CN103966157B - 用于猪繁殖与呼吸系统综合征病毒培养的细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于猪繁殖与呼吸系统综合征病毒（PRRSV）培养的细胞株及其应用。该细胞株对PRRSV高度敏感且稳定，并能持续稳定增殖高滴度PRRSV。该细胞株无支原体、细菌、真菌、外源病毒的污染，并且不存在三致的危险，安全性高。将该细胞株用于PRRSV的增殖培养，其较之Marc145母细胞更有利于PRRSV的复制与增殖。因此，采用该细胞株进行高滴度PRRSV的增殖培养有利于获得有关PRRSV研究与疫病防治方面的更全面信息，进行更加直接有效的研究。对PRRSV高敏感的猴肾细胞系Marc145-1株及高滴度PRRSV的增殖方法在PRRSV研究与疫病防治过程中具有广阔的开发和应用前景。

Description

用于猪繁殖与呼吸系统综合征病毒培养的细胞株及其应用

技术领域

本发明属于畜牧类生物制药技术领域，涉及一种用于猪繁殖与呼吸系统综合征病毒培养的细胞株，以及该细胞株在猪繁殖与呼吸系统综合征病毒培养中的应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸系统综合征是由猪繁殖与呼吸系统综合征病毒（Porcinreproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）引起的一种猪的高度传染性疾病，又称猪蓝耳病。本病以妊娠母猪的繁殖障碍（流产、死胎、木乃伊胎）及各种年龄猪特别是仔猪的呼吸道症状为特征。该病自1987年在美国被发现以来，曾经迅速传遍世界各个养猪国家，在猪群密集、流动频繁的地区更易流行，造成了严重的经济损失。近几年，该病在我国呈现明显的高发趋势，能引起不同品种、不同日龄、不同饲养管理模式的保育猪、仔猪和怀孕猪高发病率、高死亡率，给我国的养猪业造成了不可估量的损失。

PRRSV病毒的稳定性受PH和温度的影响较大，在PH小于5或大于7的条件下，其感染力降低95%以上；在PH7.5的培养液中可于-20℃和-80℃长期保存，在4℃则缓慢失去感染力；对有机溶剂敏感，对常用的化学消毒剂抵抗力不强。

PRRSV病毒能在多种细胞上生长，但Marc145是目前各实验室培养PRRSV最常用的细胞。用Marc145细胞接种猪繁殖与呼吸系统综合征病毒，细胞病变以聚集为特征，由于细胞病变死亡，病毒无法继续繁殖，经过反复冻融收获病毒液，病毒液只能收获一次，收获量小，病毒滴度低，强毒病毒含量在10^6.0~10^7.0TCID₅₀/ml，弱毒毒株病毒含量在10^8.0~10^8.5TCID₅₀/ml。可见，现有的Marc145细胞虽然适合PRRSV的增殖，但是病毒滴度比较低，病毒含量不能满足疫苗和诊断抗原的制备。

因此，目前存在的问题是为了获得关于疫苗、诊断试剂盒等治疗手段的更全面信息，进行更加直接有效的研究，需要克隆出一株对PRRSV高度敏感且稳定，并能持续稳定增殖高滴度PRRSV的Marc145细胞株。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种用于PRRSV培养的细胞株，该细胞株对PRRSV高度敏感且稳定，并能持续稳定增殖高滴度PRRSV。该细胞株无支原体、细菌、真菌、外源病毒的污染，并且不存在三致的危险，安全性高。

本发明还进一步提供了一种上述细胞株在猪繁殖与呼吸系统综合征病毒培养中的应用。该细胞株较之Marc145母细胞更有利于PRRSV的复制与增殖，采用该细胞株进行高滴度PRRSV的增殖培养有利于获得有关PRRSV研究与疫病防治方面的更全面信息，进行更加直接有效的研究。

为此，本发明提供了一种用于PRRSV培养的细胞株，其中，所述细胞株为猴肾细胞系Marc145-1株（MonkeykidneycelllinestrainMarc145-1），其保藏编号为:CCTCCNO:C2012185，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年12月10日。上述培养为增殖培养。

