CN112316128A - 一种犬瘟热病毒犬细小病毒犬传染性肝炎病毒三联活疫苗 - Google Patents

一种犬瘟热病毒犬细小病毒犬传染性肝炎病毒三联活疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于治疗、预防、减缓或控制犬瘟热、犬细小病毒性肠炎和犬传染性肝炎的疫苗株组合，包括：微生物保藏号为CGMCC No.19397的犬瘟热病毒疫苗株，微生物保藏号为CGMCC No.19398的犬细小病毒疫苗株和微生物保藏号是CGMCC No.19396的犬传染性肝炎病毒疫苗株。该疫苗株组合中的三种疫苗毒株毒力低，免疫原性良好。本发明还公开了以前述疫苗株组合为免疫原的活疫苗组合物。该疫苗组合物安全有效。

Description

一种犬瘟热病毒犬细小病毒犬传染性肝炎病毒三联活疫苗
技术领域
本发明属于预防兽医领域，涉及犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬传染性肝炎病毒联苗制备方法及其应用，尤其涉及犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬传染性肝炎病毒三联活疫苗制备方法及其应用。
背景技术
随着环境和人类生活饮食方式的改变，野生动物和伴侣动物与人类之间接触日益密切，因此増加了人类感染动物源性疾病的潜在风险。犬是人类重要的伴侣动物之一，与人类朝夕相伴，因此，加强对犬主要疾病的防控是当务之急。犬瘟热、犬细小病毒病及犬传染性肝炎是当前对我国养犬业危害严重的三大高度接触性、急性、热性传染病，发病率高、死亡率高，经常引起大批犬、貂和狐等动物发病，对养犬业造成严重经济损失。
犬瘟热(CD)是由副粘病毒科麻疹病毒属的犬瘟热病毒(CDV)引起的犬科、鼬科、猫科等多种动物感染的一种急性、高度接触性传染病。本病主要侵害动物的呼吸系统、消化系统以及神经系统，具有较高的发病率和致死率，其自然感染宿主已不断扩大到多种陆生和水生动物，还存在潜在的人兽共患性，有可能成为继狂犬病之后犬传播给人的第二种疫病，引起了动物学界和医学界的广泛关注。CD不仅给饲养场带来了毁灭性的灾难，也给从事饲养、繁殖和疫病防治以及国际贸易工作者带来了前所未有的威胁。CD呈世界性流行，目前无治疗本病的特效药物，因此，对犬瘟热疫苗的研制成为预防本病最重要的措施。
犬细小病毒(CPV)是引起犬的一种烈性传染病的病原体，它所引起的急性出血性肠炎和非化脓性心肌炎，是对当今世界犬业威胁和危害最严重的急性、接触性传染病。该病已传遍世界各类犬群，野生和家养犬群中均有CPV 广泛蔓延。随着我国工作犬(军犬、警犬、导盲犬等)、实验用犬和宠物犬饲养量的大幅增加，犬细小病毒感染日趋严重，给养业犬带来了重大的经济损失，成为危害养犬业重大疫病之一。故彻底消除该病已成为一大难题，因此，防治犬细小病毒性肠炎已成为长期而艰巨的任务，研制安全有效的疫苗就显得十分重要。
犬腺病毒(CAV)是在已发现的哺乳动物腺病毒属中致病性最强、形态结构也研究得较为清楚的一种动物病毒，其CAV-1是引起犬传染性肝炎和熊、狐脑炎的病原；CAV-2则使犬、狐发生传染性喉气管炎。CAV不仅流行于我国和世界各地家养的犬、狐中，而且广泛地流行于野生的狐、熊、郊狼和浣熊等动物中，该病死亡率高达40％，因而给养殖业造成巨大的经济损失。研究表明，经CAV-2免疫的犬能有效地产生对CAV-1强毒的免疫力。因此，研制安全有效的CAV-2型疫苗具有重要意义。犬传染性肝炎主要发生在1岁以内的幼犬，成年犬很少发生且多为隐性感染，即使发病也多能耐过。病犬和带毒犬是主要传染源。病犬的分泌物、排泄物均含有病毒，康复带毒犬可自尿中长时间排毒。该病主要经消化道感染，胎盘感染也属可能。呼吸型病例可经呼吸道感染。体外寄生虫可成为传播媒介。本病发生无明显季节性，以冬季多发，幼犬的发病率和病死率均较高。自然感染犬传染性肝炎的犬潜伏期7天左右。最急性病例出现呕吐、腹痛、腹泻症状后数小时内死亡。急性病例有精神沉郁、寒战怕冷、体温升高40.5℃左右，食欲废绝、喜喝水，呕吐、腹泻等症状。亚急性病例，症状反应较轻。上述急性期症状出现较轻外，还可见贫血、黄疸、咽炎、扁桃体炎、淋巴结肿大，特征性症状是在眼睛上，出现角膜水肿、混浊、角膜变蓝。临床上也称“蓝眼病”。眼睛半闭，羞明流泪，有大量浆液性分泌物流出，角膜混浊特征是由角膜中心向四周扩展。重者可导致角膜穿孔。恢复期时，混浊的角膜由四周向中心缓慢消退，混浊消退的犬大多可自愈可视粘膜有不同程度的黄疸。
当前，国内广泛应用的疫苗主要有单苗或多联弱毒苗。虽然对于防控犬的重大疫病起到了积极作用，但是还时有疫情发生的报道。除去母源抗体和其他病毒干扰、疫苗效价及使用不当等原因外，疫情是否由病毒变异株出现引起亟需验证。同时，目前使用的这些疫苗大部分为国外疫苗的复制品，毒种背景不清及在细胞上传代次数较多，免疫原性和安全性均难以得到保证。因此，研制适合国内流行毒株的疫苗己迫在眉睫。
发明内容
本发明制备的犬瘟热、犬细小病毒性肠炎、犬传染性肝炎三联活疫苗(D2 株+P6株+A22株)相比传统单苗免疫，减少了免疫次数，避免动物因保定造成的应激反应，达到一针防多病的目的，提高了生产效率。
为了解决现有技术中存在的问题，本发明第一方面提供了一种用于治疗、预防、减缓和/或控制犬瘟热、犬细小病毒性肠炎和犬传染性肝炎中任两种或三种的疫苗株的组合，所述疫苗株包括犬瘟热病毒疫苗株、犬细小病毒疫苗株和犬传染性肝炎病毒疫苗株中任两种或三种；
所述犬瘟热病毒疫苗株是微生物保藏号为CGMCC No.19397的病毒株，或其临床致病性与免疫原性没有变化的传代病毒株或突变病毒株；
所述犬细小病毒疫苗株是微生物保藏号为CGMCC No.19398的病毒株，或其临床致病性与免疫原性没有变化的传代病毒株或突变病毒株；
所述犬传染性肝炎病毒疫苗株是微生物保藏号为CGMCC No.19396的病毒株，或其临床致病性与免疫原性没有变化的传代病毒株或突变病毒株。
本发明第二方面提供了一种用于治疗、预防、减缓和/或控制控制犬瘟热、犬细小病毒性肠炎和犬传染性肝炎中任两种或三种的疫苗组合物，所述疫苗组合物以本发明第一方面所述的疫苗株的组合为免疫原。
在一些实施方式中，所述疫苗组合物的原料包括所述免疫原和辅料。
在一些实施方式中，所述疫苗组合物为活疫苗组合物。
在一些实施方式中，在所述疫苗组合物中，所述犬细小病毒疫苗株的用量、所述犬传染性肝炎病毒疫苗株的用量和所述辅料的干重量用量比为0.5-3 ×105.0TCID50：0.5-3×105.0TCID50：200-400mg(比如，1.0×105.0TCID50、1.5 ×105.0TCID50、2.0×105.0TCID50、2.5×105.0TCID50：1.0×105.0TCID50、1.5× 105.0TCID50、2.0×105.0TCID50、2.5×105.0TCID50：220mg、240mg、260mg、 280mg、300mg、320mg、340mg、360mg、380mg)。
在一些实施方式中，在所述疫苗组合物中，所述犬瘟热病毒疫苗株的用量、所述犬传染性肝炎病毒疫苗株的用量和所述辅料的干重量用量比为2-8 ×104.0TCID50：0.5-3×105.0TCID50：200-400mg(比如，3.0×104.0TCID50/ml、 4.0×104.0TCID50/ml、5.0×104.0TCID50/ml、6.0×104.0TCID50/ml、7.0×104.0TCID50/ml：1.0×105.0TCID50、1.5×105.0TCID50、2.0×105.0TCID50、2.5 ×105.0TCID50：220mg、240mg、260mg、280mg、300mg、320mg、340mg、 360mg、380mg)。
在一些实施方式中，在所述疫苗组合物中，所述犬瘟热病毒疫苗株的用量、所述犬细小病毒疫苗株的用量和所述辅料的干重量用量比为2-8× 104.0TCID50：0.5-3×105.0TCID50：200-400mg(比如，3.0×104.0TCID50/ml、 4.0×104.0TCID50/ml、5.0×104.0TCID50/ml、6.0×104.0TCID50/ml、7.0× 104.0TCID50/ml：1.0×105.0TCID50、1.5×105.0TCID50、2.0×105.0TCID50、2.5 ×105.0TCID50：220mg、240mg、260mg、280mg、300mg、320mg、340mg、 360mg、380mg)。
在一些实施方式中，在所述疫苗组合物中，所述犬瘟热病毒疫苗株的用量、所述犬细小病毒疫苗株的用量、所述犬传染性肝炎病毒疫苗株的用量和所述辅料的干重量用量比为2-8×104.0TCID50：0.5-3×105.0TCID50：0.5-3× 105.0TCID50：200-400mg(比如，3.0×104.0TCID50/ml、4.0×104.0TCID50/ml、 5.0×104.0TCID50/ml、6.0×104.0TCID50/ml、7.0×104.0TCID50/ml：1.0× 105.0TCID50、1.5×105.0TCID50、2.0×105.0TCID50、2.5×105.0TCID50：1.0× 105.0TCID50、1.5×105.0TCID50、2.0×105.0TCID50、2.5×105.0TCID50：220mg、240mg、260mg、280mg、300mg、320mg、340mg、360mg、380mg)。
在一些实施方式中，在所述疫苗组合物中，所述犬细小病毒疫苗株的用量、所述犬传染性肝炎病毒疫苗株的用量和所述辅料的干重量用量比为1× 105.0TCID50：1×105.0TCID50：315mg。
在一些实施方式中，在所述疫苗组合物中，所述犬瘟热病毒疫苗株的用量、所述犬传染性肝炎病毒疫苗株的用量和所述辅料的干重量用量比为5× 104.0TCID50：1×105.0TCID50：315mg。
在一些实施方式中，在所述疫苗组合物中，所述犬瘟热病毒疫苗株的用量、所述犬细小病毒疫苗株的用量和所述辅料的干重量用量比为5× 104.0TCID50：1×105.0TCID50：315mg。
在一些实施方式中，在所述疫苗组合物中，所述犬瘟热病毒疫苗株的用量、所述犬细小病毒疫苗株的用量、所述犬传染性肝炎病毒疫苗株的用量和所述辅料的干重量用量比为5×104.0TCID50：1×105.0TCID50：1×105.0TCID50：315mg。
在一些实施方式中，所述犬瘟热病毒疫苗株的TCID50是基于Vero细胞培养根据Reed-Muench法计算得到的。
在一些实施方式中，所述犬细小病毒疫苗株的TCID50是基于F81细胞培养根据Reed-Muench法计算得到的。
在一些实施方式中，所述犬传染性肝炎病毒疫苗株的TCID50是基于 MDCK细胞培养根据Reed-Muench法计算得到的。
在一些实施方式中，所述疫苗株的培养方法包括如下步骤：
