JPS63226279A - 固定化されたまたは付着性の哺乳動物の細胞を培養する方法および装置 - Google Patents
固定化されたまたは付着性の哺乳動物の細胞を培養する方法および装置Info
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- JPS63226279A JPS63226279A JP62306033A JP30603387A JPS63226279A JP S63226279 A JPS63226279 A JP S63226279A JP 62306033 A JP62306033 A JP 62306033A JP 30603387 A JP30603387 A JP 30603387A JP S63226279 A JPS63226279 A JP S63226279A
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
- C12M29/04—Filters; Permeable or porous membranes or plates, e.g. dialysis
-
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- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
- C12M29/26—Conditioning fluids entering or exiting the reaction vessel
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、哺乳動物の細胞が増殖室内で固定化されたま
たは付着性の形態であり、そして閉じたｗ１環系を介し
て媒質で連続的に洗浄される、固定化されたまたは付着
性の哺乳動物の細胞を培養する方法および装置に関する
。
たは付着性の形態であり、そして閉じたｗ１環系を介し
て媒質で連続的に洗浄される、固定化されたまたは付着
性の哺乳動物の細胞を培養する方法および装置に関する
。
半透膜を有するモノニールは循環系中に存在Ｓ、増殖室
から分離されており、そして栄養物質の供給および／ま
たは代謝生成物の除去はこれを介して実施される。本発
明による装置は、艮い期間にわって制御された条件下に
、固定化されたまたは付着性の哺乳動物の細胞の連続的
培養のために非常に適する。
から分離されており、そして栄養物質の供給および／ま
たは代謝生成物の除去はこれを介して実施される。本発
明による装置は、艮い期間にわって制御された条件下に
、固定化されたまたは付着性の哺乳動物の細胞の連続的
培養のために非常に適する。
この装置は、天然蛋白質、組み換え蛋白質、抗体および
酵素の調製に使用できる。
酵素の調製に使用できる。
動物の細胞の培養において、いくつかの問題が生ずる：
（ａ）培養に気体（０２およびＣ０２）および栄養物質
、グルコース、アミノ酸、ビタミンなどを供給しなくて
はなす、そして （ｂ）代謝最終生成物、例えば、乳酸塩、アンモニアま
たは過剰の溶解ＣＯ２を処分しな（てはならない。
、グルコース、アミノ酸、ビタミンなどを供給しなくて
はなす、そして （ｂ）代謝最終生成物、例えば、乳酸塩、アンモニアま
たは過剰の溶解ＣＯ２を処分しな（てはならない。
概して、これは動物細胞のすべての培養を制限するので
、到達できる細胞総数および生成物濃度の両者を制限す
る。
、到達できる細胞総数および生成物濃度の両者を制限す
る。
このような工業的培養系において、ｐＨおよびｐ０２の
培養パラメーターの調節は、増殖および生放物の生成を
より向上させ、そして培養を再現性あるものとし、これ
らは大規模の実施に適用可能である。
培養パラメーターの調節は、増殖および生放物の生成を
より向上させ、そして培養を再現性あるものとし、これ
らは大規模の実施に適用可能である。
既に実施されている細胞濃度を増加する１つの方法は、
潅流、すなわち、細胞を保持する媒質の交換である。こ
れは回転フィルター［Ａ、Ｌ、ヴＴン・ウェセル（ｖａ
ｎ Ｗｅｚｅｌ） （１９８４） ｒ Ｄｅｖｅｌｏ
ｐｍｅｎＬｓ ｂｉｏｌ、 Ｓ ｔａｎｄｅｒｄ、
５５ 、３−９ベーノ１、親水性膜あるいはフィルタ一
単位をもつ外部の循環系ＩＶＩ／、 Ｒ，）ルバート
（’Ｉ”ｏｌｂｅｒｔ） 。
潅流、すなわち、細胞を保持する媒質の交換である。こ
れは回転フィルター［Ａ、Ｌ、ヴＴン・ウェセル（ｖａ
ｎ Ｗｅｚｅｌ） （１９８４） ｒ Ｄｅｖｅｌｏ
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５５ 、３−９ベーノ１、親水性膜あるいはフィルタ一
単位をもつ外部の循環系ＩＶＩ／、 Ｒ，）ルバート
（’Ｉ”ｏｌｂｅｒｔ） 。
Ｙ、７エーダー（Ｆｅｄｅｒ） （１９８３） 、アニ
ュアル・リポーツ・オン・７ア一メンテイシヨン番プロ
セス（Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｏｎ Ｆ
”ｅｒ＋＋＋ａｔａＬｉ。
ュアル・リポーツ・オン・７ア一メンテイシヨン番プロ
セス（Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｏｎ Ｆ
”ｅｒ＋＋＋ａｔａＬｉ。
ｎ ＰｒｏｃｅＳｓｅｓ） −Ｖｏｌ、 ６．３５
７４ページ］によって実施されている。
７４ページ］によって実施されている。
