CN115011562A - 一种鸡新城疫禽流感二联疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种鸡新城疫禽流感二联疫苗的制备方法，其包括：(1)提供MDCK悬浮细胞，并培养传代；(2)在培养传代后的MDCK细胞中加入1～5mg/L的地塞米松和2～8mg/L依达拉奉，得到鸡新城疫培养基；将鸡新城疫病毒接种至所述鸡新城疫培养基，培养得到新城疫病毒液；(3)在培养传代后的MDCK细胞中加入1～6g/L的超滤过的酶消化产物，得到禽流感培养基；将禽流感病毒接种至所述禽流感培养基，培养得到禽流感病毒液；(4)将所述新城疫病毒液、禽流感病毒液灭活，并与辅料混合，得到鸡新城疫禽流感二联疫苗。本发明的制备方法简化了病毒繁殖培养工艺，提高了病毒滴度，进而得到的抗体效价高，攻毒保护效果好。

Description

一种鸡新城疫禽流感二联疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及疫苗技术领域，尤其涉及一种鸡新城疫禽流感二联疫苗及其制备方法。
背景技术
鸡新城疫病毒(NDV)属于副粘病毒科，单股负链RNA病毒。鸡新城疫(ND)是对养禽业危害最大的病毒性传染病之一，致死率极高，给世界各国的养禽业造成了巨大损失。目前，防治鸡新城疫的主要措施是疫苗接种。
禽流感病毒(AIV)在世界各地流行极为广泛，特别是H9亚型AIV，虽然致病力较低，但其引起的继发感染往往给养禽业带来极大的损失，且有资料表明，H9亚型AIV基因可重组到高致病性AIV中，引起高致病性AIV的变异，进而危害家禽甚至人类的健康。所以研制安全高效的H9亚型AIV疫苗是必然选择。
目前，己上市的禽类疫苗大多是通过传统的鸡胚培养制得，国内外使用鸡胚培养工艺生产新城疫、禽流感病毒己有许多年的历史。虽然“鸡胚法”这种技术不断进化来应对各个挑战，包括产量、自动化、容量、质量保证和生长速度等方面。但在我国，在实际的生产过程中，由于SPF(无特异性病原)鸡胚供应量的制约以及成本问题，许多的国产疫苗并非全部由SPF鸡胚制造。目前已有报道用传代细胞系悬浮MDCK细胞来培养新城疫、禽流感病毒，但是由于上述MDCK细胞培养新城疫病毒仍在研发阶段，虽然病毒在该细胞上大量繁殖，但繁殖出来的新城疫病毒效价虽高，病毒含量却不高，进一步研制出来的灭活苗免疫效力和攻毒保护效果不如鸡胚源疫苗，给进一步深入研究鸡新城疫疫苗甚至是新流二联苗的制备造成极大困难。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种鸡新城疫禽流感二联疫苗的制备方法，其可提升病毒含量，提升疫苗的免疫效力。
本发明还要解决的技术问题在于，提供一种鸡新城疫禽流感二联疫苗。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种鸡新城疫禽流感二联疫苗的制备方法，其包括：
(1)提供MDCK悬浮细胞，并培养传代；
(2)在培养传代后的MDCK细胞中加入1～5mg/L的地塞米松和2～8mg/L依达拉奉，得到鸡新城疫培养基；将鸡新城疫病毒接种至所述鸡新城疫培养基，培养得到新城疫病毒液；
(3)在培养传代后的MDCK细胞中加入1～6g/L的超滤过的酶消化产物，得到禽流感培养基；将禽流感病毒接种至所述禽流感培养基，培养得到禽流感病毒液；
(4)将所述新城疫病毒液、禽流感病毒液灭活，并与辅料混合，得到鸡新城疫禽流感二联疫苗。
作为上述技术方案的改进，所述鸡新城疫培养基还包括：植物蛋白胨1～5g/L、大豆水解乳蛋白1～5g/L、酵母提取物1～5g/L、葡萄糖1～10g/L和胰酶1～8mg/L。
作为上述技术方案的改进，所述禽流感培养基中还包括：植物蛋白胨1～5g/L、酵母提取物1～6g/L、葡萄糖2～10g/L和胰酶1～8mg/L。
作为上述技术方案的改进，步骤(1)包括：
(1.1)提供冷冻MDCK悬浮细胞；
(1.2)将冷冻MDCK悬浮细胞在30～35℃复苏；
(1.3)将复苏后的MDCK悬浮细胞转移至无血清培养基，在35～37℃，1～8％CO2、120～150rpm的条件下培养2～3天，然后传代3～4次。
作为上述技术方案的改进，步骤(2)包括：