(i)将所述疫苗株的组合中的疫苗株分别接种到培养细胞中培养，收获所述疫苗株的粗毒液；针对所述犬瘟热病毒疫苗株，所述培养细胞为Vero 细胞；针对所述犬细小病毒疫苗株，所述培养细胞为F81细胞；针对所述犬传染性肝炎病毒疫苗株，所述培养细胞为MDCK细胞；
(ii)将所述疫苗株的粗毒液纯化，得到纯化的疫苗株毒液。
在一些实施方式中，在步骤(i)中，当CPE达到80％(比如，85％、 88％、92％、95％、98％)以上时，收获所述疫苗株的粗毒液。
在一些实施方式中，在步骤(i)中，当CPE达到90％以上时，收获所述疫苗株的粗毒液。
在一些实施方式中，在步骤(i)中，按照MOI＝0.005～0.01(比如，0.006、 0.007、0.008、0.009)的用量接种。
在一些实施方式中，在步骤(i)中，针对所述犬瘟热病毒疫苗株，按照所述病毒量株与培养液104.0TCID50：15-30ml(比如，104.0TCID50：18ml、20ml、 25ml、28ml)的用量比接种；针对犬细小病毒疫苗株，按照所述病毒株与培养液105.0TCID50：50-150ml(比如，105.0TCID50：60ml、70ml、80ml、90ml、 100ml、110ml、120ml、130ml、140ml)的用量比接种；针对犬传染性肝炎病毒疫苗株，按照所述病毒株与培养液105.0TCID50：50-150ml(比如，105.0TCID50：60ml、70ml、80ml、90ml、100ml、110ml、120ml、130ml、140ml) 的用量比接种。
在一些实施方式中，在步骤(i)中，针对所述犬瘟热病毒疫苗株，所述培养液为含1.5-2.5v/v％(比如，1.8v/v％、2.0v/v％、2.2v/v％、2.4v/v％)新生牛血清的DMEM；针对所述犬细小病毒疫苗株，所述培养液为含2-8v/v％(比如，3v/v％、4v/v％、5v/v％、6v/v％、7v/v％)新生牛血清的RPMI Medium 1640；针对所述犬传染性肝炎病毒疫苗株，所述培养液为含1.5-2.5v/v％(比如，1.8v/v％、2.0v/v％、2.2v/v％、2.4v/v％)新生牛血清的DMEM。
在一些实施方式中，在步骤(i)中，针对所述犬瘟热病毒疫苗株或所述犬传染性肝炎病毒疫苗株，所述培养的温度为32-34℃(比如，32.5℃、33℃、 33.5℃)；针对犬细小病毒疫苗株，所述培养的温度为36.5-37.5℃(比如， 36.7℃、36.9℃、37.1℃、37.3℃)。
在一些实施方式中，在步骤(i)中，所述培养的pH值为7.0-7.5(比如， 7.1、7.2、7.3、7.4)。
在一些实施方式中，在步骤(i)中，所述培养的DO值为40-50％(比如，42％、44％、46％、48％)。
在一些实施方式中，在步骤(i)中，当所述培养为转瓶培养时，所述培养是在9-12转/小时(比如，10转/小时、11转/小时)条件下进行的。
在一些实施方式中，在步骤(i)中，当所述培养为悬浮培养时，所述培养是在25-35转/分钟(比如，26转/分钟、28转/分钟、30转/分钟、32转/ 分钟、34转/分钟)条件下进行的。
在一些实施方式中，在步骤(i)中，针对所述犬瘟热病毒疫苗株，所述 Vero细胞来自单层Vero细胞；针对所述犬细小病毒疫苗株，所述F81细胞来自单层F81细胞；针对所述犬传染性肝炎病毒疫苗株，所述MDCK细胞来自单层MDCK细胞。
在一些实施方式中，在步骤(i)中，针对所述犬瘟热病毒疫苗株，用胰酶消化所述单层Vero细胞后接种所述疫苗株；针对所述犬细小病毒疫苗株，用胰酶消化所述单层F81细胞后接种所述疫苗株；针对所述犬传染性肝炎病毒疫苗株，用胰酶消化所述单层MDCK细胞后接种所述疫苗株。
在一些实施方式中，在步骤(i)中，对所述疫苗株的粗毒液进行无菌检验。
在一些实施方式中，在步骤(i)中，所述培养细胞的制备步骤为：将培养的所述培养细胞种子细胞扩大培养，得到扩大培养的培养细胞。
在一些实施方式中，所述扩大培养是在36.5-37.5℃(比如，36.7℃、36.9℃、 37.1℃、37.3℃)下进行的。
在一些实施方式中，所述扩大培养是在9-12转/小时(比如，10转/小时、 11转/小时)条件下在转瓶中进行的。
在一些实施方式中，针对所述犬瘟热病毒疫苗株，所述扩大培的养培养液为含有6-10v/v％(比如，7v/v％、8v/v％、9v/v％)新生牛血清的DMEM；针对所述犬细小病毒疫苗株，所述扩大培的养培养液为含6-10v/v％(比如， 7v/v％、8v/v％、9v/v％)新生牛血清的RPMI Medium 1640；针对所述犬传染性肝炎病毒疫苗株，所述扩大培的养培养液为含6-10v/v％(比如，7v/v％、 8v/v％、9v/v％)新生牛血清的DMEM。
在一些实施方式中，所述扩大培的时间为18-30h(比如，20h、22h、24h、 26h、28h)。
在一些实施方式中，当所述培养为悬浮培养时，将所述扩大培养的培养细胞用胰酶消化之后转移到生物反应器中继续培养。
在一些实施方式中，在所述生物反应器中，所述继续培养的温度为 36-38℃(比如，36.5℃、37℃、37.5℃)。
在一些实施方式中，在所述生物反应器中，所述继续培养的pH值为 7.0-7.5(比如，7.1、7.2、7.3、7.4)。
在一些实施方式中，在所述生物反应器中，所述继续培养的DO值为 40-50％(比如，42％、44％、46％、48％)。
在一些实施方式中，在所述生物反应器中，所述继续培养是在25-35转/ 分钟(比如，26转/分钟、28转/分钟、30转/分钟、32转/分钟、34转/分钟) 条件下进行的。
在一些实施方式中，在步骤(ii)中，将所述疫苗株的粗毒液冻融1-3 次后纯化。
在一些实施方式中，在步骤(ii)中，所述纯化的方法为：用直径为 0.22-0.45μm滤膜过滤，除去细胞及细胞碎片，得到所述纯化的疫苗株毒液。
在一些实施方式中，针对所述犬瘟热病毒疫苗株，所述纯化的疫苗株毒液中病毒含量≥105.0TCID50/ml；针对所述犬细小病毒疫苗株，所述纯化的疫苗株毒液中病毒含量≥106.0TCID50/ml；针对所述所述犬传染性肝炎病毒疫苗株，所述纯化的疫苗株毒液中病毒含量≥106.0TCID50/ml。
在一些实施方式中，所述辅料为冻干保护剂。
在一些实施方式中，所述冻干保护剂为包括2-3mg/mL(比如，2.2mg/mL、 2.4mg/mL、2.6mg/mL、2.8mg/mL)聚乙烯吡咯烷酮、8-12mg/mL(比如， 8.5mg/mL、9.0mg/mL、9.5mg/mL、10.0mg/mL、10.5mg/mL、11.0mg/mL、 11.5mg/mL)山梨醇、3-7mg/mL(比如，4.0mg/mL、5.0mg/mL、6.0mg/mL) 甘氨酸、30-50mg/mL(比如，35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL)蔗糖、30-60mg/mL (比如，35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL)海藻糖的水溶液。
在一些实施方式中，所述冻干保护剂的制备方法包括如下步骤：
制备包括4-6mg/mL(比如，4.5mg/mL、5.0mg/mL、5.5mg/mL)聚乙烯吡咯烷酮、16-24mg/mL(比如，18.0mg/mL、20.0mg/mL、22.0mg/mL)山梨醇的第一水溶液；
制备包括6-14mg/mL(比如，8.0mg/mL、10.0mg/mL、12.0mg/mL)甘氨酸、60-100mg/mL(比如，65.0mg/mL、70.0mg/mL、75.0mg/mL、80.0mg/mL、 85.0mg/mL、90.0mg/mL、95.0mg/mL)蔗糖、60-120mg/mL(比如，65.0mg/mL、 70.0mg/mL、75.0mg/mL、80.0mg/mL、85.0mg/mL、90.0mg/mL、95.0mg/mL、 100.0mg/mL、105.0mg/mL、110.0mg/mL、115.0mg/mL)海藻糖的第二水溶液；
将所述第一水溶液与所述第二水溶液以1:0.8-1.2(比如，1:0.9、1.0、1.1) 的体积比混合，得到所述冻干保护剂。
在一些实施方式中，将所述第一水溶液灭菌后使用。
在一些实施方式中，将所述第一水溶液经110-120℃(比如，112℃、114℃、 116℃、118℃)灭菌后使用。
在一些实施方式中，将所述第二水溶液灭菌后使用。
在一些实施方式中，将所述第二水溶液过滤除菌后使用。
本发明第三方面提供了本发明第二方面所述疫苗组合物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
将所述疫苗株的组合制备成所述疫苗组合物。
在一些实施方式中，将所述疫苗株的组合与所述辅料混合，得到所述疫苗组合物。
在一些实施方式中，将所述疫苗组合物干燥，得到干燥的疫苗组合物。
在一些实施方式中，所述干燥为真空冷冻干燥。
在一些实施方式中，所述冷冻真空干燥包括如下步骤：
(a)将所述疫苗组合物进行冷冻，得到冷冻的疫苗组合物；
(b)在真空条件下对所述冷冻的疫苗组合物进行温度分阶段升高的升华干燥，得到初步干燥的疫苗组合物；
(c)在真空条件下将初步干燥的疫苗组合物在常温条件下升华干燥，得到干燥的疫苗组合物。
在一些实施方式中，在步骤(a)中，将所述疫苗组合物在-50℃到-40℃ (比如，-48℃、-46℃、-44℃、-42℃)下进行冷冻。
在一些实施方式中，在步骤(a)中，所述冷冻的持续时间为1.5-2.5h(比如，1.6h、1.8h、2.0h、2.2h、2.4h)。
在一些实施方式中，在步骤(b)中，所述真空条件为8pa～10pa(比如， 8.5pa、9.0pa、9.5pa)。
在一些实施方式中，在步骤(b)中，对所述冷冻的疫苗组合物进行-30℃到-26℃(比如，-29℃、-28℃、-27℃)下的第一升华，-17℃到-13℃(比如， -16℃、-15℃、-14℃)下的第二升华和6-10℃(比如，7℃、8℃、9℃)下的第三升华。
在一些实施方式中，在步骤(b)中，所述第一升华的时间为4-8h(比如，5h、6h、7h)。
在一些实施方式中，在步骤(b)中，温度由-50℃到-40℃升高到-30℃到 -26℃所需时间为0.5-1.5h(比如，0.6h、0.8h、1.0h、1.2h、1.4h)。
在一些实施方式中，在步骤(b)中，所述第二升华的时间为4-8h(比如，5h、6h、7h)。
在一些实施方式中，在步骤(b)中，温度由-30℃到-26℃升高到-17℃到 -13℃所需时间为0.5-1.5h(比如，0.6h、0.8h、1.0h、1.2h、1.4h)。
在一些实施方式中，在步骤(b)中，所述第三升华的时间为2-6h(比如，3.0h、3.5h、4.0h、4.5h、5.0h、5.5h)。
在一些实施方式中，在步骤(b)中，温度由-17℃到-13℃升高到6-10℃所需时间为0.5-1.5h(比如，0.6h、0.8h、1.0h、1.2h、1.4h)。