しかしながら、動物細胞の培養における生成物生成速度
のあるものは低く、こうして連続的還流系においてさえ
、基質および最終生成物への制限のため、媒質の転換を
尚くすることが要求される。
のあるものは低く、こうして連続的還流系においてさえ
、基質および最終生成物への制限のため、媒質の転換を
尚くすることが要求される。
それゆえ、生成物は引続く処理工程において濃縮し、後
に精製しなくてはならない。
に精製しなくてはならない。
血清不合媒質中の培養の場合において、還流の間の完全
な媒質の処理の高い速度は、すべての保護的蛋白質、例
えば、アルブミン、トランスフェリンおよびインスリン
を流入する媒質で連続的に更新しなくてはならいことを
意味する。、これらの基質は非常に高価であるので、こ
れは培養を不合理的に高いコストにする。
な媒質の処理の高い速度は、すべての保護的蛋白質、例
えば、アルブミン、トランスフェリンおよびインスリン
を流入する媒質で連続的に更新しなくてはならいことを
意味する。、これらの基質は非常に高価であるので、こ
れは培養を不合理的に高いコストにする。
他方において、動物細胞は中空繊維のモジュールにおい
て高い細胞総数に増殖し、そして、モノクローナル抗体
の場合において、また、高い生成物濃度を生ずることが
知られている（ｏ、’ｒ、シエーンヘル（５ｂ６ｎｈｃ
ｒｒ） 、 Ｐ、Ｙ、ヴアン・ヒース（ｖａｎ Ｉ（
ｅｅｓ） 、Ａ、 Ｍ、Ｙ、 Ｍ、ヴアン・オス（ｖａ
ｎ Ｏｓ） 、Ｈ，Ｗ、 Ｍ、 レロ７ス（Ｒｏｅｌ
。
て高い細胞総数に増殖し、そして、モノクローナル抗体
の場合において、また、高い生成物濃度を生ずることが
知られている（ｏ、’ｒ、シエーンヘル（５ｂ６ｎｈｃ
ｒｒ） 、 Ｐ、Ｙ、ヴアン・ヒース（ｖａｎ Ｉ（
ｅｅｓ） 、Ａ、 Ｍ、Ｙ、 Ｍ、ヴアン・オス（ｖａ
ｎ Ｏｓ） 、Ｈ，Ｗ、 Ｍ、 レロ７ス（Ｒｏｅｌ
。
Ｉｓ） 、 Ｐ、 １’、 Ｙ、 Ａ、ヴアン・ゲルグ
ー（ｖａｎＧｅｌｄｅｒ） 、第７回ＥＳＡＣＴ会合の
会議録（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ
７ｔｈ ＥｓＡｃＴ Ｍｅｅｔｉｎｋ） 、バー
デン・パイ・ライエン（ｆ３ａｄｅｎ ｂｅｉＷｉｅ
ｎ） 、 １９８５、Ｄ ｅｖｃｌｏｐ、 ｂｉｏ
ｌ、 Ｓ Ｌａｎｃｌｅｒｄ、 、印刷中１゜同時
に、このモジュールの毛管空間外に位置する細胞は新鮮
な基質を供給され、そして透析可能な代謝最終生成物は
、中空繊維の膜を通１平衡透析を介して処分される。し
かしながら、このようなモジュールの使用はかなりな欠
点を有し、その理由は次の通りである：（ａ）実際の細
胞培養空間におけるすぐれた混合物あるいはｐＨまたは
１１０２の調節は存在ぜず、（ｂ）細胞の供給および細
胞からの廃棄物の廃棄が拡散を制限するのでモ、ジュー
ルの大きさは制限され、 （ｃ）必要な酸素は中空の繊維の膜を介してのみ導入で
きるので、細胞は酸素が制限され、そして （ｄ）生成物は毛管外の空間から収穫することが困難で
ある。
ー（ｖａｎＧｅｌｄｅｒ） 、第７回ＥＳＡＣＴ会合の
会議録（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ
７ｔｈ ＥｓＡｃＴ Ｍｅｅｔｉｎｋ） 、バー
デン・パイ・ライエン（ｆ３ａｄｅｎ ｂｅｉＷｉｅ
ｎ） 、 １９８５、Ｄ ｅｖｃｌｏｐ、 ｂｉｏ
ｌ、 Ｓ Ｌａｎｃｌｅｒｄ、 、印刷中１゜同時
に、このモジュールの毛管空間外に位置する細胞は新鮮
な基質を供給され、そして透析可能な代謝最終生成物は
、中空繊維の膜を通１平衡透析を介して処分される。し
かしながら、このようなモジュールの使用はかなりな欠
点を有し、その理由は次の通りである：（ａ）実際の細
胞培養空間におけるすぐれた混合物あるいはｐＨまたは
１１０２の調節は存在ぜず、（ｂ）細胞の供給および細
胞からの廃棄物の廃棄が拡散を制限するのでモ、ジュー
ルの大きさは制限され、 （ｃ）必要な酸素は中空の繊維の膜を介してのみ導入で
きるので、細胞は酸素が制限され、そして （ｄ）生成物は毛管外の空間から収穫することが困難で
ある。
こうして、高い細胞密度および生成物濃縮および完全に
血清不合の媒質の処理量の減少の両者が達成される、培
養法が研究されてきた。
血清不合の媒質の処理量の減少の両者が達成される、培
養法が研究されてきた。
これは、本発明によれば、透析および限外濾過のモノニ
ールを１つの培養系の循環に統合すること、例えば、オ
プチセル（０ｐＬｉｃｃｌｌ）培養系によって達成され
る。この培養系は、固定化されたまたは付着性の細胞の
ための増殖室を含有する。
ールを１つの培養系の循環に統合すること、例えば、オ
プチセル（０ｐＬｉｃｃｌｌ）培養系によって達成され
る。この培養系は、固定化されたまたは付着性の細胞の
ための増殖室を含有する。
細胞は循環におい−Ｃ調節された条件（酸素およびｐＨ
）下に媒質を供給される（Ｌ、ストップ（Ｓｔｏｔｚ）
、Ｂ、に、ライダーセン（Ｌｙｄｅｒｓｅｎ） 、Ｇ
。
）下に媒質を供給される（Ｌ、ストップ（Ｓｔｏｔｚ）
、Ｂ、に、ライダーセン（Ｌｙｄｅｒｓｅｎ） 、Ｇ
。
Ｇ、ブ７（Ｐｕｇｈ） 、Ｍ、Ｓ、パリス（Ｐａｒｉｓ
）、Ｌ、 Ａ、 Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊ
ａｎ、 （１９８５）、６３１゜培養条件の調節は、＋
１０２およびｐＨの統合された制御および調節系によっ
て保証される。