(2.1)将培养2～3天的MDCK细胞液(细胞密度为8.0×106cells/mL-16×106cells/mL，活率在90％以上)离心，所得细胞沉淀采用预设量的无血清培养基吹打重悬均匀，然后加入1～5g/L的植物蛋白胨、1～5g/L的SE50、1～5g/L的Yeast Extract、1～10g/L的葡萄糖、1～8mg/L的TPCK、1～5mg/L的地塞米松和2～5mg/L的依拉达奉，混匀得到鸡新城疫培养基，此时鸡新城疫培养基的细胞密度为3.5×106cells/mL-4.5×106cells/mL；其中，吹打重悬所用无血清培养基的体积小于或等于鸡新城疫培养基的体积。具体的，在本发明的一个实施例之中，当病毒传代驯化时(即采用摇瓶培养时)，吹打重悬所用无血清培养基的体积等于鸡新城疫培养基的体积。例如，当需要30mL鸡新城疫培养基时，则采用30mL无血清培养基吹打重悬细胞沉淀。在本发明的另一个实施例中，当对病毒进行大规模培养(如采用生物培养器时)，则吹打重悬所用无血清培养基的体积＜鸡新城疫培养基的体积，而后补加无血清培养基按预设量进行定容。优选的，吹打重悬所用无血清培养基的体积为10～20％。例如，当采用3L的生物培养器时，则采用400～600mL的无血清培养基进行吹打重悬，而后补加无血清培养基定容至2L。
(2.2)将鸡新城疫病毒接种至所述鸡新城疫培养基，并在二氧化碳培养箱中培养48～96h，培养过程中测定病毒效价；当病毒效价≥8log2后收获病毒液，并将其传代驯化，得到新城疫病毒液；
其中，鸡新城疫病毒的接种量为10-5～10-1MOI，培养温度为30～37℃，培养转速为100～150rpm。
作为上述技术方案的改进，所述鸡新城疫病毒为基因Ⅶ型rDHN3-mF毒株；
步骤(2.2)中，鸡新城疫病毒的接种量为10-2MOI，培养温度为33℃，培养转速为120rpm。
作为上述技术方案的改进，步骤(3)包括：
(3.1)将培养2～3天的MDCK细胞液(细胞密度为8.0×106cells/mL-16×106cells/mL，活率在90％以上)离心，所得细胞沉淀采用预设量的无血清培养基吹打重悬均匀，然后加入1～5g/L的植物蛋白胨、1～5g/L的Yeast Extract、1～10g/L的葡萄糖、3～8mg/L的TPCK和1～6g/L的HyPep 1510，混匀得到禽流感培养基，此时禽流感培养基的细胞密度为3.5×106cells/mL-4.5×106cells/mL；其中，吹打重悬所用无血清培养基的体积小于或等于禽流感培养基的体积。具体的，在本发明的一个实施例之中，当病毒传代驯化时(即采用摇瓶培养时)，吹打重悬所用无血清培养基的体积等于禽流感培养基的体积。例如，当需要30mL禽流感培养基时，则采用30mL无血清培养基吹打重悬细胞沉淀。在本发明的另一个实施例中，当对病毒进行大规模培养(如采用生物培养器时)，则吹打重悬所用无血清培养基的体积＜禽流感培养基的体积，而后补加无血清培养基按预设量进行定容。优选的，吹打重悬所用无血清培养基的体积为10～20％。例如，当采用3L的生物培养器时，则采用400～600mL的无血清培养基进行吹打重悬，而后补加无血清培养基定容至2L。
(3.2)将禽流感病毒接种至所述禽流感培养基，并在二氧化碳培养箱中培养36～72h，培养过程中测定病毒效价；当病毒效价≥8log2后收获病毒液，并将其传代驯化，得到禽流感病毒液；
其中，禽流感病毒的接种量为10-5～10-2MOI，培养温度为30～37℃，培养转速为100～150rpm。
作为上述技术方案的改进，所述禽流感病毒为禽流感病毒H9亚型DA株；
步骤(3.2)中，禽流感病毒的接种量为10-3MOI，培养温度为33℃，培养转速为120rpm。
作为上述技术方案的改进，步骤(4)包括：
(4.1)将所述新城疫病毒液、禽流感病毒液灭活，并按照1：(1～3)的体积比混合均匀，得到灭活病毒液；
(4.2)将白油92～96体积份、乳化剂4～8份混匀，得到油相；
(4.3)将油相和灭活病毒液按照(6～8)：(2～4)的体积比混合均匀，得到鸡新城疫禽流感二联疫苗。
相应的，本发明还公开了一种鸡新城疫禽流感二联疫苗，其由上述的制备方法制备而得。
实施本发明，具有如下有益效果：
1、本发明的鸡新城疫禽流感二联疫苗的制备方法，在新城疫病毒的培养过程中简化了病毒繁殖培养工艺，不采用繁杂的二阶培养方式；而是在培养基中加入了地塞米松和依达拉奉，使得新城疫病毒含量和病毒滴度大大提高。具体的，抗体检测和攻毒试验结果显示，基于本发明制备方法制备的细胞源灭活疫苗无需进行浓缩，抗体效价符合规定，攻毒保护试验能达到很强的保护效果。