在一些实施方式中，在步骤(c)中，所述真空条件为8pa～10pa(比如，8.5pa、9.0pa、9.5pa)。
在一些实施方式中，在步骤(c)中，所述升华的温度为25-30℃(比如， 26℃、27℃、28℃、29℃)。
在一些实施方式中，在步骤(c)中，所述升华的时间为1-3h(比如， 1.5h、2.0h、2.5h)。
在一些实施方式中，在步骤(b)中，温度由6-10℃升高到25-30℃所需时间为0.5-1.5h(比如，0.6h、0.8h、1.0h、1.2h、1.4h)。
本发明第四方面提供了一种本发明第一方面所述的疫苗株、本发明第二方面所述的疫苗组合物，或本发明第三方面所述的制备方法在制备用于单独使用或与其他免疫制剂或药物联合使用以治疗、预防、减缓和/或控制犬瘟热、犬细小病毒性肠炎和犬传染性肝炎中任两种或三种疾病的制剂中的用途。
在一些实施方式中，所述犬瘟热是犬科动物犬瘟热、鼬科动物犬瘟热或猫科动物犬瘟热。
在一些实施方式中，所述犬瘟热是水貂犬瘟热、犬犬瘟热或狐狸犬瘟热。
在一些实施方式中，所述犬细小病毒性肠炎是犬科动物犬细小病毒性肠炎、鼬科动物犬细小病毒性肠炎或猫科动物犬细小病毒性肠炎。
在一些实施方式中，所述犬细小病毒性肠炎是水貂犬细小病毒性肠炎、犬犬细小病毒性肠炎或狐狸犬细小病毒性肠炎。
在一些实施方式中，所述犬传染性肝炎是犬科动物犬传染性肝炎、鼬科动物犬传染性肝炎或猫科动物犬传染性肝炎。
在一些实施方式中，所述犬传染性肝炎是水貂犬传染性肝炎、犬犬传染性肝炎或狐狸犬传染性肝炎。
附图说明
图1为待鉴定犬瘟热病毒分离培养的照片。
图2为待鉴定犬瘟热病毒分离株电镜照片。
图3为待鉴定犬细小病毒分离培养的照片。
图4为待鉴定犬细小病毒分离株电镜照片。
图5为疑似犬传染性肝炎病毒分离培养的照片。
图6为疑似犬传染性肝炎病毒分离株电镜照片。
图7为本发明三联活疫苗的生产工艺路线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
定义：
临床致病性与免疫原性没有变化的传代病毒株或突变病毒株：
针对本发明所请求保护的病毒株，很明显，没有突变的传代病毒株属于实质上相同的病毒株，其临床致病性与免疫原性没有变化是指没有实质性变化。由于检测操作条件，动物品种、年龄、性别、健康状况等体现的差别以及可预期的系统误差属于没有实质性变化，属于临床致病性与免疫原性没有变化的传代病毒株。另外，病毒株传代多次后不可避免引入微小的突变，当突变发生在非编码序列区或者编码区的同义突变或者不影响病毒株致病性和免疫原性的突变(比如，可能是两个结构域之间的连接氨基酸残基，或者位于蛋白质高级结构内部因不与免疫细胞接触而不影响致病性或免疫原性的微小突变的残基)，这些微小的突变仍属于非实质性突变，应当视为临床致病性与免疫原性没有变化的突变病毒株。比如，本发明保藏的病毒株(比如，生物保藏号为CGMCC No.19397的病毒株)的细胞(比如Vero细胞系)传代病毒株，其临床致病性与免疫原性没有实质性变化，则属于临床致病性与免疫原性没有变化的传代病毒株或突变病毒株。
本发明所指现行《中国兽药典》为《中华人民共和国兽药典》2015版三部，中国农业出版社出版。本发明的TCID50是根据Reed-Muench法计算得到的。犬瘟热强毒CDV-v株：由辽宁益康生物股份有限公司内部分离的毒株， ID50数据是通过临床健康比格犬测定得到的。犬细小病毒强毒CPV-v株：由辽宁益康生物股份有限公司内部分离的毒株，TCID50数据是通过F81细胞测定得到的。犬病毒性肝炎病毒CAV-1v株：由辽宁益康生物股份有限公司内部分离的毒株，TCID50数据是通过MDCK细胞测定得到的。DMEM，购自 GIBCO，批号：1928536；RPMIMedium 1640，购自GIBCO，批号：1900496；新生牛血清，购自Bovogen Biologicals PtyLtd，批号：1507D；胰蛋白酶，购自GIBCO，批号：1902509。Vero细胞，F81细胞，购自中国兽医药品监察所，由辽宁益康生物制品有限公司保存。MDCK细胞，购自长春军事兽医研究所，由辽宁益康生物股份有限公司传代、保存。
本发明三联活疫苗的生产工艺路线图参见图7。
实施例1.犬瘟热病毒原始毒株的获取
(1)病例：辽宁省辽阳市一家犬专业合作社犬场的幼犬发病，症状为：高热、精神沉郁、有涕和眼屎、后期出现神经症状。根据症状判断，疑似患有犬瘟热。
(2)病毒分离：取患病犬脑组织，将脑组织用灭菌生理盐水冲洗3次，按lg组织：10ml的比例将脑组织加入灭菌冷生理盐水，放入组织搅拌机中，以10000～12000r/min充分捣碎脑组织，反复在-15℃以下冻融3次后，用3 层灭菌纱布过滤2次，收集滤液，并以12000r/min 4℃下离心30分钟，收集上清，加入过滤除菌的终浓度为1000IU/ml青霉素、1000μg/ml链霉素，分装，得到组织液a。
将前述组织液a接种到Vero细胞上进行分离培养，培养液为含2v/v％新生牛血清的DMEM，接种量为1v/v％，置37℃、含5％CO2培养箱中，观察，盲传4代均未观察到任何可见的细胞病变，在盲传至第5代时，细胞出现了蛛网状细胞病变(如图1)，在此基础上，进一步扩大1代，共培养收集200ml 细胞培养液a，作为毒种备用，大部分加入蔗糖脱脂奶保护剂后冻干保存。将细胞培养液a中所含的病毒称作毒株a。
将前述细胞培养液a用无血清DMEM细胞培养液作10倍系列稀释，取 10-1～10-8稀释度，分别接种已长成良好单层、弃去细胞培养液的96孔Vero 细胞培养板，每个稀释度接种8孔，每孔0.1ml，同时设正常细胞对照8孔。置33℃、含5％CO2培养箱吸附1小时后，每孔补加含4％新生牛血清的DMEM 细胞培养液0.1ml，置33℃、含5％CO2培养箱培养观察6日，每日观察CPE 情况。根据Reed-Muench法计算TCID50。结果病毒含量为105.5TCID50/0.1ml。
(3)形态观察：用磷钨酸对步骤(2)的细胞培养液a上清中毒株a染色再负染染色，透射电镜观察，从形态上观察判断，形态多样，多呈椭圆形，有囊膜，上有圆形纤突，其中一个的照片参见图2，毒株a为犬瘟热病毒。
(4)分子生物学鉴定：针对犬瘟热病毒血凝素蛋白H基因片段，设计如下序列的引物F1a和R1a，对细胞培养液a上清中毒株a进行RT-PCR检测，然后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条带大小为335bp，符合犬瘟热H基因的长度，进一步判断，毒株a为犬瘟热病毒。
F1a：5′-GATAAAGCATGTCATTATAGTCCTAA-3′
R1a：5′-CTTGAGCTTTCGACCCTTC-3′
(5)特异性试验：通过0.1ml犬瘟热病毒抗血清(中和效价不低于1:128)、犬细小病毒抗血清(中和效价不低于1:64)、犬病毒性肝炎病毒抗血清(中和效价均不低于1:128)、狂犬病病毒抗血清(中和效价不低于40IU/ml)和健康犬阴性血清(阴性血清为未免疫任何疫苗的4月龄健康犬的血清)(前述血清由军事兽医研究所病毒室惠赠)分别与0.1ml细胞培养液a孵育，病毒对照孔采用0.1ml相同的病毒液不加任何血清，然后接种入已长成良好单层的Vero细胞，培养液为含2v/v％新生牛血清的DMEM，置37℃、含5％CO2培养箱中，观察5日，除了犬瘟热病毒抗血清孵育的病毒液接种的细胞及未做接种的正常细胞没有产生细胞病变以外，其他组细胞均产生了细胞病变。说明所分离获得的病毒为犬瘟热病毒。由此可知，毒株a为犬瘟热病毒。
(6)回归试验：将步骤(2)的细胞培养液a(含毒株a)用灭菌生理盐水稀释到病毒含量为104.0TCID50/ml，接种2～3月龄CDV抗体阴性(SN＜1:2) 的健康幼犬4只，接种量为2.0ml，接种方式为：腹腔注射，接种后观察时间为28天，犬症状为：3只接种犬眼分泌物和鼻分泌物过多，4只犬发热至 38.9℃～39.6℃，没有发生死亡，病程持续5天后康复，未出现第二次发热， 4只饲养方式一致的未注射病毒的对照犬均未发病。这些症状为典型的犬瘟热症状，由此可以判断毒株a为犬瘟热病毒。
(7)确诊：经前面的检测鉴定综合判定，毒株a为犬瘟热病毒。
实施例2.犬瘟热病毒毒株的驯化与毒株生化、遗传的改变的测试
(1)病毒传代培养：将实施例1的细胞培养液a(含毒株a)在Vero细胞上连续传代培养至150代，具体步骤如下：将已长成单层的Vero细胞，弃去生长液(成分为：含2v/v％新生牛血清的DMEM)，按5v/v％接种量接种实施例1的细胞培养液a，置33℃含5％CO2培养箱吸附1小时，加入含2v/v％新生牛血清的DMEM细胞维持液，置33℃含5％CO2培养箱培养5～6日，当 90％以上细胞出现CPE时收获子代病毒，连续传代150代，将第150代命名为D2株。
(2)病毒存活性测试：将120、135、150代毒种分别用无血清DMEM 细胞培养液作10倍系列稀释，采取实施例1步骤(2)相同的方法计算得到： 120、135、150代致弱毒病毒含量分别为106.30TCID50/ml、106.12TCID50/ml、 106.00TCID50/ml。
依照感染能力测量的病毒含量逐渐减少，也说明病毒的毒力在逐渐减弱。
(3)病毒安全性试验：取100、120、135、150代病毒细胞培养液，用灭菌生理盐水分别稀释为105.0TCID50/ml，皮下接种2月龄以上健康易感犬5 只，每只4.0ml，分多点注射，同时设置4只不接种对照犬，隔离观察21日，分别记录各组犬的临床表现。结果：100代病毒组发病数量2/5，症状表现发热、精神沉郁、鼻眼分泌物增多。120代病毒组发病数量1/5，症状表现发热、精神沉郁。135代病毒组、150代病毒组和对照的动物发病数为0，未见患病症状。这说明，病毒传135代已经失去了毒力，因此，传150代毒力会更弱，可能能够安全地用作活疫苗。
(4)免疫原性与免疫保护测试：将135代、150代毒种细胞培养液分别用灭菌的生理盐水稀释为104.0TCID50/ml，分别皮下注射接种5只6周龄犬瘟热病毒抗体阴性临床健康犬，同时设5只不接种病毒犬做对照组，免疫后21 日采集血液分离血清，采用中和试验进行血清中和抗体效价测定，步骤为：以为含量为104.0TCID50/ml的实施例1步骤(2)的细胞培养液a(含毒株a) 作为抗原(含200TCID50)，对血清进行2倍稀释使用，通过接种Vero细胞观察CPE来判断免疫效果，根据Reed-Muench法计算抗体效价。采集血液之后，用CDV-v株分别通过腹腔注射途径对免疫组和对照组犬各接种5.0ml(含量2ID50/ml)，隔离饲养观察28日，记录临床表现。
135代病毒组免疫后21日中和抗体效价分别为1:76.1、1:64、1:76.1、 1:76.1、1:90.5，全部健活。150代病毒组免疫后21日中和抗体效价分别为 1:64、1:76.1、1:97.2、1:76.1、1:64，全部健活。攻毒对照组第1只未检测到中和抗体，症状为：发热、精神沉郁、鼻眼分泌物增多、死亡；第2只未检测到中和抗体，症状为：发热、精神沉郁、死亡；第3只未检测到中和抗体，症状为：发热、精神沉郁、鼻眼分泌物增多、死亡；第4只免疫后21日中和抗体效价为1:2，症状为：发热、精神沉郁、死亡；第5只免疫后21日中和抗体效价为1:2，症状为：发热、精神沉郁、死亡。由此可见，本发明所分离的犬瘟热病毒传代135代后，毒力消失，免疫原性良好。