）、Ｌ、 Ａ、 Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｊ
ａｎ、 （１９８５）、６３１゜培養条件の調節は、＋
１０２およびｐＨの統合された制御および調節系によっ
て保証される。
半透膜をもつ透析または限外濾過のモジュールを、培養
系の循環の中に統合（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）すると
、栄養物質を培地に連続的に供給しかつ代謝最終生成物
を連続的に供給することが可能となる。
系の循環の中に統合（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）すると
、栄養物質を培地に連続的に供給しかつ代謝最終生成物
を連続的に供給することが可能となる。
限外濾過のモジュールを、培養系、また「内部の循環」
と呼ぶ、の中に統合すると、次の利点が得られる： （ａ）内部の循環において２〜５Ｘ１０７の細胞／ｉｆ
の培地の非常に高い濃度に到達し、かつ長時間その濃度
を維持することが可能である。
と呼ぶ、の中に統合すると、次の利点が得られる： （ａ）内部の循環において２〜５Ｘ１０７の細胞／ｉｆ
の培地の非常に高い濃度に到達し、かつ長時間その濃度
を維持することが可能である。
（ｂ）内部の循環中に生成物の蓄積は、透析されない培
養物中におおける生成物濃度の５０倍より大きい生成物
濃度が生ずる；これは生成物の最後の精製をかなり簡素
化し、その上、精製すべき培１１ト澄みの体積を減少す
る。
養物中におおける生成物濃度の５０倍より大きい生成物
濃度が生ずる；これは生成物の最後の精製をかなり簡素
化し、その上、精製すべき培１１ト澄みの体積を減少す
る。
（ｅ）内部の循環における高い生成物生成物濃度は、保
護的蛋白質の保護的作用が、ここで、生成物それ自体に
よって取られるので、蛋白質不含−血清不合培地の使用
を可能とする；これは培地中の特定の生成物の濃度をさ
らに増加する。
護的蛋白質の保護的作用が、ここで、生成物それ自体に
よって取られるので、蛋白質不含−血清不合培地の使用
を可能とする；これは培地中の特定の生成物の濃度をさ
らに増加する。
（ｄ）血清不合培養において、交換培地は低分子量のみ
の構成成分を含有することが必要であるだけであり、こ
れは培地のコストを大きく減少する。なぜなら、内部の
循環において要求される、例えば、アルブミンおよびト
ランスフェリンを含有する、完全に補充される培地の量
は、ここで、はんの比較的低いからである。
の構成成分を含有することが必要であるだけであり、こ
れは培地のコストを大きく減少する。なぜなら、内部の
循環において要求される、例えば、アルブミンおよびト
ランスフェリンを含有する、完全に補充される培地の量
は、ここで、はんの比較的低いからである。
（ｅ）透析の場合における実際の生成物の生成体積の減
少、および限外濾過の場合における連続釣力法は、内部
の循環における体積に基づく生成物の生成速度は劇的に
増加する。これは必要な反応体積を減少させるので、よ
り小さい生物反応器が適切である。
少、および限外濾過の場合における連続釣力法は、内部
の循環における体積に基づく生成物の生成速度は劇的に
増加する。これは必要な反応体積を減少させるので、よ
り小さい生物反応器が適切である。
（ｆ）細胞からの廃棄物の連続的廃棄および細胞への供
給、および制御された条件（ＩＩ■■、＋１０２）のた
め、培養は長期間にわたってすぐれた条件を維持し、こ
れは高い生成物生成速度の前提条件である。
給、および制御された条件（ＩＩ■■、＋１０２）のた
め、培養は長期間にわたってすぐれた条件を維持し、こ
れは高い生成物生成速度の前提条件である。
（ｇ）再循環する培地の分画の量は、中空繊維のモジュ
ールの分子量の排除の限界の選択によって前もって決定
できる。この排除の限界はく１゜０００から＞１５０．
０００ダルトンまでの間で変化可能である。膜は基質お
よび阻害的代謝最終生成物に対して透過性であるが、生
成物に対して不透過性であるように、排除の限界を選択
しなくてはならない。＜１００．０００の排除の限界、
例えば、ｓ、ｏｏｏ、１０，０００，２０．０００また
はｓｏ、ｏｏｏの排除の限界をもつ膜を使用することが
好ましい。
ールの分子量の排除の限界の選択によって前もって決定
できる。この排除の限界はく１゜０００から＞１５０．
０００ダルトンまでの間で変化可能である。膜は基質お
よび阻害的代謝最終生成物に対して透過性であるが、生
成物に対して不透過性であるように、排除の限界を選択
しなくてはならない。＜１００．０００の排除の限界、
例えば、ｓ、ｏｏｏ、１０，０００，２０．０００また
はｓｏ、ｏｏｏの排除の限界をもつ膜を使用することが
好ましい。
（１１）適当な中空繊維のモノニールおよび血清不合培
地の選択において、増殖室から剥離しそして粘着するよ
うになった細胞による中空４！＆維の膜の詰まりの不存
在下に、増殖において固定化される細胞ばかりでなく、
かつまた４１１着性の細胞を使用することが可能である
。これは内部の循環における高い流速によって促進され
る。
地の選択において、増殖室から剥離しそして粘着するよ
うになった細胞による中空４！＆維の膜の詰まりの不存
在下に、増殖において固定化される細胞ばかりでなく、
かつまた４１１着性の細胞を使用することが可能である
。これは内部の循環における高い流速によって促進され
る。
本発明による方法を実施する２つの別の方法が存在し、