2、本发明基于MDCK细胞对鸡新城疫病毒和禽流感病毒进行培养，获得了高滴度的新城疫病毒和禽流感病毒，进一步制备的细胞源鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗不仅避免了胚体含有外源病毒的风险，而且各批次之间质量差异小，疫苗质量好，因而有很好的经济效益和应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例、对比例采用的原料来源如下：
1、病毒：新城疫病毒Avian avulavirus 1strain NDV/Guangdong/05/2011(rDHN3-mF)株，由肇庆大华农生物药品有限公司鉴定、保管和供应；禽流感病毒为A型禽流感病毒A/chicken/Guangdong/DA/2014(H9N2)株(简称DA株)，由肇庆大华农生物药品有限公司鉴定、保管和供应。
2、细胞：全悬浮传代细胞系MDCK细胞，由甘肃健顺生物科技有限公司提供。
3、无血清、化学界定培养基：CD MDCK 244培养基(产品编号22039-244.1)、补料：Peptone植物蛋白胨、SE50大豆水解乳蛋白、Yeast Extract酵母提取物、地塞米松、依达拉奉、HyPep 1510超滤过的酶消化产物、Glucose葡萄糖、TPCK胰酶均由甘肃健顺生物科技有限公司提供。
实施例1MDCK细胞的培养
1、细胞的复苏：从液氮罐中取出冻存的MDCK细胞株，37℃水浴融化后加入到约30mL的CD MDCK 244(健顺生物产品编号22039-244.1)培养基中，经离心机1000RPM离心10min，倒掉上清液，使用125mL三角摇瓶将细胞重悬在10mL的CD EB66 210培养基中置于37℃，5％CO2培养箱中培养，转速为150rpm，每天取样计数，并计算活率。
2、细胞传代：对第一代的细胞密度进行计数，当细胞长至8.0×106cells/mL-16×106cells/mL，活率在90％以上时，按1.0×106cells/mL-1.5×106cells/mL接种至三角瓶中进行细胞传代，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，转速为150rpm，继续培养2-3天后，按照此方法继续传代，对连续传代三代次后的细胞进行扩增，用于病毒接种实验。
实施例2鸡新城疫病毒的培养
本实施例提供一种新城疫病毒的培养方法，具体包括以下步骤：
(1)MDCK细胞的扩增与培养：将约0.7L的MDCK细胞按1.0×106cells/mL-1.5×106cells/mL的细胞密度接种至体积为3L的生物反应器中进行培养，具体培养参数为：
培养基为CD MDCK 244(健顺生物产品编号22039-244.1)，温度为37℃，pH为7.3±0.2，转速为150rpm，通入10ccm的压缩空气、20ccm的氧气，控制溶氧量为50％。
每天取样计数，并计算活率，当细胞长至8.0×106细胞/mL-16×106细胞/mL，活率在90％以上时，用于病毒的接种。
(2)鸡新城疫病毒的培养：将步骤(1)得到的MDCK细胞利用大容量离心机在1000RPM离心10min，弃上清液，细胞沉淀用500mL的CD MDCK 244新鲜培养基吹打均匀，转移至3L生物反应器，而后补加无血清培养基定容至2L。此时，往细胞液中一次性补加:2g/LPeptone(植物蛋白胨)、2g/L Yeast Extract(酵母提取物)、3g/L Glucose(葡萄糖)、4mg/LTPCK、2mg/L地塞米松、3mg/L依达拉奉，所有补料添加完毕后轻轻摇匀，此时鸡新城疫培养基的细胞密度为3.5×106cells/mL-4.5×106cells/mL。取经过MDCK细胞驯化适应后的新城疫种毒一支，按MOI为0.01进行接毒，接毒后温度调整为33℃，pH设置为7.30±0.2继续培养，搅拌速度调整为120rpm，并每隔12h取样，进行病毒效价的检测。当HA效价不低于8log2时收获病毒液并保存，挑选HA效价最高的三批病毒液测定EID50，记录如下表所示：
新城疫病毒批次 HA效价(log2) 病毒含量(lgEID 50/0.1mL)
A01 10 10.2
A02 11 10.93
A03 10 10.47
对比例1鸡新城疫病毒的培养
本对比例提供一种新城疫病毒的培养方法，具体包括以下步骤：
(1)MDCK细胞的扩增与培养：将约0.7L的MDCK细胞按1.0×106cells/mL-1.5×106cells/mL的细胞密度接种至体积为3L的生物反应器中进行培养，具体培养参数为：
