CN114317403B - Bhk-21细胞克隆株及利用bhk-21细胞克隆株全悬浮培养新城疫病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及病毒培养技术领域,具体涉及BHK‑21细胞克隆株及利用BHK‑21细胞克隆株全悬浮培养新城疫病毒的方法。本发明提供BHK‑21细胞克隆株QYHZZ‑BHK‑21,其保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:C2021133。该BHK‑21细胞克隆株能够在全悬浮无血清培养过程中快速增殖,保持较高的细胞活率,在接种新城疫病毒后,能够使得病毒快速繁殖,在较短时间内获得较高的病毒HA效价,制备得到的新城疫病毒抗原的质量较好,具有较高的免疫原性和安全性。本发明提供的全悬浮无血清培养方法适用于新城疫病毒及其疫苗的规模化生产,为细胞源疫苗的生产提供了技术基础。
Description
技术领域
本发明涉及病毒培养技术领域,具体涉及一株BHK-21细胞克隆株及利用BHK-21细胞克隆株全悬浮培养新城疫病毒的方法。
背景技术
目前,禽用疫苗的生产仍主要依靠传统的鸡胚法(中国兽药典)工艺实现。鸡胚法最初于20世纪50年代开发,虽然已在产量、自动化、容量、质量保证和生产速度等方面已有较大进度,但是,鸡胚仍然存在外源病毒污染的风险和母源抗体的干扰。因此,亟需高效的病毒培养方法替代鸡胚法。
全悬浮培养方法可以解决鸡胚法制备病毒的上述问题,并降低病毒制备的生产成本,而且,全悬浮培养工艺易于逐级放大、操作简单、自动化程度高,获得的病毒效价和疫苗质量比较均一、更容易实现规模化、产业化生产。目前,BHK-21全悬浮细胞已成功在口蹄疫疫苗生产中应用,不仅缩短了疫苗生产周期,降低劳动强度和生产成本,还减少了批间差异,提高了疫苗质量。但关于新城疫病毒,尚未有成熟的全悬浮培养细胞和培养方法。
发明内容
本发明的目的是提供一株BHK-21细胞克隆株及利用BHK-21细胞克隆株全悬浮培养新城疫病毒的方法。
在采用全悬浮培养技术培养病毒时,全悬浮细胞的性能以及全悬浮细胞与病毒之间的适应性是影响病毒增殖速度、产量和病毒抗原质量的关键因素,此外,大规模生物反应器与摇瓶或小体积生物反应器的培养环境和条件不同,很多全悬浮细胞虽然能够在小规模培养时表现较好的病毒扩增性能,但是,在大规模生物反应器中的生长等性能明显降低,无法适用于病毒的规模化生产。因此,本发明首先对幼地鼠肾细胞BHK-21细胞进行驯化,获得了适应新城疫病毒(尤其是NDV-La Sota株)的全悬浮BHK-21细胞克隆株QYHZZ-BHK-21,该细胞克隆株能够在全悬浮无血清培养条件下快速繁殖,在接种新城疫病毒后,能够在较短时间内快速获得较高的病毒效价,制备的新城疫病毒抗原具有良好的免疫原性和安全性,QYHZZ-BHK-21克隆株尤其能够在大规模生物反应器中快速扩增病毒,适于新城疫病毒的规模化生产。
具体地,本发明提供以下技术方案:
本发明提供BHK-21细胞克隆株QYHZZ-BHK-21,该细胞株已于2021年12月9日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC,地址:中国武汉,武汉大学,邮编430072),分类命名为悬浮的幼地鼠肾细胞QYHZZ-BHK-21,保藏编号为CCTCC NO:C2021133。
基于BHK-21细胞克隆株QYHZZ-BHK-21的特性,本发明提供所述BHK-21细胞克隆株QYHZZ-BHK-21在病毒的全悬浮培养中的应用。
优选地,所述全悬浮培养为全悬浮无血清培养。
本发明还提供所述BHK-21细胞克隆株QYHZZ-BHK-21在病毒疫苗制备中的应用。
以上所述的病毒为BHK-21细胞克隆株QYHZZ-BHK-21敏感的动物病毒。优选为新城疫病毒。更优选为新城疫病毒La Sota株。
进一步地,本发明提供一种新城疫病毒的全悬浮无血清培养方法,所述方法包括:将所述BHK-21细胞克隆株QYHZZ-BHK-21接种于全悬浮无血清培养基中,再接种新城疫病毒进行全悬浮无血清培养,获得病毒液。