これらを、例えば、オブナセル（ＯｐｉｃｅＩＩ）培養
系の例によって説明する。
これらを、例えば、オブナセル（ＯｐｉｃｅＩＩ）培養
系の例によって説明する。
（ａ）平、ＶＷ
７０−ダイヤグラムは第１図に概略的に示されている。
２つの別々の循環は、例えば、中空繊維のモジュールの
外部の毛管空間を通過する、実際のオプチセル（Ｏｐｉ
ｃｅｌｌ＠）循環、および中空繊維の膜を反対向きで通
過する、透析または交換の循環を生ずる。オブチセル媒
質および透析媒質の体積比は、例えば、１：１０である
。血清不合の場合において、透析媒質は媒質の透析可能
な低分子量の成分のみを含有する。
外部の毛管空間を通過する、実際のオプチセル（Ｏｐｉ
ｃｅｌｌ＠）循環、および中空繊維の膜を反対向きで通
過する、透析または交換の循環を生ずる。オブチセル媒
質および透析媒質の体積比は、例えば、１：１０である
。血清不合の場合において、透析媒質は媒質の透析可能
な低分子量の成分のみを含有する。
透析の間、透析ｎｆ能な代謝最終生成物はオプチセル（
０ｐｉｃｃｌｌ■）媒質から消耗され、同時に、細胞に
よって消費される基質は交換媒質から移送し戻される。
０ｐｉｃｃｌｌ■）媒質から消耗され、同時に、細胞に
よって消費される基質は交換媒質から移送し戻される。
交換媒質中の基質が使い尽されるか、あるいは代謝最終
生成物が障害的濃度で蓄積した場合、後者は更新しなく
てはならない。
生成物が障害的濃度で蓄積した場合、後者は更新しなく
てはならない。
（１１）限外炉孔
７０−ダイヤグラムはＱＳ ２図に概略的に示されてい
る。中空繊維のモジュールは限外か過のために使用され
る。循環するオプチセル（０ｐｉｃｅｌｌｏ）媒質の一
部を、バッチ式で、あるいは連続的に、中空繊維の膜を
通して抜出す。低分子量の成分および代謝生成物を含有
する炉液を廃棄する。したがって、血清不合ｔ８養の場
合においで、新鮮な培地は限外濾過成分のみを合有し、
オプチセル（Ｏｐｉｃｅｌｌ■）の媒質の溜のｒｌ＋
ｌこ１ｆｔ接供給される。
る。中空繊維のモジュールは限外か過のために使用され
る。循環するオプチセル（０ｐｉｃｅｌｌｏ）媒質の一
部を、バッチ式で、あるいは連続的に、中空繊維の膜を
通して抜出す。低分子量の成分および代謝生成物を含有
する炉液を廃棄する。したがって、血清不合ｔ８養の場
合においで、新鮮な培地は限外濾過成分のみを合有し、
オプチセル（Ｏｐｉｃｅｌｌ■）の媒質の溜のｒｌ＋
ｌこ１ｆｔ接供給される。
生成物がオプチセル（０ｐｉｃｅｌｌ＠）媒質中に十分
に蓄積したとき、それを、バッチ式で、あるいは連続的
に、収穫し、そして抜出した体積を新鮮な培地で補充す
る。
に蓄積したとき、それを、バッチ式で、あるいは連続的
に、収穫し、そして抜出した体積を新鮮な培地で補充す
る。
火篇」劃
火１」〔し
見１五上Ｖ ｒｆＡ“形成細胞、９Ｄ１０生成物の培−
１ 菟乳Ｕ鱈狙朋１−：蛋白貿１（Ｓ Ａ （ヒト血清アル
ブミン、２ｇ／ｌ）、）ランス７エリン（ＪＯＢ／Ｉ）
およびインスリン（１０ｍｇ／ｌ）および他の低分子量
の補充物質を添加した、基礎培地Ｌ’） Ｍ ＥＭおよ
びＨＡＭのＦ １２の１：１混合物から成る血清不合培
地。透析または限外濾過の交換媒質は、低分子量のみの
補充物質を含有した。
１ 菟乳Ｕ鱈狙朋１−：蛋白貿１（Ｓ Ａ （ヒト血清アル
ブミン、２ｇ／ｌ）、）ランス７エリン（ＪＯＢ／Ｉ）
およびインスリン（１０ｍｇ／ｌ）および他の低分子量
の補充物質を添加した、基礎培地Ｌ’） Ｍ ＥＭおよ
びＨＡＭのＦ １２の１：１混合物から成る血清不合培
地。透析または限外濾過の交換媒質は、低分子量のみの
補充物質を含有した。
！ＬＬ’Ｌ飢：Ｉ）０２（増殖室への人口）１００％の
空気飽和＊ｐｌ−１（入［１）７．２−７．３；温度３
７℃；オプナセル（０ｐｉｃｅｌｌｏ）中のポンプ速度
２００−５０ Ｏｒｐｍ、後者は増殖からの出口におけ
るｐ０２が４０％の空気飽和より下に低下しないように
調節した。
空気飽和＊ｐｌ−１（入［１）７．２−７．３；温度３
７℃；オプナセル（０ｐｉｃｅｌｌｏ）中のポンプ速度
２００−５０ Ｏｒｐｍ、後者は増殖からの出口におけ
るｐ０２が４０％の空気飽和より下に低下しないように
調節した。
１胸：培養は６リツトルの血清不合培地中で１゜５Ｘ１
０９の細胞で開始した。非付着性の細胞の固定化に使用
した増殖室は、オプチコア（０ｐｔｉｃｏｒｅ）Ｓｏで
あった。１３９時間後、５１リツトルの交換媒質を使用
する透析をそれに接続した。
０９の細胞で開始した。非付着性の細胞の固定化に使用
した増殖室は、オプチコア（０ｐｔｉｃｏｒｅ）Ｓｏで
あった。１３９時間後、５１リツトルの交換媒質を使用
する透析をそれに接続した。
使用した中空繊維のモジュールの膜は、３，０００〜５
，０００ダルトンの分子量排除限界を有した。生成物は
、オプチセル（０ｐｉｃｅｌｌ■）からの収穫および、
２５９時間後の新鮮な媒質１リツトルおよび３０５時間
後の新鮮な媒質１リツトルの置換によって得た。透析媒
質は３０６時間後に更新した。次の誘発において、１リ
ツトルを３３０時間後収穫し、そして２リツトルを３５
０時間後収穫した。透析を３５０時間後停止し、そして
培養物を「インライン」限外濾過までにわたって変化さ
せた。これは８リツトルのオプチセル（Ｏｐｉｃｅｌｌ
■）体積で３８０時間後に開始した。開始時の限外濾過
速度は７５０＋ｎｌ／時間であった。それは４０４時間
後、５００ｍ１／時間に減少した。限外濾過期間の間、