培养基为CD MDCK 244(健顺生物产品编号22039-244.1)，温度为37℃，pH为7.3±0.2，转速为150rpm，通入10ccm的压缩空气、20ccm的氧气，控制溶氧量为50％。
每天取样计数，并计算活率，当细胞长至8.0×106细胞/mL-16×106细胞/mL，活率在90％以上时，用于病毒的接种。
(2)取经过MDCK细胞驯化适应后的新城疫种毒一支，采用二阶培养法，在反应器中，新城疫病毒按MOI为0.01接种MDCK细胞，接毒后搅拌速度调整为130rpm，进行吸附培养1小时，吸附完成后补加1倍体积的病毒生产液，此时,鸡新城疫培养基的细胞密度为3.5×106cells/mL-4.5×106cells/mL，生产液培养基为CD MDCK 244(健顺生物产品编号22039-244.1)，生产液需补加2g/L Peptone(植物蛋白胨)、2g/L Yeast Extract(酵母提取物)、3g/L Glucose(葡萄糖)、4mg/L TPCK(胰酶)，温度调整为33℃，pH设置为7.30±0.2继续培养，搅拌速度调整为120rpm，其他培养参数不变，并每隔12h取样，进行病毒效价的检测。当HA效价不低于8log2时收获病毒液并保存，挑选HA效价最高的三批病毒液测定EID50，记录如下表：
新城疫病毒批次 HA效价(log2) 病毒含量(lgEID 50/0.1mL)
B01 8 8.03
B02 9 8.2
B03 8 7.93
对比例2鸡新城疫病毒的培养
本对比例提供一种新城疫病毒的培养方法，具体包括以下步骤：
(1)MDCK细胞的扩增与培养：将约0.7L的MDCK细胞按1.0×106cells/mL-1.5×106cells/mL的细胞密度接种至体积为3L的生物反应器中进行培养，具体培养参数为：
培养基为CD MDCK 244(健顺生物产品编号22039-244.1)，温度为37℃，pH为7.3±0.2，转速为150rpm，通入10ccm的压缩空气、20ccm的氧气，控制溶氧量为50％。
每天取样计数，并计算活率，当细胞长至8.0×106细胞/mL-16×106细胞/mL，活率在90％以上时，用于病毒的接种。
(2)将步骤(1)得到的MDCK细胞转移至合适的离心容器中，利用大容量离心机进行快速离心处理，1000RPM离心10min，弃上清液，弃上清液，细胞沉淀用500mL的CD MDCK 244新鲜培养基吹打均匀，转移至3L生物反应器，而后补加无血清培养基定容至2L。此时，往细胞液中一次性补加:2g/LPeptone(植物蛋白胨)、2g/L Yeast Extract(酵母提取物)、3g/LGlucose(葡萄糖)、4mg/L TPCK(胰酶)和2mg/L地塞米松，所有补料添加完毕后轻轻摇匀，此时鸡新城疫培养基的细胞密度为3.5×106cells/mL-4.5×106cells/mL。取经过MDCK细胞驯化适应后的新城疫种毒一支，按MOI为0.01进行接毒，接毒后温度调整为33℃，pH设置为7.30±0.2继续培养，搅拌速度调整为120rpm，并每隔12h取样，进行病毒效价的检测。当HA效价不低于8log2时收获病毒液并保存，挑选HA效价最高的三批病毒液测定EID50，记录如下表：
新城疫病毒批次 HA效价(log2) 病毒含量(lgEID 50/0.1mL)
C01 8 7.67
C02 8 8.13
C03 8 8.2
对比例3鸡新城疫病毒的培养
本对比例提供一种新城疫病毒的培养方法，具体包括以下步骤：
(1)MDCK细胞的扩增与培养：将约0.7L的MDCK细胞按1.0×106cells/mL-1.5×106cells/mL的细胞密度接种至体积为3L的生物反应器中进行培养，具体培养参数为：
培养基为CD MDCK 244(健顺生物产品编号22039-244.1)，温度为37℃，pH为7.3±0.2，转速为150rpm，通入10ccm的压缩空气、20ccm的氧气，控制溶氧量为50％。
每天取样计数，并计算活率，当细胞长至8.0×106细胞/mL-16×106细胞/mL，活率在90％以上时，用于病毒的接种。