本发明中，所用术语“猴肾细胞系Marc145-1株”是指从猴肾细胞系Marc145母细胞克隆获得的新细胞株，也称为Marc145-1细胞，简称Marc145-1。

本发明中，所述猴肾细胞系Marc145-1株具有以下特征：

（1）从形态上观察，猴肾细胞系Marc145-1株比Marc145母细胞形态规则，细胞之间界限明显，整齐，细胞折光性强，胞质饱满，核质清晰。细胞易于传代和瓶壁分离。细胞变小，密度增大。

（2）对PRRSV具有高敏感性；

（3）病毒增殖过程中细胞的病变特征表现为细胞崩解，收获的病毒液为Marc145母细胞的4倍，病毒滴度提高1~2个滴度,并且这种敏感性可以稳定遗传；

（4）细胞生长速度变快，倍增时间提前了1d（天）。

在本发明的一个具体实施方式中，所述猴肾细胞系Marc145-1株通过以下方法构建完成，其包括：

步骤一，Marc145细胞有限稀释法克隆培养

将实验室保存的无支原体、细菌、真菌、外源病毒污染的Marc145细胞（哈尔滨兽医研究所）经胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，细胞计数后进行连续梯度稀释，然后分别接种于96孔细胞培养板，37℃5%CO₂培养箱培养10~14d，挑选有单个细胞生长的细胞孔中的细胞转入24孔板培养，并依次将细胞扩大培养到12孔板、6孔板、T25细胞培养瓶，获得亚克隆细胞株；

步骤二，对猪繁殖与呼吸系统综合征病毒敏感的Marc145细胞株的筛选。

挑选细胞状态比较好的几株克隆细胞分别接种于96孔细胞培养板内，待细胞长满单层接种猪繁殖与呼吸系统综合征病毒，于37℃5%CO₂培养箱培养48h，观察细胞病变，并以未接毒的细胞作为阴性对照，挑选病变最明显的Marc145细胞株进行传代，获得Marc145-1株，即，猴肾细胞系Marc145-1株，并用液氮保存。

本发明还提供了一种根据本发明所述的细胞株在猪繁殖与呼吸系统综合征病毒培养中的应用，其包括：

步骤B，将猪繁殖与呼吸系统综合征病毒接种于猴肾细胞系Marc145-1株进行培养；

步骤C，收获病毒液。

根据本发明，在步骤B中，所述的培养为增殖培养。

在本发明的一个优选实施例中，在步骤B之前还包括步骤A，培养猴肾细胞系Marc145-1株。在步骤A中，所述的培养为增殖培养。

在本发明的另一个优选实施例中，在步骤C之后还包括步骤D，对步骤C中收获的病毒液进行毒价测定。

根据本发明，所述猪繁殖与呼吸系统综合征病毒包括猪繁殖与呼吸系统综合征病毒强毒株NVDC-JXA1株、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒弱毒株NVDC-JXA1-R株、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒弱毒株ATCCVR-2332株、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒弱毒株CH-1R株以及猪繁殖与呼吸系统综合征病毒弱毒株HBR株。

优选地，所述猪繁殖与呼吸系统综合征病毒包括猪繁殖与呼吸系统综合征病毒强毒株NVDC-JXA1株、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒弱毒株NVDC-JXA1-R株及猪繁殖以及呼吸系统综合征病毒CH-1R株。

在本发明的一个具体实施例中，采用猴肾细胞系Marc145-1株对猪繁殖与呼吸系统综合征病毒NVDC-JXA1株的增殖培养。将猴肾细胞系Marc145-1株接种于细胞培养瓶，加入含8%胎牛血清的DMEM细胞生长液，于37℃5%CO₂条件下48h可以长成单层，0.001MOI接种猪繁殖与呼吸系统综合征病毒NVDC-JXA1株，加入含2%胎牛血清的DMEM维持液，于37℃培养36~48h有80%的细胞出现细胞病变，以细胞崩解为主要特征，分别收获上清液和细胞中的病毒，猪繁殖与呼吸系统综合征病毒NVDC-JXA1株的滴度均可以达到10^8.0TCID₅₀/ml。

