CN103566369B

CN103566369B - 一种在慢性乙肝病毒感染状态下诱导机体产生特异性免疫的乙肝疫苗

Info

Publication number: CN103566369B
Application number: CN201210272762.8A
Authority: CN
Inventors: 曲春枫; 汪颖; 吴志远
Original assignee: Cancer Hospital and Institute of CAMS and PUMC
Current assignee: Baoding Norway Technology Co ltd
Priority date: 2012-08-01
Filing date: 2012-08-01
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2032-08-01
Also published as: CN103566369A

Abstract

本发明公开了一种乙肝疫苗。具体而言，本发明公开了一种包含一种免疫增强剂的乙肝疫苗，其能够在慢性乙肝病毒感染状态下诱导机体产生特异性免疫。本发明的乙肝疫苗包含Toll样受体的激动剂作为免疫增强剂。

Description

一种在慢性乙肝病毒感染状态下诱导机体产生特异性免疫的乙肝疫苗

技术领域

本发明涉及乙肝疫苗。具体而言，本发明涉及一种包含免疫增强剂的乙肝疫苗，其能够在慢性乙肝病毒感染状态下诱导机体产生特异性免疫反应。本发明的乙肝疫苗包含Toll样受体的激动剂作为免疫增强剂。此外，本发明还涉及Toll样受体的激动剂在乙肝疫苗中作为免疫增强剂的用途。

背景技术

在中国，乙型肝炎病毒(HBV)感染已经成为最严重的公共卫生问题之一，约60%的人群感染过HBV。根据2006年全国流行病学的调查结果，目前中国慢性乙肝表面抗原(HBsAg)携带率仍然高达7.2%，约有9300万的HBV感染患者和3000万的慢性乙肝患者。

目前，临床上对慢性乙肝患者的治疗主要是采取非特异性的抗病毒疗法，包括使用核苷类似物和I型干扰素。核苷类似物药物对于HBV的特异性不强，并且，HBV病毒基因在核苷类似物药物使用后容易发生变异，治疗效果不好；I型干扰素的治疗疗程长、费用高，患者持久应答率也仅为10-47%，平均24%。这种非特异性的抗病毒疗法的治疗策略，对乙肝患者的治疗效果不理想。

常规重组乙型肝炎疫苗主要用于特异性预防新生儿和易感人群的HBV感染。新生儿乙肝疫苗免疫接种有效地预防了新发HBV感染。其中以天然结构的乙肝表面抗原(HBsAg)为靶抗原。但是，这一手段仅能在未经感染的健康人体内诱导产生抗体，发挥预防效果，是一种预防性疫苗。慢性HBV感染的持续状态主要是由于机体对乙肝病毒抗原的免疫耐受。而目前常规使用的重组乙型肝炎疫苗，即免疫预防性乙肝疫苗，对已患有慢性HBV感染者无效，也无任何治疗效果。慢性HBV感染患者如不做任何治疗，据统计将有25-40%的感染者会进展为失代偿性肝硬化或者肝癌。因此，目前全世界许多学者尝试通过诱导慢性HBV感染者产生针对HBV病毒抗原的特异性免疫应答反应，通过调动机体本身的特异性免疫力，清除慢性HBV感染性肝细胞的治疗性疫苗。

治疗性疫苗是指在已感染病原微生物或已患有某些疾病的机体中，通过诱导特异性的免疫应答，达到治疗或防止疾病恶化的天然、人工合成或用基因重组技术表达的产品或制品，其能激发和诱导机体对相关抗原的特异性免疫应答，可明显改善病情甚至可以使疾病痊愈。治疗性疫苗与传统意义上的预防性疫苗有着明显的区别。首先，治疗性疫苗的使用者为已感染患者，他们往往存在不同程度上的免疫缺陷或免疫耐受，而预防性疫苗的使用者为健康人；其次，预防性疫苗主要是产生中和性抗体，而治疗性疫苗除了需要诱导更高水平的抗体外，还需要诱导产生特异性CD4及CD8T细胞应答，才足以清除病毒感染性细胞，终止病毒感染。

乙肝治疗性疫苗的研制是发现和设计HBV相关抗原，并通过联合高效的免疫佐剂(免疫增强剂)，以达到有效刺激乙肝慢性携带者的免疫系统，从而打破免疫耐受，杀伤病毒感染性肝细胞，特异性地抑制和清除病毒，最终达到治疗的目的。其具有费用相对低、以及特异性强、疗效好等特点。从发展趋势来看，乙肝治疗性疫苗有望成为治愈慢性乙型肝炎的有效途径。因此，研制经济而有效的乙肝治疗性疫苗，是一项世界性的重大而迫切的任务，这一任务对于亚非发展中国家显得更为重要。而目前乙肝治疗性疫苗多停留在实验室研究或临床实验阶段，迄今没有治疗性疫苗被批准在任何国家上市。现阶段研究较多的治疗性疫苗种类主要有蛋白疫苗、核酸疫苗(如DNA疫苗)、T细胞表位肽疫苗等。