(2)将步骤(1)得到的MDCK细胞转移至合适的离心容器中，利用大容量离心机进行快速离心处理，1000RPM离心10min，弃上清液，细胞沉淀用500ml的CD MDCK 244新鲜培养基吹打均匀，转移至3L生物反应器，而后补加无血清培养基定容至2L。此时，往细胞液中一次性补加:2g/L Peptone(植物蛋白胨)、2g/L Yeast Extract(酵母提取物)、3g/L Glucose(葡萄糖)、4mg/L TPCK(胰酶)和3mg/L依达拉奉，所有补料添加完毕后轻轻摇匀，此时鸡新城疫培养基的细胞密度为3.5×106cells/mL-4.5×106cells/mL。取经过MDCK细胞驯化适应后的新城疫种毒一支，按MOI为0.01进行接毒，接毒后温度调整为33℃，pH设置为7.30±0.2继续培养，搅拌速度调整为120rpm，并每隔12h取样，进行病毒效价的检测。当HA效价不低于8log2时收获病毒液并保存，挑选HA效价最高的三批病毒液测定EID50，记录如下表：
新城疫病毒批次 HA效价(log2) 病毒含量(lgEID 50/0.1mL)
D01 7 7.47
D02 7.5 7.2
D03 8 7.93
实施例3禽流感病毒的培养
本实施例提供一种禽流感病毒的培养方法，具体包括以下步骤：
(1)MDCK细胞的扩增与培养：将约0.7L的MDCK细胞按1.0×106cells/mL-1.5×106cells/mL的细胞密度接种至体积为3L的生物反应器中进行培养，具体培养参数为：
培养基为CD MDCK 244(健顺生物产品编号22039-244.1)，温度为37℃，pH为7.3±0.2，转速为150rpm，通入10ccm的压缩空气、20ccm的氧气，控制溶氧量为50％。
每天取样计数，并计算活率，当细胞长至8.0×106细胞/mL-16×106细胞/mL，活率在90％以上时，用于病毒的接种。
(2)禽流感病毒的培养：将步骤(1)得到的MDCK细胞利用大容量离心机在1000RPM离心10min，弃上清液，弃上清液，细胞沉淀用500ml的CD MDCK 244新鲜培养基吹打均匀，转移至3L生物反应器，而后补加无血清培养基定容至2L。此时，往细胞液中一次性补加:2g/LPeptone(植物蛋白胨)、2g/L Yeast Extract(酵母提取物)、3g/L HyPep 1510(超滤过的酶消化产物)、3g/L Glucose(葡萄糖)、4mg/L TPCK(胰酶)，所有补料添加完毕后轻轻摇匀，此时鸡禽流感培养基的细胞密度为3.5×106cells/mL-4.5×106cells/mL。取经过MDCK细胞驯化适应后的禽流感种毒一支，按MOI为0.001进行接毒，接毒后温度调整为33℃，pH设置为7.30±0.2继续培养，搅拌速度调整为120rpm，并每隔12h取样，进行病毒效价的检测。当HA效价不低于8log2时收获病毒液并保存，挑选HA效价最高的三批病毒液测定EID50，记录如下表：
禽流感病毒批次 HA效价(log2) 病毒含量(lgEID 50/0.1mL)
E01 11.5 10.93
E02 12 11.2
E03 12 11.87
对比例4禽流感病毒的培养
本对比例提供一种禽流感病毒的培养方法，具体包括以下步骤：
(1)MDCK细胞的扩增与培养：将约0.7L的MDCK细胞按1.0×106cells/mL-1.5×106cells/mL的细胞密度接种至体积为3L的生物反应器中进行培养，具体培养参数为：
培养基为CD MDCK 244(健顺生物产品编号22039-244.1)，温度为37℃，pH为7.3±0.2，转速为150rpm，通入10ccm的压缩空气、20ccm的氧气，控制溶氧量为50％。
每天取样计数，并计算活率，当细胞长至8.0×106细胞/mL-16×106细胞/mL，活率在90％以上时，用于病毒的接种。
(2)取经过MDCK细胞驯化适应后的禽流感种毒一支，采用二阶培养法，在反应器中，禽流感病毒按MOI为0.001接种MDCK细胞，接毒后搅拌速度调整为130rpm，进行吸附培养1小时，吸附完成后补加1倍体积的病毒生产液，此时，鸡新城疫培养基的细胞密度为3.5×106cells/mL-4.5×106cells/mL，生产液培养基为CD MDCK 244(健顺生物产品编号22039-244.1)，生产液需补加2g/L Peptone(植物蛋白胨)、2g/L Yeast Extract(酵母提取物)、3g/L Glucose(葡萄糖)、4mg/L TPCK(胰酶)，温度调整为33℃，pH设置为7.30±0.2继续培养，搅拌速度调整为120rpm，其他培养参数不变，并每隔12h取样，进行病毒效价的检测。当HA效价不低于8log2时收获病毒液并保存，挑选HA效价最高的三批病毒液测定EID50，记录如下表：
