CN114525243A - 一种鹿茸干细胞的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及鹿茸干细胞培养技术领域，尤其涉及一种鹿茸干细胞的培养方法，包括培养材料的准备、消化酶法原代培养、胰蛋白酶法传代培养和细胞的纯化。本发明通过进行消化酶原代培养和胰蛋白酶传代培养，采用浓度为0.25％的胰蛋白酶作为细胞消化液，控制培养基的pH值为7.2至7.4，温度保持在37℃，为鹿茸干细胞提供最佳生长环境，并且使消化液的作用力达到最强，有利于提高鹿茸干细胞的培养效率和生长速度；血清中含有促细胞贴壁的成分，有助于鹿茸干细胞细胞贴壁生长；本试验中的培养液和PBS缓冲液分别加有青霉素和链霉素，能有效地抑制细菌生长而不影响细胞的正常生长，且较安全；本试验中使用CO2/NaHCO3缓冲液系统来维持一定的pH值。
Description
技术领域
本发明涉及鹿茸干细胞培养技术领域，尤其涉及一种鹿茸干细胞的培养方法。
背景技术
鹿茸是鹿科动物的副性征，作为鹿的一个器官，具有周期性脱落、然后完全再生的特点。在快速生长期每天可生长1.0至3.0cm，细胞分化的速度至少相当于癌细胞的30倍。对鹿茸再生机理的研究表明，鹿茸的再生不是反向分化的结果，而是建立在干细胞基础上的反应。
公开号为CN201810045324.5的发明公开了一种鹿茸干细胞的制备方法、鹿茸干细胞及其应用，该方法包括1.鹿茸间充质组织取材；2.鹿茸间充质干细胞原代培养；3.鹿茸间充质干细胞的纯化。纯化后鹿茸间充质干细胞具有更强的成骨，成软骨及成脂分化潜能；纯化后鹿茸间充质干细胞制备的条件培养液具有更强、批次间更稳定的皮肤损伤治疗效果。
但是，上述现有技术存在以下缺陷：鹿茸干细胞体外的成功培养是对鹿茸研究的基础和前提，上述技术方案通过对鹿茸组织的单次取材，实现了鹿茸干细胞体外原代培养，并不能实现鹿茸干细胞的传代培养以及批量生产，不利于提高鹿茸干细胞的培养效率，无法对鹿茸的研究典型良好的基础。
发明内容
本发明针对背景技术中存在的技术问题，提出一种鹿茸干细胞的培养方法。
本发明的技术方案：一种鹿茸干细胞的培养方法，包括以下步骤：
S1、培养材料的准备：准备DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、透明质酸酶和谷氨酰胺原材料；利用浓度为10％的胎牛血清和DMEM培养基制备细胞培养基础液；利用浓度为0.08％的胰蛋白酶制备细胞消化液；细胞培养基础液和细胞消化液均采用孔径为0.45μm和0.22μm的滤膜过滤。
S2、消化酶法原代培养：在无菌间内剪碎鹿茸取样组织，用添加有青霉素和链霉素的PBS缓冲液清洗取样组织1至2次，然后加入30至50倍体积的透明质酸酶和胶原酶Ⅰ混合液，对取样组织进行消化，随后再用胶原酶Ⅱ消化；在消化过程中注意观察消化液的混浊情况以及细胞的游离情况；当细胞部分游离时，对样品进行5分钟800r/min的离心；最后将收集到的细胞及组织小块用无血清的细胞培养基础液清洗1次，并接种到细胞培养液中；放入37℃、CO2含量为5％、最大饱和湿度的培养箱中培养，等待细胞长满汇合。
S3、胰蛋白酶法传代培养：待原代细胞生长到80％～90％汇合时，进行细胞传代培养；先用添加有青霉素和链霉素的PBS缓冲液清洗1至2次，或用胰蛋白酶洗1次，再用细胞消化液消化，待细胞变圆、脱壁时收集消化下来的细胞于离心管内，对细胞进行5分钟800r/min的离心，倒掉消化液，再以1×105个/ml的密度，将细胞接种到新的细胞培养基础液中，用吸管吹打使细胞悬浮均匀，将培养皿放入37℃、CO2含量为5％、最大饱和湿度的培养箱中培养；此后，细胞每隔4至6天传一代。