生成物は次のように収穫した２４０１３時間後２リット
ル、４２７時間後１リットル、４５０時間後１リットル
および停止時に８リツトル。ＨＳ Ａ蛋白質の補充物質
の濃度は、培養の間２ｇ／ｌから０．６ｇ／Ｉに減少し
た。
，０００ダルトンの分子量排除限界を有した。生成物は
、オプチセル（０ｐｉｃｅｌｌ■）からの収穫および、
２５９時間後の新鮮な媒質１リツトルおよび３０５時間
後の新鮮な媒質１リツトルの置換によって得た。透析媒
質は３０６時間後に更新した。次の誘発において、１リ
ツトルを３３０時間後収穫し、そして２リツトルを３５
０時間後収穫した。透析を３５０時間後停止し、そして
培養物を「インライン」限外濾過までにわたって変化さ
せた。これは８リツトルのオプチセル（Ｏｐｉｃｅｌｌ
■）体積で３８０時間後に開始した。開始時の限外濾過
速度は７５０＋ｎｌ／時間であった。それは４０４時間
後、５００ｍ１／時間に減少した。限外濾過期間の間、
生成物は次のように収穫した２４０１３時間後２リット
ル、４２７時間後１リットル、４５０時間後１リットル
および停止時に８リツトル。ＨＳ Ａ蛋白質の補充物質
の濃度は、培養の間２ｇ／ｌから０．６ｇ／Ｉに減少し
た。
水１： オプチコア（０ｐＬｉｃｏｒｅ） Ｓ ’増殖
室内の固定化された細胞の酸素消費速度（０ＣＲ）；培
地中のグルコースおよびＩｇＭｔｌａ度。
室内の固定化された細胞の酸素消費速度（０ＣＲ）；培
地中のグルコースおよびＩｇＭｔｌａ度。
ＩＩｔＬ！！Ｌ：ＯＣＨの速度論は、細胞の増殖および
状態についての基準として示し、第３図に示されている
：ＩＩ？Ｍおよびグルコース濃度の速度論は第４図に示
されている。
状態についての基準として示し、第３図に示されている
：ＩＩ？Ｍおよびグルコース濃度の速度論は第４図に示
されている。
ＯＣＲの変化は、血清不合培地中においてさえ、増殖室
の最大収容能力に到達するまで、細胞は増殖した。その
後、一定のＯＣＲにおける平衡が確 ・立された。
の最大収容能力に到達するまで、細胞は増殖した。その
後、一定のＯＣＲにおける平衡が確 ・立された。
オプチセル（０ｐｉｅｅｌｌ■）媒質中の抗体濃度は５
００ｎ＋ｇ／ｌの上昇した。全体にわたって、７゜５ｇ
のＩｇＭが１９．５リツトルの媒質中で収穫された。生
成速度は高い濃度においてさえ、現在のＩｇＭｆｉ度に
依存せず、細胞による生成物の生成は変化しないか、あ
るいはより急速でさえあった。
００ｎ＋ｇ／ｌの上昇した。全体にわたって、７゜５ｇ
のＩｇＭが１９．５リツトルの媒質中で収穫された。生
成速度は高い濃度においてさえ、現在のＩｇＭｆｉ度に
依存せず、細胞による生成物の生成は変化しないか、あ
るいはより急速でさえあった。
オプチセル（０ｐｉｃｅｌｌ＠）媒質中および交換媒質
中のグルコース濃度の使用により、透析期間を通じて透
析の機能に従うことが可能である。培養物が限外濾過を
受けている間、限外濾過速度に依存しそして、＋ｌｊび
一定のグルコース濃度によって指示される平衡条件はオ
プチセル（Ｏｐｉｃｅｌ ｌ ” ）内で確立された。
中のグルコース濃度の使用により、透析期間を通じて透
析の機能に従うことが可能である。培養物が限外濾過を
受けている間、限外濾過速度に依存しそして、＋ｌｊび
一定のグルコース濃度によって指示される平衡条件はオ
プチセル（Ｏｐｉｃｅｌ ｌ ” ）内で確立された。
オプチセル（０ｐｉｃｅｌｌ■）の培養と培養びん中の
不連続の培養との比較（表１）から明らかなように、生
成物の濃度が１０倍に増加し、そして培養系の体積当り
の生成物生成速度は１５倍程度に増加した。
不連続の培養との比較（表１）から明らかなように、生
成物の濃度が１０倍に増加し、そして培養系の体積当り
の生成物生成速度は１５倍程度に増加した。
表１： 培養びん中および透析または限外濾過を有する
オブチセル（０ρ１ｃｅｌｌ■）中の最−大ＩｇＭ濃度
および１．Ｍ生成速度の比較 培養系／方法 最大１．Ｍａ ＩｇＭ生成変成度ｇ
／ Ｉ ｍｇ／ Ｉ ／目オプチセル（Ｏｐ ｉｃｅｌｌの） ５２０ １５０オ
ブチセル（Ｏｐ ｉｃｅｌｌ■）、 透析 ４１０ ６１培地： Ｉ−二蛋白質ｌ５Ａ（２ｇ／ｌ） 、トランスフェリン
（１０ｔｎｇ／ｌ）およびインスリン（１０ｔｎｇ／ｌ
）および他の低分子量の補充物質を添加した、基礎培地
ＤＭＥＭおよびＨＡＭｆ＞Ｆ１２の１〜１混合物から成
る血清不合培地。透析の交換媒質は、低分子量のみの補
充物質を含有した。
オブチセル（０ρ１ｃｅｌｌ■）中の最−大ＩｇＭ濃度
および１．Ｍ生成速度の比較 培養系／方法 最大１．Ｍａ ＩｇＭ生成変成度ｇ
／ Ｉ ｍｇ／ Ｉ ／目オプチセル（Ｏｐ ｉｃｅｌｌの） ５２０ １５０オ
ブチセル（Ｏｐ ｉｃｅｌｌ■）、 透析 ４１０ ６１培地： Ｉ−二蛋白質ｌ５Ａ（２ｇ／ｌ） 、トランスフェリン
（１０ｔｎｇ／ｌ）およびインスリン（１０ｔｎｇ／ｌ
）および他の低分子量の補充物質を添加した、基礎培地
ＤＭＥＭおよびＨＡＭｆ＞Ｆ１２の１〜１混合物から成
る血清不合培地。透析の交換媒質は、低分子量のみの補
充物質を含有した。
培ＪＬＬ仔−：１１０２（増殖室への入口）１００〜１
８０％の空気飽和；ｐＨ（入口）７．２−７，３；温度
３７℃；オプチセル（０ｐｉｃｅｌｌ＠）中のポンプ速
度２００−５０ Ｏｒｐｍ、後者は増殖からの出口にお
けるｐＯ□が３０％の空気飽和より下に低下しないよう
に調節した。
８０％の空気飽和；ｐＨ（入口）７．２−７，３；温度
３７℃；オプチセル（０ｐｉｃｅｌｌ＠）中のポンプ速
度２００−５０ Ｏｒｐｍ、後者は増殖からの出口にお