禽流感病毒批次 HA效价(log2) 病毒含量(lgEID 50/0.1mL)
F01 7 7.03
F02 7 7.2
F03 8 7.93
对比例5禽流感病毒的培养
本对比例提供一种禽流感病毒的培养方法，具体包括以下步骤：
(1)MDCK细胞的扩增与培养：将约0.7L的MDCK细胞按1.0×106cells/mL-1.5×106cells/mL的细胞密度接种至体积为3L的生物反应器中进行培养，具体培养参数为：
培养基为CD MDCK 244(健顺生物产品编号22039-244.1)，温度为37℃，pH为7.3±0.2，转速为150rpm，通入10ccm的压缩空气、20ccm的氧气，控制溶氧量为50％。
每天取样计数，并计算活率，当细胞长至8.0×106细胞/mL-16×106细胞/mL，活率在90％以上时，用于病毒的接种。
(2)禽流感病毒的培养：将步骤(1)得到的MDCK细胞利用大容量离心机在1000RPM离心10min，弃上清液，细胞沉淀用500m的CD MDCK 244新鲜培养基吹打均匀，转移至3L生物反应器，而后补加无血清培养基定容至2L。此时，往细胞液中一次性补加:2g/L Peptone(植物蛋白胨)、2g/L Yeast Extract(酵母提取物)、3g/L Glucose(葡萄糖)、4mg/L TPCK(胰酶)，所有补料添加完毕后轻轻摇匀，此时鸡禽流感培养基的细胞密度为3.5×106cells/mL-4.5×106cells/mL。取经过MDCK细胞驯化适应后的禽流感种毒一支，按MOI为0.001进行接毒，接毒后温度调整为33℃，pH设置为7.30±0.2继续培养，搅拌速度调整为120rpm，并每隔12h取样，进行病毒效价的检测。当HA效价不低于8log2时收获病毒液并保存，挑选HA效价最高的三批病毒液测定EID50，记录如下表：
禽流感病毒批次 HA效价(log2) 病毒含量(lgEID 50/0.1mL)
G01 8.5 7.56
G02 8 7.47
G03 9 8.08
实施例4病毒液灭活与检验：
将实施例2、实施例3、对比例1～5获得的同一实例的三批病毒液(进行灭活的病毒液必须每0.1ml病毒液病毒含量应≥107.0EID50)进行混合，分别得到7个批次病毒液：A、B、C、D、E、F、G，并测定HA效价。7个批次混合病毒液分别加入甲醛溶液，边加边搅拌，使其充分混合。甲醛溶液的最终浓度为0.1％。37℃条件下灭活30小时(以罐内温度达到37℃开始计时)，期间不停搅拌。灭活后的病毒液置2～8℃保存，同时测定其HA效价。
取灭活的病毒液，按现行《中国兽药典》附录进行灭活检验，无菌生长。取灭活的病毒液，尿囊腔内接种9～11日龄SPF鸡胚10个，每胚0.2ml。36～37℃孵育72小时，收获鸡胚液，测定HA价，检测结果为阴性；盲传1代，测定HA价，也为阴性，结果表明，病毒液灭活完全，检测结果下表所示：
Figure BDA0003618786190000121
实施例5疫苗制备：
(1)油相佐剂制备：取注射用白油94份、司本-80 6份混合，随加随搅拌至混匀，121℃灭菌30分钟，冷却后备用。
(2)病毒混合液制备：将灭活后的实施例2、对比例1～3的新城疫病毒分别与实施例3、对比例4～5的禽流感病毒分别按1:1混合，取混合后的新城疫、禽流感H9亚型灭活抗原菌液96份，加入灭菌冷却后的吐温-80 4份，充分搅拌至完全溶解。
(3)乳化：分别取油相佐剂3份倾入乳化罐内搅拌，再缓慢分别加入病毒混合液2份，进行充分搅拌后乳化，得到新城疫禽流感二联苗；具体的组合以及标记如下表所示：
Figure BDA0003618786190000122
Figure BDA0003618786190000131
(4)分装：定量分装，加盖密封，分别标记各自批次。
试验例疫苗免疫效力：
(1)对鸡新城疫的免疫保护及攻毒
用28日龄SPF鸡分为16组，每组10只，颈部皮下注射传代细胞源鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗10μL、20μL、30μL、40μL，另取5只作攻毒对照。免疫后21～28日，每只鸡分别采血，分离血清，用新城疫病毒血凝抑制试验抗原测定HI抗体效价。采血后每只鸡各静脉注射新城疫病毒北京株强毒105.0ELD50，观察14日，并在攻毒后第5日采集鸡泄殖腔拭子，接种9～11日龄SPF鸡胚，进行病毒分离。对病毒分离阴性的样品，应盲传1代后再进行判定。攻毒后对照鸡在5日内均全部死亡，免疫组结果详见下表：