在本发明的一个具体实施例中，采用猴肾细胞系Marc145-1株对猪繁殖与呼吸系统综合征病毒NVDC-JXA1-R株的增殖培养，收获的猪繁殖与呼吸系统综合征病毒NVDC-JXA1-R株病毒液的滴度均可以达到10^9.5TCID₅₀/ml。

在本发明的一个具体实施例中，采用猴肾细胞系Marc145-1株对猪繁殖与呼吸系统综合征病毒CH-1R株的增殖培养，收获的猪繁殖与呼吸系统综合征病毒CH-1R株病毒液的滴度均可以达到10^9.5TCID₅₀/ml。

根据本发明的猴肾细胞系Marc145-1株形态均一，生长性能好，生长曲线呈“S”型，细胞形态和生长速度稳定，可连续传代，在连续传代过程中，每隔5代对其进行纯净性、病毒敏感性检测，每隔10代对其进行“致畸、致瘤、致病变”试验，结果表明，该细胞株无支原体、细菌、真菌、外源病毒的污染，并且不存在三致的危险，安全性高。

该猴肾细胞系Marc145-1株在接种PRRSV后，病变特征发生了一些变化，表现为细胞崩解，且收获的病毒液为Marc145母细胞的4倍，病毒滴度测定表明，猴肾细胞系Marc145-1株较之Marc145母细胞更有利于PRRSV的复制与增殖，PRRSV病毒含量提高了1~2个滴度，并且这种敏感性可以稳定遗传，在传代至50代内没有丢失，仍能保持这种对病毒的高敏感性。经检测，猴肾细胞系Marc145-1株没有细菌、真菌、支原体以及常见的几种交叉感染病毒等外源污染。因此，采用该细胞株进行高滴度PRRSV的增殖培养有利于获得有关PRRSV研究与疫病防治方面的更全面信息，进行更加直接有效的研究。对PRRSV高敏感的猴肾细胞系Marc145-1株及高滴度PRRSV的增殖方法在PRRSV研究与疫病防治过程中具有广阔的开发和应用前景。

附图说明

图1为实施例2中Marc145母细胞和Marc145-1细胞生长曲线比对结果。

图1中的坐标轴含义如下：纵坐标活细胞总数（个/孔）；横坐标为时间（d）。

菌种保藏

猴肾细胞系Marc145-1株（MonkeykidneycelllinestrainMarc145-1），由普莱柯生物工程股份有限公司筛选获得，已在中国典型培养物保藏中心（简称：CCTCC；地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学）进行保藏，保藏日期：2012年12月10日，保藏编号：CCTCCNO:C2012185。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面将结合实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

实施例

实施例1：Marc145细胞系的克隆和筛选

1.Marc145细胞有限稀释法克隆培养

将实验室保存的无支原体、细菌、真菌、外源病毒污染的Marc145细胞（哈尔滨兽医研究所）经胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，细胞计数后进行连续梯度稀释，然后分别接种于96孔细胞培养板，37℃5%的CO₂培养箱培养10~14d，挑选有单个细胞生长的细胞孔中的细胞转入24孔板培养，并依次将细胞扩大培养到12孔板、6孔板、T25细胞培养瓶，获得亚克隆细胞株；

2.对猪繁殖与呼吸系统综合征病毒敏感的Marc145细胞株的筛选

挑选细胞状态比较好的几株克隆细胞分别接种于96孔细胞培养板内，待细胞长满单层接种NVDC-JXA1病毒（0.001MOI），37℃吸附1h，接毒后48h观察细胞病变，并以未接毒的细胞作为阴性对照，挑选病变最明显的Marc145细胞克隆株进行传代，获得Marc145克隆细胞，亦即猴肾细胞系Marc145-1株，并用液氮保存。