(5)无菌检验：随机抽取致弱的第150代冻存的犬瘟热病毒毒种(D2 株)5支，按现行《中国兽药典》附录进行检验。结果：TG培养基、GA培养基和GP培养基培养的5支毒种均无菌生长。
(6)支原体检验：采用支原体培养基。随机取致弱的第150代冻存的犬瘟热病毒毒种(D2株)，按现行《中国兽药典》附录进行检验。
结果：琼脂固体平板培养无“煎蛋”状支原体菌落。阳性对照(猪鼻支原体)：固体培养基呈“煎蛋”状支原体菌落；液体培养基颜色变黄pH6.35，呈酸性。阴性对照：固体培养基无“煎蛋”状支原体菌落；液体培养基pH7.48。
(7)外源病毒检验：以150代毒种(D2株)为模板，针对犬细小病毒 VP2基因、犬病毒性肝炎病毒纤突蛋白基因做PCR扩增，针对犬副流感病毒 N基因、狂犬病病毒N基因、犬瘟热病毒H基因做RT-PCR扩增，结果仅针对犬瘟热病毒H基因扩增结果为阳性。
(8)致弱毒的特异性鉴定：取150代致弱毒用无血清DMEM稀释为 200TCID50/0.1ml，采用实施例1步骤(5)相同的方法测定病毒特异性，结果：除了犬瘟热病毒抗血清孵育的病毒液接种的细胞及未做接种的正常细胞没有产生细胞病变以外，其他组细胞均产生了细胞病变。说明D2株病毒为犬瘟热病毒。
(9)致弱毒的基因序列分析：利用犬瘟热病毒H基因全长(1735bp) 序列的上、下游引物F2a、R2a，对致弱的第120代和150代病毒进行核酸扩增，测序，对序列进行比较。结果二者同源性为99.3％。
F2a：5’-ATGCTCTCCTACCAAGATAAGGTG-3’
R2a：5’-TCAAGGTTTTGAACGGTTACATGAG-3’
将传代致弱的第150代毒种作为犬瘟热活疫苗制备的候选毒株。
(10)微生物保藏：本发明将所分离并驯化的犬瘟热病毒D2株提交专利程序认可保藏机构保藏，其微生物保藏号是CGMCC No.19397的犬瘟热病毒D2株；分类命名为：犬瘟热病毒；保藏时间是：2020年3月30日：保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。该病毒株称作犬瘟热病毒D2株、CDV D2株、D2株。
实施例3.犬瘟热病毒株(D2株)的转瓶培养
(a)细胞扩大培养：将培养的Vero种子细胞扩大至转瓶中进行培养，培养液为含有8v/v％新生牛血清的DMEM，37℃温度下，控制转速10～11转 /小时，培养24小时。(b)接种：取生长良好的Vero细胞单层转瓶，弃去培养液，按5v/v％接种量接种生产种毒实施例2所制备的犬瘟热病毒D2株(含量104.0TCID50/ml)，置33℃吸附1小时，加入含2v/v％新生牛血清的DMEM 细胞维持液，置33℃温度下旋转培养，转速10～11转/小时。(c)收获：逐日观察细胞病变，当CPE达到90％以上时，收获病毒培养液，-20℃冻融2次。同时抽样进行无菌检验和病毒含量测定。保证无菌后进行后续步骤。(d)无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，结果无菌生长。(e)病毒含量：采取实施例1步骤(2)相同的方法测定病毒含量，保证病毒含量≥ 105.0TCID50/ml。(f)纯化：通过直径为0.22μm滤膜过滤处理步骤(c)所得病毒培养液，得到去除细胞及碎片的D2株犬瘟热病毒液。
实施例4.犬瘟热病毒株(D2株)的悬浮培养
(a)细胞的制备：取复苏培养的Vero细胞扩大至转瓶中进行培养，培养液为含有8v/v％新生牛血清的DMEM，37℃温度下，控制转速10～11转/ 小时。待细胞生长至致密单层后用240USP U/mg的胰蛋白酶消化分散，细胞活力不低于95％时，按2.0～10.0×105细胞/ml接种密度将Vero细胞转移至生物反应器中，载体用量为2～5g/L，设定反应器细胞培养的参数(温度37± 0.5℃，pH值7.2±0.1，DO值45±5％，转速为30r/min)。每间隔24h取样进行细胞观察、计数。(b)接毒与收获：待生物反应器中Vero细胞长成致密单层，细胞密度达到3.0×106细胞/ml，沉淀排出培养液，按照MOI＝0.005～0.01 接种实施例2所制备的犬瘟热病毒D2株，补加含2v/v％新生牛血清的DMEM 细胞维持液进行病毒培养，设定反应器病毒培养的参数(温度33±0.5℃，pH 值7.2±0.1，DO值45±5％，转速为30r/min)，培养96～120h或细胞病变达到90％以上时收获，-20℃冻融2次，同时抽样进行无菌检验和病毒含量测定。配苗前将检验合格的病毒抗原溶液通过无菌离心或过滤去除载体及细胞碎片。(c)无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，结果无菌生长。 (d)病毒含量：采取实施例1步骤(2)相同的方法测定病毒含量，保证病毒含量≥105.0TCID50/ml。(e)纯化：通过直径为0.22μm滤膜过滤处理步骤(b) 所得病毒培养液，得到去除细胞及碎片的D2株犬瘟热病毒液。
实施例5.犬细小病毒原始毒株的获取
(1)病例：辽宁省某犬场采集了出现临床犬细小病毒病疑似症状的幼犬1例，发病，症状为：发热、精神沉郁、轻度腹泻症状。根据症状判断，疑似患有犬细小病毒性肠炎。
(2)病毒分离：取患病动物肠管组织，将肠管组织用灭菌生理盐水冲洗3次，按lg组织：10ml的比例将肠管组织加入灭菌冷生理盐水，放入组织搅拌机中，以10000～12000r/min，充分捣碎肠管组织，反复在-15℃以下冻融3次后，用3层灭菌纱布过滤2次，收集滤液，并以12000r/min4℃下离心 30分钟，收集上清，加入终浓度为1000IU/ml青霉素、1000μg/ml链霉素，分装，得到组织液b。
采用F81细胞分离。按常规方法取F81细胞消化培养，培养液为8％RPMI Medium1640，待传代分散细胞时，同步接入上述组织液b，接种量为1v/v％，同时设不接毒的健康细胞对照。置37℃含5％CO2培养箱培养观察3～5日，收获培养物，进行鉴定。第1代即出现了可见的细胞病变，细胞出现了拉网和脱落的细胞病变(见图3)，在此基础上，进一步扩大1代，共培养收集200ml 细胞培养液b，大部分加入蔗糖脱脂奶保护剂后冻干保存。将细胞培养液b 中所含的病毒称作毒株b。
将前述细胞培养液b用含8％新生牛血清的RPMI Medium 1640细胞培养液作10倍系列稀释，取10-1～10-8稀释度，分别同步接种96孔F81细胞培养板，每个稀释度接种8孔，每孔接种0.1ml，同时设正常细胞对照8孔，置 37℃、含5％CO2培养箱培养观察5日，每日观察CPE情况。根据Reed-Muench 法计算TCID50。结果病毒含量为105.2TCID50/0.1ml。
(3)形态观察：用磷钨酸对步骤(2)的细胞培养液b上清中毒株b染色再作负染，透射电镜观察，照片参见图4，从形态上观察判断，毒株b为犬细小病毒。
(4)分子生物学鉴定：针对犬细小病毒VP2基因，设计如下序列的引物P1b和P2b，对细胞培养液b上清中毒株b进行RT-PCR检测，然后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条带大小为390bp，符合犬细小病毒VP2基因的长度，进一步判断，毒株b为犬细小病毒。将扩增产物进行测序，得到的序列NCBI 已发表的犬细小病毒病毒株核酸序列同源性最高达99.3％，由此确信，毒株 b为犬细小病毒。
P1b：5’-CTCAGCCACCAACTAAAG-3’
P2b：5’-GTAAGCCCAATGCTCTAT-3’
(5)特异性试验：分别采用0.1ml犬细小病毒阳性血清(中和效价不低于1:128)、犬瘟热病毒阳性血清(中和效价不低于1:128)、犬病毒性肝炎病毒阳性血清(中和效价不低于1:128)、狂犬病病毒阳性血清(中和效价不低于40IU/ml)和健康犬阴性血清(阴性血清为未免疫任何疫苗的4月龄健康犬的血清)(前述血清由军事兽医研究所病毒室惠赠)与0.1ml细胞培养液b 在37℃孵育1小时，同步接种到F81细胞，培养液为8％RPMI Medium 1640，同时设正常细胞对照(没有接种任何病毒的F81细胞)和病毒对照(细胞培养液b不加血清接种到F81细胞)各6孔，置37℃、含5％CO2培养箱中培养观察5日。结果，除了犬细小病毒阳性血清孵育的细胞培养液b和正常细胞对照没有使F81细胞产生细胞病变以外，其他测试中细胞均出现了拉网、破碎、脱落，说明所分离的病毒为犬细小病毒。由此可知，毒株b为犬细小病毒。
(6)回归试验：将步骤(2)的细胞培养液b(含毒株b)用灭菌生理盐水稀释到病毒含量为105.0TCID50/ml，接种2～4月龄犬细小病毒抗体阴性健康幼犬(SN＜1:2)4只，接种量为2.0ml，接种方式为：口服，接种后观察时间为14天，动物症状为：饲养观察至第5、6日时，3只接种犬先后出现轻微肠炎，并伴有发热症状，病程持续5天后康复，饲养方式一致的未注射病毒的4只对照犬均未发病。这些症状为典型的犬细小病毒性肠炎，由此可以判断毒株b为犬细小病毒。
(7)确诊：经前面的检测鉴定综合判定，毒株b为犬细小病毒。
实施例6.犬细小病毒毒株的驯化与毒株生化、遗传的改变的测试
(1)病毒传代培养：将实施例5步骤(2)的细胞培养液b(含毒株b) 在F81细胞上连续传代培养至220代，具体步骤如下：培养液为8％RPMI Medium 1640，按照1v/v％剂量将细胞培养液b接种到F81细胞单层上，培养条件为：置37℃、5％CO2培养箱培养。培养箱培养观察2～3日，当CPE 达到90％以上条件时，收获子代病毒，连续传代220代，将第220代命名为P6株。将传代致弱的第220代毒种作为犬细小病毒活疫苗制备的候选毒株。
(2)病毒存活性测试：采用实施例5步骤(2)相同的方法，测定180、 200、220代毒种细胞培养液的TCID50。结果：180、200、220代病毒培养液测定的病毒含量分别为106.71TCID50/ml、106.33TCID50/ml、106.41TCID50/ml。依照感染能力测量的病毒含量逐渐减少的趋势，也说明病毒的毒力在逐渐减弱。
(3)病毒安全性试验：取150、180、200、220代病毒细胞培养液，分别采用实施例5步骤(2)相同的方法，计算TCID50，用灭菌生理盐水分别稀释为106.0TCID50/ml，口服接种2～4月龄且禁食不禁水24小时的CPV中和抗体效价不高于1:2的健康易感犬5只，每只4.0ml，同时设置4只不接种对照犬，隔离观察14日，分别记录每组犬的临床表现。结果：150代病毒细胞培养液接种的犬3/5发病，症状表现为：轻微腹泻。180代～220代病毒细胞培养液接种的犬均5/5健活，与对照犬之间未见明显差别，对幼犬没有毒力，表明本病毒没有致病性和副作用。病毒传180代已经失去了毒力，因此，传 220代毒力会更弱，可能能够安全地用作活疫苗。