以上所述方法中,接种新城疫病毒时的细胞密度为(5.5-8.0)×106个细胞/ml。
以上所述方法中,新城疫病毒的接种量优选为MOI=0.2-2。
以上所述方法中,使用的全悬浮无血清培养基可为任意适用于BHK-21细胞培养的全悬浮无血清培养基。优选为全悬浮无血清培养基B271。
上述培养的条件如下:温度36.8-37℃,溶氧45-55%,搅拌转速60-90rpm,pH 7.0-7.2。
在接种前,所述BHK-21细胞克隆株QYHZZ-BHK-21经复苏和逐级放大培养。
上述培养中,在细胞活率降至70%以下,细胞密度降至2×106个细胞/ml以下时,结束培养。
上述培养可在生物反应器中进行。
在培养结束后,将细胞破碎后收集病毒液。
上述收集的病毒液可经灭活处理(例如:于37℃甲醛溶液灭活24h)后,再经乳化后制备为新城疫病毒疫苗。
作为本发明的优选方案,所述方法包括如下步骤:
(1)种毒制备:采用所述BHK-21细胞克隆株QYHZZ-BHK-21进行新城疫病毒传代并制备种毒,种毒的效价≥1:256。
(2)QYHZZ-BHK-21细胞培养:将所述QYHZZ-BHK-21细胞复苏并进行摇瓶全悬浮传代培养,再于生物反应器中在全悬浮无血清细胞培养基中将传代后的QYHZZ-BHK-21细胞进行逐级放大培养,QYHZZ-BHK-21细胞的初始接种密度优选为(1.5-1.8)×106个细胞/ml,于温度36.8-37℃、溶氧45-55%、搅拌转速60-90rpm、pH 7.0-7.2条件下进行培养,得到QYHZZ-BHK-21细胞种子液;
(3)新城疫病毒培养:将步骤(2)得到的QYHZZ-BHK-21细胞种子液在生物反应器中接种于全悬浮无血清培养基中,细胞初始接种密度为(1.5-1.8)×106个细胞/ml,培养40-50h接种步骤(1)制备的种毒,接种量为MOI=0.2-2,接种病毒时的细胞密度为(5.5-8.0)×106个细胞/ml;培养条件如下:温度36.8-37℃、溶氧45-55%、搅拌转速60-90rpm、pH 7.0-7.2,接种病毒后继续培养60-72h,培养结束后,破碎细胞,收集病毒液。
以上步骤(2)中,先将QYHZZ-BHK-21细胞复苏后,于摇瓶中进行全悬浮传代培养,再依次于1000mL摇瓶、50L生物反应器和250L生物反应器中进行逐级放大培养。
本发明的有益效果在于:本发明提供的BHK-21细胞克隆株QYHZZ-BHK-21能够在全悬浮无血清培养过程中快速增殖,保持较高的细胞活率,在接种新城疫病毒后,能够使得病毒快速繁殖,在较短时间内获得较高的病毒HA效价,病毒的HA效价高于鸡胚培养病毒。由该细胞株制备得到的新城疫病毒抗原的质量较好,经动物免疫试验证明具有较高的免疫原性和安全性。
基于上述全悬浮BHK-21细胞克隆株QYHZZ-BHK-21,本发明还提供新城疫病毒的全悬浮无血清培养方法,该方法能够满足大规模病毒扩增生产的需要,可适用于新城疫病毒及其疫苗的规模化生产,有利于降低生产成本和劳动强度,提高生产效率和产能,为细胞源疫苗产业化和规模化生产提供了技术基础。
附图说明
图1为本发明实施例2中250L规模生物反应器的NDV-La Sota株全悬浮培养生产工艺流程示意图,其中BHK-21全悬浮细胞为BHK-21细胞克隆株QYHZZ-BHK-21。
图2为本发明实施例2中全悬浮QYHZZ-BHK-21健康细胞在摇瓶培养阶段的显微镜下形态。
图3为本发明实施例2中三批250L生物反应器QYHZZ-BHK-21健康细胞生长增殖趋势曲线,其中,BHK001、BHK002和BHK003分别代表三批250L生物反应器培养。
图4为本发明实施例2中250L生物反应器全悬浮QYHZZ-BHK-21健康细胞培养24h的显微镜下形态。
图5为本发明实施例2中250L生物反应器全悬浮QYHZZ-BHK-21健康细胞培养48h的显微镜下形态。