Figure BDA0003618786190000132
结果表明，在免疫后28日后，对照组鸡HI抗体效价低于2log2，注射I、V、VI批二联灭活苗(均由A批新城疫病毒液与禽流感病毒液组合制成)的试验鸡HI抗体效价平均水平明显高于注射其他批次二联灭活苗的HI抗体效价平均水平，并且根据《兽药质量标准》效力检验方法检验，注射疫苗20μL时，免后28日I、V、VI批疫苗的ND部分抗体平均水平为7.6log2～7.8log2，远远高出标准6log2，且高于市面上的细胞源鸡新城疫禽流感灭活二联苗HI抗体效价水平；在攻毒5日内，对照鸡全部死亡，免疫组如果注射Ⅱ批、Ⅲ批、Ⅳ批二联灭活苗，需要注射40μL的样品才能达到完全保护作用，如果注射I、V、VI批二联灭活苗(均由A批新城疫病毒液与禽流感病毒液组合制成)，仅需要注射10μL的样品就能抵抗新城疫强度的攻击，保护率达到100％。综上，经过工艺优化生产的新城疫病毒HA效价、病毒含量水平高于未优化工艺生产的新城疫病毒，且制备的鸡新城疫禽流感二联苗无需抗原浓缩处理，新城疫部分的HI抗体达到高水平、免疫保护力强。
(2)对禽流感(H9亚型)的免疫保护及攻毒
用28日龄SPF鸡分为3组，每组10只，颈部皮下注射传代细胞源鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗0.2ml，另5只作禽流感攻毒对照。免疫后21日，每只鸡分别采血，分离血清，用禽流感病毒血凝抑制试验抗原测定HI抗体效价。采血后每只鸡各静脉注射H9亚型禽流感病毒DA株鸡胚毒0.2ml(含2×107.0EID50)，观察14日，并在攻毒后第5日采集鸡泄殖腔拭子，接种9～11日龄SPF鸡胚，进行病毒分离。对病毒分离阴性的样品，应盲传1代后再进行判定。结果详见下表：
Figure BDA0003618786190000141
结果表明，在免疫后21日后，对照组鸡HI抗体效价低于2log2，注射I、V、VI批二联灭活苗(均由E批禽流感病毒液与新城疫病毒液组合制成)的试验鸡HI抗体效价平均水平明显高于注射其他批次二联灭活苗的HI抗体效价平均水平，并且根据《兽药质量标准》效力检验方法检验，注射疫苗20μL时，免后21日I、II、III、IV批疫苗的AI部分抗体平均水平为9.5log2～9.6log2，远远高出标准7log2，且高于市面上的细胞源鸡新城疫禽流感灭活二联苗HI抗体效价水平；在攻毒5日内，对照鸡全部死亡，免疫组如果注射20μL I批、II批、III批二联灭活苗样品，结果显示未能达到完全保护作用(即保护数/攻毒数没有达到100％)，但如果同样注射20μL I、V、VI、IV批二联灭活苗样品(均由E批禽流感病毒液与新城疫病毒液组合制成)就能抵抗新城疫强度的攻击，保护率达到100％。综上，经过工艺优化生产的禽流感病毒HA效价、病毒含量水平高于未优化工艺生产的禽流感病毒，且制备的鸡新城疫禽流感二联苗AI部分的HI抗体水平、免疫保护力明显高于未优化工艺生产的二联苗样品。
综上所述，本发明采用无血清全悬浮方式培养新城疫、禽流感病毒并制备新流二联疫苗的方法具有可行性，并且MDCK细胞无血清全悬浮培养方式过程中无需微载体和消化液，大大减少了产品杂质的引入，简化产品后期的分离纯化过程，有效的降低生产成本。此外，本发明经过新城疫病毒繁殖培养工艺优化，简化病毒生产工艺替代步骤繁杂的二阶式培养方式，在原有病毒接毒工艺上，加入适量的地塞米松和依达拉奉，新城疫病毒含量和病毒滴度大大提高，抗体检测和攻毒试验结果显示，该方法制备的细胞源灭活疫苗无需进行浓缩，抗体效价符合规定，攻毒保护试验能达到很强的保护效果，而没有经过优化工艺繁殖的新城疫病毒和仅添加地塞米松而未添加依达拉奉的培养工艺繁殖的新城疫病毒，病毒滴度和HA效价与新工艺相比均较低，如果需要进一步制备成新流二联苗达到该保护效果就必须经过抗原浓缩，表明本发明的生产工艺稳定、质量可控、大大节约生产成本，可用于大规模生产。本发明利用MDCK细胞系，采用全悬浮无血清的方式生产传代细胞源鸡新城疫、禽流感(H9亚型)二联灭活疫苗具有安全有效，质量稳定的优点。
以上所述是发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种鸡新城疫禽流感二联疫苗的制备方法，其特征在于，包括：
(1)提供MDCK悬浮细胞，并培养传代；