S4、细胞的纯化：首次传代、第2次和第3次传代时调节消化时间，从而纯化鹿茸干细胞；根据鹿茸干细胞与混杂细胞对酶消化作用敏感性不同及其贴壁速度的差异可将其分离；将混杂生长的培养物用常规消化法作用5～8min，用手轻轻拍打培养瓶壁，此时鹿茸干细胞绝大部分可悬浮，将样品加入培养基后移入另一培养瓶内再培养；经过2至3次选择传代，使干细胞完全纯化，形成纯的鹿茸干细胞，以分离其他细胞。
与现有技术相比，本发明的上述技术方案具有如下有益的技术效果：通过进行消化酶原代培养和胰蛋白酶传代培养，采用浓度为0.25％的胰蛋白酶作为细胞消化液，控制培养基的pH值为7.2至7.4，温度保持在37℃，为鹿茸干细胞提供最佳生长环境，并且使消化液的作用力达到最强，有利于提高鹿茸干细胞的培养效率和生长速度；血清中含有促细胞贴壁的成分，有助于鹿茸干细胞细胞贴壁生长；本试验中的培养液和PBS缓冲液分别加有青霉素和链霉素，能有效地抑制细菌生长而不影响细胞的正常生长，且较安全；本试验中使用CO2/NaHCO3缓冲液系统来维持一定的pH值，当培养液颜色偏黄，表明pH下降，此时细胞质内颗粒增多，生长减慢，培养液中漂浮的死细胞增多。当培养液颜色变为紫红色时表明pH升高，影响细胞贴壁生长。本试验中对鹿茸干细胞的培养温度范围控制在(37.0±0.5)℃，取得满意效果。
附图说明
图1为本发明一种实施例的方法流程图。
图2为本发明一种实施例所提供的方法所培养6天后的鹿茸干细胞显微照片。
具体实施方式
实施例一
本发明提出的一种鹿茸干细胞的培养方法，包括以下步骤：
S1、培养材料的准备：准备DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、透明质酸酶和谷氨酰胺原材料；利用浓度为10％的胎牛血清和DMEM培养基制备细胞培养基础液；利用浓度为0.08％的胰蛋白酶制备细胞消化液；细胞培养基础液和细胞消化液均采用孔径为0.45μm和0.22μm的滤膜过滤。
S2、消化酶法原代培养：在无菌间内剪碎鹿茸取样组织，用添加有青霉素和链霉素的PBS缓冲液清洗取样组织1至2次，然后加入30至50倍体积的透明质酸酶和胶原酶Ⅰ混合液，对取样组织进行消化，随后再用胶原酶Ⅱ消化；在消化过程中注意观察消化液的混浊情况以及细胞的游离情况；当细胞部分游离时，对样品进行5分钟800r/min的离心；最后将收集到的细胞及组织小块用无血清的细胞培养基础液清洗1次，并接种到细胞培养液中；放入37℃、CO2含量为5％、最大饱和湿度的培养箱中培养，等待细胞长满汇合。
S3、胰蛋白酶法传代培养：待原代细胞生长到80％～90％汇合时，进行细胞传代培养；先用添加有青霉素和链霉素的PBS缓冲液清洗1至2次，或用胰蛋白酶洗1次，再用细胞消化液消化，待细胞变圆、脱壁时收集消化下来的细胞于离心管内，对细胞进行5分钟800r/min的离心，倒掉消化液，再以1×105个/ml的密度，将细胞接种到新的细胞培养基础液中，用吸管吹打使细胞悬浮均匀，将培养皿放入37℃、CO2含量为5％、最大饱和湿度的培养箱中培养；此后，细胞每隔4至6天传一代。
S4、细胞的纯化：首次传代、第2次和第3次传代时调节消化时间，从而纯化鹿茸干细胞；根据鹿茸干细胞与混杂细胞对酶消化作用敏感性不同及其贴壁速度的差异可将其分离；将混杂生长的培养物用常规消化法作用5～8min，用手轻轻拍打培养瓶壁，此时鹿茸干细胞绝大部分可悬浮，将样品加入培养基后移入另一培养瓶内再培养；经过2至3次选择传代，使干细胞完全纯化，形成纯的鹿茸干细胞以分离其他细胞。
