPIV/15毒株培养物分别用做血凝试验(HA)。以确定CPIV/15毒株对动物红细胞的凝集反应。红细胞血凝性试验结果：经红细胞凝集试验结果表明，CPIV/15毒株对鸡、豚鼠、绵羊、兔和人“O”型红血球均有一定凝集作用，符合CPIV的特性。

病毒特异性血清中和试验：取CPIV毒株细胞培养物2.0mL，加入CPIV特异阳性血清1.0mL，混匀，置37℃作用1h，感作后接种Vero细胞单层两瓶，接种量为细胞培养液的5％，同时设未中和的病毒和正常细胞培养物对照，于37℃5％CO₂中培养5～7日，逐日观察CPE情况。以测定CPIV/15毒株是否能被特异的CPIV抗体所中和。病毒特异性血清中和试验结果：用CPIV特异阳性血清与CPIV/15毒株的细胞培养物中和后，经Vero细胞传代培养3代，无病毒生长和CPE，经RT-PCR扩增无CPIV特异片段扩出。表明该病毒可被CPIV阳性血清中和。

分子生物学鉴定

引物设计：根据已发表的CPIV核苷酸序列，根据CPIV基因保守性和同源性分析，选择其N基因保守区域设计一对特异引物，

SEQ ID NO:1P1:5'-AATGCCTATGCTGCACTTGC-3'，

SEQ ID NO:2P2:5'–ACGTCCTGGACCCTAAGTTTTG-3'，

由北京生工合成，扩增片段大小为667bp。

RNA的提取：取CPIV弱毒株培养液250μL，加入750μL TRIzol试剂，混匀后室温放置5min，再加入200μL氯仿，剧烈振摇15S，室温放置10min，4℃10 000r/min离心10min，小心吸取上层水相到另一个离心管内，加入等体积的异丙醇，混匀后室温放置10min，4℃10 000r/min离心10min，弃上清，沉淀中加入预冷的75％乙醇1mL，4℃10 000r/min离心10min，弃上清，干燥，将沉淀溶于40μL DEPC水中，直接用于反转录。

RT-PCR扩增：cDNA的合成：取RNA 7μL，加入1X RT Buffer 4μL、dNTP 6μL、P1 1μL、M-mLV 1μL、RNase inhibitor1 1μL，42℃水浴1h，70℃10min。PCR扩增：25μL反应体系，分别加入反转录产物2μL、10×PCR Buffer 2.5μL、dNTP 2μL、P1和P2 10pmol/L各1μL、TaKaRaTaqTM DNA聚合酶0.25μL，用去离子水补至25μL，于PCR仪上进行反应。PCR程序为：94℃预变性5min；94℃变性50S，53.5℃退火45S，72℃延伸45S，35个循环；72℃延伸10min。反应结束后取产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

RT-PCR鉴定结果：PCR扩增程序为：95℃预变性10min，94℃l min，50℃0.5min，72℃1min，30个循环，72℃延伸10min。扩增的PCR产物经l％琼脂糖电泳后观察结果，可得到与预期结果相符的一条长667bp的目的片段。结果如图2所示。

序列测序：经PCR鉴定后，取PCR扩增鉴定的产物，经北京生工公司进行序列测定，将测定的基因序列与GenBank中其它CPIV相同基因序列进行比较分析。用DNASTAR.Lasergene软件分析其同源性。序列测定分析结果：将所测得CPIV/15基因部分序列与GenBank中CPIV弱毒疫苗株N基因(KR265197.1，CPIV/BJ-202:KR265204.1)的相同基因序列百分率在97％，与弱毒疫苗株EF546391.1同源性为100％，表明所分离的CPIV/15毒株为一株弱毒株。

犬副流感病毒株CPIV/15株核苷酸序列(SEQ ID NO:1)。

实施例3犬体传代返祖试验

试验材料和方法：

细胞：非洲绿猴肾传代细胞(Vero)，购于中国兽药监察监所，由北京生泰尔科技股份有限公司保存。

毒种：犬副流感病毒弱毒CPIV/15株毒种，F50代；由北京生泰尔科技股份有限公司保存与提供。

实验动物：实验用犬为42～49日龄未经犬副流感病毒疫苗免疫的CPIV抗体SN阴性或≤2的健康比格犬。

细胞传代稳定性试验：应用Vero传代细胞，采取同步接毒的方法，37℃5％CO₂条件下培养，培养5～7天出现80％以上细胞病变(CPE)收获，再继续用Vero培养传代至60代(CPIV/15F60)观察各代次细胞的变化，并测定各代次培养物病毒毒价。