けるｐＯ□が３０％の空気飽和より下に低下しないよう
に調節した。
１虹：培養は６リツトルの血清不合培地中で２゜３ Ｘ
１０９の細胞で開始した。非付着性の細胞の固定化に
使用した増殖室は、オプチコア（０ｐｔｉｃｏｒｅ）Ｓ
＠であった。４１時間後、５１リツトルの交換媒質を使
用する透析をそれに接続した。使用した中空繊維のモジ
ュールの膜は、３．０００〜５，０００ダルトンの分子
量排除限界を有した。
１０９の細胞で開始した。非付着性の細胞の固定化に
使用した増殖室は、オプチコア（０ｐｔｉｃｏｒｅ）Ｓ
＠であった。４１時間後、５１リツトルの交換媒質を使
用する透析をそれに接続した。使用した中空繊維のモジ
ュールの膜は、３．０００〜５，０００ダルトンの分子
量排除限界を有した。
１３９時間後、透析媒質を更新し、そして３リツトルの
オプチセル（Ｏｐｉｃｅｌ ｌ■）媒質を収穫し、そし
て新鮮な媒質と置換した。この手順を次の２（回の誘発
において反復し、２０８および３０４時間後４．５リッ
トルを収穫し、そして３７７時間後３リットルのオプチ
セル（Ｏｐｉｃｅｌｌｏ） Ｗ貿ヲ収穫した。後者の２
回の誘発のための構成は多少異なっていた。これらにお
いて、交換媒質の変化に無関係に、１〜１．５リツトル
の生成物含有Ａブチセル（０ｐｉｃｅｌｌ＠）媒質を毎
目収検した。５４４時間の終りに、さらに６リツトルの
」―澄みを得た。オプチセル（０ρ１ｃｅｌｌ■）媒質
の体積は６〜８リツトルであった。蛋白質の補充のＩ
Ｓ Ａの濃度は２ｇ／ｌがら０．２ｇ／Ｉに減少した。
オプチセル（Ｏｐｉｃｅｌ ｌ■）媒質を収穫し、そし
て新鮮な媒質と置換した。この手順を次の２（回の誘発
において反復し、２０８および３０４時間後４．５リッ
トルを収穫し、そして３７７時間後３リットルのオプチ
セル（Ｏｐｉｃｅｌｌｏ） Ｗ貿ヲ収穫した。後者の２
回の誘発のための構成は多少異なっていた。これらにお
いて、交換媒質の変化に無関係に、１〜１．５リツトル
の生成物含有Ａブチセル（０ｐｉｃｅｌｌ＠）媒質を毎
目収検した。５４４時間の終りに、さらに６リツトルの
」―澄みを得た。オプチセル（０ρ１ｃｅｌｌ■）媒質
の体積は６〜８リツトルであった。蛋白質の補充のＩ
Ｓ Ａの濃度は２ｇ／ｌがら０．２ｇ／Ｉに減少した。
２ｒ（： オプチファ（０ｐＬｉｃｏｒｃ） Ｓ ”’
増殖室内の固定化された細胞の酸素消費速度（ＯＣＲ）
；培地中のグルコースおよびＩｇＭ濃度。
増殖室内の固定化された細胞の酸素消費速度（ＯＣＲ）
；培地中のグルコースおよびＩｇＭ濃度。
！ｉｉ： ＯＣＲの速度論は、細胞の増殖および状態、
および増殖室の人１０および出口におけるｐ０２の基準
として、第５図に示されている；１．Ｍおよびグルコー
ス濃度の速度論は第６図に示されている。
および増殖室の人１０および出口におけるｐ０２の基準
として、第５図に示されている；１．Ｍおよびグルコー
ス濃度の速度論は第６図に示されている。
ＯＣＲの変化は、血清不合培地中において、増殖室の最
大収容能力に到達するまで、＃Ｉ胞は増殖したことを示
した。次いで、種々の平衡のＯＣＲが媒質中のｐＣ７に
依存して確立された。
大収容能力に到達するまで、＃Ｉ胞は増殖したことを示
した。次いで、種々の平衡のＯＣＲが媒質中のｐＣ７に
依存して確立された。
オプチセル（０ｐｉｃｅｌｌ＠）媒質中の抗体濃度は２
４００ｍｇ／Ｉの上昇した。同時にＨ８Ａ濃度は減少し
たので、終りにおける媒質中の合計の蛋白質含量に対す
る生成物の寄与は７０・−８０％であった。全体におい
て、３５ｇのＩｇＧが２６リツトルの媒質中で収穫され
た。生成速度は現在のＩｇＧ濃度に代任しなかった。細
胞は、高い濃度で、なおむしろよくそれらの生成物を形
成した。
４００ｍｇ／Ｉの上昇した。同時にＨ８Ａ濃度は減少し
たので、終りにおける媒質中の合計の蛋白質含量に対す
る生成物の寄与は７０・−８０％であった。全体におい
て、３５ｇのＩｇＧが２６リツトルの媒質中で収穫され
た。生成速度は現在のＩｇＧ濃度に代任しなかった。細
胞は、高い濃度で、なおむしろよくそれらの生成物を形
成した。
オプチセル（０ｐｉｃｅｌｌ＠）媒質中および交換媒質
中のグルコース濃度の変化により、実験を通じて透析は
ｆｉ能したことが示される。
中のグルコース濃度の変化により、実験を通じて透析は
ｆｉ能したことが示される。
オプチセル（０ｐｉｃｅｌｌ■）の培養と培養びん中の
不連続の培養との比較（表２）から明らかなように、生
成物の濃度は７０倍に増加し、そして培養系の体積当り
の生成物生成速度は１６０倍程度に増加した。これは、
一方において、制御された条件（１］Ｈ１＋１０２ ）
に起因し、そして、他方において、大きく増大した細胞
総数に起因する。こうして、実験の終りにおいて、３Ｘ
１０”より大島い数の細胞がオプチセル（０ｐｉｃｅｌ
ｌ■）の増殖室から収穫された。６リツトルの体積にお
いて、これはオプチセル（０ｐｉｃｅｌ−１媒質のｌｌ
６１にっき５Ｘ１０７より高い濃度に相当し、これは透
析しない培養におけるよりも３０〜４０倍高い。
不連続の培養との比較（表２）から明らかなように、生
成物の濃度は７０倍に増加し、そして培養系の体積当り
の生成物生成速度は１６０倍程度に増加した。これは、
一方において、制御された条件（１］Ｈ１＋１０２ ）
に起因し、そして、他方において、大きく増大した細胞
総数に起因する。こうして、実験の終りにおいて、３Ｘ
１０”より大島い数の細胞がオプチセル（０ｐｉｃｅｌ
ｌ■）の増殖室から収穫された。６リツトルの体積にお