(4)免疫原性与免疫保护测试：将180、220代毒种细胞培养液分别用灭菌的生理盐水稀释为105.0TCID50/ml，分别皮下接种5只6周龄CPV抗体阴性健康犬易感犬，每只1.0ml，同时设未注射病毒的对照犬5只，免疫后 21日后采集血液分离血清，采用中和试验进行中和抗体效价测定，步骤为：以为实施例5步骤(2)的细胞培养液b(含毒株b)作为抗原(含200TCID50)，对血清进行2倍稀释使用，通过接种F81细胞观察CPE来判断免疫效果，根据Reed-Muench法计算抗体效价。
采集血液之后，用CPV-v株分别通过口服途径对免疫组和对照组各接种 2.0ml(含量103.0TCID50/ml)，隔离饲养观察14天，记录临床表现。结果， CPV第180代和220代均可诱导机体产生较好的中和抗体，21日中和抗体达 1:90.5，具有中和细胞中CPV的作用；免疫犬在攻击强毒后全部健活，对照犬在攻击强毒后全部发病死亡。具体为：180代病毒组免疫后21日中和抗体效价分别为1:45.3、1:90.5、1:76.1、1:64、1:32，全部健活。220代病毒组免疫后21日中和抗体效价分别为1:64、1:76.1、1:76.1、1:53.8、1:78.8，全部健活。攻毒对照组均未检测到中和抗体，第1只症状为：精神沉郁、弓背、酱油色稀便、死亡；第2只症状为：精神沉郁、呕吐、弓背、急性死亡；第 3只症状为：精神沉郁、酱油色稀便、死亡；第4只症状为：精神沉郁、呕吐、弓背、死亡；第5只症状为：精神沉郁、酱油色稀便、死亡。由此可见，本发明所分离的犬细小病毒传代180代后，毒力消失，免疫原性良好。
(5)无菌检验：随机抽取致弱的第220代冻存的犬细小病毒毒种细胞培养液(P6株)5支，按现行《中国兽药典》附录进行检验。结果：TG培养基、GA培养基和GP培养基培养的5支毒种均无菌生长。
(6)支原体检验：采用支原体培养基。随机抽取致弱的第220代冻存的犬细小病毒毒种细胞培养液(P6株)，按现行《中国兽药典》附录进行检验。结果：琼脂固体平板培养无“煎蛋”状支原体菌落。阳性对照(猪鼻支原体)：固体培养基呈“煎蛋”状支原体菌落；液体培养基颜色变黄pH6.35，呈酸性。阴性对照：固体培养基无“煎蛋”状支原体菌落；液体培养基pH7.48。
(7)外源病毒检验：以220代毒种(P6株)为模板，针对犬细小病毒VP2基因、犬病毒性肝炎病毒纤突蛋白基因做PCR扩增，针对犬副流感病毒 N基因、狂犬病病毒N基因、犬瘟热病毒H基因做RT-PCR扩增，结果仅针对犬细小病毒VP2基因扩增结果为阳性。
(8)致弱毒的特异性鉴定：取220代致弱毒(P6株)用8％RPMI Medium 1640稀释为200TCID50/0.1ml，采用实施例5步骤(5)相同的方法测定病毒特异性，结果：除了犬细小病毒阳性血清孵育的220代致弱毒细胞培养液和正常细胞对照没有使F81细胞产生细胞病变以外，其他测试中细胞均出现了细胞病变，说明P6株病毒为犬细小病毒。
(9)致弱毒的基因序列分析：利用犬细小病毒VP2基因全长序列的上、下游引物P1b和P2b，对致弱的第180代和220代病毒进行核酸扩增，测序，对序列进行比较。结果二者同源性为99.7％。将传代致弱的第220代毒种作为犬瘟热活疫苗制备的候选毒株。
(10)微生物保藏：本发明将所分离并驯化的犬细小病毒P6株提交专利程序认可保藏机构保藏，其微生物保藏号是CGMCC No.19398；分类命名为：犬细小病毒；保藏时间是：2020年3月30日：保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。该病毒株称作犬细小病毒P6 株、CPV P6株、P6株。
实施例7.犬细小病毒性肠炎病毒株(P6株)的转瓶培养
(a)细胞扩大培养：将培养的F81种子细胞扩大至转瓶中进行培养，培养液为：8v/v％新生牛血清的RPMI Medium 1640，37℃温度下，控制转速 10～11转/小时，培养24小时。(b)接种：当细胞转瓶长满单层F81，弃去培养液，用240USP U/mg胰酶消化后，按1:2比例传代，加入含8v/v％新生牛血清的RPMI Medium 1640，将实施例6的细小病毒P6株生产毒种(含量 105.0TCID50/ml)按1v/v％的接种量同步接种F81细胞，置37℃温度下旋转培养，转速10～11转/小时。(c)收获：逐日观察细胞病变，当CPE达到90％以上时，收获细胞培养液，-20℃冻融2次。同时抽样进行无菌检验和病毒含量测定。保证无菌后进行后续步骤。(d)无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，结果无菌生长。(e)病毒含量：采取实施例5步骤(2)相同的方法测定病毒含量，保证病毒含量≥106.0TCID50/ml。(f)纯化：通过直径为0.22μm滤膜过滤处理步骤(c)所得病毒培养液，得到去除细胞及碎片的 P6株犬细小病毒液。
实施例8.犬细小病毒性肠炎病毒株(P6株)的悬浮培养
(a)细胞的制备：取复苏培养的F81细胞扩大至转瓶中进行培养，培养液为：8v/v％新生牛血清的RPMI Medium 1640，37℃温度下，控制转速10～11 转/小时。待细胞生长至致密单层后用240USP U/mg的胰蛋白酶消化分散，细胞活力不低于95％时，按2.0～10.0×105细胞/ml接种密度将F81细胞转移至生物反应器中，载体用量为2～5g/L，设定反应器细胞培养的参数(温度37 ±0.5℃，pH值7.2±0.1，DO值45±5％，转速为30r/min)。每间隔24h取样进行细胞观察、计数。(b)接毒与收获：待生物反应器中F81细胞长成致密单层，细胞密度达到4.0×106细胞/ml，沉淀排出培养液，按照 MOI＝0.005～0.01接种实施例6的细小病毒P6株生产毒种，补加含2v/v％新生牛血清的RPMI Medium 1640进行病毒培养，设定反应器病毒培养的参数 (温度37±0.5℃，pH值7.2±0.1，DO值45±5％，转速为30r/min)，培养 36～48h或细胞病变达到90％以上时收获，-20℃冻融2次，同时抽样进行无菌检验和病毒含量测定。配苗前将检验合格的病毒抗原溶液通过无菌离心或过滤去除载体及细胞碎片。(c)无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，结果无菌生长。(d)病毒含量：采取实施例5步骤(2)相同的方法测定病毒含量，保证病毒含量≥106.0TCID50/ml。(e)纯化：通过直径为0.22μm滤膜过滤处理步骤(b)所得病毒培养液，得到去除细胞及碎片的P6株犬细小病毒液。
实施例9.犬传染性肝炎原始毒株的获取
(1)病例：辽宁省辽阳市一家犬专业合作社犬场的出现犬传染性肝炎病疑似症状的幼犬1例，发病症状为：轻微腹泻。根据症状判断，疑似患有犬传染性肝炎。
(2)病毒分离：取患病动物肠管组织，将肠管组织用灭菌生理盐水冲洗3次，按lg组织：10ml的比例将肠管组织加入灭菌冷生理盐水，放入组织搅拌机中，以10000～12000r/min，充分捣碎肠管组织，反复在-15℃以下冻融3次后，用3层灭菌纱布过滤2次，收集滤液，并以12000r/min 4℃下离心30分钟，收集上清，加入过滤除菌的终浓度为1000IU/ml青霉素、 1000μg/ml链霉素，分装，得到组织液c。
采用MDCK细胞分离。按常规方法取MDCK细胞消化培养，培养液为 DMEM，接入上述组织液c，接种量为1v/v％，同时设不接毒的健康细胞对照。置37℃含5％CO2培养箱培养观察2～3日，收获培养物，进行鉴定。第 1代即出现了可见的细胞病变，细胞出现了聚集呈葡萄串状、折光性强的细胞病变(见图5)，在此基础上，进一步通过1v/v％比例接种扩大1代，共培养收集200ml细胞培养液c，大部分加入蔗糖保护剂后冻干保存。将细胞培养液c中所含的病毒称作毒株c。
将前述细胞培养液c用无血清DMEM细胞培养液作10倍系列稀释，取 10-4～10-74个稀释度，分别接种已长成良好单层、弃去细胞培养液的96孔 MDCK细胞培养板，每个稀释度接种8孔，每孔0.1ml，同时设正常细胞对照8孔。置37℃、含5％CO2培养箱吸附1小时，每孔补加含4％新生牛血清的DMEM细胞培养液0.1ml，置37℃、含5％CO2培养箱培养观察4日。根据Reed-Muench法计算TCID50。结果病毒含量为105.5TCID50/0.1ml。
(3)形态观察：用磷钨酸对步骤(2)的细胞培养液c染色再负染染色，透射电镜观察，照片参见图6，从形态上观察判断，毒株c为犬传染性肝炎病毒。
(4)分子生物学鉴定：针对犬传染性肝炎病毒纤突蛋白基因，设计如下序列的引物P1c和P2c，对毒株c进行PCR检测，然后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条带大小为1019bp，符合犬传染性肝炎病毒纤突蛋白基因的长度，进一步判断，毒株c为犬传染性肝炎病毒。
P1c：5’-CGCGCTGAACATTACTACCTTGTC-3’
P2c：5’-CTTCGTGTCCGCTTCATG-3’
(5)特异性试验：分别采用0.1ml犬细小病毒阳性血清(中和效价不低于1:64)、犬瘟热病毒阳性血清(中和效价不低于1:128)、犬病毒性肝炎病毒阳性血清(中和效价不低于1:128)、狂犬病病毒阳性血清(中和效价不低于40IU/ml)和健康犬阴性血清(阴性血清为未免疫任何疫苗的4月龄健康犬的血清)(前述血清由军事兽医研究所病毒室惠赠)与0.1ml细胞培养液c 在37℃孵育1小时，接种已长成良好单层的MDCK细胞，培养液为DMEM，同时设正常细胞对照(没有接种任何病毒的MDCK细胞)和病毒对照(细胞培养液c不加血清接种到MDCK细胞)各6孔，置37℃、含5％CO2培养箱中培养观察4日。结果，除了犬细小病毒阳性血清孵育的细胞培养液c和正常细胞对照没有使MDCK细胞产生细胞病变以外，其他测试中细胞均出现了聚集呈葡萄串状、折光性强的细胞病变，说明所分离的病毒为犬病毒性肝炎病毒。由此可知，毒株c为犬传染性肝炎病毒。
(6)回归试验：将步骤(2)的细胞培养液c(含毒株c)用灭菌生理盐水稀释到病毒含量为105.0TCID50/ml，接种2～3月龄犬传染性肝炎抗体阴性健康幼犬(SN＜1:2)4只，接种量为4.0ml，接种方式为：口服和滴鼻各2.0ml，接种后观察时间为14天，饲养观察至5、9、14日时，3只接种犬先后出现轻微腹泻，并有轻度发热，病程持续2天后康复，另1只接种犬和饲养方式一致的未注射病毒的4只对照犬均未发病。这些症状为典型的犬传染性肝炎，由此可以判断毒株c为犬传染性肝炎病毒。
(7)确诊：经前面的检测鉴定综合判定，毒株c为犬传染性肝炎病毒。
实施例10.犬传染性肝炎病毒毒株的驯化与毒株生化、遗传的改变的测试
(1)病毒传代培养：将实施例9步骤(2)的细胞培养液c(含毒株c) 在MDCK细胞上连续传代培养至130代，具体步骤如下：培养液为含8％新生牛血清的DMEM，按照1v/v％剂量将实施例9步骤(2)的细胞培养液c 接种到MDCK细胞单层上，培养条件为：在37℃、含5％CO2培养箱培养观察2～3日，当细胞病变达到达90％以上时，收获子代病毒，连续传代130 代，将第130代命名为A22株。将传代致弱的第130代毒种作为犬传染性肝炎活疫苗制备的候选毒株。