犬体传代返祖试验：取CPIV/15F60代细胞培养物10mL，接种42～49日龄易感犬2只，每犬注射和口、鼻各接种10mL，隔离饲养观察5天，每天观察其精神，食欲、体温与粪便性状，于第7天扑杀，观察记录是否有无病理变化，取两犬的气管分泌物、扁桃体和脑脊髓，混合后用Hank’s液制成1:10乳剂，经5000r/min离心沉淀10min，再以此物接种42～49日龄易感犬2只，每犬口、鼻接种50mL，如此用42～49日龄易感犬2只连续传5代，观察试验犬精神，食欲、体温与粪便变化和剖解变化。取第5代犬的气管分泌物、扁桃体和脑脊髓制成1:10乳剂，离心取上清，用Vero细胞分离病毒，并做进行进一步鉴定。

病毒传代后核苷酸检测及基因序列比较：用Vero细胞培养经犬体传5代后分离获得的CPIV毒，与CPIV-F35代Vero细胞培养物同时进行RT-PCR扩增鉴定和序列测定并进行同源性比较。

试验结果：

细胞传代后遗传稳定性试验结果：CPIV/15毒株在Vero细胞60代，均可产生典型的CPE，病毒毒价测定其病毒价稳定在10^8.0TCID₅₀/mL以上。表明CPIV弱毒株在Vero细胞中传60代，性状稳定，经细胞传代后毒力未发生任何改变。

动物体传代后毒力返强试验结果：CPIV/15毒株经Vero细胞传60代细胞培养物接种接种42～49日龄易感犬，连传5代后，所有试验犬精神，食欲，体温、运动和粪便均正常，无犬副流感临床症状表现，剖检均无可见病理变化。结果表明CPIV/15毒株对犬安全、无致病性，经细胞传60代后再经犬体传5代遗传性状稳定、无毒力返强，对犬安全，无致病性。见表7。

表7 CPIV/15毒株犬体传代毒力返强试验结果

病毒传代后RT-PCR检测及基因序列比较结果：用CPIV/15毒株犬体连传5代后的气管分泌物和脑脊髓中提取RNA，经RT-PCR扩增与CPIV/15 F35和CPIV/15F60代基础毒与犬体传5代后RT-PCR扩增结果和序列测定比较，结果完全一致，未出现碱基的缺失或突变，表明CPIV/15弱毒株传60代，再经犬体连续传5代后未发生基因变异，仍保持较好的遗传稳定性。

实施例4犬副流感病毒活疫苗(CPIV/15株)的制备

犬副流感病毒(CPIV/15株)弱毒抗原的制备：CPIV/15株病毒毒种按5％比例同步接种10％胎牛血清的培养液的Vero细胞，37℃5％CO₂培养培养24h，换成2％胎牛血清的维持液，37℃5％CO₂培养5～7天，当细胞病变达到80％以上冻融收获病毒液。

病毒毒价测定：将培养的病毒液作10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸稀释，接种已长成良好Vero细胞单层的96孔细胞培养板，每个稀释度接种4孔，0.1mL/孔，同时设病毒和正常细胞对照，置37℃、5％CO₂培养箱培养96～120小时，每天观察并记录CPE，按照Reed-Muench法计算TCID₅₀，病毒毒价应≥10^8.0TCID₅₀/mL为合格。

犬副流感病毒活疫苗(CPIV/15株)的配备：将检验合格的犬副流感病毒(CPIV/15株)病毒抗原与冻干保护剂(其配方为：脱脂奶粉1000g，三馏水9000mL，蔗糖80g，明胶20g，谷氨酸钠100g，两性霉素5.0mg。溶解过滤，121℃10min灭菌)按照7:1的体积比混匀后，定量分装疫苗瓶，每瓶1mL，病毒含量最终为10^5.0TCID₅₀/mL/头份，低温冷冻真空干燥。