图6为本发明实施例2中250L生物反应器全悬浮QYHZZ-BHK-21健康细胞接种NDV-La Sota株病毒后培养24h的显微镜下形态。
图7为本发明实施例2中250L生物反应器全悬浮QYHZZ-BHK-21健康细胞接种NDV-La Sota株病毒后培养72h的显微镜下形态。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中使用的鸡新城疫病毒La Sota株由乾元浩生物股份有限公司郑州生物药厂提供。
以下实施例中使用的全悬浮无血清培养基均购自苏州沃美生物技术有限公司。
实施例1适应鸡新城疫病毒La Sota株扩增的全悬浮BHK-21细胞的驯化和细胞株种子库的建立
本发明通过将鸡新城疫病毒La Sota(NDV-La Sota)株在BHK-21细胞上进行适应性驯化传代培养和单克隆筛选,获得适应NDV-La Sota株的BHK-21全悬浮细胞,并建立全悬浮细胞种子库,为生物反应器规模化培养提供细胞种子库,主要流程如下:
将贴壁BHK-21细胞逐步降低血清含量(血清含量分别为5%、4%、3%、2%、1%)到无血清贴壁培养,采用有限稀释法和无血清全悬浮培养基B271进行BHK-21细胞的全悬浮无血清单细胞驯化,并筛选能够适应鸡新城疫病毒La Sota株扩增的BHK-21全悬浮细胞。
经驯化和筛选,最终获得一株BHK-21细胞克隆株QYHZZ-BHK-21,该克隆株的悬浮细胞密度达到≥1000×104个细胞/ml,病毒扩增最佳稀释比例1:1000,鸡新城疫病毒LaSota株HA效价达到1:256。
BHK-21细胞克隆株QYHZZ-BHK-21已于2021年12月9日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC,地址:中国武汉,武汉大学,邮编430072,),分类命名为悬浮的幼地鼠肾细胞QYHZZ-BHK-21,保藏编号为CCTCC NO:C2021133。
将上述BHK-21细胞克隆株QYHZZ-BHK-21以150~180×104个cells/ml的初始密度分散,于5%CO2,37℃,140rpm条件下,培养72h后,细胞密度可达1000~1200×104个细胞/ml,细胞活率98%以上。
将BHK-21细胞克隆株QYHZZ-BHK-21按照分散比例为1:6或1:8进行传代,每传2~3代进行离心换液。如此进行全悬浮细胞传代培养,并对不同代次的全悬浮细胞进行液氮冻存,建立全悬浮细胞株种子库。
采用摇瓶培养的方式,使用上述BHK-21细胞克隆株QYHZZ-BHK-21扩增鸡新城疫病毒La Sota株,筛选出最佳接种细胞密度和病毒稀释倍数,并建立细胞毒种子库。
实施例2 250L生物反应器规模的鸡新城疫病毒La Sota株全悬浮培养工艺的建立
利用BHK-21细胞克隆株QYHZZ-BHK-21在250L生物反应器中进行鸡新城疫病毒的全悬浮培养,具体包括如下步骤(流程示意图如图1所示):
1、采用三角透气摇瓶复苏实施例1经筛选得到的适应新城疫病毒La Sota株的BHK-21全悬浮细胞克隆株QYHZZ-BHK-21:使用的培养基为全悬浮无血清培养基B271,培养条件如下:36.8-37℃、5%CO2,培养时间为48-56h;
2、对步骤1经复苏后的全悬浮细胞QYHZZ-BHK-21采用摇瓶进行传代培养:使用的培养基为全悬浮无血清培养基B271,培养条件如下:36.8-37℃、5%CO2,培养时间为48-56h;
3、采用三角摇瓶以全悬浮细胞QYHZZ-BHK-21进行鸡新城疫病毒La Sota株的传代并制备种毒:使用的培养基为全悬浮无血清培养基B271,培养条件如下:36.8-37℃、5%CO2,培养时间为48-56h,制备得到的种毒的HA为1:256;
4、50L生物反应器(工作体积30L)QYHZZ-BHK-21全悬浮细胞培养:将步骤2得到的QYHZZ-BHK-21传代细胞接种于50L生物反应器中进行全悬浮培养,培养基为全悬浮无血清培养基B271,细胞初始密度为150-180×104个细胞/ml,反应器培养参数设定如下:温度:37℃,DO:50%,转数:60-80rpm,pH:7.1,细胞培养周期为48h;