(2)病毒存活测试：采用实施例9步骤(2)相同的方法，测定100、 115、130代毒种细胞培养液的TCID50。结果：100、115、130代病毒培养液测定的病毒含量分别为106.3TCID50/ml、106.7TCID50/ml、106.4TCID50/ml。
(3)病毒安全性试验：取80、100、115、130代病毒细胞培养液，分别采用实施例9步骤(2)相同的方法，计算TCID50，用灭菌生理盐水分别稀释为106.0TCID50/ml，通过皮下注射途径接种2～4月龄犬传染性肝炎病毒中和抗体不高于1:2的健康易感犬5只，每只接种1.0ml，同时设置4只不接种对照犬，隔离观察14日，分别记录每组犬的临床表现。结果：80代病毒组发病数量4/5，轻微腹泻；100代病毒组发病数量1/5，轻微腹泻；115代和 130代代病毒组发病数量均为0，均无异常表现。
(4)免疫原性与免疫保护测试：将115代、130代的毒种细胞培养液分别用灭菌生理盐水分别稀释为105.0TCID50/ml，皮下注射5只6周龄犬传染性肝炎病毒抗体阴性临床健康犬，每只注射1.0ml，同时设对照犬5只，不进行注射。免疫后21日采集血液分离血清，采用中和试验进行中和抗体效价测定，步骤为：以实施例9步骤(2)的细胞毒液c(含毒株c)作为抗原(含 200TCID50)，对血清进行2倍稀释使用，通过接种MDCK细胞观察CPE来判断免疫效果，根据Reed-Muench法计算抗体效价。采集血液之后，用CAV-1v 株对免疫组和对照组每只犬各接种2.0ml(病毒含量106.5TCID50/ml)，口服和滴鼻各1.0ml，攻毒后，隔离饲养观察14日，记录临床表现。结果：犬传染性肝炎病毒115代和130代均可诱导机体产生较好的中和抗体，具有中和细胞中犬传染性肝炎病毒的作用；免疫犬在攻击强毒后全部健活，对照犬在攻击强毒后全部发病死亡。具体为：115代病毒组免疫后21日中和抗体效价分别为1:64、1:76.1、1:45.3、1:64、1:90.5，全部健活。130代病毒组免疫后21 日中和抗体效价分别为1:53.8、1:97.2、1:32、1:64、1:76.1，全部健活。攻毒对照组均未检测到中和抗体，均表现为：发热、腹泻、死亡。由此可见，本发明所分离的犬病毒性肝炎病毒传代115代后，毒力消失，免疫原性良好。
(5)无菌检验：随机抽取致弱的第130代冻存的犬传染性肝炎病毒毒种细胞培养液(A22株)5支，按现行《中国兽药典》附录进行检验。结果： TG培养基、GA培养基和GP培养基培养的5支毒种均无菌生长。
(6)支原体检验：采用支原体培养基。随机抽取致弱的第130代冻存的犬传染性肝炎病毒毒种细胞培养液(A22株)，按现行《中国兽药典》附录进行检验。结果：琼脂固体平板培养无“煎蛋”状支原体菌落。阳性对照(猪鼻支原体)：固体培养基呈“煎蛋”状支原体菌落；液体培养基颜色变黄 pH6.35，呈酸性。阴性对照：固体培养基无“煎蛋”状支原体菌落；液体培养基pH7.48。
(7)外源病毒检验：以130代毒种(A22株)为模板，针对犬细小病毒VP2基因、犬病毒性肝炎病毒纤突蛋白基因做PCR扩增，针对犬副流感病毒N基因、狂犬病病毒N基因、犬瘟热病毒H基因做RT-PCR扩增，结果仅针犬病毒性肝炎病毒纤突蛋白基因扩增结果为阳性。
(8)致弱毒的特异性鉴定：取130代致弱毒(A22株)用DMEM稀释为200TCID50/0.1ml，采用实施例9步骤(5)相同的方法测定病毒特异性，结果：除了犬细小病毒阳性血清孵育的细胞培养液和正常细胞对照没有使 MDCK细胞产生细胞病变以外，其他测试中细胞均出现了细胞病变，说明 A22株病毒为犬传染性肝炎病毒。将传代致弱的第130代毒种作为犬瘟热活疫苗制备的候选毒株。
(6)微生物保藏：本发明将所分离并驯化的犬传染性肝炎病毒A22株提交专利程序认可保藏机构保藏，其微生物保藏号是CGMCC No.19396；分类命名为：犬传染性肝炎病毒；保藏时间是：2020年3月30日：保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。该病毒株称作犬传染性肝炎病毒A22株、CAV A22株、A22株。
实施例11.犬传染性肝炎病毒株(A22株)的转瓶培养
(a)细胞扩大培养：将培养的MDCK种子细胞扩大至转瓶中进行培养，培养液为：8v/v％新生牛血清的DMEM，37℃温度下，控制转速10～11转/ 小时，培养24小时。(b)接种：取生长良好的MDCK细胞单层转瓶，弃去培养液，按1v/v％接种量接种生产种毒实施例10的犬传染性肝炎病毒A22 株(含量105.0TCID50/ml)，置37℃吸附1小时，加入含2v/v％新生牛血清的DMEM，置37℃温度下旋转培养，转速10～11转/小时。(c)收获：逐日观察细胞病变，当CPE达到90％以上时，收获细胞培养液，-20℃冻融2次。同时抽样进行无菌检验和病毒含量测定，保证无菌后进行后续步骤。(d)无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，结果无菌生长。(e)病毒含量：采取实施例9步骤(2)相同的方法测定病毒含量，保证病毒含量≥106.0TCID50/ml。(f)纯化：通过直径为0.22μm滤膜过滤处理步骤(c)所得病毒培养液，得到去除细胞及碎片的A22株犬传染性肝炎病毒液。
实施例12.犬传染性肝炎病毒株(A22株)的悬浮培养
(a)细胞的制备：取复苏培养的MDCK细胞扩大至转瓶中进行培养，培养液为：8v/v％新生牛血清的DMEM，37℃温度下，控制转速10～11转/ 小时。待细胞生长至致密单层后用240USP U/mg的胰蛋白酶消化分散，细胞活力不低于95％时，按2.0～10.0×105细胞/ml接种密度将MDCK细胞转移至生物反应器中，载体用量为2～5g/L，设定反应器细胞培养的参数(温度 37±0.5℃，pH值7.2±0.1，DO值45±5％，转速为30r/min)。每间隔24h取样进行细胞观察、计数。(b)接毒与收获：待反应器中MDCK细胞长成致密单层，细胞密度达到3.0×106细胞/ml，沉淀排出培养液，按照MOI＝0.005～0.01 接种实施例10的犬传染性肝炎病毒A22株，补加含2v/v％新生牛血清的 DMEM细胞维持液进行病毒培养，设定反应器病毒培养的参数(温度 37±0.5℃，pH值7.2±0.1，DO值45±5％，转速为30r/min)，培养36～48小时或细胞病变达到90％以上时收获，-20℃冻融2次，同时抽样进行无菌检验和病毒含量测定。配苗前将检验合格的病毒抗原溶液通过无菌离心或过滤去除载体及细胞碎片。(c)无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，结果无菌生长。(d)病毒含量：采取实施例9步骤(2)相同的方法测定病毒含量，保证病毒含量≥106.0TCID50/ml。(e)纯化：通过直径为0.22μm滤膜过滤处理步骤(b)所得病毒培养液，得到去除细胞及碎片的A22株犬传染性肝炎病毒液。
实施例13.犬瘟热病毒(D2株)、犬细小病毒(P6株)、犬传染性肝炎病毒(A22株)三联活疫苗的制备
(1)冻干保护剂的制备
冻干保护剂的配制包括：(a)稳定剂大分子部分：用100ml注射用水溶解分装后，116℃高压灭菌30分钟。其成分包括：0.5g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、 2g山梨醇。(b)稳定剂小分子部分：用100ml注射用水溶解后滤过除菌。其成分包括：1g甘氨酸、8.3g蔗糖、9.2g海藻糖。(c)配苗时，将上述两部分溶液按1:1体积比混合后，得到冻干保护剂。
(2)疫苗的配制
分别将通过实施例3的转瓶培养或实施例4的悬浮培养检验合格的犬瘟热病毒毒液用灭菌的生理盐水稀释成含量105.0TCID50/ml；分别将通过实施例 7的转瓶培养或实施例8的悬浮培养检验合格的犬细小病毒毒液用灭菌的生理盐水稀释成含量106.0TCID50/ml；分别将通过实施例11的转瓶培养或实施例12的悬浮培养检验合格的犬传染性肝炎病毒培养液毒液用灭菌的生理盐水稀释成含量106.0TCID50/ml。稀释后的犬瘟热病毒毒液、稀释后的犬细小病毒毒液、稀释后的犬传染性肝炎病毒培养液毒液及灭菌的冻干保护剂按 5:1:1:3体积比例混合均匀，定量分装。每瓶包括2ml混合液，每瓶包括1头份。分装后，迅速进行冷冻真空干燥，加盖密封，贴签。
冷冻干燥的步骤如下：(i)在制品未装箱之前，干燥箱的搁板温度降到 0℃左右，制品装箱后，干燥箱的搁板继续进行降温，搁板温度的设定为-45℃，此过程需运行时间1小时，在此温度下保持2小时，使制品完全冻牢，共计 3小时。(ii)在产品预冻结束前1小时，冷阱开始降温，当冷阱温度达到 -40～-50℃时，启动真空泵组进行抽真空，使冻干箱压力降至8pa～10pa，准备进行制品第一阶段升华干燥。(iii)在开始第一阶段升华时，搁板温度为-28℃，升华界面不超过其崩解温度，冻干箱压力不超过18pa。第一阶段升华干燥的时间分三个阶段：搁板温度-40℃升高到-28℃，此过程需运行1小时，在此温度保持6小时；由搁板温度-28℃升高到-15℃，此过程需运行1小时；升华干燥时间6小时，由搁板温度-15℃升高到8℃，此过程需运行1小时；升华干燥时间4小时，第一阶段干燥结束，共计19小时。(iv)解析干燥阶段：第二阶段升华干燥时，使制品温度达到28℃左右，此过程需运行1小时，在此温度保持时间为2小时，使制品水分含量达到1～4％，冻干过程结束。
本发明将上述三联活疫苗简称“三联苗”。
实施例14.三联活疫苗成品检验
使用实施例3的转瓶培养的犬瘟热病毒毒液，实施例7的转瓶培养的犬细小病毒毒液和实施例11的转瓶培养的犬传染性肝炎病毒培养液毒液，根据实施例13的方法独立制备了3批三联活疫苗，进行如下检验。
(1)性状检验：3批三联苗均呈海绵状疏松团块，易与甁壁脱离，加灭菌生理盐水后迅速溶解。
(2)无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验。结果：TG培养基、GA培养基和GP培养基培养的3批三联苗均无菌生长。
(3)支原体检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验。结果：3批三联苗琼脂固体平板培养均无“煎蛋”状支原体菌落。阳性对照(猪鼻支原体)：固体培养基呈“煎蛋”状支原体菌落；液体培养基颜色变黄pH6.35，呈酸性。阴性对照：固体培养基无“煎蛋”状支原体菌落；液体培养基pH7.48。3批三联苗均无支原体生长。