实施例2：猴肾细胞系Marc145-1株的生物学性状研究

1.细胞形态学

分别接长成单层的Marc145母细胞和猴肾细胞系Marc145-1株制备成细胞悬液，经细胞计数后，按照8×10⁴个/cm²接种于T25细胞培养瓶，加入含8%~10%胎牛血清的DMEM生长液，于37℃5%CO₂条件下培养48h，观察两者的细胞形态。细胞贴壁良好、形态饱满、界限清晰，表面光滑。猴肾细胞系Marc145-1株较Marc145母细胞变小，密度增大，细胞之间的界限更明显、整齐，细胞折光性强，胞质饱满，核质清晰。

2.细胞动力学检测

将长满单层的Marc145母细胞和猴肾细胞系Marc145-1株制备成细胞悬液，经细胞计数后，按照8×10⁴个/cm²接种于24孔细胞培养板，加入含8%~10%胎牛血清的DMEM生长液，于37℃5%CO₂条件下培养。24h后取3瓶细胞，制成细胞悬液，分别进行计数，三次测定结果取平均值。以后每隔24h取3瓶细胞计数一次，连续计数7d。

根据细胞计数结果(见表1)，以活细胞总数（个/孔）为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线（见图1）。

用下列公式计算细胞的比生长速率（μ）和分裂指数（Cd）。

$\mathrm{\μ}=\frac{{\ln X}_n-{\ln X}_{n-1}}{t_n-t_{n-1}}$

其中，X代表每毫升活细胞数目；t代表采样的时间点；n代表采样点。

表1细胞动力学检测对比结果

由表1及图1可以看出，猴肾细胞系Marc145-1株比Marc145母细胞生长速度变快，细胞数增加，细胞倍增时间提前了一天。

3.染色体核型分析

按照染色体核型分析方法，在镜下分别采集Marc145母细胞和猴肾细胞系Marc145-1株染色体图片，结果显示两者的染色体数目相同，证明了该猴肾细胞系Marc145-1株是来源于Marc145母细胞的。

4.细胞微生物污染的检测

4.1无菌检验（参考中国兽药典三部2010版附录第42页）

4.1.1厌氧性及需氧性细菌的检验

用硫乙醇酸盐培养基（TG）（附录第22页）及酪胨琼脂（GA）（附录第21页）。

结果显示无细菌生长。

4.1.2霉菌及腐生菌检验

用葡萄糖蛋白胨培养基（GP）（附录第22页）。

结果显示无霉菌及腐生菌生长。

4.2外源病毒检测

4.2.1按中国兽药典三部（2010版附录第40页）的方法进行

4.2.2PCR快速检测方法

取第5、10、30、50代猴肾细胞系Marc145-1株，按照PRV、CSFV、PPV、JEV、PCV1、BVDV-1的试剂盒提取方法分别提取几种病毒的DNA/RNA，并分别用针对六种病毒的特异性引物，进行PCR/RT-PCR，同时设定已知的含特定病毒样品为阳性对照，以及阴性对照，分别测定是否含有该病毒。PCR检测结果显示，外源病毒检测均为阴性。

两种方法均显示，猴肾细胞系Marc145-1株均无外源病毒污染。

4.3支原体检测

4.3.1按中国兽药典三部（2010版附录第49页）的方法进行

4.3.1.1液体培养基培养

将细胞悬液5.0ml接种装有20ml支原体液体培养基（附录第24页）的小瓶子，摇匀后，再从小瓶中取0.4ml移植到含有1.8ml培养基的2支小管（1.0cm×10cm），每支各接种0.2ml，将小瓶与小管置37℃培养，分别于接种后5d、10d、15d从小瓶中取0.2ml培养物移植到小管液体培养基内，每日观察培养物有无颜色变黄或变红，如果无变化，则在最后一次移植小管培养、观察14d后停止观察。在观察期内，如果发现小瓶或任何一支小管培养物颜色出现明显变化，在原pH值变化达±0.5时，应立即将小瓶中的培养物移植于小管液体培养基和固体培养基，观察在液体培养基中是否出现恒定的pH值变化，及固体上有无典型的“煎蛋”状支原体菌落。