现有的治疗性乙肝疫苗具有某些优点，但也存在着一些问题。如DNA疫苗能诱导强烈的细胞免疫和体液免疫应答，可打破特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)耐受，但其安全性(包括环境安全性和人体安全性)和标准化问题尚待深入研究。多表位基因疫苗或多表位多肽疫苗为多价疫苗研究提供了新的思路，但是由于MHC分子的限制性，其仅局限于表达某些特定MHC分子的患者，并且还需要克服表位疫苗免疫原性弱的固有缺点。抗原抗体复合物治疗性疫苗由于采用的是常规的铝盐佐剂，其免疫原性也具有一定的局限性。

乙肝病毒核心抗原(HBcAg)是乙肝治疗性疫苗研发过程中一个重要抗原，其是HBV的一种非分泌性的衣壳结构蛋白，具有较高的免疫原性。在自发恢复的急性乙肝感染患者中可以检测到强烈的HBcAg特异性的T细胞应答，而在慢性乙肝感染患者中检测不到。因此，HBcAg被认为是宿主控制HBV感染中的一个重要靶标，而其特异性T细胞的存在和慢性HBV感染的清除有关：HBcAg特异性的Th细胞能帮助B细胞产生抗HBs,而其诱导产生的特异性CTL将更有助于清除HBV感染细胞。HBsAg是HBV的表面结构蛋白，含有病毒感染细胞的受体，特异性抗-HBs的产生，可以终止病毒感染的进一步发生。因此从免疫原选择方面，本发明即选用了HBsAg及HBcAg作为免疫原，以诱导更有效的抗病毒免疫应答。

目前在人体使用最广泛的佐剂是铝佐剂，同时它也是目前商品化乙肝预防性疫苗所采用的佐剂。铝佐剂主要诱导体液免疫应答，而不能诱导针对靶蛋白的细胞免疫应答。因此，对于乙肝治疗性疫苗来讲，单纯使用铝佐剂是不足够的。近年来随着免疫学的研究进展，已发现有许多分子具有佐剂的特性，它们可以活化特定种类的抗原提呈细胞(APC)并诱导不同类型的细胞免疫应答。

发明概述

本发明一方面提供了Toll样受体(TLR)的激动剂作为佐剂或者免疫增强剂在制备乙肝疫苗中的用途，其中所述Toll样受体(TLR)的激动剂用于增强所述乙肝疫苗在慢性乙肝病毒感染状态下的对象中所诱导的针对乙肝病毒的免疫反应。

在一个实施方案中，本发明提供了TLR7和/或TLR8的激动剂CL097作为免疫增强剂在制备乙肝疫苗中的用途，其中所述乙肝疫苗包含乙肝表面抗原(HBsAg)和铝佐剂，并且所述乙肝疫苗能够在慢性乙肝病毒感染状态下的对象中诱导出针对乙肝病毒的特异性免疫反应，所述CL097具有如下结构式:

在一个实施方案中，本发明所述的乙肝疫苗中还包含乙肝核心抗原(HBcAg)。

在第二个方面，本发明提供了用于在慢性乙肝病毒感染状态下的对象中诱导出针对乙肝病毒的特异性免疫反应的方法，其中所述方法包括使用TLR的激动剂作为免疫增强剂或者佐剂。

在一个实施方案中，本发明提供了用于在慢性乙肝病毒感染状态下的对象中诱导出针对乙肝病毒的特异性免疫反应的方法，所述方法包括使用乙肝疫苗来对所述对象进行免疫接种，其中使用CL097作为免疫增强剂。

在一个实施方案中，本发明的方法中所使用的乙肝疫苗包含乙肝表面抗原(HBsAg)和铝佐剂。在另一个实施方案中，本发明的方法中所使用的乙肝疫苗还包含乙肝核心抗原(HBcAg)

在第三个方面，本发明还提供了一种乙肝疫苗，其用于在慢性乙肝病毒感染状态下的对象中诱导针对乙肝病毒的特异性免疫反应，其中所述乙肝疫苗包含TLR的激动剂作为免疫增强剂，且所述乙肝疫苗还包含乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心抗原(HBcAg)和铝佐剂。

在一个实施方案中，本发明的乙肝疫苗中用作免疫增强剂的TLR激动剂是TLR7和/或TLR8的激动剂CL097。

在实施方案中，本发明所述的乙肝疫苗中所使用的CL097和铝佐剂的质量比在1:10至1:100之间，优选1:40。在实施方案中，本发明所述的乙肝疫苗中所使用的CL097和乙肝表面抗原(HBsAg)的质量比在1:2至2:1之间，优选1:1。在实施方案中，本发明所述的乙肝疫苗中所使用的CL097和乙肝核心抗原(HBcAg)的质量比在1:2至2:1之间，优选1:1。