(2)在培养传代后的MDCK细胞中加入1～5mg/L的地塞米松和2～8mg/L依达拉奉，得到鸡新城疫培养基；将鸡新城疫病毒接种至所述鸡新城疫培养基，培养得到新城疫病毒液；
(3)在培养传代后的MDCK细胞中加入1～6g/L的超滤过的酶消化产物，得到禽流感培养基；将禽流感病毒接种至所述禽流感培养基，培养得到禽流感病毒液；
(4)将所述新城疫病毒液、禽流感病毒液灭活，并与辅料混合，得到鸡新城疫禽流感二联疫苗。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述鸡新城疫培养基还包括：植物蛋白胨1～5g/L、大豆水解乳蛋白1～5g/L、酵母提取物1～5g/L、葡萄糖1～10g/L和胰酶1～8mg/L。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述禽流感培养基中还包括：植物蛋白胨1～5g/L、酵母提取物1～6g/L、葡萄糖2～10g/L和胰酶1～8mg/L。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)包括：
(1.1)提供冷冻MDCK悬浮细胞；
(1.2)将冷冻MDCK悬浮细胞在30～35℃复苏；
(1.3)将复苏后的MDCK悬浮细胞转移至无血清培养基，在35～37℃，1～8％CO2、120～150rpm的条件下培养2～3天，然后传代3～4次。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)包括：
(2.1)将MDCK细胞密度为3.5×106cells/mL～4.5×106cells/mL的MDCK细胞液离心，所得细胞沉淀采用预设量的无血清培养基吹打重悬均匀，然后加入1～5g/L的植物蛋白胨、1～5g/L的SE50、1～5g/L的Yeast Extract、1～10g/L的葡萄糖、1～8mg/L的TPCK、1～5mg/L的地塞米松和2～5mg/L的依拉达奉，混匀得到鸡新城疫培养基；
(2.2)将鸡新城疫病毒接种至所述鸡新城疫培养基，并在二氧化碳培养箱中培养48～96h，培养过程中测定病毒效价；当病毒效价≥8log2后收获病毒液，并将其传代驯化，得到新城疫病毒液；
其中，鸡新城疫病毒的接种量为10-5～10-1MOI，培养温度为30～37℃，培养转速为100～150rpm。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述鸡新城疫病毒为基因Ⅶ型rDHN3-mF毒株；
步骤(2.2)中，鸡新城疫病毒的接种量为10-2MOI，培养温度为33℃，培养转速为120rpm。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)包括：
(3.1)将MDCK细胞密度为3.5×106cells/mL～4.5×106cells/mL的MDCK细胞液离心，所得细胞沉淀采用无血清培养基吹打重悬均匀，然后加入1～5g/L的植物蛋白胨、1～5g/L的Yeast Extract、1～10g/L的葡萄糖、3～8mg/L的TPCK和1～6g/L的HyPep 1510，混匀得到禽流感培养基；
(3.2)将禽流感病毒接种至所述禽流感培养基，并在二氧化碳培养箱中培养36～72h，培养过程中测定病毒效价；当病毒效价≥8log2后收获病毒液，并将其传代驯化，得到禽流感病毒液；
其中，禽流感病毒的接种量为10-5～10-2MOI，培养温度为30～37℃，培养转速为100～150rpm。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述禽流感病毒为禽流感病毒H9亚型DA株；
步骤(3.2)中，禽流感病毒的接种量为10-3MOI，培养温度为33℃，培养转速为120rpm。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)包括：
(4.1)将所述新城疫病毒液、禽流感病毒液灭活，并按照1：(1～3)的体积比混合均匀，得到灭活病毒液；
(4.2)将白油92～96体积份、乳化剂4～8份混匀，得到油相；
(4.3)将油相和灭活病毒液按照(6～8)：(2～4)的体积比混合均匀，得到鸡新城疫禽流感二联疫苗。
10.一种鸡新城疫禽流感二联疫苗，其特征在于，其由如权利要求1～9任一项所述的的制备方法制备而得。
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