5、250L生物反应器(工作体积125L)QYHZZ-BHK-21全悬浮细胞培养:将步骤4得到的QYHZZ-BHK-21全悬浮细胞接种于250L生物反应器中进行全悬浮培养,培养基为全悬浮无血清培养基B271,细胞初始密度150-180×104个细胞/ml,反应器培养参数设定如下:温度:37℃,DO:50%,转数:60rpm,pH:7.1,细胞培养周期为48h;
6、250L生物反应器(工作体积250L)QYHZZ-BHK-21全悬浮细胞接毒(NDV-La Sota株)培养:将步骤5得到的QYHZZ-BHK-21全悬浮细胞接种于250L生物反应器中,培养基为全悬浮无血清培养基B271,细胞初始接种密度为150-180×104个细胞/ml,细胞培养48h后接种步骤3制备的NDV-La Sota株种毒,病毒接种量约为MOI=1,病毒接种时补加培养液总体积50%的全悬浮培养基B271,接种病毒时的细胞密度为550-650×104个细胞/ml;反应器培养参数设定如下:温度:37℃,DO:50%,转数:80rpm,pH:7.2;
7、每隔24h取样进行细胞密度和活力分析(细胞病变程度),当细胞活率降到70%以下,细胞密度降到100×104个cells/ml以下,结束培养(接种病毒后继续培养72h),收集细胞并破碎离心,收获病毒液(250L)。
将病毒液于37℃灭活24h,得到病毒抗原,将抗原离心、经乳化制备疫苗,进行动物免疫试验。
以上培养过程中,步骤2的摇瓶培养阶段,QYHZZ-BHK-21全悬浮细胞的形态如图2所示;三批250L生物反应器QYHZZ-BHK-21健康细胞生长增殖趋势曲线如图3所示,培养24h和48h的QYHZZ-BHK-21全悬浮细胞的形态如图4和图5所示。结果显示,QYHZZ-BHK-21细胞培养48h,细胞密度是初始密度的7倍以上,细胞活率99%以上,细胞生长良好。
在接种病毒后,培养24h和72h的QYHZZ-BHK-21全悬浮细胞的形态如图6和图7所示。
QYHZZ-BHK-21全悬浮细胞的培养过程中主要指标监测结果如表1、表2、表3、表4和表5所示(三批实验的结果)。
表1三批50L生物反应器QYHZZ-BHK-21全悬浮细胞培养
表2三批250L生物反应器QYHZZ-BHK-21全悬浮细胞培养
表3 250L生物反应器QYHZZ-BHK-21全悬浮细胞接种NDV-La Sota毒株后的培养
表4 250L反应器全悬浮细胞(接毒前)和毒种情况汇总
表5 250L反应器全悬浮细胞接毒后HA和TCID50效价检测结果
以上三批250L生物反应器NDV-La Sota株的QYHZZ-BHK-21全悬浮培养实验结果表明,本发明的全悬浮BHK-21细胞克隆株QYHZZ-BHK-21能够高效扩增病毒,收获的病毒HA效价≥1:256。
实施例3鸡新城疫病毒La Sota株灭活疫苗的制备
将实施例2经全悬浮培养得到的三批NDV-La Sota株病毒液制备为新城疫病毒灭活疫苗(批号分别为2020001、2020002、2020003),具体方法如下:
1、疫苗制备
(1)油相制备:取矿物油95份,硬脂酸铝1份,在油相制备管中混合均匀并加热至80℃后,再加入5份司本-80,至温度达到115℃时维持30分钟,冷却后完成油相制备。
(2)水相制备:取灭活的新城疫病毒液95份(NDV-La Sota株经250L全悬浮细胞培养得到的病毒液,批号分别为2021001/2021002/2021003)与5份灭菌的吐温-80,充分混匀,使吐温-80完全溶解。
(3)乳化:取油相2份放入乳化罐中,开动电机,慢速转动搅拌,同时缓慢加入水相1份后,再以3500r/min搅拌5分钟,10000r/min搅拌5分钟,完成乳化制备,乳化后,取疫苗10ml加入离心管中,以3000r/min离心15分钟,管底析出的水相应不超过0.5mL。
2、疫苗的性状
外观:乳白色均匀乳剂。