附图说明：

图1：CL097与Al结合后的解离质谱分析图

图2：CL097联合HBsAg/HBcAg免疫诱导出更高水平的抗-HBs。

图3：各组AlblHBV小鼠(HBV转基因小鼠)免疫后的抗-HBs滴度。

图4：各组AlblHBV小鼠(HBV转基因小鼠)免疫后的HBsAg滴度。

图5：各组AlblHBV小鼠(HBV转基因小鼠)免疫后的ALT水平变化。

图6：肝脏被膜下注射B16/HBV细胞小鼠的生存曲线。

图7：特异性HBV抗原性T细胞小鼠在采用HBsAg+HBcAg+Al+CL097免疫后，接种B16/HBV肿瘤细胞，无瘤生存小鼠脾脏中存在HBV抗原特异性T细胞(采用ELISPOT分析方法检测)。

发明详述

除非另有说明，所有技术和科学术语都具有本领域技术人员常见的含义。所有专利，专利申请，公开出版物，GenBank序列，网站以及其他公开材料均全文援引加入本文，除非另有说明。

本发明一方面提供了Toll样受体(TLR)的激动剂在制备乙肝疫苗或用于乙肝疫苗的佐剂中的用途，其中所述Toll样受体(TLR)的激动剂用于增强所述乙肝疫苗在慢性乙肝病毒感染状态下的对象中所诱导的针对乙肝病毒的免疫反应。

本文所用的术语“疫苗”是指：为有效预防和控制传染病的发生、蔓延，接种于生物体，具有预防或治疗传染性疾病的一类生物制品。可分为多种类型，例如但不限于蛋白质疫苗等。

本如文所用，术语“疫苗”中可包含抗原。所述抗原是指可诱导目的对象中免疫应答的抗原，所述免疫应答涉及到某些疾病的缓解、阻抑、减轻和/或治疗，所述疾病主要是指涉及某些病毒的传染性疾病，例如但不限于乙型肝炎病毒等。因此本文所述的疫苗可包括乙型肝炎病毒疫苗。

本发明的疫苗中还可以含有药物学可接受的载体、佐剂、免疫增强剂等辅助成分。

如本文所用，术语“免疫增强剂”和“佐剂”可互换使用，均是指一种免疫调节剂，其本身不具有免疫原性或具有一些免疫原性，但是可以用于刺激免疫系统以改善对其它具有免疫原性的物质的应答。例如同目的抗原一起使用或分别施用于同一对象时，可直接或间接地调节所述抗原诱导的免疫反应或改变该抗原的免疫反应类型。所述的免疫反应包括例如体液免疫、细胞免疫等。

如本文所用，术语“Toll样受体(Toll-likereceptor,TLR)”是参与非特异性免疫(天然免疫)的一类重要蛋白质分子。TLR是一类跨膜非催化性蛋白质，可以识别来源于微生物的具有保守结构的分子。当微生物突破机体的物理屏障，如皮肤、粘膜等时，TLR可以识别它们并激活机体产生免疫应答。大多数的哺乳动物物种含有10至15中不同的Toll样受体。在人类和小鼠中已经鉴别出13种Toll样受体(TLR1-13)。根据染色体的位置、基因结构和氨基酸序列，人的TLR可以分为5个亚科，即TLR2、TLR3、TLR4、TLR5和TLR9。TLR2亚科包括TLR1、TLR2、TLR6和TLR10；TLR9亚科包括TLR7、TLR8和TLR9；TLR3，TLR4和TLR5各自形成一个亚科。(参见例如：DuX,PoltorakA,WeiY，BeutlerB(September2000)."Threenovelmammaliantoll-likereceptors:genestructure,expression,andevolution".Eur.CytokineNetw.11(3):362–371；ChuangTH,UlevitchRJ(September2000)."Cloningandcharacterizationofasub-familyofhumantoll-likereceptors:hTLR7,hTLR8andhTLR9".Eur.CytokineNetw.11(3):372–378；以及TabetaK,GeorgelP，JanssenE,etal.(March2004)."Toll-likereceptors9and3asessentialcomponentsofinnateimmunedefenseagainstmousecytomegalovirusinfection".Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101(10):3516–3521)。

术语“激动剂(agonist)”是能够结合细胞的受体并诱发该细胞的特定反应的一类化学物质。Toll样受体激动剂(TLR激动剂)是能够结合Toll样受体并诱发其发挥作用的一类化学物质，可用于本发明的TLR激动剂包括TLR7和/或TLR8的激动剂CL097。