4.3.1.2琼脂固体平板培养

在每次液体培养基移植小管培养的同时，取培养物0.1~0.2ml接种琼脂固体平板（附录第25页），置于含5%~10%CO₂潮湿的环境、37℃下培养。在液体培养基颜色出现变化，在原pH变化达±0.5时，也同时接种琼脂平板。每3~5日，在低倍显微镜下，观察检查各琼脂平板上有无支原体菌落出现，经14d观察，仍无菌落者时，停止观察。4.3.2PCR快速检测方法

取待检的猴肾细胞系Marc145-1株样本，按照QIAampDNAMiniKit提取试剂盒（CatNo.51306）提取DNA，使用支原体检测试剂盒（常规PCR）检测。PCR反应体系：

ddH₂O：14.55μl

10×buffer（缓冲溶液）：2.5μl

引物：2.5μl

内控对照：2.5μl

Mg²⁺：0.75μl

Taq酶：0.2μl

依次加入EP管中，混匀，分装23μl/管。然后加入2μl模板，其中内控对照为H₂O2μl。

反应条件：94℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，39个循环。PCR产物用1.5%标准琼脂糖凝胶电泳检测。检测结果显示，被检细胞的支原体为阴性。

两种方法检测结果均显示支原体阴性。

5.细胞生物学稳定性

将猴肾细胞系Marc145-1株传至第50代，分别取5代、10代、20代、30代、50代接种到裸鼠，每代细胞均接种4只裸鼠，经腹腔接种裸鼠体内，注射体积为0.2ml，细胞浓度为每鼠1×10⁶/ml，连续观察2个月，没有观察到肿瘤形成；而对照组在接种了相同数量的HepG2细胞后，3~4周后均出现腹水、肿瘤生长。提示该细胞系无致瘤性，生物安全性高。见表2。

表2猴肾细胞系Marc145-1株细胞生物学稳定性实验结果

实施例3：猪繁殖与呼吸系统综合征病毒NVDC-JXA1株增殖特性检测

取Marc145母细胞和猴肾细胞系Marc145-1株各约1×10⁶个细胞接种于T25细胞培养瓶，待细胞长满单层每瓶接种等量的NVDC-JXA1病毒（0.001MOI），加入等量维持液5ml，于37℃5%CO₂培养箱培养，分别于接种后24h、48h、72h、96h各取3瓶细胞，经反复冻融后获得病毒液，用TCID₅₀测定四个时间点的病毒含量。

将NVDC-JXA1病毒液作10^-1到10^-8倍比稀释后，分别接种于96孔板长满单层的Marc145母细胞和猴肾细胞系Marc145-1株。每个稀释度6孔，同时设立阴性对照，培养7d后，观察细胞病变（见表3）。

表3猪繁殖与呼吸系统综合征病毒NVDC-JXA1株增殖特性对比

由表3可以看出，猴肾细胞系Marc145-1株比Marc145母细胞对猪繁殖与呼吸系统综合征病毒更易敏感，病毒滴度能提高一个以上，在NVDC-JXA1病毒培养96h后仍然具有高达10^7.0TCID5₀/ml的病毒滴度，仍然可以达到Marc145母细胞培养猪繁殖与呼吸系统综合征病毒的高峰值。

实施例4：猪繁殖与呼吸系统综合征病毒NVDC-JXA1-R株增殖特性检测

取Marc145母细胞和猴肾细胞系Marc145-1株细胞各约1×10⁶个细胞接种于T25细胞培养瓶，待细胞长满单层每瓶接种等量的NVDC-JXA1-R病毒（0.001MOI），加入等量维持液5ml，于37℃5%CO₂培养箱培养，分别于接种后24h、48h、72h、96h各取3瓶细胞，经反复冻融后获得病毒液，用TCID₅₀测定四个时间点的病毒含量。

将NVDC-JXA1-R病毒液作10^-1到10^-8倍比稀释后，分别接种于96孔板长满单层的Marc145母细胞和猴肾细胞系Marc145-1株。每个稀释度6孔，同时设立阴性对照，培养7d后，观察细胞病变（见表4）。