いて、これはオプチセル（０ｐｉｃｅｌ−１媒質のｌｌ
６１にっき５Ｘ１０７より高い濃度に相当し、これは透
析しない培養におけるよりも３０〜４０倍高い。
表２： 培養びん中および透析をイｊするオプチセル（
０ｐｉｃｅｌｌ■）中の最大ＩｇＧ濃度およびＩｇＧ生
成速度の比較 培養系／方法 最大ＩｇＧ濃 ＩｇＧ生戒度 Ｂ／Ｉ
０ｇ７１７日 オプチセル（Ｏｐ ｉｃｅｌｌ■）、 ２４ （１０６５０透析 培養びん、不連続 ３５ ４
０ｐｉｃｅｌｌ■）中の最大ＩｇＧ濃度およびＩｇＧ生
成速度の比較 培養系／方法 最大ＩｇＧ濃 ＩｇＧ生戒度 Ｂ／Ｉ
０ｇ７１７日 オプチセル（Ｏｐ ｉｃｅｌｌ■）、 ２４ （１０６５０透析 培養びん、不連続 ３５ ４
第１図は、平衡透析の７０−ダイヤグラムである。
ｔｌＳ２図は、限外濾過０７０−ダイヤグラムである。
第１３図は、培養時間の関数として細胞の酸素消費（０
ＣＲ）を示すグラフである。 ｔＩＳ４図は、培養時間の関数としてＩＢＭお上びグル
コースの濃度を示すグラフである。 −−−−−１８Ｍの濃度 ・・・ 外部循環におけるグルコースの濃度−一一一
内部循環におけるグルコースの濃度（↓） 収穫および
媒質の交換 第５図は、培養時間の関数として酸素の消費および飽和
を示すグラフである。グラフＡは増殖室への人口におけ
る酸素の飽和を示し、そしてグラフＢは増殖室からの出
口における酸素の飽和を示す。 第６図は、培養時間の関数としてｌ［？Ｇおよびグルコ
ースの濃度を示すグラフである。 −−−−−、ＩｇＧの濃度 ・・・ 外部循環におけるグルコースの濃度−−−一一
一 内部循環におけるグルコースの濃度（↓） 収穫お
よび媒質の交換 Ａ 外部の循環 Ｂ 内部の循環 １．１ 細胞の増殖室 １．２ｐＯ７、ｐｌ−１、ｐＣ０２などの調節１．３
ポンプ １．４ 透析モジュール １．６０□を供給しかっＣＯ２を廃棄するための〃大交
換 １．７ 交換媒質のための溜 １．８ 内部の媒質の溜 ２．１ 細胞の増殖室 ２．２ｐＯハｐＨのための制御単位 ２．３ ポンプ ２．４ 限外濾過モジュール ２．５ 使用した媒質のための廃棄物容器２．６０□を
供給しかつｃｏ２を廃棄するための〃ス交換 ２．７ 新鮮な媒質のあめの容器 ２．８ 内部の媒質の溜 特許出願人 バイエル・アクチェンデセルシャフト Ａ Ｂ ＦＩＧ、 １
ＣＲ）を示すグラフである。 ｔＩＳ４図は、培養時間の関数としてＩＢＭお上びグル
コースの濃度を示すグラフである。 −−−−−１８Ｍの濃度 ・・・ 外部循環におけるグルコースの濃度−一一一
内部循環におけるグルコースの濃度（↓） 収穫および
媒質の交換 第５図は、培養時間の関数として酸素の消費および飽和
を示すグラフである。グラフＡは増殖室への人口におけ
る酸素の飽和を示し、そしてグラフＢは増殖室からの出
口における酸素の飽和を示す。 第６図は、培養時間の関数としてｌ［？Ｇおよびグルコ
ースの濃度を示すグラフである。 −−−−−、ＩｇＧの濃度 ・・・ 外部循環におけるグルコースの濃度−−−一一
一 内部循環におけるグルコースの濃度（↓） 収穫お
よび媒質の交換 Ａ 外部の循環 Ｂ 内部の循環 １．１ 細胞の増殖室 １．２ｐＯ７、ｐｌ−１、ｐＣ０２などの調節１．３
ポンプ １．４ 透析モジュール １．６０□を供給しかっＣＯ２を廃棄するための〃大交
換 １．７ 交換媒質のための溜 １．８ 内部の媒質の溜 ２．１ 細胞の増殖室 ２．２ｐＯハｐＨのための制御単位 ２．３ ポンプ ２．４ 限外濾過モジュール ２．５ 使用した媒質のための廃棄物容器２．６０□を
供給しかつｃｏ２を廃棄するための〃ス交換 ２．７ 新鮮な媒質のあめの容器 ２．８ 内部の媒質の溜 特許出願人 バイエル・アクチェンデセルシャフト Ａ Ｂ ＦＩＧ、 １
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、細胞が増殖室内で固定化されたまたは付着性の形態
であり、そして循環する媒質で洗浄される、培養系にお
いて固定化されたまたは付着性の細胞を培養する方法で
あって、栄養物質の供給および／または代謝最終生成物
の除去を循環系中に位置する別の半透膜によって連続的
に実施することを特徴とする前記方法。 ２、前記半透膜が透析膜であり、細胞の培養を本来閉じ
た培養系において実施し、前記培養系が透析膜を介して
外部の媒質循環系へ接続されており、そして栄養物質の
供給および代謝最終生成物の除去を透析によって実施す
る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、半透膜が限外ろ過膜であり、細胞の培養を本来閉じ
た培養系において実施し、栄養物質の供給を別の貯蔵容
器から実施し、そして代謝最終生成物の除去を限外ろ過
によって実施する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、半透膜が１００，０００ダルトンより大きい分子量
を有する分子に対して不透過性であることを特徴とする
の特許請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の透析膜
。 ５、半透膜が５０，０００ダルトンより大きい分子量を
有する分子に対して不透過性であることを特徴とする特
許請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の透析膜。 ６、半透膜が１０，０００ダルトンより大きい分子量を