CL097是咪唑并喹啉(imidazoquinolin)化合物R848的一种高度水可溶的衍生物，其是TLR7和TLR8的配体。其分子式为：C₁₃H₁₄N_4O，分子量：242.28；结构式如下：

在一个实施方案中，本发明提供了TLR7和/或TLR8的激动剂CL097作为免疫增强剂在制备乙肝疫苗中的用途，其中所述乙肝疫苗包含乙肝表面抗原(HBsAg)和铝佐剂，并且所述乙肝疫苗能够在慢性乙肝病毒感染状态下的对象中诱导出针对乙肝病毒的特异性免疫反应。

在一个实施方案中，本发明的乙肝疫苗包含乙肝表面抗原(HBsAg)，乙肝核心抗原(HBcAg)和铝佐剂。

术语“乙肝表面抗原(HBsAg)”是乙肝病毒的包膜蛋白，本身不具有传染性，但它的出现常伴随乙肝病毒的存在，所以它是已感染乙肝病毒的标志并可用于诱导机体产生相应的抗体。乙肝病毒的血清亚型可由包膜主蛋白上的一些残基决定，主蛋白携带两对相互排斥的亚型决定簇d/y和w/r，由此构成乙肝表面抗原的4个主要亚型：adw、adr、ayw、ayr。

乙核心抗原(HBcAg)存在于乙型肝炎病毒(HBV)颗粒的核心，是HBV的结构蛋白即病毒核壳蛋白，主要存在于受感染的肝细胞内，其分泌形式是乙肝病毒e抗原(HBeAg)，表明了血清中HBV颗粒的存在及肝内HBV的复制。

本文所述的“抗原”包括HBsAg、HBcAg以及其片段或变体。

在一些实施方案中，所使用是HBsAg和/或HBcAg的片段或变体。

本文中所述的“片段”是指可实现本发明目的的抗原的某些部分，例如对于蛋白抗原而言，其片段可以是经截短后的某一部分。而本文中所述的“变体”是指可实现本发明目的的抗原经修饰或改造的变体，例如对于蛋白抗原而言，其变体可以是通过插入、缺失、或取代一个或多个氨基酸等方法所获得的突变体。所述“片段”和“变体”保留完整膜抗原的至少部分免疫原性。

在本发明的实施方案中，所使用的CL097的量可以是1-100μg/对象或者更多，例如每次免疫使用1μg/对象、2μg/对象、3μg/对象、4μg/对象、5μg/对象、6μg/对象、7μg/对象、8μg/对象、9μg/对象、10μg/对象、11μg/对象、12μg/对象、13μg/对象、14μg/对象、15μg/对象、16μg/对象、17μg/对象、18μg/对象、19μg/对象、20μg/对象、25μg/对象、30μg/对象、35μg/对象、40μg/对象、45μg/对象、50μg/对象、60μg/对象、70μg/对象、80μg/对象、90μg/对象、或者100μg/对象等。

在本发明的实施方案中，将CL097与相应的抗原蛋白物理性的彼此连接(例如，如Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2005;102(42):15190-15194中所述)。在一个实施方案中，通过铝佐剂吸附将抗原蛋白与CL097物理性地彼此连接在一起。

在本发明的实施方案中，所使用的铝佐剂可以例如是氢氧化铝(如氢氧化铝凝胶)、磷酸铝、硫酸铝、铵明矾及钾明矾等。铝佐剂的使用量是10-1000μg/对象或者更多，例如每次免疫使用10μg/对象、20μg/对象、30μg/对象、40μg/对象、50μg/对象、60μg/对象、70μg/对象、80μg/对象、90μg/对象、100μg/对象、110μg/对象、120μg/对象、130μg/对象、140μg/对象、150μg/对象、160μg/对象、170μg/对象、180μg/对象、190μg/对象、200μg/对象、250μg/对象、300μg/对象、350μg/对象、400μg/对象、450μg/对象、500μg/对象、600μg/对象、700μg/对象、800μg/对象、900μg/对象、或者1000μg/对象等。

在本发明的实施方案中，所使用的CL097和铝佐剂的质量比可以是1:10至1:100之间，例如1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、或者1:100等。

在本发明的实施方案中，所使用的CL097和乙肝表面抗原(HBsAg)的质量比可以是在1:1至1:10之间，例如1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、或者1:10等。

在本发明的实施方案中，所使用的CL097和乙肝核心抗原(HBcAg)的质量比可以是在1:1至1:10之间，例如1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、或者1:10等。

在一个实施方案中，对对象进行的免疫次数为1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、或者10次。