表4猪繁殖与呼吸系统综合征病毒NVDC-JXA1-R株增殖特性对比

由表4可以看出，猴肾细胞系Marc145-1株比Marc145母细胞对猪繁殖与呼吸系统综合征病毒更易敏感，病毒滴度能提高一个以上，在NVDC-JXA1-R株病毒培养96h后仍然具有高达10^8.57TCID₅₀/ml的病毒滴度，仍然可以达到Marc145母细胞培养猪繁殖与呼吸系统综合征病毒的高峰值。

实施例5：猪繁殖与呼吸系统综合征病毒CH-1R株增殖特性检测

取Marc145母细胞和猴肾细胞系Marc145-1株各约1×10⁶个细胞接种于T25细胞培养瓶，待细胞长满单层每瓶接种等量的CH-1R病毒（0.001MOI），加入等量维持液5ml，于37℃5%CO₂培养箱培养，分别于接种后24h、48h、72h、96h各取3瓶细胞，经反复冻融后获得病毒液，用TCID₅₀测定四个时间点的病毒含量。

将CH-1R病毒液作10^-1到10^-8倍比稀释后，分别接种于96孔板长满单层的Marc145母细胞和猴肾细胞系Marc145-1株。每个稀释度6孔，同时设立阴性对照，培养7d后，观察细胞病变（见表5）。

表5猪繁殖与呼吸系统综合征病毒CH-1R株增殖特性对比

由表5可以看出，猴肾细胞系Marc145-1株比Marc145母细胞对猪繁殖与呼吸系统综合征病毒更易敏感，病毒滴度能提高一个以上，在CH-1R株病毒培养96h后仍然具有高达10^8.5TCID₅₀/ml的病毒滴度，仍然可以高于Marc145母细胞培养猪繁殖与呼吸系统综合征病毒的高峰值。

实施例6：猴肾细胞系Marc145-1株与Marc145母细胞培养猪繁殖与呼吸系统综合征病毒收获量比较

将猴肾细胞系Marc145-1株接种于细胞培养3000ml滚瓶，加入含8%胎牛血清的DMEM细胞生长液，于37℃5%CO₂条件下24h可以长成单层，0.001MOI接种NVDC-JXA1，加入含2%胎牛血清的DMEM维持液600ml，于37℃培养36~48h有80%的细胞出现细胞病变，以细胞崩解为主要特征，分别收获上清液和细胞中的病毒，即，收获完上清液之后，再补入600ml含2%胎牛血清的DMEM维持液，冻融三次，收获病毒。两次收获的NVDC-JXA1的滴度均可以达到10^8.0TCID₅₀/ml，一个滚瓶可以收获病毒液1200ml。

将Marc145母源细胞接种于细胞培养3000ml滚瓶，加入含8%胎牛血清的DMEM细胞生长液，于37℃5%CO₂条件下48h可以长成单层，0.001MOI接种NVDC-JXA1，加入含2%胎牛血清的DMEM维持液300ml，于37℃培养72h出现细胞病变，以细胞崩解为主要特征，将上清和细胞一起冻融三次，收获病毒，NVDC-JXA1的滴度可以达到10^6.0TCID₅₀/ml，一个滚瓶可以收获病毒液300ml。

将猴肾细胞系Marc145-1株接种于细胞培养3000ml滚瓶，加入含8%胎牛血清的DMEM细胞生长液，于37℃5%CO₂条件下24h可以长成单层，0.001MOI接种NVDC-JXA1-R，加入含2%胎牛血清的DMEM维持液600ml，于37℃培养36~48h有80%的细胞出现细胞病变，以细胞崩解为主要特征，分别收获上清液和细胞中的病毒，即，收获完上清之后，再补入600ml含2%胎牛血清的DMEM维持液，冻融三次，收获病毒。两次收获的NVDC-JXA1-R的滴度均可以达到10^9.5TCID₅₀/ml，一个滚瓶可以收获病毒液1200ml。

将Marc145母源细胞接种于细胞培养3000ml滚瓶，加入含8%胎牛血清的DMEM细胞生长液，于37℃5%CO2条件下48h可以长成单层，0.001MOI接种NVDC-JXA1-R，加入含2%胎牛血清的DMEM维持液300ml，于37℃培养72h出现细胞病变，以细胞崩解为主要特征，将上清和细胞一起冻融三次，收获病毒，NVDC-JXA1-R的滴度可以达到10^8.5TCID₅₀/ml，一个滚瓶可以收获病毒液300ml。