剂型:油包水型,取一清洁吸管,吸取少许疫苗滴于清洁冷水表面,除第一滴外,均未扩散。
稳定性:吸取疫苗10mL加入离心管中,以3000rpm离心15分钟,管底析出的水相不超过0.5mL。
3、无菌检查
按现行《中国兽药典》附录进行检验,结果表明,无菌生长。
实施例4鸡新城疫病毒La Sota株灭活疫苗的安全性检测
对实施例3制备的鸡新城疫病毒La Sota株灭活疫苗进行单剂量重复接种的安全性试验,具体方法如下:
将40只14日龄SPF鸡,分成4组,每组10只,三批鸡新城疫病毒La Sota株灭活疫苗(批号为2020001、2020002、2020003)分成3组,每组10只,皮下注射,剂量为1mL/只;对照组10只SFP鸡颈部皮下注射灭菌生理盐水,剂量为1mL/只。各组鸡在相同条件下分别饲养管理,连续观察14日;如有死亡,将死亡的鸡逐一剖检,观察内脏有无病变;观察活鸡有无不良反应。接种后14天将存活的鸡全部剖杀,观察内脏有无病变。对鸡只的局部炎症、组织病变等进行评判。第二次免疫后14天将存活的鸡全部剖杀,观察内脏有无病变。
单剂量重复接种安全性实验的结果见表6。
表6单剂量重复接种的安全性试验结果
以上结果表明,鸡新城疫病毒La Sota株灭活疫苗具有较高的安全性。
实施例5鸡新城疫病毒La Sota株灭活疫苗的免疫效力检测
对实施例3制备的鸡新城疫病毒La Sota株灭活疫苗的免疫效力进行检验,具体方法如下:
取3周龄的SPF鸡50只,共分为5组,其中3组为实施例3的三批鸡新城疫病毒LaSota株灭活疫苗(全悬浮细胞培养,批号为2020001、2020002、2020003),1组为鸡胚培养的鸡新城疫病毒La Sota株制备的灭活疫苗,1组为对照组,每组10只SPF鸡胚。每只分别胸部肌肉注射,ND:20μl/只。21天采血检测HI抗体,检测结果如表7所示。
表7鸡新城疫病毒La Sota株灭活疫苗的免疫效力检验结果
以上结果表明,三批250L生物反应器制备的鸡新城疫病毒La Sota株病毒疫苗免疫鸡(20μl/只)时,免疫21天HI抗体效价≥1:16,其抗体水平与经鸡胚培养获得的胚毒按照相同的方法制备的灭活疫苗相当,达到规程标准。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.BHK-21细胞克隆株QYHZZ-BHK-21,其特征在于,其保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:C2021133。
2.权利要求1所述的BHK-21细胞克隆株QYHZZ-BHK-21在新城疫病毒的全悬浮培养中的应用。
3.权利要求1所述的BHK-21细胞克隆株QYHZZ-BHK-21在新城疫病毒疫苗制备中的应用。
4.一种新城疫病毒的全悬浮无血清培养方法,其特征在于,包括:将权利要求1所述的BHK-21细胞克隆株QYHZZ-BHK-21接种于全悬浮无血清培养基中,再接种新城疫病毒进行全悬浮无血清培养,获得病毒液。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,接种新城疫病毒时的细胞密度为(5.5-8.0)×106个细胞/ml。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述新城疫病毒的接种量为MOI=0.2-2。
7.根据权利要求4~6任一项所述的方法,其特征在于,所述培养的条件如下:温度36.8-37℃,溶氧45-55%,搅拌转速60-90rpm,pH 7.0-7.2。
8.根据权利要求4~6任一项所述的方法,其特征在于,在培养结束后,将细胞破碎后收集病毒液。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,在细胞活率降至70%以下,细胞密度降至2×106个细胞/ml以下时,结束培养。
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