在一个实施方案中，在第0天进行首次免疫，在第14天进行第二次免疫，在第28天进行第三次免疫。在另一个实施方案中，在第0天进行首次免疫，在第14天进行第二次免疫，在第28天进行第三次免疫，在第42天进行第四次免疫。在另一个实施方案中，在第0天进行首次免疫，在第14天进行第二次免疫，在第28天进行第三次免疫，在第42天进行第四次免疫，在第56天进行第五次免疫。

在第二个方面，本发明提供了用于在慢性乙肝病毒感染状态下的对象中诱导出针对乙肝病毒的特异性免疫反应的方法，其中所述方法包括使用TLR的激动剂作为免疫增强剂。

在一些实施方案中，本发明的方法包括如下步骤：将不同的抗原、免疫增强剂、佐剂或者其混合物依次顺序进行免疫；或将不同的抗原、免疫增强剂、佐剂先混合然后共同进行免疫。

利用疫苗和/或抗原对动物(包括人)进行免疫的方法和技术是本领域熟知的。本领域技术人员可以在本发明的免疫方法的基础上，根据需要选择适当的免疫策略以提高免疫效果。例如采用不同的免疫顺序，不同的免疫频率，不同的免疫剂量，在不同的位点免疫，以及使用适当的佐剂等等。应理解这些选择都属于本领域中常规的技术选择，是在本领域技术人员能力范围之内的。因此本发明的技术方案涵盖了这些选择。

本发明选用铝佐剂作为TLR激动剂的载体，通过联合使用TLR激动剂与HBsAg/HBcAg等抗原进行免疫，从而能够在正常的对象(例如免疫正常)中诱导出比不含TLR7/8激动剂的疫苗更高滴度的针对乙肝病毒的抗体，并能减缓表达HBV抗原的肿瘤细胞在肝脏上的生长。而在受HBV感染的转基因小鼠中，通过联合使用TLR激动剂与HBsAg/HBcAg等抗原进行免疫，能打破免疫耐受，发生血清学转换(即从HBsAg阳性转换成抗-HBs阳性)，产生针对乙肝病毒的抗体，从而对乙肝病毒产生治疗作用。此外，在与外源性IFN-α的治疗结合使用时，能够加速所述转换。

以下结合具体实施例对本发明做进一步的阐述。

实施例

除非另有说明，以下实施例中所使用的分子技术均是本领域技术人员熟知的常规技术。此类技术的具体实施步骤可参见各种实验室手册以及教科书等，例如J.Sambrook的MolecularCloning:ALaboratoryManual(ColdSpringHarbourLaboratoryPress,1989)、J.Perbal的APracticalGuidetoMolecularCloning(JohnWileyandSons,1984)、T.A.Brown等的EssentialMolecularBiology:APracticalApproach(IRLPress,1991)、以及D.M.Glover等的DNACloning:APracticalApproach(IRLPress,1995和1996)等。

实施例1：CL097与铝佐剂的结合方法：

配制方法1：

Al与抗原先混合室温30分钟

Al与CL097先混合室温30分钟

两者随后进行混合，

质谱测定的游离CL097,为加入总量的41%

推测结合量为59%。

配制方法2：

Al与CL097先混合室温15分钟，

加入抗原合室温10分钟，

质谱测定的游离CL097，为加入总量的42%，

推测结合量为58%。

配制方法3：

Al与抗原先混合室温30分钟，

随后加入CL097室温10分钟，

质谱测定的游离CL097，为加入总量的44%，

推测结合量为56%。

质谱分析后确定CL097结合到铝佐剂上(参见图1)，3种疫苗配制方法所结合的CL097无差异，本发明的下述实施例中所有的疫苗配制方法为第三种。

实施例2：CL097联合HBsAg和/或HBcAg对C57/B6J小鼠体液免疫应答的影响

1.实验动物：C57/B6J小鼠(购于北京华阜康生物科技股份有限公司，雄性，小鼠出生日期：2012年3月14-21日)

2.试剂：

1)乙型肝炎病毒表面抗体定量测定试剂盒(酶联免疫法):购自北京万泰生物药业股份有限公司(批号:R20110905)。

2)乙型肝炎病毒核心抗体诊断试剂盒(酶联免疫法):购自上海科华生物工程股份有限公司(批号：201203031)，检测结果采用4减去吸光度值作为相对滴度(此试剂盒采用的为竞争法检测，如待测样品中抗-HBc含量高，则吸光度值较低，容易引起理解误差，为避免这种情况的发生，我们采用吸光度检测的上限4减去其实际检测所得吸光度作为其相对滴度)。

3)常规乙肝疫苗(预防性乙肝疫苗)：重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)，购自大连汉信生物制药有限公司(批号：2010041303)，每西林瓶0.5ml,含HBsAg10μg,每只小鼠注射100μl。