将猴肾细胞系Marc145-1株接种于细胞培养3000ml滚瓶，加入含8%胎牛血清的DMEM细胞生长液，于37℃5%CO₂条件下24h可以长成单层，0.001MOI接种CH-1R，加入含2%胎牛血清的DMEM维持液600ml，于37℃培养36~48h有80%的细胞出现细胞病变，以细胞崩解为主要特征，分别收获上清液和细胞中的病毒，即，收获完上清之后，再补入600ml含2%胎牛血清的DMEM维持液，冻融三次，收获病毒。两次收获的CH-1R的滴度均可以达到10^9.5TCID₅₀/ml，一个滚瓶可以收获病毒液1200ml。

将Marc145母源细胞接种于细胞培养3000ml滚瓶，加入含8%胎牛血清的DMEM细胞生长液，于37℃5%CO₂条件下48h可以长成单层，0.001MOI接种CH-1R，加入含2%胎牛血清的DMEM维持液300ml，于37℃培养72h出现细胞病变，以细胞崩解为主要特征，将上清和细胞一起冻融三次，收获病毒，CH-1R的滴度可以达到10^8.0TCID₅₀/ml，一个滚瓶可以收获病毒液300ml。

表6为猴肾细胞系Marc145-1株与Marc145母细胞培养猪繁殖与呼吸系统综合征病毒比较结果。

表6两种细胞增殖猪繁殖与呼吸系统综合征病毒比较结果

以上可以看出，猴肾细胞系Marc145-1株增殖速度较Marc145母细胞快，提前24h形成单层，由于细胞增殖速度较快，需要Marc145母细胞培养2倍的维持液量才能保证正常需求；在接毒后36~48h80%细胞出现细胞病变，以细胞崩解为主要特征，上清液收获之后再添加相同数量的维持液，冻融三次，使细胞中的病毒粒子释放出来，两次收获的病毒液滴度相当，共收获4倍量的Marc145母细胞培养的病毒液。而Marc145母细胞不仅在细胞增殖速度慢于猴肾细胞系Marc145-1株，病毒在胞内的增殖速度也慢于猴肾细胞系Marc145-1株，造成了无论在生产时间上、病毒液的滴度还是病毒液的收获量等方面指标要低于猴肾细胞系Marc145-1株。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种用于猪繁殖与呼吸系统综合征病毒培养的细胞株，其中，所述细胞株为猴肾细胞系Marc145-1株(MonkeykidneycelllinestrainMarc145-1)，其保藏编号为:CCTCCNO:C2012185，保藏于中国典型培养物保藏中心。

2.一种根据权利要求1所述的细胞株在猪繁殖与呼吸系统综合征病毒培养中的应用，其包括：

步骤B，将猪繁殖与呼吸系统综合征病毒接种到猴肾细胞系Marc145-1株进行培养；

步骤C，收获病毒液。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：在步骤B中，所述的培养为增殖培养。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：在步骤B之前还包括步骤A，培养猴肾细胞系Marc145-1株。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：在步骤A中，所述的培养为增殖培养。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：在步骤C之后还包括步骤D，对步骤C中收获的病毒液进行毒价测定。

7.根据权利要求2～6中任意一项所述的应用，其特征在于：所述猪繁殖与呼吸系统综合征病毒选自猪繁殖与呼吸系统综合征病毒强毒株NVDC-JXA1株、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒弱毒株NVDC-JXA1-R株、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒弱毒株ATCCVR-2332株、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒弱毒株CH-1R株以及猪繁殖与呼吸系统综合征病毒弱毒株HBR株。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述猪繁殖与呼吸系统综合征病毒选自猪繁殖与呼吸系统综合征病毒强毒株NVDC-JXA1株、猪繁殖与呼吸系统综合征病毒弱毒株NVDC-JXA1-R株及猪繁殖以及呼吸系统综合征病毒CH-1R株。