离体细胞对于培养液的pH值要求很高，细胞的耐酸性比耐碱性强，在偏酸性环境中更利于生长，大部分细胞最佳生长pH值一般在7.2至7.4之间。本试验中使用CO2/NaHCO3缓冲液系统来维持一定的pH值，当培养液颜色偏黄，表明pH下降，此时细胞质内颗粒增多，生长减慢，培养液中漂浮的死细胞增多。当培养液颜色变为紫红色时表明pH升高，影响细胞贴壁生长。在培养鹿茸干细胞的培养过程中，由于细胞代谢旺盛，培养液会较快地变酸，因此，培养液常配得稍微偏碱一些(pH7.3至7.4)，这样可使培养液得到较充分的利用。
细胞代谢强度与温度呈正比，随温度降低，生长趋向缓慢，但其对低温的耐受力比对高温强，一般细胞的适宜生长温度为36.5～37.5℃。当温度上升至39～40℃1h，细胞受到一定损伤仍有可能恢复；上升到41～42℃1h，细胞受到严重损伤；相反，温度不低于0℃时，细胞代谢变得缓慢，但并无伤害；温度降至冰点以下时，细胞因胞质结冰受损而死亡。本试验中对鹿茸干细胞的培养温度范围控制在(37.0±0.5)℃，取得满意效果。
试验过程中由于操作失误或环境污染，培养瓶中偶有霉菌或细菌污染，在显微镜下观察，霉菌呈白色的丝状团块，如棉絮状漂浮在培养液中或附着在培养瓶的表面。污染细菌的培养液变得浑浊，黑色颗粒增多。一经发现污染应立即弃除，并用过氧乙酸和新洁尔灭认真擦拭，紫外灯照射或高压灭菌消毒。因此在细胞培养工作中，要有无菌操作意识，严格执行实验室无菌操作规程，以保证试验顺利进行。
实施例二
本发明提出的一种鹿茸干细胞的培养方法，包括以下步骤：
S1、培养材料的准备：准备DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、透明质酸酶和谷氨酰胺原材料；利用浓度为10％的胎牛血清和DMEM培养基制备细胞培养基础液；利用浓度为0.08％的胰蛋白酶制备细胞消化液；细胞培养基础液和细胞消化液均采用孔径为0.45μm和0.22μm的滤膜过滤。
S2、消化酶法原代培养：在无菌间内剪碎鹿茸取样组织，用添加有青霉素和链霉素的PBS缓冲液清洗取样组织1至2次，然后加入30至50倍体积的透明质酸酶和胶原酶Ⅰ混合液，对取样组织进行消化，随后再用胶原酶Ⅱ消化；在消化过程中注意观察消化液的混浊情况以及细胞的游离情况；当细胞部分游离时，对样品进行5分钟800r/min的离心；最后将收集到的细胞及组织小块用无血清的细胞培养基础液清洗1次，并接种到细胞培养液中；放入37℃、CO2含量为5％、最大饱和湿度的培养箱中培养，等待细胞长满汇合。
进一步的，完成S2后，3至4天后观察细胞的贴壁情况，此后，每2天换1次细胞培养液，8至10天后细胞即可长满汇合。
S3、胰蛋白酶法传代培养：待原代细胞生长到80％～90％汇合时，进行细胞传代培养；先用添加有青霉素和链霉素的PBS缓冲液清洗1至2次，或用胰蛋白酶洗1次，再用细胞消化液消化，待细胞变圆、脱壁时收集消化下来的细胞于离心管内，对细胞进行5分钟800r/min的离心，倒掉消化液，再以1×105个/ml的密度，将细胞接种到新的细胞培养基础液中，用吸管吹打使细胞悬浮均匀，将培养皿放入37℃、CO2含量为5％、最大饱和湿度的培养箱中培养；此后，细胞每隔4至6天传一代。
S4、细胞的纯化：首次传代、第2次和第3次传代时调节消化时间，从而纯化鹿茸干细胞；根据鹿茸干细胞与混杂细胞对酶消化作用敏感性不同及其贴壁速度的差异可将其分离；将混杂生长的培养物用常规消化法作用5～8min，用手轻轻拍打培养瓶壁，此时鹿茸干细胞绝大部分可悬浮，将样品加入培养基后移入另一培养瓶内再培养；经过2至3次选择传代，使干细胞完全纯化，形成纯的鹿茸干细胞以分离其他细胞。
S5、细胞的冷冻保存；制备细胞冻存液；用与S3相同的方法消化、收集细胞；对消化液进行离心后，向消化液加入细胞冷冻液，使其成为最终浓度为5×106个/ml的均匀的细胞悬液；将细胞悬液分装入2ml的冻存管内，用封口膜封口，再用较厚的脱脂棉包好，然后装入泡沫的保温盒内，直接放入超低温冰箱，使冻存管内的细胞悬液缓慢结冻；最后将冻存管放入液氮中长期保存，或放在-80℃的环境下长期保存。