3.疫苗制备及免疫用量：

对每只小鼠使用的100μl体积的注射物，所述注射物包含：

1)抗原：酵母表达的纯化重组HBsAg，用量为5μg/只小鼠，(购自大连汉信生物制药有限公司,批号20101013,浓度:176μg/ml)；和大肠杆菌表达的HBcAg，用量为5μg/只小鼠(购自北京健安生物科技有限公司，批号20110319，浓度:2mg/ml)；

2)氢氧化铝(Al,氢氧化铝凝胶)，用量为200μg/只小鼠，购自sigma，批号：MKBC0623，浓度：2%。

3)免疫增强剂CL097，用量为5μg/只小鼠，购自Invivogen公司，批号：#c97-3301，按产品说明书配制成终浓度为1mg/ml的储存液，零下20摄氏度保存，2年内有效。

4)缓冲溶液：生理盐水

4.实验方案：

将小鼠分为4组,具体免疫物质及小鼠数目如下：

1)上述常规预防性乙肝疫苗10只

2)HBsAg+Al+CL09710只

3)HBsAg+HBcAg+Al+CL09710只

4)HBsAg+HBcAg+Al10只

在第0、14天时，按上述分组向小鼠肌肉注射总量为100μl/只小鼠的疫苗，其中所述疫苗含有条目3中所列出的物质。在第0、14、28天每次免疫前，对各实验组中的小鼠进行尾静脉采血，离心分离血清，使用乙型肝炎病毒表面抗体定量测定试剂盒(酶联免疫法)检测血清中的乙肝表面抗体滴度。

5.实验结果

如图2所示，2次免疫后，各组均可以诱导乙肝表面抗体(anti-HBs)的产生，其中，HBsAg+HBcAg+Al+CL097治疗组抗体滴度最高(IQR=144.0-591.1)，其次是HBsAg+Al+CL097治疗组(IQR=27.88-244.9)，HBsAg+HBcAg+Al治疗组偏低(IQR=4.833-55.84)，上述常规预防性乙肝疫苗治疗组最低(IQR=0-43.58)。

上述结果表明，HBcAg的加入可以增强针对HBsAg的体液免疫应答，，然而，单独采用HBcAg与HBsAg的应答反应不强，而这种应答可通过加入CL097而得到有效增强。

实施例3:CL097联合HBsAg/HBcAg能打破HBV转基因小鼠的免疫耐受

1.实验动物：C57BL/BJ-TgN(AlblHBV)44Bri小鼠,这是一种HBV转基因小鼠，携带有编码HBV的S、PreS1、PreS2以及HBx区域的基因，并能在血清，肝脏及肾脏中表达HBsAg,但并无病毒复制(购自北京大学医学部实验动物中心，雄性，小鼠出生日期：2011年9月21-28日)。

2.试剂：

1)乙型肝炎病毒表面抗体定量测定试剂盒(酶联免疫法)：购自北京万泰生物药业股份有限公司(批号:R20110905)；

2)乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(酶联免疫法)：购自上海科华生物工程股份有限公司(批号：201110031);

3)丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒(速率法)：购自中生北控生物科技股份有限公司(批号:111751);

4)IFN-α-2b:爱尔兰先灵葆雅公司(批号110L30301)，5000IU/只,注射量100μl，皮下注射，连续注射3天，每次疫苗免疫前、后及当天各注射一次；

5)常规乙肝疫苗(预防性乙肝疫苗)：重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)，购自大连汉信生物制药有限公司(批号：2010041303)，每西林瓶0.5ml,含HBsAg10μg,每只小鼠注射100μl。

3.疫苗制备及免疫用量：

对每只小鼠使用的100μl体积的注射物，所述注射物包含：

1)抗原：酵母表达的纯化重组HBsAg，用量为5μg/只小鼠，(购自大连汉信生物制药有限公司,批号20101013;浓度,176μg/ml)；和大肠杆菌表达的HBcAg，用量为5μg/只小鼠(购自北京健安生物科技有限公司，批号20110319，浓度:2mg/ml)；

2)氢氧化铝(Al,氢氧化铝凝胶)：用量为200μg/只小鼠，购自sigma，批号：MKBC0623，浓度：2%。

3)免疫增强剂CL097：用量为5μg/只小鼠，购自Invivogen公司，批号：#c97-3301，按产品说明书配制成终浓度为1mg/ml的储存液，零下20摄氏度，2年内有效。