有する分子に対して不透過性であることを特徴とする特
許請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の透析膜。 ７、半透膜を有するモジュールをさらに含有する固定化
されたまたは付着性の哺乳動物の細胞のための培養系か
ら成ることを特徴とする特許請求の範囲第１〜６項のい
ずれかに記載の方法を実施するための装置。 ８、前記半透膜を有するモジュールが外部の媒質循環系
に接続しており、そして栄養物質の供給および代謝最終
生成物の除去が透析によって実施される特許請求の範囲
第７項記載の装置。 ９、培養系が外部の媒質の溜に接続しており、前記溜か
ら栄養物質が供給され、そして代謝最終生成物が半透膜
を有するモジュールを介して限外ろ過によって除去され
る特許請求の範囲第７項記載の方法。 １０、組み換え蛋白質、天然蛋白質、酵素および／また
は抗体の調製のための特許請求の範囲第７〜９項のいず
れかに記載の装置の使用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3641824.2 | 1986-12-06 | ||
| DE19863641824 DE3641824A1 (de) | 1986-12-06 | 1986-12-06 | Verfahren und vorrichtung zur kultivierung immobilisierter oder adhaerierter saeugerzellen sowie dessen verwendung bei der herstellung von proteinen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63226279A true JPS63226279A (ja) | 1988-09-20 |
Family
ID=6315667
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62306033A Pending JPS63226279A (ja) | 1986-12-06 | 1987-12-04 | 固定化されたまたは付着性の哺乳動物の細胞を培養する方法および装置 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0270905A2 (ja) |
| JP (1) | JPS63226279A (ja) |
| AU (1) | AU8217387A (ja) |
| DE (1) | DE3641824A1 (ja) |
| IL (1) | IL84628A0 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02291253A (ja) * | 1989-05-01 | 1990-12-03 | Asahi Medical Co Ltd | 細胞の培養方法及び装置 |
| JPH05504901A (ja) * | 1990-03-26 | 1993-07-29 | ハンプシャー アドバイザリィ アンド テクニカル サービシィズ リミテッド | 減菌または特異的無病原体環境製品 |
| WO2013161885A1 (ja) | 2012-04-27 | 2013-10-31 | 旭化成株式会社 | 細胞培養システム及び細胞培養方法 |
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| WO2021111196A1 (en) * | 2019-12-02 | 2021-06-10 | Avant Meats Company Limited | Methods of meat production by in vitro cell cultivation |
-
1986
- 1986-12-06 DE DE19863641824 patent/DE3641824A1/de not_active Withdrawn
-
1987
- 1987-11-24 EP EP87117282A patent/EP0270905A2/de not_active Withdrawn
- 1987-11-27 IL IL84628A patent/IL84628A0/xx unknown
- 1987-12-04 AU AU82173/87A patent/AU8217387A/en not_active Abandoned
- 1987-12-04 JP JP62306033A patent/JPS63226279A/ja active Pending
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| WO2013161885A1 (ja) | 2012-04-27 | 2013-10-31 | 旭化成株式会社 | 細胞培養システム及び細胞培養方法 |
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0270905A2 (de) | 1988-06-15 |
| AU8217387A (en) | 1988-06-09 |
| IL84628A0 (en) | 1988-04-29 |
| DE3641824A1 (de) | 1988-06-16 |
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