进一步的，制备细胞冻存液的方法如下：准备原材料二甲基亚砜，用浓度为10％的二甲基亚砜制备细胞冻存液。
实施例三
本发明提出的一种鹿茸干细胞的培养方法，包括以下步骤：
S1、培养材料的准备：准备DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、透明质酸酶和谷氨酰胺原材料；利用浓度为10％的胎牛血清和DMEM培养基制备细胞培养基础液；利用浓度为0.08％的胰蛋白酶制备细胞消化液；细胞培养基础液和细胞消化液均采用孔径为0.45μm和0.22μm的滤膜过滤。
S2、消化酶法原代培养：在无菌间内剪碎鹿茸取样组织，用添加有青霉素和链霉素的PBS缓冲液清洗取样组织1至2次，然后加入30至50倍体积的透明质酸酶和胶原酶Ⅰ混合液，对取样组织进行消化，随后再用胶原酶Ⅱ消化；在消化过程中注意观察消化液的混浊情况以及细胞的游离情况；当细胞部分游离时，对样品进行5分钟800r/min的离心；最后将收集到的细胞及组织小块用无血清的细胞培养基础液清洗1次，并接种到细胞培养液中；放入37℃、CO2含量为5％、最大饱和湿度的培养箱中培养，等待细胞长满汇合。
S3、胰蛋白酶法传代培养：待原代细胞生长到80％～90％汇合时，进行细胞传代培养；先用添加有青霉素和链霉素的PBS缓冲液清洗1至2次，或用胰蛋白酶洗1次，再用细胞消化液消化，待细胞变圆、脱壁时收集消化下来的细胞于离心管内，对细胞进行5分钟800r/min的离心，倒掉消化液，再以1×105个/ml的密度，将细胞接种到新的细胞培养基础液中，用吸管吹打使细胞悬浮均匀，将培养皿放入37℃、CO2含量为5％、最大饱和湿度的培养箱中培养；此后，细胞每隔4至6天传一代。
S4、细胞的纯化：首次传代、第2次和第3次传代时调节消化时间，从而纯化鹿茸干细胞；根据鹿茸干细胞与混杂细胞对酶消化作用敏感性不同及其贴壁速度的差异可将其分离；将混杂生长的培养物用常规消化法作用5～8min，用手轻轻拍打培养瓶壁，此时鹿茸干细胞绝大部分可悬浮，将样品加入培养基后移入另一培养瓶内再培养；经过2至3次选择传代，使干细胞完全纯化，形成纯的鹿茸干细胞以分离其他细胞。
S5、细胞的冷冻保存；制备细胞冻存液；用与S3相同的方法消化、收集细胞；对消化液进行离心后，向消化液加入细胞冷冻液，使其成为最终浓度为5×106个/ml的均匀的细胞悬液；将细胞悬液分装入2ml的冻存管内，用封口膜封口，再用较厚的脱脂棉包好，然后装入泡沫的保温盒内，直接放入超低温冰箱，使冻存管内的细胞悬液缓慢结冻；最后将冻存管放入液氮中长期保存，或放在-80℃的环境下长期保存。
S6、细胞的复苏：细胞的冻存需要慢冻，但细胞的复苏需要快速复苏，以避免在冷冻和融化的过程中形成冰晶，刺破细胞，影响其成活率；因此在复苏时首先将细胞冻存管从液氮罐中取出，迅速放入37～38℃水浴中解冻，待冰块全部融化后，将细胞悬液放入5ml离心管内，加入在培养箱中平衡至37℃的DMEM培养液3ml，充分混合后，离心清洗2次，最后制成1×105个/ml的细胞悬液，放入培养箱中培养。
实施例四
本发明提出的一种鹿茸干细胞的培养方法，包括以下步骤：
S1、培养材料的准备：准备DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、透明质酸酶和谷氨酰胺原材料；利用浓度为10％的胎牛血清和DMEM培养基制备细胞培养基础液；利用浓度为0.08％的胰蛋白酶制备细胞消化液；细胞培养基础液和细胞消化液均采用孔径为0.45μm和0.22μm的滤膜过滤。