4)缓冲溶液：生理盐水。

4.实验方案：

将小鼠分为5组,具体免疫物质及小鼠数目如下：

1)IFN-α-2b6只

2)IFN-α-2b,HBsAg+HBcAg+Al+CL09714只

3)HBsAg+HBcAg+Al+CL09713只

4)HBsAg+Al+CL09714只

5)上述常规预防性乙肝疫苗10只

在第0、14、28和42天时，按上述分组向小鼠肌肉注射总量为100μl/只小鼠的疫苗，其中所述疫苗含有上文条目3中所列的物质。在第0、14、28、42及56天每次免疫前，对各实验组中的小鼠进行眼眶采血，离心分离血清，使用丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒(速率法)检测血清中ALT(谷丙转氨酶)水平，用乙型肝炎病毒表面抗体定量测定试剂盒(酶联免疫法)检测血清中的乙肝表面抗体滴度，乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(酶联免疫法)检测血清中的乙肝表面抗原滴度。

5.实验结果：

1)处理过程中的死亡率：

由于药物毒性或采血等操作原因，其中一些实验组中的小鼠有部分死亡，具体死亡情况如下表1所示：(备注：其中P值为各组与上述常规预防性乙肝疫苗治疗组比较所得)，各组死亡率与上述常规预防性乙肝疫苗治疗组相比无统计学差异。

表1：各组AlblHBV小鼠免疫后存活率统计

2)抗体应答反应：

HBsAg+HBcAg+Al+CL097治疗组小鼠免疫3次后，11只小鼠中的6只可检测到有anti-HBs的产生，第四次免疫后二周，11只小鼠中的4只产生的anti-HBs>10mIU/ml,GMT=85.88；而联合外源性IFN-α-2b注射治疗组组小鼠免疫3次后，14只小鼠中6只产生的anti-HBs>10mIU/ml,GMT=20.70；第4次免疫后，14只小鼠中的9只产生的anti-HBs>10mIU/ml,GMT=83.51；HBsAg+Al+CL097治疗组小鼠免疫4次后，14只小鼠中的2只产生的anti-HBs>10mIU/ml。IFN-α-2b单独治疗组及上述常规预防性乙肝疫苗治疗组无anti-HBs产生。具体结果如图3所示。

各组AlblHBV小鼠免疫后抗体阳性率统计如表2所示：(备注：其中P值为各组数值与相应上述常规预防性乙肝疫苗治疗组数值比较所得)。

表2各组AlblHBV小鼠免疫后抗体阳性率

表3各组AlblHBV小鼠免疫后GMT水平

3)治疗性疫苗使用后对表面抗原水平的影响：

各组免疫后，血清中的表面抗原(HBsAg)平均水平无明显变化，这主要是由于所采用的小鼠是转基因小鼠，机体持续性表达HBsAg。具体结果如图4所示。

4)疫苗使用后对小鼠肝脏功能的影响：

由于抗原在肝脏细胞中持续性表达，对抗原表达性肝细胞的清除反应将会导致肝脏细胞的损伤与破坏，比较各组免疫后，在抗体最早开始后，部分小鼠出现一过性的肝细胞损伤(第42天)，与抗体的产生具有相关性，然而肝功能随后很快恢复正常(第56天)，具体结果如图5所示。

上述结果表明，在HBV转基因小鼠中，CL097联合HBsAg/HBcAg免疫能打破免疫耐受，发生血清学逆转，产生anti-HBs,联合外源性IFN-α-2b免疫能加快这一转换，单纯加入联合使用CL097与HBsAg的效果并不很好，只有CL097联合HBsAg/HBcAg的效果最好。

实施例4：CL097联合HBsAg/HBcAg对表达HBV抗原肿瘤细胞的清除作用

2.试剂：

1)B16/HBV细胞(构建方法参见《中华肿瘤杂志》，2012年7月34卷(7期)：486-491)：转有2HBV的B16细胞，能稳定表达HBsAg及HBcAg，接种量：3000个细胞/只小鼠。

2)常规乙肝疫苗(预防性乙肝疫苗)：重组乙型肝炎疫苗(汉逊酵母)，购自大连汉信生物制药有限公司，每西林瓶0.5ml,含HBsAg10μg,每只小鼠注射100μl。(批号：2010041303)

3.疫苗制备及免疫用量：

对每只小鼠使用的100μl体积的注射物包含：

3)免疫增强剂CL097：用量为5μg/只小鼠，购自Invivogen公司，批号：#c97-3301，按产品说明书配制成终浓度为1mg/ml的储存液，零下20摄氏度保存，2年内有效

4)缓冲溶液：生理盐水。

4.实验方案：

将小鼠分为4组,具体免疫物质及小鼠数目如下：

1)上述常规预防性乙肝疫苗8只

2)HBsAg+Al+CL0978只

3)HBsAg+HBcAg+Al+CL0978只

4)HBsAg+HBcAg+Al8只

在第0、14和28天时，按上述分组向小鼠肌肉注射总量为100μl/只小鼠的疫苗，其中所述疫苗含有上文列出的物质。在第29天，对每组小鼠进行肝脏被膜下注射B16/HBV细胞，接种量：每只小鼠3000个B16/HBV细胞，每只小鼠的注射总体积为5μl，(细胞浓度：6×10⁵/ml)。接种细胞后，观察记录小鼠的生存时间，绘制生存曲线。排除手术后一周内死亡小鼠(手术原因导致的动物死亡)。