(4)外源病毒检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，分别以3 批三联苗的核酸为模板，分别针对犬细小病毒VP2基因、犬病毒性肝炎病毒纤突蛋白基因、犬副流感病毒N基因、狂犬病病毒N基因、犬瘟热病毒H 基因设计引物，以RT-PCR模式进行扩增。3批三联苗结果仅针对针对犬细小病毒VP2基因、犬病毒性肝炎病毒纤突蛋白基因、犬瘟热病毒H基因扩增结果为阳性，其他基因扩增结果为阴性。
实施例15.三联活疫苗安全性的测定
健康犬检查参考标准：耳朵是冷的，耳孔呈茶色或污黑色。眼睛清澈，炯炯有神。鼻子除了睡觉和刚睡醒时，鼻头呈冷湿状态。嘴里没有像鱼腥味等臭味，口内的黏膜呈粉红色。牙齿整齐，咬合正常。尾巴经常摆动尾巴。肛门紧紧闭合，周围没有秽物。被毛清洁而有光泽。四肢强壮有力，行走自然平稳，符合其品种的步态标准，不会出现踉跄或者跌倒的现象，腿的内侧保持清洁。体格强壮，骨架牢固，肌肉丰满而结实，抱在手里的重量的感觉要比看起来大。使用实施例14所述3批三联活疫苗，分别用灭菌生理盐水将 1头份疫苗稀释成1.0ml的疫苗注射液1，将5头份疫苗稀释成1.0ml的疫苗注射液2用。做下述6组安全试验，测试动物以及不接种的同种动物健康对照组分别使用比格犬5只或昆明鼠10只，每个测试中测试动物与对照动物在相同的条件下饲养，具体参见下面内容。
(1)一次单剂量接种的安全试验：使用疫苗注射液1，将3批三联苗分别一次单剂量皮下接种2月龄临床健康犬，接种剂量为1头份/只，接种后观察14日。结果表明，3批三联苗以皮下注射，单剂量接种犬全部健活，与健康对照组犬健康状况无明显差异，精神良好，行为未见异常，粪便正常，采食、饮水未见异常，体温正常，体重正常，注射局部吸收良好、未见红肿、无硬结，肝脏、脾脏、肾脏、心脏、胆囊未见异常。试验证明，该三联苗经皮下注射一次单剂量接种试验犬均安全。
(2)单剂量重复接种的安全试验：使用疫苗注射液1，将3批三联苗分别一次单剂量皮下接种2月龄临床健康犬，接种剂量为1头份/只，接种后 14日重复接种1次，接种剂量为1头份/只，继续观察14日。结果表明：3 批三联苗以经皮下注射单剂量重复接种犬全部健活，与健康对照组犬健康状况无明显差异，精神良好，行为未见异常，粪便正常，采食、饮水未见异常，体温正常，体重正常，注射局部吸收良好、未见红肿、无硬结，肝脏、脾脏、肾脏、心脏、胆囊未见异常。试验证明，该三联苗经皮下注射途径单剂量重复接种试验犬均安全。
(3)一次超剂量接种的安全试验：使用疫苗注射液2，将3批三联苗分别一次超剂量皮下接种2月龄临床健康犬接种剂量为10头份/只，接种后观察14日。结果表明，3批三联苗经皮下注射途径超剂量接种犬全部健活，与健康对照组犬健康状况无明显差异，精神良好，行为未见异常，粪便正常，采食、饮水未见异常，体温正常，体重正常，注射局部吸收良好、未见红肿、无硬结，肝脏、脾脏、肾脏、心脏、胆囊未见异常。试验证明，该三联苗经皮下注射一次超剂量接种试验犬均安全。
(4)对怀孕犬和哺乳犬的安全性试验：使用疫苗注射液2，将3批三联苗分别经皮下注射途径超剂量接种怀孕犬连续观察2周，接种剂量为10头份/ 只。超剂量接种哺乳犬，接种剂量为10头份/只，连续观察2周。结果表明， 3批三联苗经皮下接种怀孕犬和哺乳犬，全部健活，与健康对照组犬健康状况无明显差异，精神良好，行为未见异常，粪便正常，采食、饮水未见异常，体温正常，体重正常，注射局部吸收良好、未见红肿、无硬结，肝脏、脾脏、肾脏、心脏、胆囊未见异常。怀孕犬未见流产或死胎。哺乳犬未见断奶或奶水不足。试验证明，该三联苗免疫怀孕犬和哺乳犬对其生产性能无明显影响。
(5)对非使用日龄犬(幼龄犬)的安全性试验：使用疫苗注射液2，将3 批三联苗分别一次超剂量皮下途径接种1月龄健康幼犬，接种剂量为10头份 /只，接种后观察14日。结果表明，3批三联苗以皮下途径超剂量接幼犬全部健活，与健康对照组犬健康状况无明显差异，精神良好，行为未见异常，粪便正常，采食、饮水未见异常，体温正常，体重正常，注射局部吸收良好、未见红肿、无硬结，肝脏、脾脏、肾脏、心脏、胆囊未见异常。试验证明，该三联疫苗对1月龄幼犬安全。
(6)对非靶动物小鼠的安全性试验：使用疫苗注射液2，将3批三联苗分别一次超剂量皮下接种健康小鼠，接种剂量为2.0ml(含10头份)/只，接种后观察14日。结果表明，3批三联苗以皮下途径超剂量接种小鼠全部健活，与健康对照组小鼠健康状况无明显差异，精神良好，行为未见异常，粪便正常，采食、饮水未见异常，体温正常，体重正常，注射局部吸收良好、未见红肿、无硬结，肝脏、脾脏、肾脏、心脏、胆囊未见异常。试验证明，该三联疫苗对于非靶动物小鼠安全。结果表明，3批三联苗接种犬和小鼠全部健活，注射局部未见红肿，全身无临床异常反应，与健康对照组采食、饮水、排便等健康状况无明显差异。因此，本发明所制备的犬三联活疫苗接种犬安全，未见不良反应。
实施例16.三联活疫苗接种途径的效力测试
本实施例用灭菌生理盐水将1头份疫苗稀释成1.0ml的疫苗注射液使用，取2月龄临床健康比格犬32只，其中30只随机分成6组，每组5只。其中 3组应用实施例14所述3批次三联苗分别皮下注射疫苗1头份/只，另3组，应用实施例14所述3批次三联苗分别肌肉注射疫苗1头份/只。剩余2只作空白对照，同条件下进行饲养。分别于免疫后21日针对32只犬采血并分离血清，根据现行《中国兽药典》的方法，(1)测定犬瘟热病毒血清中和抗体效价，步骤为：以实施例2所制备的犬瘟热病毒D2株作为抗原(含 200TCID50)，对各份血清分别进行2倍稀释使用，通过接种Vero细胞观察 CPE来判断免疫效果，根据Reed-Muench法计算抗体效。(2)测定犬细小病毒血清中和抗体效价，步骤为：以实施例6所制备的犬细小病毒P6株作为抗原(含200TCID50)，对血清进行2倍稀释使用，通过接种F81细胞观察CPE来判断免疫效果，根据Reed-Muench法计算抗体效价。(3)测定犬病毒性肝炎病毒血清中和抗体效价(含200TCID50)，步骤为：以实施例10所制备的犬病毒性肝炎A22株作为抗原，对血清进行2倍稀释使用，通过接种 MDCK细胞观察CPE来判断免疫效果，根据Reed-Muench法计算抗体效价。
结果显示：采用肌肉注射途径免疫，犬瘟热病毒D2株中和抗体效价平均值针对三批疫苗分别为1:108.2、1:104.0、1:107.6；犬细小病毒性肠炎病毒 P6株中和抗体效价平均值针对三批疫苗分别为1:99.7、1:90.5、1:97；犬传染性肝炎病毒A22株中和抗体效价平均值针对三批疫苗分别为1:108.9、 1:104.0、1:111.4。采用皮下注射途径免疫，犬瘟热病毒D2株中和抗体效价平均值针对三批疫苗分别为1:112.3、1:111.4、1:115.4；犬细小病毒性肠炎病毒P6株中和抗体效价平均值针对三批疫苗分别为1:104.6、1:100.4、1:104.0；犬传染性肝炎病毒A22株中和抗体效价针对三批疫苗平均值分别为1:113.8、 1:107.6、1:119.4。对照组，未检出犬瘟热病毒D2株中和抗体、未检出犬细小病毒性肠炎病毒P6株中和抗体、未检出犬传染性肝炎病毒A22株中和抗体。由此可见，两种接种途径都能对犬激发有效的免疫保护，皮下注射效果略好。
实施例17.三联活疫苗免疫效力与保护测试
本实施例用灭菌生理盐水将1头份疫苗稀释成1.0ml的疫苗注射液使用，取2月龄临床健康比格犬60只，随机分小组，每小组5只，犬瘟热病毒攻毒组、犬细小病毒攻毒组、犬传染性肝炎病毒攻毒组各分为四个小组，每组中，三个小组分别取实施例14所述3批次三联苗中的第一批疫苗以0.01头份/只、 0.1头份/只和1头份/只3个剂量皮下注射疫苗，另一个小组设5只不免疫犬作为空白对照，在同条件下进行饲养。免疫后21日，对60只犬采血，使用实施例16相同的方法分别测定犬瘟热病毒血清中和抗体效价，犬细小病毒血清中和抗体效价以及犬病毒性肝炎病毒血清中和抗体效价。采血之后，针对犬瘟热病毒攻毒组，对所有20只犬分别腹腔注射犬瘟热CDV-v株强毒5.0ml (含量2ID50/ml)，连续观察28日。针对犬细小病毒攻毒组，对所有20只犬分别口服犬细小病毒CPV-v株强毒2.0ml(含量103.0TCID50/ml)，连续观察 14日。针对犬传染性肝炎病毒攻毒组，对所有20只犬分别口服、滴鼻犬病毒性肝炎病毒CAV-1v株强毒各1.0ml(含量106.5TCID50/ml)，连续观察14 日。
结果，(1)犬瘟热病毒攻毒组：0.01头份/只免疫小组，血清中和抗体效价为1:53.8、1:76.1、1:53.8、1:64、1:45.3，攻毒保护为80％；0.1头份/只免疫小组，血清中和抗体效价为1:64、1:76.1、1:90.5、1:76.1、1:90.5，攻毒保护为100％；1头份/只免疫小组，血清中和抗体效价为1:107.6、1:90.5、1:107.6、 1:152.2、1:128，攻毒保护为100％。对照小组犬，未检测到中和抗体，5/5 死亡。(2)犬细小病毒攻毒小组：0.01头份/只免疫小组，血清中和抗体效价为1:13.5、1:26.9、1:45.3、1:53.8、1:32，攻毒保护为80％；0.1头份/只免疫小组，血清中和抗体效价为1:64、1:90.5、1:76.1、1:64、1:32，攻毒保护为 100％；1头份/只免疫小组，血清中和抗体效价为1:90.5、1:76.1、1:90.5、1:152.2、 1:90.5，攻毒保护为100％。对照小组犬，未检测到抗体，5/5死亡。(3)犬传染性肝炎病毒攻毒组：0.01头份/只免疫小组，血清中和抗体效价为1:6.72、 1:32、1:16、1:26.9、1:32，攻毒保护为80％；0.1头份/只免疫小组，血清中和效价为1:76.1、1:64、1:53.8、1:64、1:90.5，攻毒保护为100％；1头份/只免疫小组，血清中和抗体效价为1:128、1:90.5、1:76.1、1:107.6、1:152.2，攻毒保护为100％。对照小组犬，未检测到抗体，5/5死亡。由此可见，本发明所制备的犬三联活疫苗用于预防犬瘟热、犬细小病毒性肠炎、犬传染性肝炎能起到很好的保护效果。
由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。

Claims (10)

1.一种用于治疗、预防、减缓和/或控制犬瘟热、犬细小病毒性肠炎和犬传染性肝炎中任两种或三种的疫苗株的组合，所述疫苗株包括犬瘟热病毒疫苗株、犬细小病毒疫苗株和犬传染性肝炎病毒疫苗株中任两种或三种；
所述犬瘟热病毒疫苗株是微生物保藏号为CGMCC No.19397的病毒株，或其临床致病性与免疫原性没有变化的传代病毒株或突变病毒株；
所述犬细小病毒疫苗株是微生物保藏号为CGMCC No.19398的病毒株，或其临床致病性与免疫原性没有变化的传代病毒株或突变病毒株；
所述犬传染性肝炎病毒疫苗株是微生物保藏号为CGMCC No.19396的病毒株，或其临床致病性与免疫原性没有变化的传代病毒株或突变病毒株。
2.一种用于治疗、预防、减缓和/或控制控制犬瘟热、犬细小病毒性肠炎和犬传染性肝炎中任两种或三种的疫苗组合物，所述疫苗组合物以权利要求1所述的疫苗株的组合为免疫原。
3.如权利要求2所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物的原料包括所述免疫原和辅料；