犬副流感病毒活疫苗(CPIV/15株)成品检验

经剩余水分、真空度按现行《中华人民共和国兽药典》附录检进行检测，均应合格。

无菌检验：按现行《中华人民共和国兽药典》附录检进行检测，应无细菌、霉菌、支原体。

外源性病毒检验

红细胞吸附检验：分别将各待检毒种接种其适应细胞于37℃5％CO₂培养4天，然后按《中华人民共和国兽药典》附录进行检验，结果应均为血吸附阴性。

特定病毒检验：分别采用PCR/RT-PCR法检测CDV、CPV、CAV1、CAV2、CCV和RV检测，结果应均为阴性。

根据犬副流感病毒活疫苗(CPIV/15株)的制备标准，制备了三批犬副流感病毒活疫苗(CPIV/15株)，批号为201601，201602，201603。

实施例5犬副流感病毒活疫苗(CPIV/15株)免疫试验、最小免疫量和血清抗体与攻毒保护之间的相关性

试验材料和方法

实施例4制备得到的犬副流感病毒活疫苗(CPIV/15株)，批号：201601。

实验动物：实验用犬为42～49日龄未经犬副流感病毒疫苗免疫的抗体SN阴性或≤2的健康比格犬。

犬副流感病毒活疫苗(CPIV/15株)安全试验。

1、一次单剂量不同途经注射安全试验

对42～49日龄犬安全性试验：选择CPIV抗原、抗体阴性的易感犬10只，随机分成2组，每组5只，1组用犬副流感病毒活疫苗(CPIV/15株)颈部皮下注射1个免疫剂量(1.0mL)，另一组犬注射生理盐水作为空白对照。注射后观察21天，观察所有犬局部反应、精神、食欲、体温、眼鼻分泌物、咳嗽等临床症状。

结果表明：注射疫苗后对犬无刺激和任何不良反应轻，表明对犬安全。

2、单剂量重复注射安全试验

选择CPIV抗原、抗体阴性的42～49日龄易感比格犬10只，随机分成2组，每组5只，用犬副流感病毒活疫苗(CPIV/15株)颈部皮下注射1个免疫剂量(1.0mL)，间隔21天重复注射一次，连续注射3次。另5只犬注射生理盐水作为空白对照。三次注射后观察21天，观察所有犬局部反应、精神、食欲、体温、眼鼻分泌物、咳嗽等临床症状。

结果：所有犬经三次注射后均未出现任何不良临床反应，表明三次单剂量重复注射对犬安全，无任何不良反应。

3、超剂量注射安全试验

选择CPIV抗原、抗体阴性的42～49日龄易感比格犬10只，随机分成2组，每组5只，用犬副流感病毒活疫苗(CPIV/15株)颈部皮下注射10个免疫剂量(10^6.0TCID₅₀/mL)，另5只犬注射生理盐水作为对照。注射后观察21天，观察犬的局部反应、精神、食欲、体温、眼鼻分泌物、咳嗽等临床症状。

结果：注射疫苗犬仅在注射部位有轻微红肿症状，经过2～3天后逐渐消失，未出现任何其它不良临床反应，对犬安全，无明显的不良反应。

4、对怀孕犬安全性试验

用怀孕母犬10只，随机分成2组，每组5只犬。于产前30天左右颈部注射犬副流感病毒活疫苗(CPIV/15株)10个免疫剂量(10^6.0TCID₅₀/mL)，另一对照组犬注射生理盐水作为对照。注射后观察母犬的临床变化至分娩，包括有无早产、流产、死胎、弱胎等情况以及仔犬的成活、生长发育等。

结果：所有犬均正常分娩发育，无流产和死胎，仔犬均成活、生长发育正常。表明该疫苗两倍剂量注射怀孕母犬安全。

5、犬副流感病毒活疫苗(CPIV/15株)最小免疫量和最低血清SN抗体保护价测定：

取CPIV抗体阴性或≤1:2的健康犬20只，分为4组，每组5只犬，第1、2、3组每犬分别接种犬副流感病毒CPIV/15株细胞毒10^5.0TCID₅₀/mL、10^4.0TCID₅₀/mL、10^3.0TCID₅₀/mL，第4组犬注射细胞培养液作为对照，分组隔离饲养。于接种的当天和第21天各采血测定每只犬的SN抗体效价，并于接种后21天用CPIV强毒6.0mL(10^6.0TCID₅₀/mL)对所有犬肌肉注射和滴鼻攻毒，攻毒后逐日观察21天。以能保护80％试验犬的最低用量为最小免疫量，以能使试验犬攻毒保护最低的SN抗体值为其最低SN抗体保护价，并以此分析和确定疫苗的免疫期、免疫间隔时间及免疫后血清SN抗体效价与攻毒保护的相关性。