5.实验结果：

排除手术后一周内死亡小鼠，各组剩余小鼠只数如下：

1)上述常规预防性乙肝疫苗8只

2)HBsAg+Al+CL0977只

3)HBsAg+HBcAg+Al+CL0977只

4)HBsAg+HBcAg+Al7只

剩余存活小鼠，观察记录生存时间，绘制生存曲线如图6所示。

其中HBsAg+HBcAg+Al+CL097免疫组小鼠中位生存时间为39天(IQR=27-42),虽然生存期延长与常规预防性乙肝疫苗比较无显著性差异，但是其中的1/7只小鼠实现了无瘤生存，在超过肿瘤接种后70天开腹检查，无病理学特征的肿瘤发生，脾脏组织中检测到HBsAg和HBcAg的特异性IFN-g产生性的T细胞。见图7。具体每组中位时间统计如表4所示：

表4肝脏被膜注射B16/HBV细胞小鼠的中位生存时间统计

组别	中位生存时间(d)
		常规预防性乙肝疫苗治疗组	34
HBsAg+AL+CL097治疗组	33
		HBsAg+HBcAg+AL治疗组	32
HBsAg+HBcAg+AL+CL097治疗组	39

结果表明，CL097联合HBsAg/HBcAg免疫能减缓表达HBV抗原的肿瘤细胞在肝脏上的生长。

这些动物实验结果表明，CL097联合HBsAg/HBcAg免疫能够在免疫正常鼠中诱导出较高滴度的anti-HBs及HBsAg特异性的T细胞，并能减缓表达HBV抗原的肿瘤细胞在肝脏上的生长；而在HBV转基因小鼠中，CL097联合HBsAg/HBcAg免疫能打破免疫耐受，发生血清学逆转，产生anti-HBs,联合外源性IFN-α免疫可加速这一转换。

Claims

1.CL097作为免疫增强剂在制备用于慢性乙肝病毒感染对象的乙肝疫苗中的用途，其中所述乙肝疫苗包含乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心抗原(HBcAg)和铝佐剂，并且所述乙肝疫苗能够在慢性乙肝病毒感染状态下的对象中诱导出针对乙肝病毒的特异性免疫反应，其中所述铝佐剂是氢氧化铝，所述乙肝疫苗中所使用的CL097和乙肝表面抗原的质量比在1∶1至1∶10之间并且CL097和乙肝核心抗原的质量比在1∶1至1∶10之间，所述CL097具有如下结构式：

2.权利要求1的用途，其中所述乙肝疫苗中所使用的CL097和铝佐剂的质量比在1∶10至1∶100之间。

3.权利要求2的用途，其中所述乙肝疫苗中所使用的CL097和铝佐剂的质量比在1∶20至1∶80之间。

4.权利要求3的用途，其中所述乙肝疫苗中所使用的CL097和铝佐剂的质量比为1∶40。

5.权利要求1的用途，其中所述乙肝疫苗中所使用的CL097和乙肝表面抗原的质量比为1∶1。

6.权利要求1的用途，其中所述乙肝疫苗中所使用的CL097和乙肝核心抗原的质量比为1∶1。

7.一种用于在慢性乙肝病毒感染状态下的对象中诱导出针对乙肝病毒的特异性免疫反应的乙肝疫苗，所述乙肝疫苗包含CL097作为免疫增强剂，且所述乙肝疫苗还包含乙肝表面抗原、乙肝核心抗原和铝佐剂，其中所述铝佐剂是氢氧化铝，所述乙肝疫苗中所使用的CL097和乙肝表面抗原的质量比在1∶1至1∶10之间并且CL097和乙肝核心抗原的质量比在1∶1至1∶10之间，其中所述CL097具有如下结构式：

8.权利要求7的乙肝疫苗，其中所述乙肝疫苗中所使用的CL097和铝佐剂的质量比在1∶10至1∶100之间。

9.权利要求8的乙肝疫苗，其中所述乙肝疫苗中所使用的CL097和铝佐剂的质量比在1∶20至1∶80之间。

10.权利要求9的乙肝疫苗，其中所述乙肝疫苗中所使用的CL097和铝佐剂的质量比为1∶40。

11.权利要求7的乙肝疫苗，其中所述乙肝疫苗中所使用的CL097和乙肝表面抗原的质量比为1∶1。

12.权利要求7的乙肝疫苗，其中所述乙肝疫苗中所使用的CL097和乙肝核心抗原的质量比为1∶1。