优选地，所述疫苗组合物为活疫苗组合物。
4.如权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，在所述疫苗组合物中，所述犬细小病毒疫苗株的用量、所述犬传染性肝炎病毒疫苗株的用量和所述辅料的干重量用量比为0.5-3×105.0TCID50：0.5-3×105.0TCID50：200-400mg；
优选地，在所述疫苗组合物中，所述犬瘟热病毒疫苗株的用量、所述犬传染性肝炎病毒疫苗株的用量和所述辅料的干重量用量比为2-8×104.0TCID50：0.5-3×105.0TCID50：200-400mg；
优选地，在所述疫苗组合物中，所述犬瘟热病毒疫苗株的用量、所述犬细小病毒疫苗株的用量和所述辅料的干重量用量比为2-8×104.0TCID50：0.5-3×105.0TCID50：200-400mg；
优选地，在所述疫苗组合物中，所述犬瘟热病毒疫苗株的用量、所述犬细小病毒疫苗株的用量、所述犬传染性肝炎病毒疫苗株的用量和所述辅料的干重量用量比为2-8×104.0TCID50：0.5-3×105.0TCID50：0.5-3×105.0TCID50：200-400mg；
优选地，在所述疫苗组合物中，所述犬细小病毒疫苗株的用量、所述犬传染性肝炎病毒疫苗株的用量和所述辅料的干重量用量比为1×105.0TCID50：1×105.0TCID50：315mg；
优选地，在所述疫苗组合物中，所述犬瘟热病毒疫苗株的用量、所述犬传染性肝炎病毒疫苗株的用量和所述辅料的干重量用量比为5×104.0TCID50：1×105.0TCID50：315mg；
优选地，在所述疫苗组合物中，所述犬瘟热病毒疫苗株的用量、所述犬细小病毒疫苗株的用量和所述辅料的干重量用量比为5×104.0TCID50：1×105.0TCID50：315mg；
优选地，在所述疫苗组合物中，所述犬瘟热病毒疫苗株的用量、所述犬细小病毒疫苗株的用量、所述犬传染性肝炎病毒疫苗株的用量和所述辅料的干重量用量比为5×104.0TCID50：1×105.0TCID50：1×105.0TCID50：315mg；
优选地，所述犬瘟热病毒疫苗株的TCID50是基于Vero细胞培养根据Reed-Muench法计算得到的；
优选地，所述犬细小病毒疫苗株的TCID50是基于F81细胞培养根据Reed-Muench法计算得到的；
优选地，所述犬传染性肝炎病毒疫苗株的TCID50是基于MDCK细胞培养根据Reed-Muench法计算得到的。
5.如权利要求2-4中任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗株的培养方法包括如下步骤：
(i)将所述疫苗株的组合中的疫苗株分别接种到培养细胞中培养，收获所述疫苗株的粗毒液；针对所述犬瘟热病毒疫苗株，所述培养细胞为Vero细胞；针对所述犬细小病毒疫苗株，所述培养细胞为F81细胞；针对所述犬传染性肝炎病毒疫苗株，所述培养细胞为MDCK细胞；
(ii)将所述疫苗株的粗毒液纯化，得到纯化的疫苗株毒液；
优选地，在步骤(i)中，当CPE达到80％以上时，收获所述疫苗株的粗毒液；
优选地，在步骤(i)中，当CPE达到90％以上时，收获所述疫苗株的粗毒液；
优选地，在步骤(i)中，按照MOI＝0.005～0.01的用量接种；
优选地，在步骤(i)中，针对所述犬瘟热病毒疫苗株，按照所述病毒量株与培养液104.0TCID50：15-30ml的用量比接种；针对犬细小病毒疫苗株，按照所述病毒株与培养液105.0TCID50：50-150ml的用量比接种；针对犬传染性肝炎病毒疫苗株，按照所述病毒株与培养液105.0TCID50：50-150ml的用量比接种；
优选地，在步骤(i)中，针对所述犬瘟热病毒疫苗株，所述培养液为含1.5-2.5v/v％新生牛血清的DMEM；针对所述犬细小病毒疫苗株，所述培养液为含2-8v/v％新生牛血清的RPMI Medium 1640；针对所述犬传染性肝炎病毒疫苗株，所述培养液为含1.5-2.5v/v％新生牛血清的DMEM；
优选地，在步骤(i)中，针对所述犬瘟热病毒疫苗株或所述犬传染性肝炎病毒疫苗株，所述培养的温度为32-34℃；针对犬细小病毒疫苗株，所述培养的温度为36.5-37.5℃；
优选地，在步骤(i)中，所述培养的pH值为7.0-7.5；
优选地，在步骤(i)中，所述培养的DO值为40-50％；
优选地，在步骤(i)中，当所述培养为转瓶培养时，所述培养是在9-12转/小时条件下进行的；
优选地，在步骤(i)中，当所述培养为悬浮培养时，所述培养是在25-35转/分钟条件下进行的；
优选地，在步骤(i)中，针对所述犬瘟热病毒疫苗株，所述Vero细胞来自单层Vero细胞；针对所述犬细小病毒疫苗株，所述F81细胞来自单层F81细胞；针对所述犬传染性肝炎病毒疫苗株，所述MDCK细胞来自单层MDCK细胞；
优选地，在步骤(i)中，针对所述犬瘟热病毒疫苗株，用胰酶消化所述单层Vero细胞后接种所述疫苗株；针对所述犬细小病毒疫苗株，用胰酶消化所述单层F81细胞后接种所述疫苗株；针对所述犬传染性肝炎病毒疫苗株，用胰酶消化所述单层MDCK细胞后接种所述疫苗株；
优选地，在步骤(i)中，对所述疫苗株的粗毒液进行无菌检验；
优选地，在步骤(i)中，所述培养细胞的制备步骤为：将培养的所述培养细胞种子细胞扩大培养，得到扩大培养的培养细胞；
优选地，所述扩大培养是在36.5-37.5℃下进行的；
优选地，所述扩大培养是在9-12转/小时条件下在转瓶中进行的；
优选地，针对所述犬瘟热病毒疫苗株，所述扩大培的养培养液为含有6-10v/v％新生牛血清的DMEM；针对所述犬细小病毒疫苗株，所述扩大培的养培养液为含6-10v/v％新生牛血清的RPMI Medium 1640；针对所述犬传染性肝炎病毒疫苗株，所述扩大培的养培养液为含6-10v/v％新生牛血清的DMEM；
优选地，所述扩大培的时间为18-30h；
优选地，当所述培养为悬浮培养时，将所述扩大培养的培养细胞用胰酶消化之后转移到生物反应器中继续培养；
优选地，在所述生物反应器中，所述继续培养的温度为36-38℃；
优选地，在所述生物反应器中，所述继续培养的pH值为7.0-7.5；
优选地，在所述生物反应器中，所述继续培养的DO值为40-50％；
优选地，在所述生物反应器中，所述继续培养是在25-35转/分钟条件下进行的；
优选地，在步骤(ii)中，将所述疫苗株的粗毒液冻融1-3次后纯化；
优选地，在步骤(ii)中，所述纯化的方法为：用直径为0.22-0.45μm滤膜过滤，除去细胞及细胞碎片，得到所述纯化的疫苗株毒液；
优选地，针对所述犬瘟热病毒疫苗株，所述纯化的疫苗株毒液中病毒含量≥105.0TCID50/ml；针对所述犬细小病毒疫苗株，所述纯化的疫苗株毒液中病毒含量≥106.0TCID50/ml；针对所述所述犬传染性肝炎病毒疫苗株，所述纯化的疫苗株毒液中病毒含量≥106.0TCID50/ml。
6.如权利要求3所述的疫苗组合物，其特征在于，所述辅料为冻干保护剂；
优选地，所述冻干保护剂为包括2-3mg/mL聚乙烯吡咯烷酮、8-12mg/mL山梨醇、3-7mg/mL甘氨酸、30-50mg/mL蔗糖、30-60mg/mL海藻糖的水溶液；
优选地，所述冻干保护剂的制备方法包括如下步骤：
制备包括4-6mg/mL聚乙烯吡咯烷酮、16-24mg/mL山梨醇的第一水溶液；
制备包括6-14mg/mL甘氨酸、60-100mg/mL蔗糖、60-120mg/mL海藻糖的第二水溶液；
将所述第一水溶液与所述第二水溶液以1:0.8-1.2的体积比混合，得到所述冻干保护剂；
优选地，将所述第一水溶液灭菌后使用；
优选地，将所述第一水溶液经110-120℃灭菌后使用；
优选地，将所述第二水溶液灭菌后使用；
优选地，将所述第二水溶液过滤除菌后使用。
7.权利要求2-6中任一项所述的疫苗组合物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
将所述疫苗株制备成所述疫苗组合物。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，将所述疫苗株的组合与所述辅料混合，得到所述疫苗组合物；
优选地，将所述疫苗组合物干燥，得到干燥的疫苗组合物；
优选地，所述干燥为真空冷冻干燥；
优选地，所述冷冻真空干燥包括如下步骤：
(a)将所述疫苗组合物进行冷冻，得到冷冻的疫苗组合物；
(b)在真空条件下对所述冷冻的疫苗组合物进行温度分阶段升高的升华干燥，得到初步干燥的疫苗组合物；
(c)在真空条件下将初步干燥的疫苗组合物在常温条件下升华干燥，得到干燥的疫苗组合物；
优选地，在步骤(a)中，将所述疫苗组合物在-50℃到-40℃下进行冷冻；
优选地，在步骤(a)中，所述冷冻的持续时间为1.5-2.5h；
优选地，在步骤(b)中，所述真空条件为8pa～10pa；
优选地，在步骤(b)中，对所述冷冻的疫苗组合物进行-30℃到-26℃下的第一升华，-17℃到-13℃下的第二升华和6-10℃下的第三升华；
优选地，在步骤(b)中，所述第一升华的时间为4-8h；
优选地，在步骤(b)中，温度由-50℃到-40℃升高到-30℃到-26℃所需时间为0.5-1.5h；
优选地，在步骤(b)中，所述第二升华的时间为4-8h；
优选地，在步骤(b)中，温度由-30℃到-26℃升高到-17℃到-13℃所需时间为0.5-1.5h；
优选地，在步骤(b)中，所述第三升华的时间为2-6h；
优选地，在步骤(b)中，温度由-17℃到-13℃升高到6-10℃所需时间为0.5-1.5h；
优选地，在步骤(c)中，所述真空条件为8pa～10pa；
优选地，在步骤(c)中，所述升华的温度为25-30℃；
优选地，在步骤(c)中，所述升华的时间为1-3h；
优选地，在步骤(b)中，温度由6-10℃升高到25-30℃所需时间为0.5-1.5h。
9.如权利要求1所述的疫苗株、权利要求2-6中任一项所述的疫苗组合物，或权利要求7或8所述的制备方法在制备用于单独使用或与其他免疫制剂或药物联合使用以治疗、预防、减缓和/或控制犬瘟热、犬细小病毒性肠炎和犬传染性肝炎中任两种或三种疾病的制剂中的用途。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述犬瘟热是犬科动物犬瘟热、鼬科动物犬瘟热或猫科动物犬瘟热；
优选地，所述犬瘟热是水貂犬瘟热、犬犬瘟热或狐狸犬瘟热；
优选地，所述犬细小病毒性肠炎是犬科动物犬细小病毒性肠炎、鼬科动物犬细小病毒性肠炎或猫科动物犬细小病毒性肠炎；
优选地，所述犬细小病毒性肠炎是水貂犬细小病毒性肠炎、犬犬细小病毒性肠炎或狐狸犬细小病毒性肠炎；
优选地，所述犬传染性肝炎是犬科动物犬传染性肝炎、鼬科动物犬传染性肝炎或猫科动物犬传染性肝炎；
优选地，所述犬传染性肝炎是水貂犬传染性肝炎、犬犬传染性肝炎或狐狸犬传染性肝炎。
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