试验结果：接种CPIV/15株毒10^5.0TCID₅₀/mL、10^4.0TCID₅₀/mL和10^3.0TCID₅₀/mL的试验犬，接种后均未见任何临床异常症状，21天后SN抗体分别为1:158～217、1:48～114和1:14～60。用CPIV强毒攻毒后，观察21天，结果第1组和第2组5/5未见异常，全部健活；第3组5只犬攻毒后4只正常，1只出现CPIV临床症状，并呈CPIV病理变化。未免疫的对照犬，SN抗体始终小于1:6，用CPIV强毒攻毒后，5只犬全部都呈典型的CPIV临床症状，其中1只犬死亡，剖检呈典型CPIV病理变化。试验结果表明，接种10^5.0TCID₅₀/mL和10^4.0TCID₅₀/mL的CPIV/15弱毒株可使犬获得100％(5/5)的免疫保护；接种10^3.0TCID₅₀/mL可使犬获得80％(4/5)的免疫保护，最低SN抗体保护值为l:16。因此，根据结果确定：CPIV/15弱毒株的最小免疫剂量为10^3.0TCID₅₀/mL，最低SN抗体保护效价为1:16。为了使免疫更可靠，规定疫苗免疫量为10^5.0TCID₅₀/mL，根据疫苗免疫犬后检测血清中和SN抗体结果表明，其SN抗体与攻毒保护呈正相关，SN抗体最低保护效价为1:16，因此可以用检测疫苗免疫犬后血清中SN抗体来代替攻毒检验方法，从而可减少免疫试验用犬的成本和时间。结果见表8。

表8最小免疫剂量和最低SN抗体与攻毒保护试验结果

6、母源抗体消长规律试验：

用CPIV/15F60代培养物免疫母犬所产仔犬5只，分别于出生后14d、21d、28d、35d、42d、49d、56d、63d采血测定SN抗体效价，测定其母源抗体消失规律。结果见表9。

表9母源抗体消长规律试验结果(SN值)

试验结果：从表9可见犬出生后63天有的犬SN抗体低于最低保护效价(1：16)，所以对幼犬首次免疫确定为42～56日龄。

7、母源抗体干扰试验：

分别选择母源抗体1:2和1:20的45日龄易感犬各5只，以14天间隔2次接种犬副流感病毒活疫苗(CPIV/15株)，每次接种剂量均为10^5.0TCID₅₀/mL，于第一次接种后14天和第二次接种14天采血测定其SN抗体效价，以检测母源抗体对犬副流感病毒活疫苗(CPIV/15株)免疫的干扰情况。

试验结果：以相同剂量的CPIV/15弱毒株免疫母源抗体为1:20和1:2的两组犬，免疫后不同时间检测的SN抗体。结果母源抗体为1:20组犬免疫后抗体平均值分别为26.6(14～31)和102.3(86～113)，母源抗体为1:2组的犬免疫后抗体平均值分别为28.3(16～38)和110.6(94～115)，两组犬SN抗体值差异不大，均大于免疫保护值。结果表明母源抗体对CPIV/15弱毒株免疫无明显干扰。

8、免疫期试验：

取42～49日龄CPIV抗体阴性或≤2的健康易感犬15只，其中10只犬采用一个免疫剂量(10^5.0TCID₅₀/mL)免疫犬，连续免疫3次，每次间隔21d，另5只不免疫作为对照。分别于免疫后90d、180d、270d、360d、420d各采血一次，采血后分离血清进行SN抗体价测定，并于免疫后420d用CPIV强毒进行攻毒保护试验，以能维持最低抗体保护价的最长时间即为其免疫期，并以此确定CPIV/15弱毒疫苗的免疫期。

试验结果：用一个免疫剂量的CPIV/15株免疫10只犬，连续免疫3次，间隔21天，另5只犬注射正常细胞培养物作为对照。分别于第3次免疫后90d、180d、270d、360d、420d采血，测定SN抗体价。结果表明，犬3次免疫后420d时的SN平均价均保持在最低保护效价1:16以上，于免疫420d时，分别用CPIV强毒6×10^6.0TCID₅₀/mL攻毒，攻毒后观察21d，对照组5犬均表现为CPIV症状，免疫组10只犬均正常，无CPIV临床症状，保护率100％(10/10)。结果表明CPIV/15弱毒株的免疫期可达420天，为了确保免疫效果，确定免疫期为360天(1年)。

实施例6犬副流感病毒活疫苗(CPIV/15株)保存期试验

试验材料和方法：按照实施例4的方法制备犬副流感病毒活疫苗(CPIV/15株)，三个批次：批号为201601、201602、201603。

实验动物：实验用犬为42～49日未经犬副流感病毒疫苗免疫的CPIV抗体SN阴性或≤2的健康犬。

犬副流感病毒活疫苗(CPIV/15株)保存试验：将三批疫苗在2～8℃条件下保存，分别在保存后第3、6、9、12、18、24、30个月随机取样，进行性状、真空度、剩余水分含量、病毒含量检测。

结果表明：3批犬副流感病毒活疫苗(CPIV/15株)置于2～8.0℃保存30个月，性状、真空度、剩余水分均合格，病毒含量均不低于10^5.0TCID50/mL/头份。