S2、消化酶法原代培养：在无菌间内剪碎鹿茸取样组织，用添加有青霉素和链霉素的PBS缓冲液清洗取样组织1至2次，然后加入30至50倍体积的透明质酸酶和胶原酶Ⅰ混合液，对取样组织进行消化，随后再用胶原酶Ⅱ消化；在消化过程中注意观察消化液的混浊情况以及细胞的游离情况；当细胞部分游离时，对样品进行5分钟800r/min的离心；最后将收集到的细胞及组织小块用无血清的细胞培养基础液清洗1次，并接种到细胞培养液中；放入37℃、CO2含量为5％、最大饱和湿度的培养箱中培养，等待细胞长满汇合。
S3、胰蛋白酶法传代培养：待原代细胞生长到80％～90％汇合时，进行细胞传代培养；先用添加有青霉素和链霉素的PBS缓冲液清洗1至2次，或用胰蛋白酶洗1次，再用细胞消化液消化，待细胞变圆、脱壁时收集消化下来的细胞于离心管内，对细胞进行5分钟800r/min的离心，倒掉消化液，再以1×105个/ml的密度，将细胞接种到新的细胞培养基础液中，用吸管吹打使细胞悬浮均匀，将培养皿放入37℃、CO2含量为5％、最大饱和湿度的培养箱中培养；此后，细胞每隔4至6天传一代。
S4、细胞的纯化：首次传代、第2次和第3次传代时调节消化时间，从而纯化鹿茸干细胞；根据鹿茸干细胞与混杂细胞对酶消化作用敏感性不同及其贴壁速度的差异可将其分离；将混杂生长的培养物用常规消化法作用5～8min，用手轻轻拍打培养瓶壁，此时鹿茸干细胞绝大部分可悬浮，将样品加入培养基后移入另一培养瓶内再培养；经过2至3次选择传代，使干细胞完全纯化，形成纯的鹿茸干细胞以分离其他细胞。
S5、细胞的冷冻保存；制备细胞冻存液；用与S3相同的方法消化、收集细胞；对消化液进行离心后，向消化液加入细胞冷冻液，使其成为最终浓度为5×106个/ml的均匀的细胞悬液；将细胞悬液分装入2ml的冻存管内，用封口膜封口，再用较厚的脱脂棉包好，然后装入泡沫的保温盒内，直接放入超低温冰箱，使冻存管内的细胞悬液缓慢结冻；最后将冻存管放入液氮中长期保存，或放在-80℃的环境下长期保存。
S6、细胞的复苏：细胞的冻存需要慢冻，但细胞的复苏需要快速复苏，以避免在冷冻和融化的过程中形成冰晶，刺破细胞，影响其成活率；因此在复苏时首先将细胞冻存管从液氮罐中取出，迅速放入37～38℃水浴中解冻，待冰块全部融化后，将细胞悬液放入5ml离心管内，加入在培养箱中平衡至37℃的DMEM培养液3ml，充分混合后，离心清洗2次，最后制成1×105个/ml的细胞悬液，放入培养箱中培养。
进一步的，由于低温保护剂DMSO对细胞有毒性，因而应尽量缩短DMSO与成细胞在4℃以上的接触时间。降温和复温速度是影响细胞存活的关键因素。为保持细胞最大存活率，还包括细胞复苏的方法：采用慢冻快融的方法，在细胞冻存液中加入保护剂DMSO培养液后，可使细胞冰点降低，在缓慢冻结条件下，使细胞内水分在冻结前透出细胞外，从而减少细胞内冰晶的形成；细胞复苏时采用37～42℃水浴快速复温法，使之迅速通过细胞最易受损伤的-5～0℃；结果证明，鹿茸干细胞细胞复苏后仍具有正常的结构和形态并保持新陈代谢和自我复制功能。
应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于示例性说明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神和范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围和边界、或者这种范围和边界的等同形式内的全部变化和修改例。
Claims (6)
1.一种鹿茸干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、培养材料的准备：准备DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、胶原酶Ⅰ、胶原酶Ⅱ、透明质酸酶和谷氨酰胺原材料；利用浓度为10％的胎牛血清和DMEM培养基制备细胞培养基础液；利用浓度为0.08％的胰蛋白酶制备细胞消化液；细胞培养基础液和细胞消化液均采用孔径为0.45μm和0.22μm的滤膜过滤；
S2、消化酶法原代培养：在无菌间内剪碎鹿茸取样组织，用添加有青霉素和链霉素的PBS缓冲液清洗取样组织1至2次，青霉素和链霉素在PBS缓冲液的质量浓度为100μg/ml，然后加入30至50倍体积的透明质酸酶和胶原酶Ⅰ混合液，对取样组织进行消化，随后再用胶原酶Ⅱ消化；在消化过程中注意观察消化液的混浊情况以及细胞的游离情况；当细胞部分游离时，对样品进行5分钟800r/min的离心；最后将收集到的细胞及组织小块用无血清的细胞培养基础液清洗1次，并接种到细胞培养液中；放入37℃、CO2含量为5％、最大饱和湿度的培养箱中培养，等待细胞长满汇合；
S3、胰蛋白酶法传代培养：待原代细胞生长到80％～90％汇合时，进行细胞传代培养；先用添加有青霉素和链霉素的PBS缓冲液清洗1至2次，或用胰蛋白酶洗1次，再用细胞消化液消化，待细胞变圆、脱壁时收集消化下来的细胞于离心管内，对细胞进行5分钟800r/min的离心，倒掉消化液，再以1×105个/ml的密度，将细胞接种到新的细胞培养基础液中，用吸管吹打使细胞悬浮均匀，将培养皿放入37℃、CO2含量为5％、最大饱和湿度的培养箱中培养；此后，细胞每隔4至6天传一代；
S4、细胞的纯化：首次传代、第2次和第3次传代时调节消化时间，从而纯化鹿茸干细胞；将混杂生长的培养物用常规消化法作用5～8min，用手轻轻拍打培养瓶壁，此时鹿茸干细胞绝大部分可悬浮，将样品加入培养基后移入另一培养瓶内再培养；经过2至3次选择传代，使干细胞完全纯化，形成纯的鹿茸干细胞以分离其他细胞。
2.根据权利要求1所述的一种鹿茸干细胞的培养方法，其特征在于，还包括细胞冷冻保存的方法；制备细胞冻存液；用与S3相同的方法消化、收集细胞；对消化液进行离心后，向消化液加入细胞冷冻液，使其成为最终浓度为5×106个/ml的均匀的细胞悬液；将细胞悬液分装入2ml的冻存管内，用封口膜封口，再用较厚的脱脂棉包好，然后装入泡沫的保温盒内，直接放入超低温冰箱，使冻存管内的细胞悬液缓慢结冻；最后将冻存管放入液氮中长期保存，或放在-80℃的环境下长期保存。
3.根据权利要求2所述的一种鹿茸干细胞的培养方法，其特征在于，制备细胞冻存液的方法如下：准备原材料二甲基亚砜，用浓度为10％的二甲基亚砜制备细胞冻存液。
4.根据权利要求1所述的一种鹿茸干细胞的培养方法，其特征在于，还包括细胞复苏的方法：在复苏时首先将细胞冻存管从液氮罐中取出，迅速放入37～38℃水浴中解冻，待冰块全部融化后，将细胞悬液放入5ml离心管内，加入在培养箱中平衡至37℃的DMEM培养液3ml，充分混合后，离心清洗2次，最后制成1×105个/ml的细胞悬液，放入培养箱中培养。
5.根据权利要求1所述的一种鹿茸干细胞的培养方法，其特征在于，还包括细胞复苏的方法：采用慢冻快融的方法，在细胞冻存液中加入保护剂DMSO培养液后，在缓慢冻结条件下，使细胞内水分在冻结前透出细胞外，细胞复苏时采用37～42℃水浴快速复温法，使之迅速通过细胞最易受损伤的-5～0℃。
6.根据权利要求1所述的一种鹿茸干细胞的培养方法，其特征在于，完成S2后，3至4天后观察细胞的贴壁情况，此后，每2天换1次细胞培养液，8至10天后细胞即可长满汇合。
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