无菌检验：将三批疫苗在2～8℃条件下保存30个月随机取样，按现行《中华人民共和国兽药典》附录检进行检测。

结果：三批疫苗均无细菌、霉菌、支原体检出。

安全试验：取2～8℃保存30个月三批疫苗，每批疫苗分别于犬颈部接种42～49日龄犬5只，每只接种一头份，检测注射后1天、2天、7天体温变化，连续观察21天。

结果：所有犬注射后均无任何不良临床反应，均健活，表明该三联灭活疫苗保存30个月后免疫犬安全，无不良副作用。

效力检验：用2～8℃保存30个月三批疫苗，每批疫苗经颈部注射接种42～49日犬5只，每只接种一头份，间隔21日按照相同方法和剂量免疫3次，同时取5只不接种对照犬。第3次免疫后21天时分别用犬副流感病毒强毒进行攻毒，攻毒后观察21天，观察各组犬局部反应、精神、食欲、体温、眼鼻分泌物、咳嗽等临床症状和剖解病理变化，计算攻毒保护率。

结果：三批疫苗在2～8℃条件下保存30个月对犬均可以提供较好的保护力，攻毒保护率均达到100％(5/5)保护。对照组犬5/5发病。

综上表明：三批疫苗在2～8℃条件下保存30个月对犬安全、可靠、稳定、有效。为了给靶动物提供更好的保护力，规定该疫苗在2～8℃条件下保存，保存期为24个月。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (15)

1.一株犬副流感病毒弱毒株，其特征在于，保藏号为：CGMCC No.19993。

2.如权利要求1所述的犬副流感病毒弱毒株在制备用于预防或诊断犬科动物的犬副流感的药物或试剂中应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述犬科动物包括幼犬和成年犬，所述成年犬包括怀孕母犬。

4.如权利要求1所述犬副流感病毒弱毒株的生产方法，其特征在于，所述犬副流感病毒弱毒株采用Vero细胞进行培养传代。

5.根据权利要求4所述犬副流感病毒弱毒株的生产方法，其特征在于，所述生产方法包括：将所述犬副流感病毒弱毒株用Vero细胞培养，在细胞传代时按5％比例同步接种含10%胎牛血清的DMEM培养液，培养22~26小时，换成含有2%胎牛血清的DMEM维持液，继续培养5~7天，当细胞病变达到80％以上时收获病毒液。

6.根据权利要求5所述犬副流感病毒弱毒株的生产方法，其特征在于，在含10%胎牛血清的DMEM培养液中的培养时间为24h。

7.根据权利要求5或6所述犬副流感病毒弱毒株的生产方法，其特征在于，所述培养的条件为：温度为36 ~ 37 ℃，气体环境中含有5% CO₂。

8.一种用于预防犬副流感的疫苗，其特征在于，所述疫苗含有预防有效量的如权利要求1所述的犬副流感病毒弱毒株，所述疫苗中犬副流感病毒含量为10^5.0 TCID₅₀/mL/头份。

9.一种用于预防犬副流感的疫苗组合物，其特征在于，所述组合物中含有预防有效量的如权利要求1所述的犬副流感病毒弱毒株以及药学上可接受的载体。

10.根据权利要求9所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物的剂型为冻干剂，所述药学上可接受的载体选自冻干保护剂，所述冻干保护剂中含有脱脂奶粉、蔗糖、明胶、谷氨酸钠和两性霉素中的一种或多种。

11.根据权利要求10所述的疫苗组合物，其特征在于，所述冻干保护剂中含有脱脂奶粉900 ~ 1200重量份、蔗糖60 ~ 100重量份、明胶15 ~ 30重量份、谷氨酸钠90 ~ 120重量份、两性霉素0.001 ~ 0.01重量份。

12.根据权利要求10所述的疫苗组合物，其特征在于，所述冻干保护剂中含有：脱脂奶粉1000重量份、蔗糖80重量份、明胶20重量份、谷氨酸钠100重量份、两性霉素0.005重量份。

13.根据权利要求10至12任一所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物中，所述犬副流感病毒弱毒株与所述冻干保护剂的重量比为5 ~ 10：1。

14.根据权利要求13所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物中，所述犬副流感病毒弱毒株与所述冻干保护剂的重量比为7：1。

15.一种多联疫苗，其特征在于，含有如权利要求8所述的疫苗，还含有犬腺病毒疫苗、犬细小病毒疫苗、犬瘟热病毒疫苗和犬冠状病毒疫苗中的一种或多种。

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